專利名稱：降眼壓類脂類的制作方法
背景技術(shù)：
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及降眼壓類脂類。更具體地說，本發(fā)明涉及PGF2α1-乙醇酰胺及相關(guān)化合物，并涉及含這些化合物的藥物組合物，以及用這些化合物降低哺乳動(dòng)物眼內(nèi)壓的方法。
2、現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)述現(xiàn)有技術(shù)已充分了解許多降眼壓藥劑，用它們治療各種眼高壓癥狀，包括代表嚴(yán)重的人類健康問題的原發(fā)性和續(xù)發(fā)性青光眼。治療眼高壓(青光眼)所用的藥包括β-腎上腺素能受體拮抗劑和各種前列腺素。有著大量有關(guān)前列腺素及其在治療眼高壓中的應(yīng)用的科學(xué)及專利文獻(xiàn)。例如見Bito，L.Z.的“前列腺素的生物保護(hù)作用”(BiologicalProtection with Prostaglandins)，Cohen，M.M.編，BocaRaton.Fla.，CRC出版公司，1985，231-252頁；以及Bito，L.Z.的“青光眼醫(yī)療中的應(yīng)用藥物學(xué)”，Drance，S.M.和Neufeld，A.H.編，紐約，Grune & Stratton，1984，477-505頁。
US 5,288,754包括針對(duì)前列腺素及相關(guān)衍生物具體的現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)一步引文，前列腺素和其相關(guān)衍生物作為降低哺乳動(dòng)物眼內(nèi)壓的藥劑是有效的。US 5,288,754本身描述了“極性的前列腺素C-1酯類”，包括稱為PGF2α的羧酸化合物C-1酰胺類和C-1取代酰胺類。相關(guān)于PGF2α的另外的前列腺素衍生物以下式表示并以任取號(hào)碼“現(xiàn)有技術(shù)化合物1號(hào)”和“現(xiàn)有技術(shù)化合物2號(hào)”標(biāo)明，這些衍生物出現(xiàn)于以本申請(qǐng)社團(tuán)受讓人研究設(shè)備進(jìn)行的現(xiàn)有技術(shù)研究中并顯示強(qiáng)烈的降眼內(nèi)壓活性?，F(xiàn)有技術(shù)化合物1號(hào)在US 5,352,708、5,607,978和5,688,819中作了描述，而現(xiàn)有技術(shù)化合物2號(hào)在US 5,545,665中作了描述。 現(xiàn)有技術(shù)化合物1號(hào) 現(xiàn)有技術(shù)化合物2號(hào)絕大多數(shù)具有前列腺素相關(guān)(或密切相關(guān))結(jié)構(gòu)的降眼壓藥通過已知的“前列腺素”受體起作用。特別是，PGF2α化合物已知通過稱為FP的受體發(fā)揮其降眼壓作用。所謂“FP受體”意思是一種人類的前列腺素受體，如Abramovitz等在生物化學(xué)雜志2692632(1994)中所公開的，特此于本文中引入作為參考。PGF2α的結(jié)構(gòu)，包括用于前列腺素及相關(guān)化合物命名法中的習(xí)慣編號(hào)，如下所示。 本發(fā)明針對(duì)一類涉及PGF2α1-乙醇酰胺的化合物，已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)此類化合物同現(xiàn)有技術(shù)化合物1號(hào)和2號(hào)一起，可作為具有強(qiáng)烈降眼壓活性的藥劑，但此藥劑并不通過FP受體也不通過迄今已認(rèn)知的任何前列腺素受體如DP、EP、EP2、EP3、EP4、FP、IP和TP發(fā)揮其降眼壓效應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及式1化合物類，其中虛線表示沒有鍵或有一個(gè)其條件為在式中沒有兩個(gè)相鄰雙鍵的鍵；波紋線附著基表示α(向下)或β(向上)構(gòu)型，在附著于雙鍵的波紋線處它們表示Z(順式)或E(反式)構(gòu)型；影線指示α構(gòu)型，實(shí)心三角形指示β構(gòu)型；m是0至5的整數(shù)；n是1至6的整數(shù)，條件是以該式表示的化合物不是PGF2α1-乙醇酰胺；q和r各自是0至6的整數(shù)；X是CH2、O或S，條件是，當(dāng)X是O或S時(shí)，鄰接于X的虛線表示沒有鍵；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的環(huán)烷基，或者是以一或二個(gè)取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基則選自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6個(gè)碳；R1、R2、R3和R4各自表示氫、1至6碳的直鏈或支鏈烷?；?、苯甲酰基或1至6碳低級(jí)烷基；R5是氫或1至6碳的直鏈或支鏈烷基；以及R6是氫、1至4碳的直鏈或支鏈烷基或者是該化合物的藥物學(xué)上可接受的鹽，所說的化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的眼具有降低眼內(nèi)壓活性，但不通過FP前列腺素受體也不通過任何迄今已認(rèn)知的前列腺素受體發(fā)揮其降眼壓活性。 式1本發(fā)明也涉及分離出的基本純的PGF2α1-乙醇酰胺，已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)它作為天然產(chǎn)物存在于某些生物體系中。而且，本發(fā)明針對(duì)含有PGF2α1-乙醇酰胺和/或一種或更多種式1的化合物作為活性組分的藥物組合物，并涉及為降低眼內(nèi)壓而使用有效量的該藥物組合物治療需要治療的哺乳動(dòng)物包括人類的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表明PGF2α1-乙醇酰胺的分級(jí)劑量對(duì)貓的虹膜括約肌平滑肌的影響。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝4。
圖2表明PGF2α1-乙醇酰胺的分級(jí)劑量對(duì)離體的豚鼠輸精管電場(chǎng)刺激收縮的抑制效應(yīng)。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝4。
圖3表明PGF2α1-乙醇酰胺的分級(jí)劑量對(duì)離體的小雞回腸的影響。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝4。
圖4表明PGF2α1-乙醇酰胺的分級(jí)劑量對(duì)離體的豚鼠回腸的影響。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝4。
圖5表明PGF2α1-乙醇酰胺的分級(jí)劑量對(duì)離體的大鼠主動(dòng)脈平滑肌的影響。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝4。
圖6表明PGF2α(■)和PGF2α1-乙醇酰胺(●)在CRL1497細(xì)胞中的分級(jí)劑量產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[Ca2+]i的增量。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝4。
圖7表明前列腺素F2α1-乙醇酰胺(●)和前列腺素F2α(■)對(duì)組胺預(yù)收縮的兔頸靜脈片段的血管舒張效應(yīng)。各點(diǎn)為平均值±SEM；對(duì)PGF2α1-乙醇酰胺，n＝6，對(duì)PGF2α，n＝7。
