專利名稱：崗哨病毒Ⅱ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒領(lǐng)域，且更詳細(xì)地講，涉及肝炎病毒。
背景技術(shù)：
嚴(yán)格定義的術(shù)語“肝炎”表示肝的炎癥。各種各樣不同的化學(xué)因子、病毒因子以及生物學(xué)因子會誘發(fā)肝炎。然而，術(shù)語肝炎更通常地表示由病毒感染、尤其是嗜肝病毒的感染引起的肝的炎癥。
可以將病毒性肝炎分成兩大類別急性的和慢性的。急性病毒性肝炎的特征為黃疸、不適、惡心以及血液中肝臟之酶升高。雖然病毒性肝炎的大多數(shù)病例自發(fā)地消退，但是一部分急性肝炎受害者(一般低于約10％)發(fā)生暴發(fā)性壞死性肝炎，這是一種發(fā)病率和死亡率非常高的病癥。有趣的是，許多急性肝炎病例是如此之輕微，以致于被忽略過去或?qū)⑵渥鳛椤傲鞲小毕Ｂ愿窝滓鸶又卮蟮墓步】祮栴}，且在美國是肝移植的最常見的原因。慢性肝炎的特征為加重或“突然發(fā)作”，伴有類似急性肝炎的癥狀，以及門靜脈血壓過高和導(dǎo)致肝衰竭的肝硬變(肝的瘢痕形成)。因為急性肝炎感染可以不引人注意地進(jìn)行，所以許多慢性肝炎患者直到他們的疾病頗為發(fā)展后才被診斷出來；這樣則限制了治療的選擇。
有六個不同的病毒家族叫做“肝炎病毒”(A、B、C、D、E和G，已發(fā)現(xiàn)F是人工產(chǎn)物(artifactual))。在發(fā)達(dá)國家里，根據(jù)公共衛(wèi)生的觀點(diǎn)，普遍認(rèn)為能建立慢性感染的那些肝炎病毒是最重要的病毒。在所述肝炎病毒中，只有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是已知建立與慢性肝炎有關(guān)之慢性感染的已知肝炎病毒。然而，HBV和HCV并不是造成所有輸血性肝炎病例的原因。用術(shù)語“原因不明性肝炎”和“非A-G”來表示不能歸因于已知肝炎病毒的輸血性肝炎。
先前稱為“輸血性肝炎”的乙型肝炎由經(jīng)皮途徑、性途徑、以及垂直途徑傳播。作為嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)一員的乙型肝炎病毒，既能引起急性肝炎，又能引起慢性肝炎。乙型肝炎病毒(HBV)已被充分表征，且各種各樣的篩選和診斷分析通?？梢缘玫降?。另外，在美國已產(chǎn)生了一種目前大多數(shù)學(xué)齡兒童所需的重組疫苗。
先前稱為“非甲非乙型肝炎”的丙型肝炎主要通過經(jīng)皮途徑傳播，雖然像HBV一樣，也存在性途徑以及垂直途徑傳播。僅有少數(shù)的急性丙型肝炎病毒(HCV)感染是臨床上顯而易見的；這是成問題的，因為這種病毒以非常高的比率建立慢性感染。在美國，這種組合使慢性HCV感染成為肝移植的主要原因。
用于檢測所捐獻(xiàn)血液中抗HBV和/或HCV抗體的篩選分析的出現(xiàn)，顯著地減少了“輸血性肝炎”的傳播。然而，傳染性血液捐贈的20-30％仍處于沒被發(fā)現(xiàn)的狀態(tài)。相信未能檢測出這些傳染性樣品主要是由于存在一種或更多種尚未鑒定出的肝炎病毒。
新近，除了六種已知肝炎病毒外，也鑒定出了與肝炎有關(guān)的新病毒。由日本的一個小組最先鑒定出稱為TTV的病毒；該小組使用表現(xiàn)度差異分析(RAD)技術(shù)鑒定出了得自該病毒的基因組序列(Nishizawa等，1997，Biochem.Biophys.Res.Common，241(1)92-97)。最初被認(rèn)為是細(xì)小病毒科(Parvoviridae)中一員的這種病毒，是一種浮力密度大大低于細(xì)小病毒科之病毒浮力密度的相對小的病毒。由于TTV的環(huán)狀單鏈DNA基因組，已提出TTV為稱為環(huán)狀病毒科(Circinoviridae)的病毒科中與人相關(guān)的原型成員(Mushahwar等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(6)3177-3182)。
近來，Diasorin，Inc.已宣布分離出了一種新的肝炎病毒。過后，發(fā)現(xiàn)稱為SEN-V的該病毒在健康群體中非常流行，并不限于來自肝炎患者的血液樣品；因而不大可能是一種肝炎病毒。他們既未公開SEN-V的多核苷酸序列，又未公開分離SEN-V的方法。
因此，在本技術(shù)領(lǐng)域，不僅需要用于檢測非甲/非庚型肝炎的組合物和方法，而且需要用于預(yù)防非甲/非庚型肝炎傳染的組合物和方法以及治療非甲/非庚型肝炎感染的組合物和方法。
發(fā)明的公開我們發(fā)現(xiàn)了一種與原因不明性非甲/非庚型肝炎有關(guān)的新病毒。已從中衍生出各種各樣有價值的發(fā)明，所述發(fā)明提供例如1)包含分離的SVII病毒的組合物。分離的SVII病毒的實例包括包含

圖1的多核苷酸序列的分離的病毒。
2)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包括可選擇性地與圖1的核苷酸序列及其互補(bǔ)鏈雜交的分離的多核苷酸；編碼分離的SVII蛋白或其片段的分離的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈。所述分離的多核苷酸可以是一種反義多核苷酸。
3)包含一種分離的SVII蛋白或其片段的組合物。
4)包含一種分離的SVII蛋白或其片段的疫苗組合物。所述疫苗組合物可包括一種藥學(xué)可接受的賦形劑和/或一種佐劑。
5)包含一種編碼一種SVII蛋白或其片段之分離的多核苷酸的表達(dá)載體。
6)包含一種分離的多核苷酸的表達(dá)載體；其中，所述分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致一種SVII反義多核苷酸的產(chǎn)生。
7)與一種SVII病毒或其蛋白結(jié)合的分離的多克隆抗體和單克隆抗體。
8)用于檢測SVII病毒的方法，所述方法包括使樣品與一種與SVII病毒或其一種蛋白結(jié)合的抗體接觸，以及檢測所述抗體與SVII病毒或其蛋白之復(fù)合物。
9)用于檢測SVII病毒的方法，所述方法包括使樣品與一種選擇性地同SVII多核苷酸雜交的探針多核苷酸接觸，以及檢測所述探針與SVII多核苷酸的雜交。
10)用于檢測SVII病毒的方法，所述方法包括使樣品與一種選擇性地和SVII多核苷酸雜交的第一引物多核苷酸及一種和SVII多核苷酸互補(bǔ)物雜交的第二引物多核苷酸相接觸，從而進(jìn)行引物延伸的DNA合成；以及檢測所述合成產(chǎn)物。
附圖簡述圖1顯示了來自一個崗哨病毒(Sentinel Virus)II(SVII)克隆的核苷酸序列以及概念上的可讀框的翻譯(使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母編碼；k、m、r、s、y和w相應(yīng)地各表示T/G、A/C、G/A、G/C、T/C、A/T)。把稱為“正的”鏈注上標(biāo)記“+”，且把其相反的互補(bǔ)物注上標(biāo)記“-”。編號是指+鏈的核苷酸序列。也顯示了可讀框P1、M1和M2。從右到左地讀-鏈和M1及M2的閱讀框架。
發(fā)明詳述我們發(fā)現(xiàn)并分離了與原因不明性非甲-庚型肝炎有關(guān)的一種新的肝炎病毒，稱之為崗哨病毒II(SVII)。所述原型病毒包括一個至少約371個堿基的DNA基因組。在圖1中顯示了來自所述原型病毒的基因組序列。相應(yīng)地，本發(fā)明提供分離的SVII。
在一個方面，本發(fā)明提供分離的、包含SVII病毒基因組及其片段的多核苷酸。所述多核苷酸可以是DNA或RNA。也提供供檢測SVII感染和/或SVII病毒本身之用的分離的核苷酸探針或引物。同樣可以將所述探針和/或引物用于鑒定與分離SVII新變異體的方法中。
本發(fā)明的另一方面提供分離的SVII病毒蛋白及/或其片段以及包含與異源(非SVII)蛋白融合的SVII病毒蛋白或其片段的融合蛋白。也包括至少包含兩個SVII表位的嵌合多肽。在包含來自同一SVII蛋白的兩個表位的本發(fā)明嵌合多肽中，使在所述表位之間插入的氨基酸基本上缺失，或用異源序列取代。另一方面，本發(fā)明嵌合多肽可包含來自不同SVII蛋白的兩個表位，或包含來自SVII家族的至少兩種病毒的同源表位。
本發(fā)明提供重組表達(dá)構(gòu)成物，所述構(gòu)成物包含與在原核或真核宿主細(xì)胞中可操縱的啟動子可操作地連接的、來源于SVII病毒可讀框的多核苷酸序列。也提供表達(dá)載體及包含所述表達(dá)構(gòu)成物的重組宿主細(xì)胞。
也提供對SVII病毒家族之表位特異性的抗體。包括單克隆抗體和分離的多克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測SVII感染和/或檢測SVII病毒的測定和用于進(jìn)行所述測定的試劑盒。本發(fā)明的測定可以是使用本發(fā)明多肽或抗體的免疫測定，或者是基于核酸的、用一種或更多種本發(fā)明多核苷酸而使用雜交或擴(kuò)增技術(shù)的測定。
在另外一個方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防和/或治療SVII感染的疫苗。所述疫苗可以是基于蛋白的疫苗，或者可以是基于DNA的疫苗。基于蛋白的疫苗包含一種或更多種來源于SVII的多肽，可任意選擇地將其與一種佐劑組合?；贒NA的疫苗包含一種編碼SVII多肽或多肽片段的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與在待接種受體體內(nèi)有活性(例如如果待接種的受體是人類，則在人類細(xì)胞中有活性)的啟動子可操作地連接。一般性的技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)；所述常規(guī)技術(shù)是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。在下述文獻(xiàn)中全面說明了這樣的技術(shù)，所述著作例如“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版(Sambrook等，1989)、“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait編輯，1984)、“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney編輯，1987)、“Methods inEnzymology”(Academic Press，Inc.)