專利名稱：鑒定和生產(chǎn)抗原肽的方法并且將其用作疫苗的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及誘導抗原呈遞細胞呈遞特殊的靶細胞特異的表位，從而促進對靶細胞有效的細胞毒性T細胞反應的方法和組合物。
本發(fā)明還涉及靶細胞表位和表位簇的鑒別，也涉及表位編碼載體，該載體可用于產(chǎn)生免疫活性藥物組合物。這些組合物在被給予時，可以刺激受試者的免疫系統(tǒng)對呈現(xiàn)靶抗原的靶細胞發(fā)動免疫反應。因此本發(fā)明在治療和預防腫瘤和病毒疾病中有用。
相關技術描述瘤的形成與免疫系統(tǒng)通常被稱為癌癥的腫瘤性病狀，一般被認為是由于單細胞生長失控而引起的。典型地，失控生長狀態(tài)由多步驟過程導致，在該多步驟過程中，發(fā)生了一系列細胞系統(tǒng)損壞，引起瘤細胞發(fā)生。這樣產(chǎn)生的瘤細胞快速自我復制，形成一個或多個腫瘤，最終可能導致宿主死亡。
由于瘤細胞的先祖具有與宿主細胞相同的遺傳物質(zhì)，所以瘤細胞在很大程度上逃避于宿主的免疫系統(tǒng)。在宿主免疫系統(tǒng)檢查和定位外來物質(zhì)的免疫監(jiān)視過程中，瘤細胞會在宿主的免疫監(jiān)視機構中呈現(xiàn)為自我細胞。病毒和免疫系統(tǒng)與癌細胞對比，病毒感染包括明顯的非我抗原的表達。結果，免疫系統(tǒng)成功地處理了許多病毒感染，而只伴隨著最小限度的臨床后遺癥。此外，對那些引起嚴重疾病的感染，形成有效的疫苗是可能的。許多疫苗方法已經(jīng)被成功地用來與多種疾病作斗爭。這些方法包括個體蛋白組成的亞單位疫苗，該個體蛋白是通過重組DNA技術生產(chǎn)的。盡管有這些進展，但是，用作病毒疫苗的最小表位的選擇和有效給予仍然是有困難的。
除了涉及表位選擇的那些困難，還存在病毒的難題，這些病毒已經(jīng)演化出了逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力。許多病毒，特別是建立了持續(xù)感染的病毒，例如皰疹病毒和痘病毒家族的成員，產(chǎn)生了允許病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)分子?？梢酝ㄟ^導向作為免疫原性組合物給藥的選擇表位，來克服這些免疫調(diào)節(jié)分子對抗原呈遞的影響。為了更好地理解瘤細胞和病毒感染細胞與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，對該系統(tǒng)的組分討論如下。
免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能，從外來的或與有機體無關的物質(zhì)(“非我”分子)中，辨別有機體內(nèi)源性分子(“自我”分子)?；诮閷Х磻慕M分，免疫系統(tǒng)對異物有兩種類型的適應反應體液反應和細胞介導的反應。體液反應由抗體介導，而細胞介導的反應涉及被分類為淋巴細胞的細胞。近來的抗癌和抗病毒策略集中在將調(diào)動宿主的免疫系統(tǒng)作為抗癌和抗病毒處理或治療的手段。
免疫系統(tǒng)在三個階段發(fā)揮作用，來保護宿主免于異物侵害認知期，活化期，和效應期。在認知期，免疫系統(tǒng)對體內(nèi)的外來抗原或侵入者識別并且發(fā)出信號。外來抗原可以是，例如，來自于瘤細胞或病毒蛋白的細胞表面標記。一旦系統(tǒng)意識到有侵入體，免疫系統(tǒng)的抗原特異性細胞增生并且分化，以此來響應侵入者觸發(fā)的信號。最后一個階段是效應期，在效應期，免疫系統(tǒng)的效應細胞作出反應并消除被發(fā)現(xiàn)的侵入物。