圖8表明PGF2α(■)和PGF2α1-乙醇酰胺(●)在以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中的分級(jí)劑量產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[Ca2+]i的增量。各點(diǎn)為平均值±SEM；n＝3。
圖9表明17-苯基前列腺素F2α(▲)和前列腺素F2α1-乙醇酰胺(●)在以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中分級(jí)劑量產(chǎn)生的磷酸肌醇酯總積累。各數(shù)值為平均值±SEM。N＝3。
圖10表明17-苯基前列腺素F2α(▲)和前列腺素F2α1-乙醇酰胺(●)在以重組人FP受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中分級(jí)劑量產(chǎn)生的磷酸肌醇酯總積累。各數(shù)值為平均值±SEM。n＝3。
圖11表明使用以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞對(duì)5nM3H-17-苯基PGF2α的放射配體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)作用研究。畫出了由未標(biāo)記的PGF2α1-乙醇酰胺(●)和未標(biāo)記的17-苯基PGF2α(▲)提供的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)圖。各點(diǎn)是平均值±SEM；重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)的n＝3。
圖12表明使用以重組人FP受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞對(duì)5nM3H-17-苯基PGF2α的放射配體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)作用研究。畫出了由未標(biāo)記的PGF2α1-乙醇酰胺(●)和未標(biāo)記的17-苯基PGF2α(▲)提供的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)圖。各點(diǎn)是平均值±SEM；重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)的n＝3。
圖13表明0.1％PGF2α1-乙醇酰胺(●)對(duì)狗眼內(nèi)壓的影響。對(duì)側(cè)的眼睛接受賦形劑(○)作為對(duì)照。各點(diǎn)是平均值±SEM；n＝6。
圖14表明0.1％PGF2α1-乙醇酰胺(●)對(duì)狗瞳孔直徑的影響。對(duì)側(cè)的眼睛接受賦形劑(○)作為對(duì)照。各點(diǎn)是平均值±SEM；n＝6。
圖15表明PGF2α1-乙醇酰胺(●)對(duì)狗眼表充血的影響。對(duì)側(cè)的眼睛接受賦形劑(○)作為對(duì)照。各點(diǎn)是平均值±SEM；n＝6。
發(fā)明詳述與本發(fā)明相關(guān)連，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，PGF2α1-乙醇酰胺是一種天然物質(zhì)，它可以由天然擬大麻的花生四烯乙醇胺，通過重組體COX-2和PGF合酶形成。已知COX-2(環(huán)-(加)氧酶-2)是一種前列腺素橋過氧化物合酶，它可以誘發(fā)而且在組織中基本不存在(參見Meade等，(1993)生物化學(xué)雜志，2686610-6614)。由于不能指望COX-2在未受刺激的組織中存在，與本發(fā)明相關(guān)連的發(fā)現(xiàn)，即對(duì)首次實(shí)驗(yàn)的鼠給以anandamide后產(chǎn)生了大量PGF2α乙醇酰胺是預(yù)想不到的結(jié)果。而且，令人驚奇地是，在未接受anandamide的鼠中也檢測(cè)到了PGF2α乙醇酰胺，提示PGF2α1-乙醇酰胺是體內(nèi)組成要素，并可以表現(xiàn)為一種內(nèi)源合成激素。
按本發(fā)明，合成了PGF2α1-乙醇酰胺，以分離出的基本純的形式提供了這一物質(zhì)，并能配制含此物質(zhì)的藥物組合物。PGF2α乙醇酰胺的合成也使得使用在合成過程中唯一的這種改良來合成所有在式1范圍內(nèi)化合物成為可能，這樣的合成對(duì)實(shí)驗(yàn)有機(jī)化學(xué)家來說是易于做到的，特別對(duì)工作在前列腺素及相關(guān)化學(xué)領(lǐng)域的化學(xué)家更是如此。因此，本發(fā)明涵蓋式1化合物。 式1a在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的化合物以式1a表示，具體優(yōu)選的是在式1a范圍內(nèi)的化合物，其中碳10和11、8和12及17和18之間的虛線表示沒有鍵，而碳5和6之間則表示有一個(gè)鍵。此外，涉及到式1a或式1化合物羥基官能團(tuán)的取代(R1至R4基)，則優(yōu)選一個(gè)或更多個(gè)羥基官能團(tuán)未酯化也未烷基化(一個(gè)或更多個(gè)R1至R4是H)的化合物，或者酯化時(shí)，酯化基是1至6個(gè)碳的烷?；?甲?；?、乙?；?、丙?；⒍□；⑽祯；?、己?；蛉魏?至6個(gè)碳的支鏈烷酰基)。涉及到式1a或式1中R5選定的取代基，優(yōu)選化合物的R5是氫或1至3個(gè)碳的低級(jí)烷基，更優(yōu)選氫。R6優(yōu)選氫，或1至3個(gè)碳的低級(jí)烷基，更優(yōu)選氫，n優(yōu)選2。
涉及式1a和式1的還有，OR1、OR2和OR3的構(gòu)型優(yōu)選α(C-9、C-11和C-15α)，而5-6雙鍵的構(gòu)型優(yōu)選Z(順式)。
按本發(fā)明，最優(yōu)選的化合物是以式2表示的PGF2α1-乙醇酰胺及其?；蛲榛苌?，其中R1至R4定義為與式1相關(guān)連，但酰化衍生物比烷基化的更受優(yōu)選。 式2PGF2α1-乙醇酰胺＝R1＝R2＝R3＝R4＝H本發(fā)明化合物的合成以示于反應(yīng)圖式1的PGF2α1-乙醇酰胺的合成為例來說明，并在以下實(shí)驗(yàn)詳情中公開?，F(xiàn)在談一下反應(yīng)圖式，市場(chǎng)上可購得的PGF2α羧酸的三乙醇胺(三甲醇氨基甲烷)鹽用酸處理得游離羧酸。游離的PGF2α羧酸在酸受體(優(yōu)選1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一-7-烯)存在下用甲基化試劑(優(yōu)選碘代甲烷)處理，轉(zhuǎn)化為PGF2α甲酯。此后，PGF2α甲酯用乙醇胺處理，得到PGF2α1-乙醇酰胺。這樣，在PGF2α甲酯和式3的羥烷基胺衍生物的反應(yīng)中將完整的“酰胺”結(jié)構(gòu)引入分子，式中R5、R6和n像與式1相關(guān)連那樣定義，而當(dāng)R5、R6為氫和n為2時(shí)，式3表示乙醇胺。式3的羥烷基胺可根據(jù)化學(xué)文獻(xiàn)制得，而且完全在實(shí)驗(yàn)有機(jī)化學(xué)家的技藝之中。式1中一個(gè)或更多個(gè)虛線表示一個(gè)鍵，和/或羥基構(gòu)型，或在一個(gè)或更多個(gè)雙鍵周圍的取代基構(gòu)型不同于PGF2α1-乙醇酰胺的一些化合物可以通過類似于反應(yīng)圖式1所示的一些反應(yīng)來獲得，但要由適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)結(jié)構(gòu)與立體化學(xué)的前列腺素衍生物C-1羧酸開始合成。