、“Handbook of ExperimentalImmunology”(D.M.Weir&C.C.Blackwell編輯)、“Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cell”(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)、“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等編輯，1987，和周期性更新材料)、“PCRThe Polymerase Chain Reaction”(Mullis等編輯，1994)、“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan等編輯，1991，和周期性更新材料)以及“Immunochemistry in Practice”(Johnstone和Thorpe編輯，1996，Blackwell Science)。定義術(shù)語“崗哨病毒II”和“SVII”是指在人類中可通過經(jīng)皮膚暴露而傳播且在血清學(xué)上與甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)以及庚型肝炎病毒(HGV)截然不同的病毒、病毒類型或病毒類別。SVII包括一個具有主要可讀框(ORF)的基因組，所述可讀框與圖1的氨基酸序列有至少大約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同源性和/或與圖1的氨基酸序列有至少約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的核苷酸全序列同一性。另一方面，“SVII變異體”可以與圖1的序列有至少大約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的核苷酸全序列同一性，并編碼一個與圖1的氨基酸序列有至少約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同源性和/或至少約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同一性的ORF。
“SVII多肽”或“SVII蛋白”是由SVII病毒基因組的ORF編碼的一種多肽。典型的SVII多肽顯示于圖1所示的氨基酸序列。SVII多肽最好是至少約8、10、12、15、20、25、30、40或50個氨基酸，且可以少于約250、200、150、134、125、110、100、90、80、70、60或50個氨基酸；其中，除了上限始終是大于下限之外，獨(dú)立地選擇上限和下限。
“變異型SVII多肽”是一種與圖1中任一相應(yīng)氨基酸序列具有至少約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同源性和/或與圖1中任一氨基酸序列的相應(yīng)部分有至少約40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的多肽。變異型SVII多肽最好是至少約8、10、12、15、20、25、30、40或50個氨基酸且可以少于約250、200、150、134、125、110、100、90、80、70、60或50個氨基酸；其中，除了上限始終是大于下限之外，獨(dú)立地選擇上限和下限。
“SVII多核苷酸”是一種與圖1中所示多核苷酸或其片段具有等同序列的多核苷酸或其互補(bǔ)物，或者是一種編碼SVII多肽的多核苷酸或其互補(bǔ)物。SVII多核苷酸的長度最好是至少約15、20、25、30、35、40、50或60個核苷酸且少于約371、350、300、250、200、150、125、75、50、40或30個核苷酸；其中，除了上限始終是大于下限之外，獨(dú)立地選擇上限和下限。所關(guān)注的多核苷酸的“互補(bǔ)物”是一種根據(jù)Watson/Crick堿基配對而具有所述參比多核苷酸的反相互補(bǔ)性的多核苷酸。在合適條件下，運(yùn)用Watson/Crick堿基配對，互補(bǔ)的多核苷酸能夠雜交到所述參比多核苷酸上。
“變異型SVII多核苷酸”是一種編碼變異型SVII多肽的多核苷酸或其互補(bǔ)物；或者是一種可選擇性地與SVII多核苷酸或其互補(bǔ)物雜交、但不落入SVII多核苷酸定義范圍內(nèi)的多核苷酸。在任何已知的序列中，都未發(fā)現(xiàn)變異型SVII多核苷酸。變異型SVII多核苷酸的長度最好是至少約15、20、25、30、35、40、50或60個核苷酸且少于約400、370、367、350、300、200、150、125、100、75或50個核苷酸；其中，除了上限始終是大于下限之外，獨(dú)立地選擇上限和下限。
“氨基酸序列同源性”和“氨基酸序列同一性”是指在比較兩種序列時同源或相同的氨基酸的百分?jǐn)?shù)。運(yùn)用本技術(shù)領(lǐng)域已知的軟件程序，可確定這種序列比對以及序列同源性或序列同一性的百分?jǐn)?shù)，所述軟件程序例如在Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編輯，1987)附錄30的7.7.18節(jié)之表7.7.1中描述的那些程序。至于序列比對，最好用缺省參數(shù)。對本發(fā)明來說，所述序列比對程序為BLASTP，使用下面的缺省參數(shù)數(shù)據(jù)庫(databases)＝非冗余的(non-redundant)(非冗余GenBank CDS翻譯(all non-redundant GenBankCDS translations)+PDB+SwissProt+PIR+PRE)，低復(fù)雜性過濾(lowcomplexity filtering)＝ON，預(yù)期值(expect)＝10，矩陣(matrix)＝BLOSUM62(空位存在罰分(gap existence cost)11，每殘基空位(gap perresidue)為1，λ0.85)且字串大小(word size)＝3?？梢肟瘴换虿灰肟瘴坏剡M(jìn)行序列比對，且優(yōu)選引入空位進(jìn)行序列比對。按下面的因特(Internet)網(wǎng)網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST，可得到以上所述BLASTP執(zhí)行程序和這些參數(shù)的詳情。
“核苷酸序列同一性”表示在比較兩種序列時相同核苷酸殘基的百分?jǐn)?shù)。運(yùn)用本技術(shù)領(lǐng)域已知的軟件程序，可確定這種序列比對以及序列同一性的百分?jǐn)?shù)，所述軟件程序例如在Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等編輯，1987)附錄30的7.7.18節(jié)之表7.7.1中描述的那些程序。至于序列比對，最好用缺省參數(shù)。對本發(fā)明來說，所述序列比對程序為BLASTN，使用下面的缺省參數(shù)數(shù)據(jù)庫＝非冗余的(全部非冗余的GenBank(all non-redundant GenBank)+EMBL+DDBJ+PDB序列)，低復(fù)雜性過濾＝ON，預(yù)期值＝10，矩陣＝BLOSUM62，空位存在罰分＝5，空位擴(kuò)展罰分＝2，錯配處罰(mismatch penalty)＝-3，匹配獎分＝1，且字串大?。?1?？梢肟瘴换虿灰肟瘴坏剡M(jìn)行序列比對，且優(yōu)選引入空位進(jìn)行序列比對。按下面的因特(Intetnet)網(wǎng)網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST，可得到以上所述BLASTN執(zhí)行程序和這些參數(shù)的詳情。
與SVII多核苷酸序列“可選擇性地雜交”的多核苷酸是(i)一種與SVII多核苷酸序列雜交而不與已知病毒多核苷酸序列雜交的多核苷酸；或者是一種特異性地引發(fā)SVII多核苷酸序列擴(kuò)增而不引發(fā)已知病毒多核苷酸序列擴(kuò)增的多核苷酸。可以適當(dāng)?shù)卦诟叨葒?yán)格、中等嚴(yán)格或低度嚴(yán)格(例如考慮到錯配)的條件下，完成可選擇性雜交多核苷酸的雜交。高度嚴(yán)格條件利用一種決定性的、低于所期望雜合體的Tm12-20℃的洗滌，而中等嚴(yán)格雜交和低度嚴(yán)格雜交利用決定性的、低于所述雜合體的Tm21-30℃和31-40℃的洗滌條件。按照Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/N，可以得到長鏈多核苷酸的Tm，這里N＝所研究的可選擇性雜交的多核苷酸的長度；而按照Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-600/N，可以得到長度大約從70個核苷酸至15個核苷酸的寡核苷酸的Tm；按照Tm＝2(A+T)+4(G+C)，可以得到≤14個核苷酸的短寡核苷酸的Tm。最好在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(例如50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3(在20℃)，1.5mM MgCl2，可任意選擇地用0.01％的明膠)和水生棲熱菌(T.aquaticus)DNA聚合酶的一種修飾形式-AmpliTaq GoldTM(PEBiosystems)的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增的引發(fā)。
“分離的”病毒、病毒結(jié)構(gòu)(例如殼體)、多核苷酸或多肽是至少已部分純化而去掉了在其正常環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的污染成分的病毒、病毒結(jié)構(gòu)(例如殼體)、多核苷酸或多肽。例如，分離的病毒是一種至少已部分純化而去掉血液、血清或組織蛋白的病毒。在分離的病毒多核苷酸的情況下，該多核苷酸至少是部分純化而去掉病毒蛋白和/或其它病毒組分的，且另外可以從其正常環(huán)境中取出(例如，可以缺失掉正常位于該多核苷酸兩側(cè)的核苷酸序列)。