一批效應細胞執(zhí)行著對侵入物的免疫反應。一種類型的效應細胞一一B細胞，產(chǎn)生針對宿主遇到的外來抗原的抗體。抗體與補體系統(tǒng)相結合，指導著對含有靶抗原的細胞或有機體的破壞。另一種類型的效應細胞是自然殺傷細胞(NK細胞)，這是一種淋巴細胞，該淋巴細胞是具有自發(fā)識別并破壞多種病毒感染細胞和惡性細胞能力的細胞。我們對NK細胞所使用的識別靶細胞的方法知道的很少。
另一種類型的效應細胞——T細胞，含有被分為三種亞類的細胞，每一種業(yè)類都在免疫反應中起著不同的作用。輔助性T細胞分泌刺激其它細胞增殖的細胞因子，所述的其它細胞對發(fā)動有效的免疫反應是必需的；而抑制性T細胞對免疫反應進行負調(diào)節(jié)。第三類的T細胞——細胞毒性T細胞(CTL)能夠直接將細胞表面呈現(xiàn)有外來抗原的靶細胞溶解。主要組織相容性復合物和T細胞靶識別T細胞是抗原特異的免疫細胞，它們響應特異抗原信號而發(fā)揮作用。B淋巴細胞和它們產(chǎn)生的抗體也是抗原特異的實體。然而，T細胞與B細胞不同，它不與自由或溶解形式的抗原響應。當T細胞與抗原響應的時候，它需要抗原結合到一個被稱作主要組織相容性復合物(MHC)的呈遞復合物上。
MHC復合物蛋白提供了某些方法，通過這些方法，T細胞將外來細胞與自體細胞或自我細胞鑒別開來。存在兩種類型的MHC，I類MHC和II類MHC。輔助性T細胞(CD4+)主要與II類MHC蛋白相互作用，而細胞毒性T細胞(CD8+)主要與I類MHC蛋白相互作用。兩種MHC復合物都是跨膜蛋白，它們的大部分結構在細胞的外表面。此外，在兩種類型的MHC的外部都有一個肽結合裂隙。正是在這個裂隙中，自體或外來的小片段蛋白被結合并被呈現(xiàn)在細胞外環(huán)境中。
被稱作抗原呈遞細胞(APCs)的細胞，通過使用MHC復合物將抗原呈遞給T細胞。為了使T細胞識別抗原，抗原必須呈現(xiàn)在MHC復合物上以供識別。這種需要稱作MHC限制，而且就是通過這種機制T細胞將自我細胞從非我細胞辨別出來。如果一種抗原不能通過可識別的MHC復合物呈遞，T細胞就不會識別并作用于該抗原信號。對肽(結合于可識別MHC復合物的肽)特異的T細胞，結合到這些MHC-肽復合物上并且進行下一階段的免疫反應。
如上所述，瘤細胞在很大程度上被免疫系統(tǒng)忽視。研究者正在作出大量的努力，試圖利用宿主的免疫系統(tǒng)來幫助與宿主體內(nèi)出現(xiàn)的瘤細胞作斗爭。這些研究的其中一個領域涉及抗癌疫苗制劑?？拱┮呙鐚τ谀[瘤學家來說，受試者的免疫系統(tǒng)是在與癌癥的斗爭中可以使用的多種武器中的一種。已經(jīng)做過了多種嘗試來引起免疫系統(tǒng)與癌癥或腫瘤疾病作斗爭，不幸的是，迄今為止，結果很令人失望。一個特別重要的領域涉及抗癌疫苗的生產(chǎn)和使用。
為了產(chǎn)生疫苗或其它免疫原性的組合物，必須要給受試者引入一種可以引發(fā)免疫反應的抗原或表位。盡管瘤細胞衍生于正常細胞，并且因此在遺傳水平上與正常細胞基本相同，但是已知許多瘤細胞呈現(xiàn)出腫瘤相關抗原(TuAAs)。理論上講，受試者的免疫系統(tǒng)可以識別這些抗原并攻擊瘤細胞。不幸的是，宿主的免疫系統(tǒng)看起來卻忽視了瘤細胞。
研究者研究出了大量不同的策略，試圖產(chǎn)生出針對瘤細胞的活性疫苗。這些策略包括將腫瘤相關抗原作為免疫原。例如在美國專利No.5,993,828中描述了一種方法，該方法通過給予受試者有效劑量的、含有失活腫瘤細胞和至少一種腫瘤相關抗原的組合物，產(chǎn)生針對泌尿腫瘤相關抗原特殊亞單位的免疫反應，其中所述的失活腫瘤細胞在細胞表面含有泌尿腫瘤相關抗原，所述的腫瘤相關抗原是至少-種選自GM-2，GD-2，胚胎性抗原，和黑素瘤相關抗原的腫瘤相關抗原。因而，該專利描述了使用整體的，失活的腫瘤細胞作為抗癌疫苗中的免疫原。