這些起始化合物可按化學(xué)文獻(xiàn)制得，而且在實(shí)驗(yàn)有機(jī)化學(xué)家的技藝之中。式1中一個(gè)或更多個(gè)R1至R4基不是氫的化合物，即C-9、C-11、C-15中一個(gè)或更多個(gè)，以及酰胺部分中羥烷基結(jié)構(gòu)的羥基酯化或烷基化的化合物可以由“游離羥基”化合物經(jīng)酯化或烷基化反應(yīng)而獲得。一般來說。式1化合物α和ω側(cè)鏈的修飾如同相關(guān)于該式的定義一樣，在實(shí)驗(yàn)有機(jī)化學(xué)家的技藝之中，按照或類似于US 5,545,665，5,834,498和5,352,708中的公開內(nèi)容，這些專利的說明書特地引入本文作為參考。 PGF2三甲醇氨基甲烷基 游離的PGF2羧酸 PGF2甲酯 PGF2 1-乙醇酰胺R5＝H；R6＝H；n＝2反應(yīng)方式1生物活性本發(fā)明化合物是獨(dú)特的，其獨(dú)特在于，它們是有效力的降眼壓藥然而不通過FP受體起作用。這種情況用許多檢定方法作了證實(shí)，在確定降低眼內(nèi)壓活性及確定化合物通過其作用的受體的領(lǐng)域中完全認(rèn)可這些方法。當(dāng)PGF2α1-乙醇酰胺的生物特征與“母體”化合物PGF2α相比較時(shí)，其降低眼內(nèi)壓活性以及其在許多探查FP或其它已知前列腺素受體活性的檢定中實(shí)際上的惰性特別引入注目并令人驚奇。
在下文中提供生物檢定的描述及檢定結(jié)果。
方法離體組織研究用力位移轉(zhuǎn)換儀(Grass FT-03)等比例地測(cè)量離體組織的平滑肌張力并在Grass多導(dǎo)描記器(7G型和79E型)上記錄。盛裝Krebs液的器官浴保持在37℃并供以95％O2/5％CO2氣使pH為7.4。Krebs液具有下列組成(mM)NaCl，118.0；KCl，4.7；KH2PO4，1.2；CaCl2，1.9；MgSO4，1.18；NaHCO3，25.0；葡萄糖，11.7；消炎痛，0.001。(a)貓虹膜成年家貓靜脈注射過量戊巴比妥鈉(Anthony，Arcaia，CA)致死，立即剜出眼睛并置于冰上。虹膜括約肌在50至100mg張力下垂直安放在加套的10ml器官浴中。開始每一次實(shí)驗(yàn)前要使其穩(wěn)定60分鐘。活性作為收縮性反應(yīng)而測(cè)定。將化合物以累加方式加入器官浴中并在完全清洗后使之恢復(fù)至少30分鐘，回到基線張力。在各次實(shí)驗(yàn)的開始和終了以及劑量-反應(yīng)曲線間測(cè)定10-7M PGF2α的反應(yīng)作為參照。在每件組織上檢驗(yàn)的化合物不多于兩個(gè)。(b)大鼠主動(dòng)脈重180-220g的成年Sprague Dawley鼠使吸入CO2麻醉，然后斷頭并除去血。取出胸主動(dòng)脈，清除掉任何粘附的組織。脈管用水沖洗除去所有血污。主動(dòng)脈分割為5-8mm長(zhǎng)的三個(gè)小段。每段用兩只金屬絲鉤穿過脈管在2g張力下安放在加套的10ml器官浴中。這樣的安放方式使得可以測(cè)量由環(huán)狀平滑肌發(fā)出的收縮力。在以累加方式將化合物加入器官浴之前要讓組織平衡1小時(shí)。在各次實(shí)驗(yàn)的開始和終了，測(cè)定對(duì)10-7M U-46619(一種擬血栓素)的反應(yīng)作為參照。完全清洗掉藥物后，使之有30-45分鐘恢復(fù)時(shí)間。每件組織上只檢查一個(gè)試驗(yàn)化合物。(c)小雞回腸小雞回腸是一種EP3受體標(biāo)本。1.5cm長(zhǎng)的小雞回腸在1g張力下懸吊著。經(jīng)1小時(shí)平衡期后，以非累加方式及各單個(gè)劑量間用30分鐘清洗時(shí)間，取得PGE2的標(biāo)準(zhǔn)劑量-響應(yīng)曲線。隨后，以非累加方式加入試驗(yàn)化合物。最后給予最大劑量的PGE2(10-6M)作為第二級(jí)參照標(biāo)準(zhǔn)。然后計(jì)算各濃度的收縮活性作為達(dá)到10-6M濃度的最大PGE2反應(yīng)的％數(shù)。(d)豚鼠回腸豚鼠回腸是一種EP1受體標(biāo)本。約1.5cm豚鼠回腸段在1g張力下懸吊在加套的器官浴中。在1小時(shí)平衡周期后，獲得PGE2的清洗劑量響應(yīng)曲線。在各劑量之間要有30分鐘清洗期間。然后以相同方式產(chǎn)生PGF2α1-乙醇酰胺的劑量反應(yīng)曲線。最后給予PGE210-6M作為參照。數(shù)據(jù)以最大值PGE2響應(yīng)的％數(shù)表示。(e)豚鼠輸精管對(duì)前列腺素敏感的EP3受體亞型的活性也以前列腺素類化合物抑制由電流在離體豚鼠輸精管中刺激平滑肌抽搐反應(yīng)的能力而測(cè)定。1.5cm份額的豚鼠輸精管在1g起始張力下懸吊并使之平衡至少30分鐘。然后使組織經(jīng)受每30秒20伏電脈沖的刺激。在抽搐反應(yīng)穩(wěn)定后，以累加方式完成對(duì)PGE2的標(biāo)準(zhǔn)劑量反應(yīng)曲線。然后通過完成累加劑量的反應(yīng)曲線來評(píng)估試驗(yàn)化合物。在各化合物之間要清洗組織并使之平衡1小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)尾再次評(píng)估PGE2作為標(biāo)準(zhǔn)參照?；钚杂?jì)算為肌肉抽搐反應(yīng)高度的百分抑制率。(f)兔頸靜脈重2-4kg的任何性別的新西蘭白化體兔，將1000U肝素注入其耳緣靜脈，然后用CO2氣致死。清出外頸靜脈的脂肪和粘附的連接組織并除去。橫切靜脈，每個(gè)環(huán)為3-4mm長(zhǎng)，懸吊在加套器官浴中兩個(gè)金屬鉤之間。此組織在0.75g張力下平衡1小時(shí)，它被再調(diào)整為舒張組織。給予10-5M然后2-3×10-6M的單劑量組胺使組織收縮并建立反應(yīng)度，每次投藥后要用水洗滌。以5分鐘加入10-6M的TP-受體拮抗劑SQ29548(0gletree等，(1985)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)與理論雜志234435-441)，然后加入2-3×10-6M組胺以引起收縮反應(yīng)。在用組胺作30分鐘預(yù)處理后，通過加入累加劑量的試驗(yàn)化合物檢驗(yàn)舒張反應(yīng)，在各劑量-反應(yīng)曲線結(jié)尾用10-8至10-7M的PGE2作為參照。在清洗組織后要有30-50分鐘恢復(fù)周期。舒張活性計(jì)算為組胺引起的參照伸縮性的百分?jǐn)?shù)。(g)人血小板前列腺素類化合物在DP-、TP-和IP-受體型上的活性通過引起體外的人血小板聚集(TP-受體活性)或抑制ADP誘發(fā)的聚集(DP-和IP-受體活性)的能力而測(cè)定。由同意的健康人志愿者得到新鮮全血，與酸性檸檬酸右旋糖酯(ACD)混合。血液以1000rpm離心15-20分鐘，得到富血小板血漿(PRP)。4.5μl前列腺素類化合物或賦形劑加入到450μlPRP中并在Payton集合度計(jì)中在37℃保溫2分鐘，觀察聚集活性。然后加入2×10-5M ADP(最終濃度)誘發(fā)完全聚集。聚集的抑制作用計(jì)算為用2×10-5M ADP在不存在和存在藥物之下引起的聚集之間的百分差別。聚集活性計(jì)算為前列腺素類化合物誘發(fā)的聚集相對(duì)于2×10-5M ADP誘發(fā)的聚集的百分?jǐn)?shù)。在各次實(shí)驗(yàn)的開始和結(jié)尾單獨(dú)對(duì)2×10-5M ADP進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)聚集反應(yīng)。(h)CRL1497細(xì)胞Ca2+信號(hào)人CRL1497細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中并加進(jìn)含有10％胎牛血清、2mM 1-谷氨酰胺和0.05mg/ml硫酸慶大霉素(這些都從Gibco，GrandIsland，NY購來)的Dulbecco的改良Eagle介質(zhì)(DMEM)。