當(dāng)用于本文時，當(dāng)以這樣一種方式共價連接所關(guān)注序列和調(diào)節(jié)序列、以致設(shè)置所關(guān)注序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄在調(diào)節(jié)序列影響或控制之下時；則說所關(guān)注序列和調(diào)節(jié)序列是“可操作地連接的”。術(shù)語“可操作地連接的”涉及有功能聯(lián)系的多核苷酸元件的定向?？刹僮鞯剡B接的意味著被連接的DNA序列通常是物理上鄰近的；且在必需連接兩個蛋白編碼區(qū)時，所述DNA序列是鄰近的，并在同一閱讀框內(nèi)。然而，由于增強(qiáng)子通常當(dāng)與啟動子隔開幾千堿基時起作用，而內(nèi)含子序列可以具有可變的長度；所以，某些多核苷酸元件可以是可操作地連接的，但并不是鄰近的。如果希望將所關(guān)注的序列翻譯成功能蛋白，那么，如果誘導(dǎo)5’端調(diào)節(jié)序列中的啟動子導(dǎo)致所關(guān)注序列的轉(zhuǎn)錄，且如果在兩種DNA序列之間鍵合的性質(zhì)(1)不導(dǎo)致移碼突變的引入、(2)不干擾啟動子區(qū)域指導(dǎo)所關(guān)注序列轉(zhuǎn)錄的能力、或者(3)不干擾相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物被翻譯成蛋白的能力；則說兩種DNA序列是可操作地連接的。因此，如果啟動子區(qū)域能夠影響所關(guān)注序列的轉(zhuǎn)錄，以致于可以將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物翻譯成所需蛋白或多肽；則該啟動子區(qū)域與所述DNA序列則是可操作地連接的。應(yīng)該注意術(shù)語“可操作地連接的”包括這樣的可操作連接，在所述這樣的可操作連接中，最終的蛋白編碼區(qū)需要移碼或剪接，來保持合適的、通過該蛋白整個編碼區(qū)的閱讀框架(例如在某些逆轉(zhuǎn)病毒系統(tǒng)中所看到的)。
當(dāng)用于本文時，術(shù)語“抗體”是指具有特異性地結(jié)合特定抗原能力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。對于免疫學(xué)學(xué)科領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，抗體是眾所周知的。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“抗體”不僅意指完整的抗體分子，而且意指保留了抗原結(jié)合能力的抗體分子片段。這樣的片段也是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，且在體外和體內(nèi)都是經(jīng)常使用的。具體地說，當(dāng)用于本文時，術(shù)語“抗體”不僅意指任何同種型的完整免疫球蛋白分子(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)，而且意指眾所周知的活性(即抗原結(jié)合)片段F(ab)2、Fab、Fv、scFv、Fd、VH和VL。關(guān)于抗體片段，參見例如“Immunochemistry in Practice”(Johnstone和Thorpe編輯，1996，Blackwell Science)，第69頁。所述術(shù)語的“抗體”另外包括單鏈抗體、CDR移植抗體、雙抗體(diabodies)、嵌合抗體、人源化抗體以及Fab表達(dá)文庫。該術(shù)語也包括包含本發(fā)明抗體與另一種多肽或多肽之一部分(“融合配偶體”)的融合多肽。融合配偶體的實例包括生物學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)物、淋巴因子、細(xì)胞因子以及細(xì)胞表面抗原?！翱贵w活性”表示抗體通過位于免疫球蛋白可變區(qū)內(nèi)的抗原結(jié)合位點(diǎn)而優(yōu)先于其它潛在抗原地結(jié)合特定抗原的能力。術(shù)語“血清學(xué)上不同的”描述可借助于多肽、蛋白或病毒與其它種類多肽、蛋白或病毒的抗原差異而用特異性抗體經(jīng)免疫學(xué)鑒定的與這類其它種類不同的多肽、蛋白或病毒。
當(dāng)用于本文時，術(shù)語“包含(comprising)”及其同詞源的詞按其包括在內(nèi)的意思使用，即，等同于術(shù)語“包括(including)”及其相應(yīng)的同詞源的詞。分離的SVII病毒最好由來源于受SVII感染的個體的血漿或血清，制備分離的SVII?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)，從血漿或血清中分離出SVII病毒；所述任何技術(shù)包括但不限于沉淀、等密度梯度離心尤其是制備規(guī)模的等密度梯度離心、以及免疫分離。
可以用本領(lǐng)域已知的沉淀技術(shù)(例如超速離心)來分離SVII病毒顆粒。處理含有SVII病毒的材料而除去大量的碎片和任何細(xì)胞(例如通過過濾或中/高速離心)，然后將其超速離心，從而沉淀SVII病毒。最好是在沉淀該病毒之前，稀釋含有SVII病毒的材料，例如用tris緩沖鹽溶液或用含有EDTA的tris緩沖鹽溶液來稀釋。例如，通過以200,000×g離心18小時(例如，在一個SW41Ti轉(zhuǎn)頭中以200,000×g離心，用TEN緩沖液稀釋包含SVII的血清)，可以沉淀SVII病毒。
根據(jù)等密度梯度離心的SVII的分析表明當(dāng)用蔗糖密度梯度測定時，SVII具有～1.26g/cm3的密度；而在CsCl梯度時，SVII具有～1.26-1.28g/cm3的密度。可以用本技術(shù)領(lǐng)域已知的、將形成一種合適梯度的任何形成梯度之化合物，最好是用一種將形成每立方厘米約1.2-1.35克(g/cm3)之梯度的形成梯度的化合物，來進(jìn)行等密度梯度離心；蔗糖和氯化銫(CsCl)是優(yōu)選的形成梯度的化合物。在一個合適的離心管中，于蔗糖梯度上，將含有SVII的血漿或血清鋪成一層；或者，作為CsCl中的均相混合物，將含有SVII的血漿或血清引入到一個合適的離心管中；然后，將其離心至平衡。通過收集該梯度的合適密度之級分，可以回收分離的SVII病毒。
免疫分離技術(shù)利用與本技術(shù)領(lǐng)域已知的、任何合適的分離介質(zhì)結(jié)合的SVII特異性抗體。優(yōu)選的分離介質(zhì)包括固體塑料基質(zhì)(例如在用于淘選)、層析介質(zhì)(例如免疫親和層析)以及磁性顆粒(例如免疫磁性分離)。將SVII抗體綴合到分離介質(zhì)上，使所述介質(zhì)接觸含有SVII病毒的材料中。除去未結(jié)合的材料，且從免疫分離基質(zhì)上洗掉殘留的未結(jié)合材料；然后，一般通過用一種pH變化的或具有高鹽濃度的洗脫緩沖液，來洗脫結(jié)合的SVII。
另一方面，用體外培養(yǎng)方法，可制備分離的SVII病毒。各種各樣這樣的方法是本技術(shù)領(lǐng)域已知的，且通常包括用SVII感染一種合適宿主細(xì)胞，最好是一種肝細(xì)胞系；培養(yǎng)所述受感染的細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中收集SVII病毒顆粒、或通過裂解所述細(xì)胞而收集SVII病毒顆粒?？墒褂妹芏忍荻确蛛x或免疫分離技術(shù)，以進(jìn)一步分離該病毒。分離的SVII多核苷酸用任一種本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，例如，通過由病毒粒子直接分離出病毒DNA，通過直接分離作為SVII生活周期一部分的、轉(zhuǎn)錄的病毒RNA，通過使用雜交方法(即鑒定由病毒DNA、或包含病毒的血漿或血清制備的DNA文庫中的病毒DNA)，通過使用擴(kuò)增方法(即病毒DNA、包含病毒DNA的文庫、或由血漿或血清分離的DNA之聚合酶鏈反應(yīng))，或通過直接合成；可制備分離的SVII多核苷酸。可以用圖1中所示的多核苷酸序列，來設(shè)計用于雜交方法和擴(kuò)增方法的探針或引物，以及來選擇用于合成的序列。所挑選的探針或引物最好是獨(dú)特的(例如，不是在GenBank中或在其它序列數(shù)據(jù)庫中找到的)。
通過分離出的病毒粒子的提取，可制備分離的基因組多核苷酸?？梢允狗蛛x出的病毒粒子經(jīng)受本技術(shù)領(lǐng)域已知的、DNA提取的任何操作，例如鹽酸胍抽提；可任意選擇地繼之以進(jìn)一步的純化操作和/或濃縮操作，例如瓊脂糖凝膠純化，苯酚/氯仿抽提，或在有鹽情況下的乙醇沉淀。
DNA文庫的制備是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的。用本領(lǐng)域通常使用的技術(shù)，可以把從病毒粒子、或包含病毒的血漿或血清中分離出的DNA克隆到方便的文庫載體之中。雖然通常也使用粘粒文庫和質(zhì)粒文庫，但最常用基于λ噬菌體的文庫載體來構(gòu)建所述文庫。通過感染大腸桿菌宿主細(xì)胞的“菌苔”，平板接種基于噬菌體的文庫；而粘粒文庫和質(zhì)粒文庫一般被轉(zhuǎn)化到鋪平板的細(xì)胞中。在鋪平板之后，把來自所述文庫的DNA轉(zhuǎn)移到篩選濾膜上；并用SVII多核苷酸探針來篩選。雖然通過使用一種結(jié)合所標(biāo)記探針且作用于產(chǎn)色底物或別樣的可檢測底物的修飾酶(例如堿性磷酸酶或熒光素酶)，可檢測其它修飾的探針(例如地高辛配基或生物素標(biāo)記的)；但最好修飾所述的探針，一般通過摻入一種放射性核苷酸(例如32P)來修飾所述的探針，以致于能檢測雜交。通過一“輪”或更多“輪”的純化(例如，用逐漸更加純化的克隆，來重復(fù)鋪平板和篩選步驟)，來純化與SVII多核苷酸探針雜交的克??；這一點(diǎn)在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的。通過從篩選步驟里分離的克隆中收獲DNA，可制備SVII DNA；且可任意選擇地通過限制性內(nèi)切酶消化，而進(jìn)一步從所述文庫載體DNA中分離出SVII DNA。另一方面，可以將通過篩選分離的克隆DNA用作底物，以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增SVII病毒DNA。可以根據(jù)SVII病毒DNA來設(shè)計PCR引物，或者更方便地，可設(shè)計雜交到該文庫載體中位于插入文庫DNA之位點(diǎn)兩側(cè)的DNA序列上的PCR引物；對于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，這一點(diǎn)將是顯而易見的。
由含有SVII DNA的樣品通過擴(kuò)增，也可以分離SVII病毒多核苷酸?？苫趫D1中所示的序列，設(shè)計用于擴(kuò)增的引物；且優(yōu)選設(shè)計用于擴(kuò)增的引物，以便擴(kuò)增SVII DNA，而不擴(kuò)增來自其它病毒的病毒DNA或者來自動物或原核生物的基因組DNA。另外，正如本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，選擇引物序列以使分子內(nèi)任何二級結(jié)構(gòu)成最??；所述二級結(jié)構(gòu)大大抑制擴(kuò)增，甚至可以阻止擴(kuò)增。用于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的方案是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，用于其它擴(kuò)增方法例如連接酶鏈反應(yīng)的方案也是眾所周知的。擴(kuò)增后，可以通過大小選擇(例如凝膠電泳)或化學(xué)抽提(例如苯酚/氯仿抽提)來進(jìn)一步純化所述的SVII DNA和/或通過在有鹽情況下的乙醇沉淀，來濃縮SVII DNA。