抗癌疫苗使用的另一策略包括給予含有分離的腫瘤抗原的組合物。在一種方法中，MAGE-Al抗原肽被用作免疫原(見Chaux，P.，等，“通過MAGE-Al轉(zhuǎn)導的Dendritic細胞的體外刺激得到的、由細胞裂解T淋巴細胞識別的5種MAGE-Al的鑒別，”J.Immunol.，163(5)2928-2936(1999))。盡管接種方案的效果有限，但是已經(jīng)有幾個治療試驗將MAGE-Al肽用于接種。這些試驗中的一些試驗的結果在Vose，J.M.，“由T淋巴細胞識別的腫瘤抗原，”10thEuropean Cancer Conference，Day 2，Sept.14，1999.中討論。
在將腫瘤相關抗原用作疫苗的另一個實例中，Scheinberg等對已經(jīng)接受了5劑I類相關bcr-ab1肽的干擾素(INF)或羥基脲的12個慢性粒性白血病(CML)患者，給予了輔助肽和助劑QS-21。Scheinberg，D.A.，et al，“衍生于BCR-ABL斷裂點的癌基因融合肽疫苗在慢性粒性白血病(CML)患者中產(chǎn)生特異性免疫反應[Abstract 1665]”，American Societyof Clinical Oncology 35thAnnual Meeting，Atlanta(1999).在新鮮血液樣品中，誘導出了表明T輔助細胞活性的T細胞增生和遲發(fā)型超敏反應(DTH)，但是沒有觀察到細胞溶解殺傷T細胞的活性。
在Cebon等和Scheibenbogen等的近期工作中，可以看到試圖鑒定用作疫苗的TAAs的附加實例。Cebon等使用真皮內(nèi)給予MARI-126-35肽，伴隨皮下或者靜脈內(nèi)給予增量的IL-2的方法，對患有黑色素瘤的患者進行免疫。注意到在最初的15名患者中，1人完全緩解，1人部分緩解，一人有混合反應。T細胞產(chǎn)生的免疫測定包括DTH，在存在或者不存在IL-12的患者中觀察到了這種反應。在伴隨有臨床有益跡象的患者中，可以看到陽性結果的CTL測定，但是在沒有腫瘤退化的患者中卻看不到。Cebon，等，“在HLA A2+陽性的患有第III和IV期惡性黑色素瘤的患者中用Melan-A和IL-12免疫的第I期研究，”[Abstract 1671]，American Society of ClinicalOncology 35thAnnual Meeting，Atlanta(1999)。
Scheibenbogen等用4 HLA I類限制性酪氨酸酶肽對18名患者進行免疫，其中16名患者患有轉(zhuǎn)移黑色素瘤，2名為輔助患者。Scheibenbogen，etal，“在轉(zhuǎn)移黑色素瘤患者中用酪氨酸酶肽和GM-CSF接種第II期試驗，”[Abstract 1680]，American Society of Clinical Oncology 35thAnnual Meeting，Atlanta(1999)。在4/15的患者，2名輔助患者和2名出現(xiàn)了腫瘤退化跡象的患者中觀察到了增加的CTL活性。就像Cebon等的試驗中一樣，患有累進性疾病的患者沒有顯示增高的免疫力。盡管迄今為止作了多種嘗試來產(chǎn)生有效的抗癌疫苗，但是仍沒有研究出這樣的組合物。
保護病毒疾病的疫苗方法已經(jīng)獲得了許多成功?；蛟S這些成功中最有名的就是在天花疾病中取得的進步了，天花已經(jīng)滅絕。脊髓灰質(zhì)炎疫苗也獲得了類似程度的成功。
病毒疫苗可以被分為3類活的衰減病毒疫苗，例如天花牛痘，薩賓脊髓灰質(zhì)炎疫苗，麻疹病毒性腮腺炎和風疹；整體死亡或失活的病毒疫苗，例如Salk脊髓灰質(zhì)炎疫苗，甲型肝炎病毒疫苗和典型的流感疫苗；和亞單位疫苗，例如乙型肝炎。由于亞單位疫苗缺少完全的病毒基因組，它們比基于全病毒的那些疫苗在安全性上要好得多。