細(xì)胞培養(yǎng)保持在增濕的95％空氣、5％CO2的氣氛中并生長(zhǎng)至匯合。通過在Hanks平衡鹽溶液(HBSS，Gibco，GrandIsland，NY)中用胰蛋白酶0.05％/0.53mM EDTA在37℃處理約1分鐘，由培養(yǎng)瓶中移出細(xì)胞。分解蛋白的活性以在DMEM中加5ml 10％的胎牛血清來抑制。細(xì)胞順序地在Hank的BSS和含有140mM NaCl、50mM KCl、1mM MgCl2、1.5mM CaCl2、10mM HEPESTRIS、5mM葡萄糖、5mM丙酮酸鈉、0.1％牛血清清蛋白，pH為7.4的介質(zhì)中洗滌。洗滌物的離心分離在室溫以200g進(jìn)行15分鐘。細(xì)胞計(jì)數(shù)，再懸浮在上述介質(zhì)中并在37℃與2×10-6M Fura2/乙酸基甲酯一起在擺動(dòng)水浴中保溫30分鐘。隨后，細(xì)胞在如上述的介質(zhì)中洗滌，并以2×106細(xì)胞ml-1的濃度再懸浮。然后將等分為0.5ml一份的細(xì)胞懸浮液加入autocap microtube，對(duì)每次實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)提供106個(gè)細(xì)胞。
在Perkin-Elmer LS-5熒光分光光度計(jì)中以激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為340和492nm，二者狹縫均為10nm測(cè)量熒光。對(duì)于各次實(shí)驗(yàn)測(cè)定，106個(gè)細(xì)胞要洗滌(200×g，5分鐘)并用含120mM NaCl、6mM KCl、1mM MgSO4、1.5mM CaCl2、20mM HEPES、1mg ml-1葡萄糖和1mgml-1丙酮酸鈉的緩沖液懸浮在2ml的液槽中。溫度保持在37℃，用裝在槽頂?shù)臐{式攪拌機(jī)完成攪拌。用毛地黃皂苷(10μl的100mg ml1DMSO溶液)松解(或“溶解”)細(xì)胞以獲得fmax。然后，連續(xù)加入EGTA(100mM)和足夠的10N NaOH，調(diào)節(jié)pH至8.5以獲得fmin。(i)重組的貓和人FP受體；穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子
HEK-293細(xì)胞在具有10％胎牛血清(FBS)、250μg ml-1G418(“生物技術(shù)”)和200μg ml-1慶大霉素或青霉素/鏈霉素的DMEM中生長(zhǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的選擇以200μg ml-1的潮霉素來達(dá)到，最適宜濃度通過潮霉素殺傷曲線研究來確定。
就轉(zhuǎn)染作用而言，在10cm平皿上，細(xì)胞生長(zhǎng)至50-60％匯合。結(jié)合了人FP受體cDNA插入片段的質(zhì)粒pCEP4(20μg)加入到500μl的250mM CaCl2中。然后將HEPES緩沖鹽水×2(2×HBSS、280mM NaCl、20mM HEPES酸、1.5mM Na2HPO4，pH7.05-7.12)在室溫下以滴加方式連續(xù)渦旋地加入至總量為500μl。30分鐘后，9ml DMEM加入混合物。然后將DNA/DMEM/磷酸鈣混合物加到此前已用10毫升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)涮洗過的細(xì)胞中。再后將細(xì)胞在37℃、增濕的95％空氣/5％CO2中保溫5小時(shí)。接著除掉磷酸鈣溶液，細(xì)胞用10％甘油在DMEM中的溶液處理2分鐘。然后甘油溶液用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM置換。細(xì)胞保溫過夜，介質(zhì)用含有250μg ml-1G418和青霉素/鏈霉素的DMEM/10％FBS置換。第二天加入潮霉素B至最終濃度為200μg ml-1。
轉(zhuǎn)染之后十天，選出各個(gè)耐潮霉素B的克隆系并轉(zhuǎn)移到24孔平皿上的不相連孔中。在匯合時(shí)，各克隆轉(zhuǎn)移到6孔平皿的一個(gè)孔中，然后在10cm培養(yǎng)皿中擴(kuò)展。細(xì)胞直至使用前均保持在連續(xù)的潮霉素選擇之下。
以類似方法用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑制備穩(wěn)定的貓F(tuán)P受體轉(zhuǎn)染子。細(xì)胞也在10cm平皿上生長(zhǎng)至50-60％匯合，結(jié)合了貓F(tuán)P受體cDNA插入片段的質(zhì)粒pCEP4用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)開始潮霉素選擇。轉(zhuǎn)染后8天，選出耐潮霉素B的克隆系并轉(zhuǎn)移到24孔平皿上。
對(duì)重組貓和人FP受體的Ca2+信號(hào)研究以相同于已描述的CRL1497細(xì)胞研究的方式進(jìn)行。(j)磷酸肌醇酯的形成受體媒介的磷酸肌醇(PI)水解通過測(cè)量與3H-肌醇一起預(yù)保溫的細(xì)胞中總磷酸肌醇酯(IP)的積累量而測(cè)定。表達(dá)人或貓F(tuán)P受體的HEK293細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株接種在10cm培養(yǎng)皿中(每皿106個(gè)細(xì)胞，在含有10％FBS的DMEM中)。第二天，細(xì)胞在37℃下與在6ml含10％FBS的DMEM中的18μCi[23H]肌醇(Amersham；10-20μCi mmol-1)混在一起保溫24小時(shí)。然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)涮洗細(xì)胞兩次，細(xì)胞與1ml胰蛋白酶-EDTA一起培養(yǎng)5分鐘，而后懸浮在10ml含25mM HEPES緩沖液的DMEM中。在1000rpm下，細(xì)胞群形成小團(tuán)并再懸浮于含10mM LiCl的DMEM/25mM HEPES中10分鐘。等分為200μl一份的細(xì)胞懸浮液連同50μl藥物在37℃保溫30分鐘(雙份測(cè)定)，而后用750μl氯仿∶甲醇∶4N HCl(100∶200∶2)的混合物終止興奮劑刺激作用，接著加250μl氯仿和0.5N HCl抽提磷酸肌醇酯。750μl體積的水層裝入以0.5ml Dowex AG1-X8陰離子交換樹脂(甲酸形式，100-200目，BioRad)充填的柱上以分離出放射標(biāo)記的組分。洗脫程序由3次3ml含5mM肌醇的水洗，然后以750μl含0.1M甲酸的1.3M甲酸銨洗脫兩次等組成。洗出液與10ml水溶膠閃爍液(Packard儀器公司)混合，[3H]磷酸肌醇酯總量以液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定。(k)放射配體結(jié)合以人或貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的血漿膜標(biāo)本如下獲得。用TME緩沖液洗過的細(xì)胞由瓶底刮下，用Brinkman PT10/35polytron均化30秒。按需要加TME緩沖液以達(dá)到在離心管中為40ml體積。TME由100mM TRIS堿、20mM MgCl2、2m EDTA組成，再加10NHCl達(dá)到生理pH。