也可以化學(xué)合成SVII多核苷酸；盡管合成的SVII多核苷酸的長度最好小于約50-60個核苷酸，因為當(dāng)鏈長增加時，多核苷酸合成的產(chǎn)率下降。用于合成多核苷酸的方法是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，且通常涉及將核苷酸(或修飾的核苷酸)反復(fù)地添加到合成的多核苷酸的生長端。各種各樣的不同系統(tǒng)在本技術(shù)領(lǐng)域中是可得到的，且把特定方法及化學(xué)的選擇交給本領(lǐng)域的專業(yè)人員。
SVII多核苷酸有各種各樣的用途，所述用途包括檢測SVII病毒(這在診斷SVII感染方面是有用的)，生產(chǎn)SVII多肽，構(gòu)建基于SVII的表達(dá)/轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，以及作為反義寡核苷酸或用于構(gòu)建反義SVII載體。
反義SVII多核苷酸是能夠與由SVII基因組產(chǎn)生的mRNA分子片段選擇性雜交的SVII多核苷酸。反義SVII多核苷酸可以是任何大小的SVII多核苷酸，但最好是長度小于約200個核苷酸的。在SVII感染的細(xì)胞中，反義SVII多核苷酸阻止SVII蛋白的表達(dá)和/或SVII病毒的復(fù)制。因此，可以用反義SVII多核苷酸來治療SVII感染并/或減輕SVII感染的癥狀，包括減弱SVII病毒血癥。
如果化學(xué)合成SVII反義多核苷酸，則最好將其合成為修飾的寡核苷酸，以增加對核酸酶的抗性?？梢院铣稍?’末端和3’末端包含亞磷酰胺(phosphoroamidites)的修飾的寡核苷酸(Dagle等，1990，Nucl.AcidsRes.184751-4757)，以引入在第4,469,863號美國專利中公開的膦酸乙酯類似物或膦酸甲酯類似物，引入硫代磷酸酯(Stein等，1988，Nucl.Acids Res.163209-3221)或2’-O-甲基核糖核苷酸(Inove等，1987，Nucl.Acids Res.156131)，或作為復(fù)合RNA-DNA類似物的嵌合寡核苷酸(Inove等，1987，F(xiàn)EBS Lett.215327)。
可以將反義SVII多核苷酸以“裸DNA”形式傳遞到SVII病毒感染的個體中，通常通過非腸道注射，優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射或引入到門靜脈中，從而利用天然發(fā)生的寡核苷酸的吸收。另一方面，可以借助于載體，例如一種病毒載體，將反義SVII多核苷酸引入到靶細(xì)胞中。該載體包括一個與一段多核苷酸序列可操作地連接、在用SVII病毒感染的宿主細(xì)胞且最好在人宿主細(xì)胞中可操作的啟動子，所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致SVII反義多核苷酸的產(chǎn)生。優(yōu)選的病毒載體包括但不限于本技術(shù)領(lǐng)域已知的腺伴隨病毒載體。優(yōu)選靜脈內(nèi)給予由病毒載體傳遞的SVII反義多核苷酸，且最好給予到門靜脈。分離的SVII多肽SVII蛋白可包括來自SVII病毒的完整ORF、一種或更多種來自SVII病毒的融合蛋白、來自SVII病毒的單一蛋白、或其片段。也包括在同一蛋白內(nèi)包含兩個或更多個SVII蛋白片段的“嵌合蛋白”。嵌合蛋白中的SVII蛋白片段可以來自同一SVII蛋白、或來自不同的SVII蛋白。在所述SVII蛋白片段來自同一SVII蛋白時，使正常分開所述片段的氨基酸序列大大缺失，或用一種不相關(guān)的“間隔區(qū)”序列取代。本發(fā)明包括的另一種嵌合蛋白是一種包含來自至少兩種不同SVII病毒的至少一類表位之同源形式的“超表位”嵌合蛋白。例如，在篩選分析中，可以使用超表位嵌合蛋白，從而在種屬上檢測SVII病毒感染。
可以用本技術(shù)領(lǐng)域已知的任一方法來制備SVII多肽；所述方法包括由分離的病毒粒子純化、重組生產(chǎn)以及化學(xué)合成。因為由天然來源分離出大量病毒粒子相對困難，因而重組生產(chǎn)和/或化學(xué)合成是用于生產(chǎn)的優(yōu)選方法。
蛋白的重組生產(chǎn)是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的。通常，將編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸序列克隆到一種“表達(dá)載體”中，然后將所述表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中。在適合于表達(dá)該蛋白的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；并收集重組蛋白。雖然表達(dá)構(gòu)成物通常將包含在宿主細(xì)胞中可操作的啟動子/操縱基因或啟動子/增強(qiáng)子、以及一種選擇性標(biāo)記，從而使包含該標(biāo)記的細(xì)胞的選擇能進(jìn)行；但所述表達(dá)構(gòu)成物的確切詳情將根據(jù)所需宿主和表達(dá)構(gòu)成物的性質(zhì)而變化；對于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，這一點(diǎn)將是顯而易見的。優(yōu)選啟動子/操縱基因或啟動子/增強(qiáng)子是“可控制的”，因為培養(yǎng)條件的變化將導(dǎo)致所述SVII蛋白(或SVII蛋白的融合蛋白)的表達(dá)。
應(yīng)該注意為了重組生產(chǎn)，可以使SVII肽結(jié)合成“融合蛋白”。融合蛋白包含一種連接于一種融合配偶體的關(guān)注蛋白(例如SVII蛋白)，且可任意選擇地在該關(guān)注蛋白和融合配偶體之間包括一個特異性切割位點(diǎn)，從而使這兩部分能分開。該融合配偶體可以在該蛋白的氨基末端或羧基末端，盡管也考慮了作為編碼區(qū)序列內(nèi)的“插入片段”而引入該關(guān)注蛋白的融合蛋白。作為篩選工具，包含一種SVII蛋白插入片段的融合蛋白可能是特別有用的，例如，當(dāng)引入到“噬菌體展示”系統(tǒng)時(例如在將該SVII蛋白序列插入到λ噬菌體外殼蛋白的情況下)。
有用的融合配偶體包括便于融合蛋白的簡易純化的蛋白(例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、寡聚組氨酸和某些來源于myc癌基因的序列)、增加融合蛋白的溶解度的蛋白(例如大腸桿菌的DsbA，公開于5,629,172號美國專利)、或形成一種使該蛋白結(jié)合到一種基質(zhì)上的“接頭”的蛋白(例如，可以用具有一個末端賴氨酸的聚甘氨酸，將一種SVII蛋白連接到基質(zhì)上，供免疫分析之用)。
通常，通過使用合適的限制性內(nèi)切酶，將編碼本發(fā)明一種蛋白的多核苷酸插入到一種合適的重組DNA表達(dá)載體中，而構(gòu)建表達(dá)構(gòu)成物。限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)可以是天然存在的或是用本技術(shù)領(lǐng)域已知的任一方法引入的合成的位點(diǎn)；所述方法例如定點(diǎn)誘變、PCR或?qū)⒔宇^/連接物連接到所述多核苷酸上。另一方面，該多核苷酸可以是一段被設(shè)計成含有方便的限制性酶位點(diǎn)和/或針對所預(yù)期的宿主細(xì)胞優(yōu)化密碼子選擇的合成序列。所使用的親代表達(dá)載體的限制性酶的切割模式將決定所用的特定內(nèi)切酶。進(jìn)行限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的選擇，以便使編碼序列和控制序列正確地定向，從而完成所述蛋白正確的符合讀框地閱讀及表達(dá)。
可以將所述多核苷酸插入到任一合適的表達(dá)載體中?？梢缘玫饺舾尚问降谋磉_(dá)載體，包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體(YAC)以及病毒載體。通常，表達(dá)載體會包含一個至少在繁殖該載體的生物中有活性且常常也在重組宿主細(xì)胞中有活性的自主復(fù)制位點(diǎn)。該表達(dá)載體一般也會包含在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中能夠提供表型選擇的標(biāo)記序列，例如，諸如抗生素抗性基因(例如bla、tetR、neoR或hygR)或補(bǔ)充輔源營養(yǎng)的基因(例如trp或DHFR)之類的正選擇標(biāo)記和/或諸如單純皰疹病毒1型的胸苷激酶之類的負(fù)選擇標(biāo)記。該表達(dá)載體同樣會包括起始與終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需序列(例如，啟動子、Shine-Dalgarno序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn))，并可任意選擇地包含調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列(例如，SV40增強(qiáng)子或lac阻抑物)，且在必需時，同樣可包含指導(dǎo)加工的序列，例如一種內(nèi)含子或聚腺苷酸化位點(diǎn)。
以正確的定向且按照與表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄及翻譯控制序列的正確關(guān)系，將本發(fā)明的多核苷酸插入到表達(dá)載體中，從而提供從啟動子起的轉(zhuǎn)錄和從核糖體結(jié)合位點(diǎn)起的翻譯；在所述蛋白將被表達(dá)的宿主細(xì)胞中，它們兩者應(yīng)該是起作用的。所述轉(zhuǎn)錄控制序列最好是誘導(dǎo)型的(即通過改變培養(yǎng)條件，可調(diào)節(jié)它們；所述轉(zhuǎn)錄控制序列例如大腸桿菌的lac操縱子或用于哺乳動物細(xì)胞的金屬硫蛋白啟動子)。這樣的一種表達(dá)載體的實例是在Belagaje等的5,304,493號美國專利中描述的一種質(zhì)粒。用限制酶NdeI和BamHI，可以從質(zhì)粒pRB182中除去在參考文獻(xiàn)中描述的編碼A-C-B胰島素原的基因。可以將編碼本發(fā)明蛋白的基因在NdeI/BamHI限制性片段盒中插入到該質(zhì)粒的骨架里。