一個成功的亞單位疫苗的范例是基于病毒包膜蛋白的重組乙型肝炎疫苗。盡管學術界對于將亞單位的概念從單個蛋白上升到個體表位很感興趣，但是這些努力還沒有帶來很多成果。病毒疫苗研究同樣集中在誘導抗體反應，雖然細胞反應也會發(fā)生。但是，許多亞單位制劑在產(chǎn)生CTL反應方面特別差。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一些方法和組合物，這些方法和組合物用于使抗原呈遞細胞呈遞特殊的靶細胞特異的抗原表位，從而促進對靶細胞的延長的，定向的細胞毒性T細胞反應。含有看家表位的疫苗在本發(fā)明的一個部分中，提供了一種含有看家表位的疫苗，所述的看家表位衍生于與靶細胞相關的抗原。有利地，靶細胞可以是瘤細胞。瘤細胞可以是任何與實體瘤或淋巴瘤相關的轉(zhuǎn)化細胞，例如白血病，癌瘤，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。或者，靶細胞可以被細胞內(nèi)寄生物感染。例如細胞內(nèi)寄生物可以是病毒如腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒，人類皰疹病毒6，水痘-帶狀皰疹病毒，肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒，多瘤病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，或人T細胞白血病病毒。細胞內(nèi)寄生物可以是細菌，原生動物，真菌或朊病毒。更具體而言，細胞內(nèi)病毒可以是衣原體，李司忒氏菌，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次體，分支桿菌屬，利什曼蟲屬，錐蟲屬，弓形體和瘧原蟲。
看家表位可以衍生于與靶細胞相關的抗原?？乖梢允荕elanA(MART-I)，gp 100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16，TAGE，PSMA，PSCA，CT7，端粒酶，43-9F，5T4，791Tgp72，α-胎蛋白，β-HCG，BCA225，BTAA，CA 125，CA 15-3(CA27.29\BCAA)，CA 195，CA242，CA-50，CAM43，CD68\KP1，CO-029，F(xiàn)GF-5，G250，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB/70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG 16，TA-90(Mac-2結合蛋白\親環(huán)蛋白C-相關蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP，TPS，GA733-2\KSA等等。任選地，抗原可以是病毒相關抗原。在本發(fā)明的另一方面，抗原可以是寄生物相關抗原。
在本發(fā)明的另一方面中，看家表位可以包括或編碼一條長度為6-23個氨基酸的多肽。優(yōu)選地，該多肽長度為9-10個氨基酸。該多肽可以是合成多肽。有利地，該疫苗額外地包括緩沖劑，去垢劑，表面活性劑，抗氧化劑或還原劑。在該疫苗的另一方面中，看家表位包括核酸。在優(yōu)選實施方案中，看家表位對至少一條MHC等位基因特異。該等位基因可以編碼類型A1，A2，A3，A11，A24，A26，A29，B7，B8，B14，B18，B27，B35，B44，B62，B60，或B51。
在本發(fā)明的另一方面中，疫苗可以包括免疫表位。任選地，免疫表位衍生于與靶細胞相關的第二抗原。第一抗原和第二抗原可以相同也可以不同。有利地，看家表位對MHC第一等位基因特異，免疫表位對MHC的第二等位基因特異。第一等位基因與第二等位基因可以相同也可以不同。
在本發(fā)明的另一方面中，疫苗包括含有免疫表位的表位簇(見下面)。表位簇可以衍生于與靶細胞相關的第二抗原。第一抗原和第二抗原可以相同也可以不同。有利地，表位簇可以包括或編碼長度為至少10個氨基酸，但少于60個氨基酸的多肽。優(yōu)選地，表位簇的多肽鏈的長度小于大約80％，50％，或20％第二抗原的長度。