細(xì)胞勻漿用Backman Ti-60離心機(jī)以19000rpm在4-6℃下離心分離20分鐘。然后細(xì)胞團(tuán)在TME緩沖液中再懸浮，按生物放射檢定，具有1mg/ml的最終蛋白濃度。放射配體結(jié)合檢定在200μl體積中完成。(N)17-苯基PGF2α(比活性85Ci/mmol)的結(jié)合經(jīng)兩次重復(fù)測(cè)定，而實(shí)驗(yàn)則重復(fù)三次。在25℃保溫60分鐘，而后加入4ml冰冷卻的50mM TRIS-HCl使終止，繼之通過Whatman GF/B濾紙迅速過濾，并將收得的細(xì)胞作3次另加的4ml水洗(Brandel)。競(jìng)爭(zhēng)作用研究用最終濃度為5nM[3H](N)17-苯基PGF2α來完成，而非特異結(jié)合則用10-5M未標(biāo)記的17-苯基PGF2α來測(cè)定。(1)眼內(nèi)壓(IOP)涉及Pneumatonometry的對(duì)狗的眼內(nèi)壓研究以清醒狀態(tài)下兩種性別的小獵兔犬(10-15kg)進(jìn)行。在整個(gè)研究過程中該動(dòng)物保持清醒，用手輕柔地加以約束。一般對(duì)一只眼用藥為25μl體積的一滴，另一只眼接受25μl賦形劑(0.1％吐溫80∶10mM TRIS)作為對(duì)照。在眼壓測(cè)定過程中，0.1％丙對(duì)卡因用于角膜麻醉。在5天研究的每一天，眼內(nèi)壓于恰在給藥之前和此后的2、4和6小時(shí)時(shí)測(cè)定。在首次IOP讀數(shù)后立即用藥。(m)瞳孔直徑測(cè)量狗瞳孔直徑用Optistick(一種包括標(biāo)準(zhǔn)寬度(mm)的半圓形參照的mm尺)為參照。用手輕柔地約束狗，通過在標(biāo)準(zhǔn)室內(nèi)光中使半圓對(duì)瞳孔匹配來測(cè)定瞳孔直徑。對(duì)具有很黑瞳孔的狗使用一種專門的鋼筆形小手電筒，但只是很簡(jiǎn)單地避免瞳孔收縮。在IOP和眼充血的同時(shí)測(cè)量瞳孔直徑。(n)眼表充血眼表充血憑目視按一般臨床用的體系估計(jì)并評(píng)分。
眼充血等級(jí)指定值＜1輕微 0.51輕度 1中等 2嚴(yán)重 3眼表充血與眼內(nèi)壓測(cè)量在同一時(shí)間評(píng)估。應(yīng)當(dāng)注意，未經(jīng)處理的狗眼常常具有粉紅/紅色調(diào)。因此，輕微或甚至輕度的值并不必然是超出了正常的范圍。
結(jié)果前列腺素F2α1-乙醇酰胺對(duì)貓虹膜括約肌的影響描繪在圖1中并列表顯示(表1)。前列腺素F2α1-乙醇酰胺(PGF2α1-乙醇酰胺)產(chǎn)生了依賴于其劑量的貓虹膜括約肌平滑肌收縮作用。獲得了58nM的有效濃度(E.C.)50值。此數(shù)據(jù)表明在10nM范圍內(nèi)的閾值濃度。
前列腺素F2α1-乙醇酰胺在抑制電場(chǎng)刺激引起的離體豚鼠輸精管標(biāo)本收縮方面有節(jié)制地有效。數(shù)據(jù)描繪在圖2中并列表顯示(表2)。
圖3描繪PGF2α1-乙醇酰胺對(duì)離體小雞回腸的影響。對(duì)參照化合物(前列腺素E2，10-6M)響應(yīng)的比較暗示PGF2α1-乙醇酰胺可作為弱的局部興奮劑而運(yùn)作。數(shù)據(jù)列于表3中。PGF2α1-乙醇酰胺對(duì)豚鼠回腸顯示效力較低(圖4，表4)，豚鼠回腸據(jù)報(bào)告是EP1受體標(biāo)本。
PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)離體鼠主動(dòng)脈的影響表達(dá)在圖5和表5中。在10-6和10-5的高劑量出現(xiàn)殘留活性。由于鼠主動(dòng)脈是TP受體標(biāo)本，TP受體活性用血小板聚集作了進(jìn)一步的評(píng)估。此外，測(cè)定抑制ADP誘發(fā)人血小板聚集的作用以揭示DP或IP受體的任何相互作用。對(duì)血小板沒有影響是明顯的。數(shù)據(jù)列在表6中，未提供圖，因?yàn)榻^對(duì)沒有反應(yīng)發(fā)生。
前列腺素F2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量在人皮膚成纖維細(xì)胞(CRL1497細(xì)胞)中產(chǎn)生的Ca2+信號(hào)與前列腺素F2α所產(chǎn)生的在圖6中作了對(duì)比。數(shù)據(jù)還作了列表顯示(表7)。PGF2α和PGF2α1-乙醇酰胺的E.C.50值分別為16nM和1586nM，表明在對(duì)人FP受體的效力方面約100倍的差別。
近年的研究已表明，前列腺素F2α可產(chǎn)生內(nèi)皮依賴的，氧化氮(NO)介導(dǎo)的血管舒張作用(Chen等(1995)英國藥理學(xué)雜志1163035-3041)。因此，在對(duì)組胺預(yù)收縮的，離體兔頸靜脈片段產(chǎn)生內(nèi)皮依賴的血管舒張作用方面，將PGF2α1-乙醇酰胺的效果與PGF2α的作了比較。雖然PGF2α強(qiáng)有力地產(chǎn)生顯著的血管舒張作用，但PGF2α1-乙醇酰胺還是顯示了較小的活性(圖7)。數(shù)據(jù)也列表顯示(表8)。對(duì)預(yù)收縮的兔頸靜脈片段的血管舒張作用得到如下的E.C.50值PGF2α1-乙醇酰胺＝2000nM，PGF2α＝5.3。
由于觀察到PGF2α1-乙醇酰胺在貓虹膜括約肌標(biāo)本中的顯著活性，所以將它的活性與PGF2α在重組貓F(tuán)P受體上的活性作了比較。圖8比較了PGF2α1-乙醇酰胺和PGF2α在以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中引起Ca2+信號(hào)的活性。獲得PGF2α和PGF2α1-乙醇酰胺的E.C.50值分別為14nM和1458nM，表明了在效力上約100倍的差別。數(shù)據(jù)也列表顯示(表9)。
PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α對(duì)以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中磷酸肌醇酯總累積量的影響在圖9中作了描繪。效力上的差距大也是明顯的。17-苯基PGF2αE.C.50值為9nM，而PGF2α1-乙醇酰胺E.C.50值則為524nM。數(shù)據(jù)列表顯示(表10)。
另外，PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α對(duì)以重組人FP受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中磷酸肌醇酯總累積量的影響也作了調(diào)查。得到了E.C.50值，17-苯基PGF2α為8nM，PGF2α1-乙醇酰胺為1003nM。數(shù)據(jù)顯示于圖10和表11中。結(jié)果類似于重組貓F(tuán)P受體情形下所得結(jié)果。
與使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FP受體的標(biāo)本的功能研究相-致，PGF2α1-乙醇酰胺對(duì)FP受體具有相對(duì)有節(jié)制的結(jié)合親合力。因此，PGF2α1-乙醇酰胺(現(xiàn)有技術(shù)化合物1號(hào))對(duì)貓受體僅有弱親合力，而17-苯基PGF2α則呈現(xiàn)高親合力(圖11；表12)。得到的抑制濃度50(I.C.50)是，PGF2α1-乙醇酰胺為882nM，而17-苯基PGF2α則為43.5nM。對(duì)重組人FP受體獲得類似結(jié)果PGF2α1-乙醇酰胺I.C.50＝2015nM，17-苯基PGF2αI.C.50＝2.3nM。這些放射配體結(jié)合數(shù)據(jù)描繪在圖12中并列表顯示(表13)。