對于本發(fā)明蛋白的重組表達(dá)，一般優(yōu)選微生物宿主；且可以使用通常所用的任何微生物宿主，包括例如W3110(原養(yǎng)型，ATCC 27325號)的大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、以及諸如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)之類的腸桿菌科之其它種和各種假單胞桿菌屬之種。另一方面，可以使用真核宿主細(xì)胞；所述真核宿主細(xì)胞不僅包括酵母例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，而且包括較高等真核生物，例如非酵母真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如Sf9)和哺乳動物細(xì)胞(例如COS、CHO)。
用本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何合適的方法，將完成了的表達(dá)構(gòu)成物引入到重組宿主細(xì)胞中；所述方法例如CaCl2轉(zhuǎn)染、Ca2PO4轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因槍轉(zhuǎn)染等等。在引入表達(dá)構(gòu)成物后，通常在可根據(jù)表達(dá)構(gòu)成物的存在進(jìn)行選擇的合適條件下(例如，對具有包含bla的表達(dá)構(gòu)成物的細(xì)菌宿主，在存在氨芐青霉素的情況下進(jìn)行培養(yǎng))，培養(yǎng)重組的宿主細(xì)胞；或者，可以根據(jù)所述蛋白的表達(dá)而用任何合適的方法(例如，熒光激活細(xì)胞分類術(shù)，F(xiàn)ACS；使用SVII蛋白特異性的抗體)來選擇重組的宿主細(xì)胞。
在選擇以及合適的分離步驟(例如重劃線分離或有限稀釋克隆)之后，使用本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)，以生產(chǎn)規(guī)模培養(yǎng)重組的宿主細(xì)胞(所述生產(chǎn)規(guī)模對于微生物宿主細(xì)胞可以從500ml的搖瓶到幾百升級的發(fā)酵罐，或者，對于哺乳動物宿主細(xì)胞可以從T25燒瓶直到幾百升級的生物反應(yīng)器；這取決于所述專業(yè)人員的要求)。如果在表達(dá)載體中的啟動子/增強(qiáng)子是誘導(dǎo)型的，則在培養(yǎng)物達(dá)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，根據(jù)特定的構(gòu)成物適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)所述蛋白的表達(dá)(例如，通過添加一種誘導(dǎo)物，或通過使一種阻抑物從該培養(yǎng)基中除去)；否則，使所述細(xì)胞生長，直到它們達(dá)到供收獲的適當(dāng)密度為止。本發(fā)明重組蛋白的收獲將取決于重組的宿主細(xì)胞、表達(dá)構(gòu)成物以及編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸的確切性質(zhì)；對于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，這一點(diǎn)將是顯而易見的。至于產(chǎn)生分泌型蛋白的表達(dá)構(gòu)成物，一般通過從培養(yǎng)容器中取出培養(yǎng)基而回收該蛋白；而引起細(xì)胞內(nèi)蛋白累積的表達(dá)構(gòu)成物，則通常需要回收及裂解所述的細(xì)胞，從而釋放出所述已表達(dá)蛋白。
用高水平細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白以包含高水平的超量表達(dá)的該蛋白的微?；虬w形式特征性地聚集。溶解該蛋白聚集物，從而達(dá)到所需蛋白產(chǎn)物的進(jìn)一步純化與分離；例如，使用例如鹽酸胍的強(qiáng)變性溶液，或許配合還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)。在“重折疊”反應(yīng)后，回收活性形式的所述溶解的蛋白；在所述“重折疊”反應(yīng)中，通常涉及降低變性劑濃度和添加氧化劑。普遍認(rèn)為適用于蛋白重折疊的方案是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，且被公開于例如4,511,502號、4,511,503號和4,512,922號的美國專利中。
運(yùn)用合成化學(xué)即一種本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法，也可以方便地生產(chǎn)短的(例如少于約20個氨基酸殘基)SVII蛋白。因為在肽長度長時收率下降，所以對于生產(chǎn)大約15個氨基酸殘基的或更短的肽，合成是一種優(yōu)選的方法。
在用于預(yù)防SVII感染和/或治療SVII感染的疫苗中，可以使用SVII多肽。在SVII疫苗中，可以使用任一SVII多肽或SVII多肽的組合。包含來自一種SVII蛋白的多個表位、其中正常分開所述表位的氨基酸被缺失掉的SVII嵌合多肽，是一種供疫苗制劑之用的優(yōu)選SVII蛋白。供疫苗之用的另一種優(yōu)選的SVII蛋白是一種超表位蛋白，該超表位蛋白包含來自許多SVII病毒、已融合成一種單一蛋白的多個同源表位。
按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法配制SVII疫苗。該疫苗最好是一種用于非腸道給予的液體制劑?？梢耘渲瓢炯夹g(shù)領(lǐng)域已知的藥用賦形劑的疫苗，所述藥用賦形劑例如生理學(xué)上及藥學(xué)上可接受的鹽、緩沖劑、防腐劑、填充劑、滲壓劑等等，在the USP(UNITEDSTATESPHARMACOPEIA，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，MD，1995)中可查明它們。
也可以用佐劑來配制基于SVII蛋白的疫苗。供基于SVII蛋白的疫苗之用的佐劑，包括化學(xué)佐劑、細(xì)胞因子佐劑以及諸如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑之類的水包油型乳狀液；所述化學(xué)佐劑例如氫氧化鋁(尤其是氫氧化鋁凝膠)、明礬、魚精蛋白、磷酸鋁和磷酸鈣，所述細(xì)胞因子佐劑包括白細(xì)胞介素1.β、腫瘤壞死因子α以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如在5,980,911號美國專利中描述的。
優(yōu)選非腸道地傳遞SVII疫苗，更優(yōu)選通過經(jīng)皮給予而將其傳遞。優(yōu)選的給予途徑不僅包括肌內(nèi)注射和皮下注射，而且包括經(jīng)皮氣動給予(例如無針注射)。可以以單獨(dú)一劑的方式給予該疫苗，或可按照多次給予，來給予該疫苗。在多次給予時，優(yōu)選相差至少一天、一周或一個月地隔開多次給予。SVII抗體運(yùn)用由本發(fā)明提供的分離的病毒粒子和/或SVII病毒蛋白，可制備針對SVII的抗體。不僅可以制備分離的多克隆抗體，而且可制備單克隆抗體。
最好通過注射一種免疫原性的“SVII免疫原”(例如分離的SVII病毒粒子、SVII蛋白、連接于載體的SVII寡肽或SVII融合蛋白)到動物中，來制備分離的、針對SVII蛋白的多克隆抗體；所述動物最好是一種哺乳動物，例如嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠或兔)、山羊、?；蝰R。最常用一種油/水乳狀液完全佐劑例如弗氏完全佐劑，進(jìn)行SVII免疫原的第一次注射；該完全佐劑包含一種非特異性的免疫系統(tǒng)激活劑，從而改善對所注射免疫原的免疫應(yīng)答。一般用不完全佐劑(例如在一種水/油乳狀液中的非特異性免疫刺激物)進(jìn)行后面的注射。另一方面，可引入吸附到一種固體基質(zhì)上的SVII免疫原，或可引入作為一種純?nèi)芤旱腟VII免疫原。收獲血清；并運(yùn)用任何方便的測定，最典型的是用一個簡單的免疫試驗，例如一種使用作為靶的SVII免疫原以及使用種特異性的抗免疫球蛋白二次抗體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，來測定血清中特異性抗體的存在。
用若干不同的技術(shù)，可制備本發(fā)明的單克隆抗體。至于雜交瘤技術(shù)，讀者通?？蓞㈤咹arrow與Lane(1988)的4,491,632號、4,472,500號和4,444,887號美國專利以及Methods in Enzymology 73B3(1981)。傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)涉及從一種在前面段落中描述的、已被免疫的動物(一般為小鼠)體內(nèi)回收的產(chǎn)生抗體之細(xì)胞的無限增殖化與克隆?？梢允顾黾?xì)胞無限增殖，例如，通過與一種非生產(chǎn)性骨髓瘤融合，用EB病毒感染，或者用癌基因DNA轉(zhuǎn)化?？寺〔⑴囵B(yǎng)經(jīng)處理的細(xì)胞，且挑選產(chǎn)生所需特異性的抗體的克隆。用一些技術(shù)，例如在一種免疫測定中運(yùn)用所述免疫抗原作為檢測試劑，用培養(yǎng)基上清液進(jìn)行特異性測定。然后，從大體積的培養(yǎng)物上清液中，或從用所述克隆注射的、適當(dāng)?shù)靥幚磉^的宿主動物的腹水中，可純化出來自所選克隆的一批單克隆抗體。
用于獲得單克隆抗體的另一個可供選擇的方法涉及使一種免疫活性細(xì)胞或病毒粒子與本發(fā)明的一種蛋白接觸。在這方面，“免疫活性”意指沒有進(jìn)一步的基因重排，所述細(xì)胞或粒子就已表達(dá)或能夠表達(dá)對該抗原特異性的抗體；且可以通過該抗原的呈遞，將其從細(xì)胞混合物中選擇出來。由免疫過的哺乳動物供體，可收獲免疫活性真核細(xì)胞；或者，可從未經(jīng)免疫的供體中收獲真核細(xì)胞，并通過在有免疫原和免疫刺激生長因子情況下，于體外培養(yǎng)進(jìn)行預(yù)刺激。在導(dǎo)致特異性克隆增殖而非特異性克隆不增殖的培養(yǎng)條件下，通過與免疫原接觸，可選擇出所需特異性的細(xì)胞?？梢詷?gòu)建免疫活性噬菌體，從而在其表面表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)片段。參見Marks等，New Engl.J.Med.335730，1996；94/13804號、92/01047號、90/02809號國際專利申請；以及McGuinness等，Nature Biotechnol.141149，1996。例如，通過吸附到與一種固相相連的SVII免疫原上，而可選擇出所需特異性的噬菌體；然后，在大腸桿菌中將其擴(kuò)增。