在本發(fā)明的另一方面中，疫苗還包括第二看家表位，該第二看家表位衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原。任選地，第一抗原和第一抗原可以相同?；蛘撸谝豢乖偷诙乖煌?。類似地，第一靶細胞和第二靶細胞可以相同也可以不同。
有利地，本發(fā)明的疫苗可以包括核酸構建體，該核酸構建體編碼衍生于靶細胞相關抗原的看家表位。優(yōu)選地，靶細胞是瘤細胞。瘤細胞可以是任何與實體瘤或淋巴瘤相關的轉(zhuǎn)化細胞，例如白血病，癌瘤，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。作為對比，靶細胞可以是被細胞內(nèi)寄生物感染的細胞，細胞內(nèi)寄生物可以是病毒。具體說，病毒可以是腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒I，單純皰疹病毒II，人類皰疹病毒6，水痘—帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I或人T細胞白血病病毒II。任選地，細胞內(nèi)寄生物可以是細菌，原生動物，真菌或朊病毒。更具體而言，細胞內(nèi)病毒可以是衣原體，李司忒氏菌，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次體，分支桿菌屬，利什曼蟲屬，錐蟲屬，弓形體和瘧原蟲。
含有核酸構建體的疫苗抗原可以是MelanA(MART-I)，gp 100(Pmel17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，和p16。任選地，抗原可以是與病毒或病毒感染相關的抗原。在另一種實施方案中，抗原是與非病毒細胞內(nèi)寄生物相關的抗原。
該看家表位優(yōu)選編碼一條長度為6-23個氨基酸的多肽。更優(yōu)選地，看家表位編碼一條長度為9-10個氨基酸的多肽。有利地，看家表位對至少一個MHC等位基因特異。該等位基因可以編碼類型A1，A2，A3，A11，A24，A26，A29，B7，B8，B14，B18，B27，B35，B44，B62，B60，或B51。
在本發(fā)明的另一方面中，疫苗含有免疫表位。該免疫表位可以衍生于與靶細胞相關的第二抗原。第一抗原與第二抗原可以相同也可以不同。優(yōu)選地，看家表位對MHC第一等位基因特異，免疫表位對MHC的第二等位基因特異。第一等位基因與第二等位基因可以相同也可以不同。
在本發(fā)明的另一方面中，含有核酸構建體的疫苗還額外地包括表位簇。表位簇含有免疫表位。優(yōu)選地，表位簇衍生于與靶細胞相關的第二抗原。第一抗原和第二抗原可以相同也可以不同。
有利地，表位簇包括或編碼一條長度為至少10個氨基酸，但少于60個氨基酸的多肽。在優(yōu)選實施方案中，表位簇包括或者編碼長度小于第二抗原長度大約80％的多肽。在另一個優(yōu)選實施方案中，表位簇包括或者編碼長度小于第二抗原長度大約50％的多肽。在特別優(yōu)選實施方案中，表位簇包括或者編碼長度小于第二抗原長度大約20％的多肽。
在本發(fā)明的另一方面中，含有核酸構建體的疫苗還包括第二看家表位，其中的第二看家表位衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原。第一抗原和第二抗原可以相同也可以不同。優(yōu)選地，第一靶細胞和第二靶細胞不同。核酸構建體本發(fā)明提供了包括第一編碼區(qū)的核酸構建體，其中的第一編碼區(qū)包括編碼至少第一多肽的第一序列，其中的第一多肽包括衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原的第一看家表位。第一編碼區(qū)還可以包括編碼至少第二多肽的第二序列，其中的第二多肽包括衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原的第二表位。第一多肽和第二多肽可以是鄰接的或者不鄰接的。第二表位可以是看家表位或者免疫表位。第一抗原和第二抗原可以相同也可以不同。同樣，第一靶細胞和第二靶細胞可以相同也可以不同。