用狗研究了PGF2α1-乙醇酰胺對(duì)眼球的影響。0.1％劑量的PGF2α1-乙醇酰胺顯著地、高效地降低了眼內(nèi)壓(圖13；表14)。此效果持續(xù)整整24小時(shí)實(shí)驗(yàn)期。PGF2α1-乙醇酰胺也引起顯著的瞳孔縮小(圖14；表15)。不像降眼壓效果，瞳孔直徑縮小在24小時(shí)處便消除了。與賦形劑相比，PGF2α1-乙醇酰胺在整個(gè)24小時(shí)實(shí)驗(yàn)期中引起輕度眼表充血。(圖15；表16)。
在接連列出的表中，除非另作說明，試驗(yàn)或?qū)φ栈衔锏臐舛榷贾灰詫?duì)數(shù)的指數(shù)表示。因此，例如在表中的“-8”意思是10-8M濃度的試驗(yàn)或?qū)φ瘴镔|(zhì)。
表1、PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)離體貓虹膜括約肌平滑肌的影響。參照收縮由10-7PGF2α提供。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表2、PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)離體豚鼠輸精管電場(chǎng)刺激收縮的抑制效應(yīng)。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表3、PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)離體小雞回腸的影響。參照收縮由10-6M PGE2提供。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表4、PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)離體豚鼠回腸的影響。參照收縮由PGE210-6M提供。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表5、PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)離體的朋鼠主動(dòng)脈的影響。參照收縮由10-7M U-46619提供。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表6、PGF2α1-乙醇酰胺分級(jí)劑量對(duì)血小板聚集的影響及對(duì)ADP誘發(fā)聚集的抑制作用的影響。參照反應(yīng)由2×10-5M ADP提供。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表7、由PGF2α1-乙醇酰胺和前列腺素F2α的分級(jí)劑量在CRL1497人表皮成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度[Ca2+]i的增量。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝4
表8、PGF2α1-乙醇酰胺和PGF2α對(duì)預(yù)收縮的兔頸靜脈片段血管的舒張作用。參照的血管舒張作用由PGE210-7M提供。各數(shù)值為平均值±SEM；PGF2α1-乙醇酰胺，n＝6；PGF2α，n＝7。
表9、由PGF2α1-乙醇酰胺和前列腺素F2α的分級(jí)劑量在以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度[Ca2+]i的增量。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝3。
表10、由PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α的分級(jí)劑量在以重組貓F(tuán)P受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中產(chǎn)生的磷酸肌醇酯總累積量。參照刺激由17-苯基PGF2α10-6M提供。各數(shù)值為平均值±SEM；PGF2α1-乙醇酰胺，n＝3；17-苯基PGF2α，n＝4；實(shí)驗(yàn)雙份進(jìn)行。
表11、由PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α的分級(jí)劑量在以重組人FP受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中產(chǎn)生的磷酸肌醇酯總累積量。參照刺激由17-苯基PGF2α10-6M提供。各數(shù)值為平均值±SEM；PGF2α1-乙醇酰胺，n＝3；17-苯基PGF2α，n＝4；實(shí)驗(yàn)雙份進(jìn)行。
表12、對(duì)重組貓F(tuán)P受體的放射配體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研究(PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α對(duì)5nM3H-17-苯基PGF2α)。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝3，實(shí)驗(yàn)雙份進(jìn)行。
表13、對(duì)重組人FP受體的放射配體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研究(PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α對(duì)5nM3H-17-苯基PGF2α)。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝3，實(shí)驗(yàn)雙份進(jìn)行。
表14、0.1％PGF2α1-乙醇酰胺對(duì)狗眼內(nèi)壓的影響。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝6。**按學(xué)生的成對(duì)t驗(yàn)測(cè)，從基線眼內(nèi)壓發(fā)生p＜0.01的有效變化。
表15、0.1％PGF2α1-乙醇酰胺對(duì)狗瞳孔直徑的影響。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝6。**按學(xué)生的成對(duì)t驗(yàn)測(cè)，從基線瞳孔直徑發(fā)生p＜0.01的有效變化。
表16、0.1％PGF2α-1乙醇酰胺對(duì)狗眼表充血的影響。各數(shù)值為平均值±SEM；n＝6。
藥物組合物，使用方法藥物組合物可如下制備，結(jié)合治療上有效量的至少一種按本發(fā)明的化合物或其在藥物學(xué)上可接受的鹽作為一種活性成分，加上通常眼科可接受的藥物賦形劑，并制備成適于局部眼球使用的單位劑量形式。治療上的有效量一般在約0.0001和約5％(W/V)之間，優(yōu)選在約0.001至約1.0％(W/V)，用液體配方。
就治療應(yīng)用而言，溶液優(yōu)選用生理鹽水作為主要賦形劑來制備。這樣的治療溶液應(yīng)優(yōu)選用一種合適的緩沖液體系，使pH保持在6.5和7.2之間，受到優(yōu)選的是實(shí)際上為中性的pH。配方也可以包含通常藥物上可接受的防腐劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。
優(yōu)選的可以用于本發(fā)明藥物組合物的防腐劑包括(但不限于)潔爾滅、氯代丁醇、乙基汞硫代水楊酸鈉、乙酸苯汞和硝酸苯汞。優(yōu)選的表面活性劑例如Tween80。同樣，各種優(yōu)選的賦形劑可以用于本發(fā)明的眼藥制備中。這些賦形劑包括(但不限于)聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素、泊洛沙姆類、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素和純水。