可以用傳統(tǒng)的生物化學(xué)分離技術(shù)的組合，從血清、細(xì)胞上清液、裂解液或腹水中純化抗體；所述生物化學(xué)分離技術(shù)例如硫酸銨沉淀、在一種弱陰離子交換樹脂例如DEAE上的離子交換層析、羥基磷灰石層析以及凝膠過濾層析。也可以單獨(dú)地、或連同傳統(tǒng)生物化學(xué)分離技術(shù)一起使用特異性親和技術(shù)，例如使用SVII免疫原作為親和部分的親和層析，來分離本發(fā)明的抗體。
最好是不僅根據(jù)所獲得抗體與SVII病毒蛋白反應(yīng)的能力，而且根據(jù)與同樣存在于有診斷意義樣品中的潛在交叉反應(yīng)物的低交叉反應(yīng)性，篩選或純化所獲得抗體。必要時，可以使用所述交叉反應(yīng)物或一種來自一個對SVII感染呈陰性的個體之血清的抗原制劑，從多克隆抗血清中吸附出不需要的活性。
通過制備片段和測定抗體結(jié)合的能力，可對特定抗體所結(jié)合的表位作圖。例如，制備連續(xù)的、覆蓋該免疫原完整序列且重疊8個殘基的12個氨基酸的肽?？梢园凑罩圃焐痰恼f明書，用來自Genosys的SPOTSTM試劑盒，用F-Moc化學(xué)法在尼龍膜支持物上制備所述肽。然后，用所述抗體覆蓋所制備的膜，洗滌所述膜，并用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶綴合的抗人IgG覆蓋這些膜。通過添加所用的特定酶綴合物的合適底物，來顯現(xiàn)該試驗結(jié)果。陽性染色表明由所述抗體識別的抗原片段。然后，可以用該片段來獲得識別所關(guān)注的表位的其它抗體。在一種標(biāo)準(zhǔn)的免疫測定中，識別同一表位的兩種抗體將競爭結(jié)合。
本發(fā)明的抗體可以用來檢測和/或鑒定SVII病毒，也可以用于分離病毒粒子和/或病毒蛋白。SVII的檢測在檢測SVII病毒感染和檢測SVII病毒本身的方法與試劑盒中，可以使用本發(fā)明的多核苷酸、蛋白及抗體。根據(jù)所需的測定效用，可以設(shè)計各種各樣形式的應(yīng)用本發(fā)明多核苷酸、蛋白和/或抗體的測定。
可以本發(fā)明的多核苷酸檢測SVII病毒基因組DNA。在血液樣品中檢測出SVII基因組DNA則表明該樣品被SVII病毒污染，且該樣品之源被SVII感染。用于檢測核苷酸的各種各樣的不同測定是已知的，盡管所有這樣的測定通常都需要一個使引物或探針與樣品中的DNA雜交的雜交步驟。
用分離的SVII基因組序列的已測定部分作為基礎(chǔ)，可以或者通過切取或者通過合成，制備大約八個或更多個核苷酸的、與所述SVII基因組雜交的寡聚體。用于SVII多核苷酸的天然探針或衍生探針為允許通過雜交而檢測特有病毒序列的長度。通常，探針的長度最小為6個至8個核苷酸，優(yōu)選至少10至12個核苷酸的序列，且可以最優(yōu)選至少約20個核苷酸的那些序列。根據(jù)所需測定的效用(例如，所有SVH病毒的檢測對單一SVII病毒類型的檢測)，所述探針可以基于SVII基因組序列中在SVII病毒之中保守或在SVII病毒中間高度趨異的一個區(qū)域?？蛇\(yùn)用包括自動化寡核苷酸合成法的常規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)方法，來制備這些探針。SVII基因組的任何特有部分的互補(bǔ)物通常會是令人滿意的。通常在探針方面，完全互補(bǔ)是所需的；盡管當(dāng)增加該片段的長度時，完全互補(bǔ)可能是不必要的。
通常，處理待分析的試驗樣品例如血液或血清，以便提取包含于其中的核酸。一般將核酸樣品吸附到一種用于分析的固體支持物上(例如硝化纖維)(有或沒有初步的大小分離，例如通過凝膠電泳)；盡管也可以使用溶液相樣式的分析，例如在4,868,105號美國專利中描述的分析。
根據(jù)所述分析的形式和檢測系統(tǒng)，可以對所述探針進(jìn)行或不進(jìn)行直接標(biāo)記或另外的修飾，從而允許隨后根據(jù)標(biāo)記的結(jié)合進(jìn)行檢測。合適的標(biāo)記以及使標(biāo)記相連到探針上的方法是本技術(shù)領(lǐng)域已知的，且包括但不限于通過切口平移或激酶處理(kinasing)引入的放射性標(biāo)記、允許標(biāo)記隨后結(jié)合例如生物素化的修飾、以及可以直接結(jié)合到探針上或經(jīng)過修飾探針而結(jié)合的熒光標(biāo)記與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
在基本的核酸雜交測定中，在適當(dāng)嚴(yán)格性的雜交條件與洗滌條件下，使樣品的單鏈核酸和所述探針接觸，并檢測所產(chǎn)生的雙鏈體。嚴(yán)格性的控制是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，且取決于例如鹽濃度、探針長度、甲酰胺濃度、溫度等等的變量。最好是在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交及洗滌。按照用于所述測定的標(biāo)記/檢測系統(tǒng)的要求，進(jìn)行結(jié)合探針的檢測。例如，在該探針經(jīng)放射性標(biāo)記的情況下，通過放射自顯影而檢測探針的結(jié)合。在修飾該探針以允許探針隨后結(jié)合(例如，通過共價連接生物素或地高辛配基到該探針上，或者通過添加聚腺苷酸尾到該探針上)的情況下，使一種標(biāo)記連接于一種修飾結(jié)合部分(例如，使鏈霉親和素連接于一種可檢測的酶例如堿性磷酸酶、綠色熒光蛋白或熒光素酶、或者使一種熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記結(jié)合到抗地高辛配基抗體上)。通常用熒光計來完成熒光探針的檢測，而可以用一臺發(fā)光計或一張照相底片來檢測發(fā)光標(biāo)記。可以使用分支DNA技術(shù)及增強(qiáng)來自所述分析之信號的其它方法(Urdea等，1989，Clin.Chem.35(8)1571-1575；第5,849,481號美國專利)。
其它分析使用探針作為擴(kuò)增樣品中SVII基因組DNA的引物?？墒褂美缇酆厦告湻磻?yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、Q-β復(fù)制酶、NASBA(Compton，1991，Nature 350(6313)91-92)等的方法，來產(chǎn)生存在于一種樣品中的部分或完整SVII基因組DNA的大量拷貝。在這樣的測定中的檢測，通常是檢測預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，一般則通過凝膠電泳和目測所存在的任何條帶檢測。
也可以用本發(fā)明的抗體檢測樣品中病毒蛋白的存在，來檢測SVII病毒?？梢越Y(jié)合本發(fā)明抗體使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的各種各樣免疫測定形式中的任一種，來檢測SVII病毒或病毒蛋白。
在其大多數(shù)的基本類型方面，用于檢測樣品中的SVII病毒或SVII病毒蛋白的免疫測定檢測出SVII蛋白與本發(fā)明抗體的復(fù)合體。雖然優(yōu)選的免疫測定形式需要至少兩種本發(fā)明的抗體，但至少需要一種本發(fā)明的抗體。
許多測定形式要求將樣品或來自該樣品的SVII蛋白固定在一種固體支持物上?？梢杂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域已知的各種各樣的方法來完成連接；最常用的是使其吸附到蛋白結(jié)合表面(例如聚苯乙烯板或硝化纖維或PVA膜)或結(jié)合到與基底相結(jié)合的抗體上。在“夾心”免疫測定中使用這第二種安排；且對于SVII病毒蛋白的檢測，則優(yōu)選這第二種安排。
在固定該樣品(或該樣品中的SVII蛋白)到所述基底上后，使一種檢測抗體與該樣品接觸，并檢測該檢測抗體的存在。由于用染料或有色顆粒修飾了該檢測抗體，因而該檢測抗體本身可以是可檢測的；可這樣的修飾該檢測抗體，以致一種檢測試劑將結(jié)合到該檢測抗體上，或者可以用一種作用于顯色底物的酶來修飾該檢測抗體。
當(dāng)然，檢測該檢測抗體的確切詳情，將取決于所使用的檢測系統(tǒng)。通過例如簡單檢查、光學(xué)顯微鏡術(shù)或比色法(對于用有色顆粒例如乳膠微珠或膠態(tài)金屬修飾的抗體)、放射分析(對于用一種放射性化合物修飾的抗體)或熒光測定或表面熒光顯微鏡術(shù)(對于用熒光染料標(biāo)記的抗體)，可以檢測可直接檢測的檢測抗體。一般通過在包含經(jīng)一種酶加工后即成為可檢測的底物的溶液中保溫所述的試驗樣品，且用一種合適的方法(例如用于顯色底物的比色法，用于熒光底物的熒光測定法等等)來檢測任何已加工的底物，從而檢測出已經(jīng)過修飾而包含所述酶的檢測抗體?？梢孕揎椘渌臋z測抗體而為“間接”檢測創(chuàng)造條件，其中結(jié)合到經(jīng)修飾的檢測抗體上的第二種試劑允許檢測結(jié)合的檢測抗體。修飾所述的第二種試劑，使其成為可檢測的(或當(dāng)用染料或當(dāng)用有色顆粒時可直接檢測，或當(dāng)用一種酶與可檢測底物時間接檢測)。
實施例實施例1SVII病毒DNA的分離運(yùn)用一種由Lititsyn等描述的表現(xiàn)度差異分析(RAD)法(1993，Science 259946-951)的改良法，分離包含SVII基因組DNA的DNA克隆。這種方法利用一種“驅(qū)動者”DNA源來富集擴(kuò)增“試驗者”DNA源特有序列的擴(kuò)增物。
將來自稱為H101的一位原因不明性肝炎患者的血清用作“試驗者”DNA之源。通過蛋白酶K消化，繼之以苯酚與氯仿抽提而提取DNA。在37℃，用10個單位的Sau3A I消化分離自100μl H101血清的DNA達(dá)3小時，而至完成。通過在65℃保溫20分鐘而使該酶失活。