靶細胞可以是瘤細胞，例如白血病，癌瘤，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。第一抗原可以是，例如，MART-I/MelanA，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，p15，NY-ESO，SSX基因家族成員的產(chǎn)物，CT-7，和SCP基因家族成員的產(chǎn)物。靶細胞可以被下列病毒感染，例如，腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒1和2，人類皰疹病毒6，水痘-帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I或人T細胞白血病病毒II。靶細胞同樣可以被細菌，原生動物，真菌，朊病毒和任何其它細胞內(nèi)寄生物感染，其實例包括衣原體，李司忒氏菌，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次體，分支桿菌屬，利什曼蟲屬，錐蟲屬，弓形體和瘧原蟲。
核酸構建體典型地包括與第一編碼區(qū)有效連接的第一啟動子序列。啟動子可以是，例如巨細胞病毒(CMV)，SV40和逆病毒長末端重復序列(LTR)。啟動子可以是雙向啟動子，和/或與第二編碼區(qū)有效連接的第二啟動子序列。核酸構建體還可以包括與第一編碼區(qū)、第二編碼區(qū)或兩者有效連接的聚合A序列。核酸構建體也可以包括內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列，泛素序列，自動催化肽序列，增強子，核進入序列，免疫刺激序列，和細胞因子、選擇標記、報告分子等的表達盒，等等。第一多肽的長度可以是7-15個氨基酸，優(yōu)選9或10個氨基酸。第二多肽的長度可以是9或10個氨基酸，或者可以是長度為大約10個和大約75個氨基酸之間的表位簇。第一表位和第二表位可以結合到相同或不同的MHC等位基因上。
本發(fā)明的其它實施方案包括含有任何上述核酸構建體的疫苗；通過給予此疫苗來治療動物的方法；和制造該疫苗的方法。表位簇的鑒定本發(fā)明的其它實施方案涉及表位簇區(qū)域的鑒別，這些表位簇區(qū)域用來產(chǎn)生能夠誘導受試者體內(nèi)發(fā)生免疫反應的藥物組合物，其中的受試者被給予了這種組合物。本發(fā)明的一種實施方案涉及衍生于與靶相關的表位簇，該表位簇含有或編碼至少兩個序列，這兩個序列對MHC受體肽結合裂隙有已知的或者預測的親和力，其中的表位簇為抗原片段。
在本發(fā)明的一方面中，靶是瘤細胞?；蛘撸幸部梢允潜患毎麅?nèi)寄生物感染的細胞。細胞內(nèi)寄生物可以是病毒，細菌或者原生動物。任選地，靶是一種病原體。病原體可以包括病毒，細菌，真菌，原生動物，朊病毒，毒素或毒液。
在本發(fā)明的另一方面中，MHC受體可以是HLA I類受體。類似地，MHC受體可以是HLA II類受體。
在本發(fā)明的另一方面中，這種簇包括或編碼具有一定長度的多肽，其中該長度最少是10個氨基酸。有利地，多肽的長度可以少于大約75個氨基酸。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了具有一定長度的抗原，其中的簇由一定長度的多肽組成或者編碼一定長度的多肽，其中多肽的長度小于抗原長度的大約80％。優(yōu)選地，多肽長度小于抗原長度的大約50％。特別優(yōu)選地，多肽長度小于抗原長度的大約20％。