按需要和方便可加入張力調(diào)節(jié)劑。它們包括(但不限于)鹽類，具體是氯鈉、氯化鉀、甘露糖醇和甘油，或任何其它適于眼科接受的張力調(diào)節(jié)劑。
各種緩沖劑和調(diào)節(jié)pH的方法都可以用，只要所得的制備物是眼科可接受的。因此，緩沖液包括乙酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液和硼酸鹽緩沖液。酸或堿都可以按需要用來調(diào)節(jié)這些配方的pH。
按類似的意向，用于本發(fā)明的眼科可接受的抗氧化劑包括(但不限于)焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、乙酰半胱氨酸、丁基化的羥基苯甲醚和丁基化的羥基甲苯。
其它的可包括在眼科制備品中的賦形劑組分是螯合劑。優(yōu)選的螯合劑是edentate二鈉，但是其它螯合劑也可以用來代替它或與它結(jié)合。
各成分通常按下列的量使用成分 量(％W/V)活性成分 約0.001-5防腐劑 0-0.10賦形劑 0-40張力調(diào)節(jié)劑 0-10緩沖液 0.01-10pH調(diào)節(jié)劑 Q.s.pH 4.5-7.5抗氧化劑 按需要表面活性劑 按需要純水 按需要加入使總和達(dá)到100％本發(fā)明活性化合物的真實(shí)劑量取決于具體化合物以及要治療的病癥；合適劑量的選擇完全在熟練工藝人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的眼藥制劑通常包裝成適于對(duì)眼睛計(jì)量使用的形式，如裝入帶有滴管的容器中，以方便使用到眼上。適于以液滴方式使用的容器通常用合適的惰性、無毒塑料材料制作，一般容納約0.5和約15ml之間的溶液。
特殊的無防腐劑溶液常配制在不可再封上的容器中，包含直至10個(gè)左右，優(yōu)選約5個(gè)單位劑量，典型的單位劑量由1滴至約8滴，優(yōu)選1滴至約3滴。一滴的體積通常是約20-35μl。
合成方法詳述PGF2α(游離羧酸)向攪拌的在150ml水中的20g PGF2α或“三甲醇氨基甲烷鹽”(51.9mmol)溶液加入濃鹽酸，使溶液的pH調(diào)節(jié)至2。此溶液用3×200ml氯仿抽提并在真空中濃縮。游離的PGF2α羧酸主要以固體層出現(xiàn)在水相與有機(jī)相之間。由該層收集此固體，并與由濃的氯仿溶液用過濾得到的固體結(jié)合，結(jié)合在一起的固體用50％氯仿/甲醇洗滌。PGF2α甲酯(5Z，8α，9α，11α，13E，15S)-9，11，15-三羥基前列腺-5，13-二烯-1-甲基酯向攪拌的在50ml丙酮中的游離PGF2α羧酸(2.528g，7.13mmol)溶液加入3.2ml 1，8-二氮雜二環(huán)[5.4，0]十一-7-烯(21.39mmol)和1.33ml碘代甲烷(21.39mmol)。溶液攪拌過夜，用150ml乙酸乙酯稀釋，以2×50ml 0.5m LiOH、1×50ml鹽水洗滌，在真空中濃縮，產(chǎn)生標(biāo)題所示的化合物純甲酯(用1HNMR檢驗(yàn)純度)。
H1NMR(CDCl3)5.56-5.34(m，4H)，4.01(m，1H)，3.87(m，1H)，3.87(m，1H)，3.63(s，3H)，3.18(t，2H，J＝5.8Hz)，2.31-2.02(m，8H)，1.69-1.25(m，12H)，0.849(t，3H，J＝6.7Hz)。PGF2α1-乙醇酰胺(5Z，8α，9α，11α，13E，15S)-9，11，15-三羥基-N-(2-羥乙基)前列腺-5，13-二烯-1-酰胺向攪拌的在4.5ml無水甲醇中的PGF2α甲酯(235.4mg，0.639mmol)溶液加入771μl乙醇胺(12.78mmol)。裝有此混合物的試管封口并在50℃加熱過夜。取一個(gè)等分部分，在高真空下加熱濃縮以除去過量的乙醇胺并用1HNMR分析。表明此反應(yīng)為80％的完成度。溶液在高真空下在65℃濃縮1.5小時(shí)，然后用Kugehlrohr蒸餾在60℃下過夜以除去殘留的乙醇胺。1HNMR和用5％甲醇/乙酸乙酯的TLC指示乙醇胺的去除。(甲酯Rf=0.41，PGF2α1-乙醇酰胺Rf＝0.04)。粗產(chǎn)品用5％甲醇/乙酸乙酯作急驟色層分離以回收剩留的未反應(yīng)的起始物料，甲酯在級(jí)分4-8和50％中，在甲醇/乙酸乙酯中產(chǎn)生在級(jí)分11-18中的所要求的標(biāo)題所示化合物。用15％的甲醇/乙酸乙酯進(jìn)一步急驟色層分離級(jí)分11-18，產(chǎn)生無起始物料但在某些級(jí)分(級(jí)分7-10)仍為C15差向異構(gòu)體沾污的標(biāo)題所示化合物以及所要求的純態(tài)產(chǎn)物(在級(jí)分11-20中)。標(biāo)題所示化合物及其C15差向異構(gòu)體的1H+13C NMR譜是相同的。理論產(chǎn)量＝254.0mg，實(shí)際產(chǎn)量＝205.6mg，81％。H1NMR(CD3OD)5.4-5.2(m，4H)，3.98(m，1H)，3.89(m，1H)，3.72(m，1H)，3.47(t，2H，J＝5.8Hz)，3.18(t，2H，J＝5.8Hz)，2.24-1.90(m，8H)，1.50-1.21(m，12H)，0.796(t，3H，J＝6.5Hz)。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式如下的化合物 式中虛線表示沒有鍵或有一個(gè)其條件為在式中沒有兩個(gè)相鄰雙鍵的鍵；波紋線附著基表示α(向下)或β(向上)構(gòu)型，在附著于雙鍵的波紋線處它們表示Z(順式)或E(反式)構(gòu)型；影線指示α構(gòu)型，實(shí)心三角形指示β構(gòu)型；m是0至5的整數(shù)；n是1至6的整數(shù)，條件是以該式表示的化合物不是PGF2α1-乙醇酰胺；q和r各自是0至6的整數(shù)；X是CH2、O或S，條件是，當(dāng)X是O或S時(shí)，鄰接于X的虛線表示沒有鍵；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的環(huán)烷基，或者是以一或二個(gè)取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基則選自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6個(gè)碳；R1、R2、R3和R4各自表示氫、1至6碳的直鏈或支鏈烷?；⒈郊柞；?至6碳低級(jí)烷基；R5是氫或1至6碳的直鏈或支鏈烷基；以及R6是氫、1至4碳的直鏈或支鏈烷基或者是該化合物的藥用鹽，所說的化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的眼具有降低眼內(nèi)壓活性，但不通過FP前列腺素受體發(fā)揮其降眼壓活性。
2.按權(quán)利要求1的一種化合物具有結(jié)構(gòu)式
3.按權(quán)利要求2的化合物，其中碳10和11、8和12及17和18間的虛線表示沒有鍵，而碳5和6間的虛線表示有一個(gè)鍵。
4.按權(quán)利要求2的化合物，其中R5是氫或1至3個(gè)碳的低級(jí)烷基。
5.按權(quán)利要求4的化合物，其中R5是氫。
6.按權(quán)利要求2的化合物，其中R6是氫或1至3個(gè)碳的低級(jí)烷基。
7.按權(quán)利要求6的化合物，其中R6是氫。
8.按權(quán)利要求2的化合物，其中n是2。
9.按權(quán)利要求2的化合物，其中OR1、OR2和OR3基的構(gòu)型是α，5和6位間的虛線表示一個(gè)鍵，而5-6雙鍵的構(gòu)型是Z(順式)。
10.結(jié)構(gòu)式如下的化合物 式中R1、R2、R3和R4各自表示氫、1至6碳的直鏈或支鏈烷?；?、苯甲?；?至6碳的直鏈或支鏈烷基；n是1至6的整數(shù)；該化合物對(duì)降低哺乳動(dòng)物眼的眼內(nèi)壓具有活性，但并不通過FP前列腺素受體發(fā)揮其降眼壓活性，條件是，當(dāng)n是2時(shí)，R1、R2、R3和R4基中至少一個(gè)不是氫。