通過在T4 DNA連接酶緩沖液(具有ATP，來自New EnlandBiolabs)中將各1nmol的寡核苷酸接頭R-Bgl-24(5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’)和R-Bgl-12(5’-GATCTGCGGTGA-3’)與經(jīng)消化的DNA混合，通過在55℃保溫2分鐘來變性該混合物，通過在大約1小時期間將該混合物逐漸冷卻至10-15℃而使所述接頭退火，然后，添加800單位的T4 DNA連接酶(NewEnland Biolabs)并在12-16℃保溫過夜；而把所述接頭連接于消化的DNA上。
通過嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)而制備試驗者擴(kuò)增子；因為一輪PCR不產(chǎn)生可測定量的DNA。將所述連接產(chǎn)物的一部分與PCR緩沖液、dNTPs以及另外的250pmol R-Bgl-24寡核苷酸相混合，并用礦物油將其覆蓋。通過在72℃保溫該混合物3分鐘而‘釋放’所述的R-Bgl-12寡核苷酸。通過添加7.5單位的AMPLITAQTaq DNA聚合酶(PEBiosystems)以及于72℃再保溫5分鐘，而補(bǔ)平突出端。通過使該混合物經(jīng)過20個于95℃1分鐘和在72℃3分鐘的循環(huán)，繼之以最后的于72℃10分鐘的延伸步驟，構(gòu)建試驗者擴(kuò)增子。在第二輪聚合酶鏈反應(yīng)中，于與第一輪相同的條件下，使用第一輪PCR的產(chǎn)物10μl及接頭R-Bgl-25(5’-ACTCTCCAGCCTCTCACCGCAGATC-3’)，進(jìn)行15個循環(huán)。然后，用苯酚/氯仿抽提該產(chǎn)物，并用乙酸鈉和異丙醇將其沉淀。通過離心收集該沉淀，在除去上清液后，將其風(fēng)干，并用TE(tris-EDTA)緩沖液重新懸浮。通過基本上如上所述進(jìn)行Sau3A I消化而除去R-Bgl-24接頭，繼之以在65℃使該酶失活。在存在糖原的情況下，用乙酸鈉和乙醇將所述消化產(chǎn)物沉淀；通過離心收集該沉淀，在除去上清液后，將其風(fēng)干，并用TE重懸浮。然后，在1×TAE中，于1％的瓊脂糖凝膠電泳上，將所述產(chǎn)物分離；并切取對應(yīng)于150-1500個核苷酸的凝膠部分。按照制造商的說明書，用QIAGENQiaex II凝膠提取(QIAGENQiaex II Gel Extraction)試劑盒從該凝膠中純化出消化的試驗者擴(kuò)增子?；旧习凑諏τ赗-Bgl接頭而描述的，將2μg的試驗者擴(kuò)增子DNA與J-Bgl-24接頭和J-Bgl-12接頭(分別為5’-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3’和5’-GATCTGTTCATG-3’)連接。
除了在第二次Sau3A I消化后不添加新的接頭外，基本上按照對于試驗者擴(kuò)增子而描述的，由從得自10位健康獻(xiàn)血者的混合血清提取的DNA制備驅(qū)動者擴(kuò)增子。
以100∶1的質(zhì)量比，混合驅(qū)動者擴(kuò)增子和試驗者擴(kuò)增子；用苯酚/氯仿抽提，并用乙酸鈉和乙醇將其沉淀。通過離心收集該沉淀，在除去上清液后，將其風(fēng)干，并用4μl EE×3緩沖液(30mM EPPS，pH 8.0，3mM EDTA)重新懸浮。用礦物油覆蓋混合物，通過在98℃變性5分鐘，添加1μl的5M NaCl，于98℃保溫另外的2分鐘，然后在65℃保溫20小時進(jìn)行雜交。
在選擇性地僅擴(kuò)增雙鏈試驗者DNA的條件下，擴(kuò)增試驗者/驅(qū)動者的雜交混合物。除了在70℃進(jìn)行延伸循環(huán)外，基本上如同為擴(kuò)增J-Bgl連接的試驗者DNA所做的，擴(kuò)增該雜交混合物的一部分達(dá)10個循環(huán)。收集所述擴(kuò)增的產(chǎn)物，用苯酚/氯仿/異戊醇抽提，然后，用乙酸鈉和異丙醇將其沉淀。通過離心收集該沉淀，在除去上清液后，將其風(fēng)干，并用TE重新懸浮。通過在30℃用綠豆核酸酶(New EnglandBioLabs)消化30分鐘，除去單鏈的DNA；繼之以在98℃熱滅活該酶達(dá)5分鐘。在存在追加的J-Bgl-24寡核苷酸的情況下，重新擴(kuò)增所述消化產(chǎn)物達(dá)15個循環(huán)。
收集所述擴(kuò)增的產(chǎn)物，用苯酚/氯仿/異戊醇抽提，用乙酸鈉和異丙醇將其沉淀；通過離心收集該沉淀，用70％的乙醇洗滌，在除去上清液后，將其風(fēng)干，并用TE重新懸浮，從而形成第一種差異產(chǎn)物(theFirst Difference Product)(DP1)。
基本上如上所述，把R-Bgl接頭換成J-Bgl接頭，通過用Sau3A I消化DP1，并用N-Bgl接頭(N-Bgl-12和N-Bgl-24，分別為5’-GATCTTCCCTCG-3’和5’-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3’)取代J-Bgl接頭；以1∶800的質(zhì)量比，使N-接頭DP1與驅(qū)動者擴(kuò)增子雜交；且除了在72℃進(jìn)行擴(kuò)增期間的延伸外，按照對DP1所描述的，進(jìn)行擴(kuò)增/消化/擴(kuò)增；從而產(chǎn)生第二種差異產(chǎn)物(the Second DifferenceProduct)(DP2)。
通過用Sau3A I消化DP2，并用J-Bgl接頭取代N-Bgl接頭；再繼之以4×105∶1的驅(qū)動者∶試驗者的質(zhì)量比，與驅(qū)動者擴(kuò)增子雜交；且按照對DP1所描述的，進(jìn)行擴(kuò)增/消化/擴(kuò)增；從而產(chǎn)生第三種差異產(chǎn)物(the Third Difference Product)(DP3)在三輪扣除雜交和選擇性擴(kuò)增之后，在凝膠電泳后，當(dāng)與最初的試驗者擴(kuò)增子的‘不清晰的成片’帶型比較時，看到了清楚的帶。按照制造商的說明書，用QIAGEN凝膠提取試劑盒(QIAGENGelExtraction Kit)(目錄號28704)從各條帶中分離出DNA；然后，將該DNA連接于TA質(zhì)粒2.1(In Vitrogen Cat.K2000-01)中。然后將所產(chǎn)生的質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并將大腸桿菌鋪平板。選擇來自每個文庫的30個菌落，并按照制造商的說明書，用一種PE Biosciences PCR測序試劑盒，將其測序。在DNA和蛋白水平上，針對GenBank數(shù)據(jù)庫，比較序列。將顯示出與所述數(shù)據(jù)庫沒有顯著同源性的克隆分為“未知類”。使用根據(jù)每種“未知”序列設(shè)計的引物，通過PCR，測試每種“未知物”是否在人類基因組DNA中存在。對任何存在于人類基因組DNA中的序列，則終止分析。選擇一種最初稱為“克隆33”或“H101.c33”的、371個核苷酸的未知物，供進(jìn)一步的特性鑒定。在圖1中顯示了H101.c33的核苷酸序列。
通過概念上的、按所有六種可能之閱讀框架的翻譯，來分析克隆33的核苷酸序列。鑒定出了一個大的可讀框(ORF)ORF 1。在圖1中也顯示了ORF 1的氨基酸序列。
通過PCR，證實了克隆33的非人類起源。在用克隆33特異性的PCR引物擴(kuò)增人類基因組DNA后，沒有檢測到擴(kuò)增的產(chǎn)物。因證實了克隆33的非人類起源，故將其重新命名為崗哨病毒II或SVII。
運(yùn)用對SVII特異性的PCR引物，在對應(yīng)于峰值A(chǔ)LT水平的兩個時間點(diǎn)，證實了SVII在患者H101之血清中的存在。實施例2SVII病毒粒子的物理特性鑒定通過密度梯度超速離心，將SVII陽性血清分級分離，以測定SVII病毒粒子的浮力密度。
在連續(xù)的蔗糖密度梯度(20-65％的蔗糖，w/w)的表面上，鋪上摻入HBV作為標(biāo)記的500μl SVII陽性血清樣品。在6℃，用BeckmanSW41Ti轉(zhuǎn)頭以39,000rpm離心該樣品15小時。借助于連接于聚硅氧烷管的玻璃毛細(xì)管，通過從離心管底抽吸，而收集級分(500μl)。
運(yùn)用嵌套式PCR，分析各級分中的SVII。第一輪使用引物對33.1/33.2(分別為5’-GGATTGACGACGACGACGAC-3’、5’-TGTCAAATACCCGCTCAGGA-3’)，且第二輪使用引物對33.3/33.4(分別為5’-GACGACGACGACGACATTG-3’和5’-CAAATACCCGCTCAGGAAGG-3’)。同樣，運(yùn)用兩輪的PCR，來分析各級分中的HBV；第一輪用引物HBV1和HBV4(分別為5’-CATCTTCTTRTTGGTCTTCTGG-3’和5’-CAAGGCAGGATAGCCACATTGTG-3’)以及引物HBV3(5’-CCTATGGGAGTGGGCCTCAG-3’)和HBV4。在對應(yīng)于1.26g/cm3的級分中，發(fā)現(xiàn)了SVII病毒。
也測定了SVII在CsCl梯度中的浮力密度。在一支合適的離心管中，將摻入HBV作為標(biāo)記的500μl SVII陽性血清樣品與同質(zhì)的CsCl溶液(密度4.2g/cm3且折射率為1.3645)相混合。在6℃，用BeckmanSW41Ti轉(zhuǎn)頭，以35,000rpm離心該樣品達(dá)70小時。通過穿刺靠近該管底部的側(cè)壁且收集500μl的各級分，來收集級分；并如同對該蔗糖梯度實驗所描述的，分析所述的級分。在對應(yīng)于1.26-1.28g/cm3的級分中，發(fā)現(xiàn)了SVII。實施例3SVII感染的流行對于SVII的存在，通過PCR分析了不止700份的血清樣品。將所述樣品分成(a)“超正常”獻(xiàn)血者(正常血液值，無肝炎標(biāo)志，且≥5次獻(xiàn)血，不牽連有關(guān)輸血的事件)；(b)“正?！鲍I(xiàn)血者(符合獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn))；(c)“不合格的”獻(xiàn)血者(在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中不適合于獻(xiàn)血的健康個體)；以及(d)“肝炎”患者，分為急性肝炎、HBV慢性肝炎、HCV慢性肝炎、原因不明性肝炎(非A-E)、及超感染肝炎(HBV加HCV或HBV加HDV)的“肝炎”患者。
使用引物對33.1/33.2和引物對33.3/33.4，通過嵌套式PCR擴(kuò)增提取自血清樣品的DNA，來分析樣品。在來自符合獻(xiàn)血篩選標(biāo)準(zhǔn)之個體的血清樣品中，沒有檢測出SVII基因組DNA；且在不符合獻(xiàn)血篩選標(biāo)準(zhǔn)的健康個體中，發(fā)現(xiàn)SVII基因組DNA僅以非常低的水平流行。然而，在來自急性肝炎患者的血清中，發(fā)現(xiàn)SVII以高度流行；且在來自慢性肝炎患者的血清中，尤其在來自慢性HCV患者和被多過一種類型的肝炎病毒超感染之患者的血清中，也發(fā)現(xiàn)了SVII。在表1中概括了結(jié)果。