本發(fā)明的另一實施方案涉及表位簇的鑒別方法，方法包含以下步驟提供與靶細胞相關的抗原序列；基于對MHC受體肽結合裂隙的已知的或者預測的親和力，給序列中的候選肽評分，以鑒定假定的MHC表位；鑒定抗原中的一個區(qū)域，其中該區(qū)域包括至少兩個假定MHC表位，而且該區(qū)域中所含有的假定MHC表位的密度要比整體抗原中假定MHC表位的密度要大。治療方法本發(fā)明類似地設計了一種治療動物的方法，方法包括給予動物含有第一看家表位的疫苗，其中的看家表位衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原。優(yōu)選地，給予步驟包括輸送方法，即經(jīng)皮膚的，經(jīng)結節(jié)內(nèi)(intranodal)，經(jīng)結節(jié)周(perinodal)，經(jīng)口的，靜脈內(nèi)的，真皮內(nèi)的，肌肉內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，或者粘膜的。
治療動物的方法還可以額外地包括一個測定步驟，該測定步驟用來確定表示靶細胞狀態(tài)的特征。有利地，測定步驟還可以包括第一測定步驟和第二測定步驟，其中第一測定步驟先于給予步驟，第二測定步驟在給予步驟之后。優(yōu)選地，將在第一測定步驟中確定的特征與在第二測定步驟中確定的特征進行比較以得出結果。結果可以是靶細胞數(shù)目減少，含有靶細胞的腫瘤的質(zhì)量和大小減小，或者感染靶細胞的細胞內(nèi)寄生物的數(shù)量或濃度的降低。
優(yōu)選地，靶細胞是瘤細胞，瘤細胞可以是任何與實體瘤或淋巴瘤相關的轉(zhuǎn)化細胞，例如白血病，癌瘤，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。或者，靶細胞可以被細胞內(nèi)寄生物感染。例如細胞內(nèi)寄生物可以是病毒如腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，人類皰疹病毒6，水痘—帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I或人T細胞白血病病毒II。細胞內(nèi)寄生物可以是細菌，原生動物，真菌或朊病毒。有利地，細胞內(nèi)病毒是衣原體，李司忒氏菌，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次體，分支桿菌屬，利什曼蟲屬，錐蟲屬，弓形體和瘧原蟲。
本發(fā)明的另一方面中，抗原是MelanA(MART-I)，gp 100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16。或者，抗原與病毒或病毒感染相關。在另一種實施方案中，抗原是與非病毒細胞內(nèi)寄生物相關的抗原。
看家表位可以含有或編碼長度為6-23個氨基酸的多肽。優(yōu)選地，多肽的長度為9-10個氨基酸。該多肽可以是合成多肽。疫苗可以額外地包括緩沖劑，去垢劑，表面活性劑，抗氧化劑或還原劑。有利地，看家表位可以包括核酸。優(yōu)選地，看家表位對至少一個MHC等位基因特異。該等位基因可以編碼類型A1，A2，A3，A11，A24，A26，A29，B7，B8，B14，B18，B27，B35，B44，B62，B60，或B51。
在本發(fā)明的另一個方面中，治療動物的方法還包括免疫表位。該免疫表位可以衍生于與靶細胞相關的第二抗原。任選地，第一抗原和第二抗原相同。看家表位可以對MHC的第一等位基因特異，免疫表位可以對MHC的第二等位基因特異。第一等位基因與第二等位基因可以相同也可以不同。