11.一種分離出來的基本上純的具有下式結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)
12.對(duì)降低需要用組合物治療的哺乳動(dòng)物眼的眼內(nèi)壓有效的藥物組合物，該組合物包括作為其活性成分的有效量的一種或更多種下式結(jié)構(gòu)化合物， 式中虛線表示沒有鍵或有一個(gè)其條件為在式中沒有兩個(gè)相鄰雙鍵的鍵；波紋線附著基表示α(向下)或β(向上)構(gòu)型，在附著于雙鍵的波紋線處它們表示Z(順式)或E(反式)構(gòu)型；影線指示α構(gòu)型，實(shí)心三角形指示β構(gòu)型；m是0至5的整數(shù)；n是1至6的整數(shù)；q和r各自是0至6的整數(shù)；X是CH2、O或S，條件是，當(dāng)X是O或S時(shí)，鄰接于X的虛線表示沒有鍵；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的環(huán)烷基，或者是以一或二個(gè)取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基則選自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6個(gè)碳；R1、R2、R3和R4各自表示氫、1至6碳的直鏈或支鏈烷?；?、苯甲酰基或1至6碳低級(jí)烷基；R5是氫或1至6碳的直鏈或支鏈烷基；R6是氫、1至4碳的直鏈或支鏈烷基或者是該化合物的藥用鹽，所說的化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的眼具有降低眼內(nèi)壓活性，但不通過FP前列腺素受體發(fā)揮其降眼壓活性，以及藥用賦形劑。
13.按權(quán)利要求12的藥物組合物，其中活性化合物具有下式結(jié)構(gòu)
14.按權(quán)利要求13的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中碳10和11、8和12及17和18間的虛線表示沒有鍵，而碳5和6間虛線表示一個(gè)鍵。
15.按權(quán)利要求13的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中R5是氫或1至3碳的低級(jí)烷基。
16.按權(quán)利要求15的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中R5是氫。
17.按權(quán)利要求13的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中R6是氫或1至3碳的低級(jí)烷基。
18.按權(quán)利要求17的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中R6是氫。
19.按權(quán)利要求13的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中n是2。
20.按權(quán)利要求13的藥物組合物，其中活性化合物的結(jié)構(gòu)式中OR1、OR2和OR3基的構(gòu)型是α，5和6位間的虛線表示一個(gè)鍵，而5-6雙鍵的構(gòu)型是Z(順式)。
21.按權(quán)利要求13的藥物組合物，其中活性化合物具有下式結(jié)構(gòu)
22.按權(quán)利要求21的藥物組合物，其中活性化合物具有下式結(jié)構(gòu)
23.按權(quán)利要求12的藥物組合物，適合于哺乳動(dòng)物眼的局部用藥。
24.按權(quán)利要求13的藥物組合物，適合于哺乳動(dòng)物眼的局部用藥。
25.按權(quán)利要求21的藥物組合物，適合于哺乳動(dòng)物眼的局部用藥。
26.按權(quán)利要求22的藥物組合物，適合于哺乳動(dòng)物眼的局部用藥。
27.降低需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物眼的眼內(nèi)壓的方法，此方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物用一種藥物組合物的步驟，該藥物組合物包括藥用賦形劑和作為其活性成分的有效量的一種或多種下式結(jié)構(gòu)的化合物， 式中虛線表示沒有鍵或有一個(gè)其條件為在式中沒有兩個(gè)相鄰雙鍵的鍵；波紋線附著基表示α(向下)或β(向上)構(gòu)型，在附著于雙鍵的波紋線處它們表示Z(順式)或E(反式)構(gòu)型；影線指示α構(gòu)型，實(shí)心三角形指示β構(gòu)型；m是0至5的整數(shù)；n是1至6的整數(shù)；q和r各自是0至6的整數(shù)；X是CH2、O或S，條件是，當(dāng)X是O或S時(shí)，鄰接于X的虛線表示沒有鍵；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的環(huán)烷基，或者是以一或二個(gè)取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基則選自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6個(gè)碳；R1、R2、R3和R4各自表示氫、1至6碳的直鏈或支鏈烷?；?、苯甲?；?至6碳低級(jí)烷基；R5是氫或1至6碳的直鏈或支鏈烷基；R6是氫、1至4碳的直鏈或支鏈烷基或者是該化合物的藥用鹽，所說的化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的眼具有降低眼內(nèi)壓活性，但不通過FP前列腺素受體發(fā)揮其降眼壓活性。
28.按權(quán)利要求27的治療方法，其中活性化合物具有下式結(jié)構(gòu)
29.按權(quán)利要求28的治療方法，其中活性化合物具有下式結(jié)構(gòu)
30.按權(quán)利要求29的治療方法，其中活性化合物具有下式結(jié)構(gòu)
31.按權(quán)利要求27的治療方法，其中藥物組合物適合于對(duì)眼局部用藥，方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物眼局部地使用該組合物。
32.按權(quán)利要求28的治療方法，其中藥物組合物適合于對(duì)眼局部用藥，方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物眼局部地使用該組合物。
33.按權(quán)利要求29的治療方法，其中藥物組合物適合于對(duì)眼局部用藥，方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物眼局部地使用該組合物。
34.按權(quán)利要求30的治療方法，其中藥物組合物適合于對(duì)眼局部用藥，方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物眼局部地使用該組合物。
全文摘要
式中符號(hào)如說明書中定義的式(1)化合物，用作降眼壓藥，但此類藥不通過FP前列腺素受體發(fā)揮其作用。特別是具有式(I)的PGF
文檔編號(hào)A61K31/557GK1420865SQ01807431
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2001年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日
發(fā)明者D·F·伍德瓦德, H·H·烏桑斯基, S·W·安德魯斯, R·M·博克, J·陳, A·H·P·克勞斯, C·馬胡 申請(qǐng)人:阿勒根公司