表1組別 樣品數(shù) 陽性超正常 1000％正常 96 0％不合格 1722％肝炎 37418％急性肝炎 24 63％慢性HBV肝炎79 1％慢性HCV肝炎98 29％原因不明性肝炎 94 23％慢性HBV/HCV/HDV肝炎79 4％
序列表<110>Liu，en-KueiLewis，SamanthaBatz，Hans-GeorgRamaswamy，LathaBohenzky，RoyLin，Yu-HueiMontiel，JanineChen，Benjamin<120>崗哨病毒II<130>RDID 0070<150>US 60/202271<151>2000-05-05<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>371<212>DNA<213>崗哨病毒II<400>1gatcmggaaa cgyttsgctc ggtgcatgca gaaggacggg wtgaaggcgg acgggattga 60cgacgacgac gacattgcga tgaaagatgg gaccgcygac gtccttggcg gggcggagcg120cgagaaccaa gacgacgagg acgaggacgt ctacgcgcgc atccgtttcc ttcctgagcg180ggtatttgac acctccgcat tgctgatcct gaagttctcg cttgcagacg ctgattcagc240gccgcttcgt cgcacctgct ttggacgctg caaaccgcac ggctcggacc atcgtcagtt300tcctgcttca gaggtgaatt tccgaccccg ttggactttg ctctctcttc tctctctacc360cgacgacgat c 371<210>2<211>372<212>DNA<213>崗哨病毒II<220><221>misc_feature<222>(372)..(372)<223>未知可以是a、t、g、c，或者在該位置可能不存在核苷酸。<400>2gatcgtcgtc gggtagagag agaagagaga gcaaagtcca acggggtcgg aaattcacct 60ctgaagcagg aaactgacga tggtccgagc cgtgcggttt gcagcgtcca aagcaggtgc120gacgaagcgg cgctgaatca gcgtctgcaa gcgagaactt caggatcagc aatgcggagg180tgtcaaatac ccgctcagga aggaaacgga tgcgcgcgta gacgtcctcg tcctcgtcgt240cttggttctc gcgctccgcc ccgccaagga cgtcrgcggt cccatctttc atcgcaatgt300cgtcgtcgtc gtcaatcccg tccgccttca scccgtcctt ctgcatgcac cgagcwaarc360gtttcckgat cn372<210>3<211>123<212>PRT<213>崗哨病毒II<220><221>Miscellaneous<222>(14)..(14)<223>該殘基可以是Met或Leu。<220><221>Miscellaneous<222>(5)..(5)<223>該殘基可以是Phe或Leu。<400>3Ile Arg Lys Arg Xaa Ala Arg Cys Met Gln Lys Asp Gly Xaa Lys Ala1 5 10 15Asp Gly Ile Asp Asp Asp Asp Asp Ile Ala Met Lys Asp Gly Thr Ala20 25 30Asp Val Leu Gly Gly Ala Glu Arg Glu Asn Gln Asp Asp Glu Asp Glu35 40 45Asp Val Tyr Ala Arg Ile Arg Phe Leu Pro Glu Arg Val Phe Asp Thr50 55 60Ser Ala Leu Leu Ile Leu Lys Phe Ser Leu Ala Asp Ala Asp Ser Ala65 70 75 80Pro Leu Arg Arg Thr Cys Phe Gly Arg Cys Lys Pro His Gly Ser Asp85 90 95His Arg Gln Phe Pro Ala Ser Glu Val Asn Phe Arg Pro Arg Trp Thr100 105 110Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Asp Asp Asp115 120<210>4<211>124<212>PRT<213>崗哨病毒II<220><221>Miscellaneous<222>(111)..(111)<223>該殘基可以是Ala或Pro。<220><221>Miscellaneous<222>(119)..(119)<223>該殘基可以是Gln或His。<220><221>Miscellaneous<222>(120)..(120)<223>該殘基可以是Ser或Asn。<220><221>Miscellaneous<222>(123)..(123)<223>該殘基可以是Gly或一個終止密碼子。<400>4Asp Arg Arg Arg Val Glu Arg Glu Glu Arg Ala Lys Ser Asn Gly Val1 5 10 15Gly Asn Ser Pro Leu Lys Gln Glu Thr Asp Asp Gly Pro Ser Arg Ala20 25 30Val Cys Ser Val Gln Ser Arg Cys Asp Glu Ala Ala Leu Asn Gln Arg35 40 45Leu Gln Ala Arg Thr Ser Gly Ser Ala Met Arg Arg Cys Gln Ile Pro50 55 60Ala Gln Glu Gly Asn Gly Cys Ala Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg65 70 75 80Leu Gly Ser Arg Ala Pro Pro Arg Gln Gly Arg Xaa Arg Ser His Leu
85 90 95Ser Ser Gln Cys Arg Arg Arg Arg Gln Ser Arg Pro Pro Ser Xaa Arg100 105 110Pro Ser Ala Cys Thr Glu Xaa Xaa Val Ser Xaa Ser115 120<210>5<211>25<212>PRT<213>崗哨病毒II<220><221>Miscellaneous<222>(12)..(12)<223>該殘基可以是Ser或Thr。<220><221>Miscellaneous<222>(24)..(24)<223>該殘基可以是Leu或Arg。<400>5Met Ser Ser Ser Ser Ser Ile Pro Ser Ala Phe Xaa Pro Ser Phe Cys1 5 10 15Met His Arg Ala Lys Arg Phe Xaa Ile20 2權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包括分離的SVII病毒。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分離的SVII病毒包括圖1中顯示的一種多核苷酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自可選擇性地與圖1中顯示的一種核苷酸序列雜交的、分離的多核苷酸；可選擇性地與圖1中顯示的一種核苷酸序列雜交的、分離的多核苷酸的互補(bǔ)物；編碼一種SVII蛋白或SVII蛋白片段的、分離的多核苷酸；以及編碼一種SVII蛋白或SVII蛋白片段的、分離的多核苷酸的互補(bǔ)物。
4.權(quán)利要求3的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸是一種反義多核苷酸。
5.一種組合物，所述組合物包括一種分離的SVII蛋白或其片段。
6.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括一種分離的SVII蛋白或其片段；以及一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
7.權(quán)利要求6的疫苗組合物，該疫苗組合物還包括一種佐劑。
8.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括編碼一種SVII蛋白或SVII蛋白片段的、分離的多核苷酸。
9.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括一種分離的多核苷酸；其中，所述分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致一種SVII反義多核苷酸的產(chǎn)生。
10.一種分離的、與一種SVII病毒或其蛋白特異性結(jié)合的多克隆抗血清。
11.一種與SVII病毒或其蛋白結(jié)合的單克隆抗體。
12.一種檢測SVII病毒的方法，該方法包括使樣品與一種特異性地與SVII病毒或其蛋白結(jié)合的抗體接觸；以及檢測所述抗體與SVII病毒或其蛋白的復(fù)合物。
13.一種用于檢測SVII病毒的方法，該方法包括使樣品與一種選擇性地同SVII多核苷酸雜交的探針多核苷酸接觸；以及檢測所述探針與一種SVII多核苷酸的雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種命名為H101.c33或崗哨病毒II(SVII)的新的病毒。提供了分離的SVII病毒、來自SVII病毒的多核苷酸和蛋白、以及結(jié)合SVII病毒和SVI病毒蛋白的抗體?？梢允褂帽景l(fā)明的多核苷酸、蛋白以及抗體來檢測SVII病毒或者易感個體中SVII病毒的感染。另外，可以將本發(fā)明的多核苷酸插入到重組表達(dá)載體中以供重組生產(chǎn)病毒蛋白。
文檔編號A61P1/16GK1440456SQ01812236
公開日2003年9月3日 申請日期2001年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月5日
發(fā)明者J·－K·劉, S·路易斯, R·博亨茨基, Y·－H·林, L·拉馬斯瓦米, J·蒙蒂爾, H·－G·巴茨, B·陳 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司