有利地，疫苗包括含有免疫表位的表位簇。表位簇可以衍生于與靶細胞相關的第二抗原。任選地，第一抗原和第二抗原相同。表位簇可以包含或者編碼長度為至少10個氨基酸并且小于大約60個氨基酸的多肽。
優(yōu)選地，表位簇包括或者編碼長度少于第二抗原長度大約80％的多肽。多肽的長度可以少于第二抗原長度的大約50％。在另一方面，多肽的長度可以少于第二抗原長度的大約20％。
治療動物的方法還可以包括第二看家表位，其中的第二看家表位衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原。第一抗原和第二抗原可以相同也可以不同。類似地，第一靶細胞與第二靶細胞可以相同也可以不同。
本發(fā)明同樣設計了一種治療動物的方法，方法包括向動物給予含有核酸構建體的疫苗。有利地，該核酸構建體編碼一種看家表位。其中的看家表位可以衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種制造疫苗的方法，該方法包括通過鑒定表位(所述的表位是通過看家蛋白酶，從特殊抗原源制造或者可能制造出來的)來選擇看家表位(所述的看家表位衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原)；制造含有看家表位的疫苗；和制備含有或編碼所選擇的看家表位的疫苗組合物。
本發(fā)明同樣提供了依照前述方法制造的疫苗。該疫苗可以被給予用以治療動物。因此，本發(fā)明類似地設計了用疫苗治療動物的方法?？醇冶砦缓推渌砦坏陌l(fā)現(xiàn)本發(fā)明的其它實施方案涉及對表位的鑒別(這些表位對產(chǎn)生能夠誘導受試者體內(nèi)免疫反應的疫苗有用，其中的受試者被給予了這種組合物)，尤其是對那些在發(fā)明實施方案中最有用的表位的鑒別。本發(fā)明的一種實施方案涉及發(fā)現(xiàn)表位的方法，該方法包括下列步驟從大量與靶細胞相關的抗原多肽片段中，選擇一種表位，其中的片段對主要組織相容性復合物I類受體的肽結合裂隙有已知的或者預測的親和力，其中被選擇的表位與靶細胞的蛋白酶體切割產(chǎn)物相對應。
本發(fā)明的另一種實施方案涉及發(fā)現(xiàn)表位的方法，該方法包括從靶細胞中提供一個序列，其中的序列編碼或者包含靶細胞中表達的蛋白；鑒別蛋白的肽段群，其中肽段群中的成員具有對主要組織相容性復合物I類受體的肽結合裂隙有已知的或者預測的親和力；從肽段群中選擇表位，其中的表位與靶細胞中活性蛋白酶體的產(chǎn)物相對應。
該實施方案的一個方面涉及用前述的方法發(fā)現(xiàn)的表位。該實施方案的另一方面涉及含有被發(fā)現(xiàn)表位的疫苗。本發(fā)明的另一方面涉及治療動物的方法，包括給予動物上述的疫苗。
本發(fā)明的一種實施方案涉及發(fā)現(xiàn)表位的方法，該方法包括的步驟有提供瘤細胞和一段序列，其中的序列含有或者編碼與瘤細胞相關的抗原；鑒別抗原的肽段群，其中的肽段群被預測對主要組織相容性復合物I類受體的肽結合裂隙有親和力；從肽段群中選擇表位，其中的表位通過體外分析被確定為是瘤細胞中活性蛋白酶體的蛋白酶體切割反應產(chǎn)物。
本實施方案的一個方面涉及用前述方法發(fā)現(xiàn)的表位。本實施方案的另一方面涉及含有被發(fā)現(xiàn)表位的疫苗。本發(fā)明的另一方面涉及治療動物的方法，包括給予動物上述的疫苗。
本發(fā)明的另一實施方案涉及發(fā)現(xiàn)表位的方法，該方法包括的步驟是從與宿主中的靶相關的抗原的肽段群中，選擇表位，其中的片段對宿主主要組織相容性復合物I類受體或II類受體的肽結合裂隙具有已知的或者預測的親和性，其中被選擇的表位與宿主細胞中抗原的蛋白水解切割產(chǎn)物相對應。
本實施方案的一個方面涉及用前述的方法發(fā)現(xiàn)的表位。本實施方案的另一方面涉及含有被發(fā)現(xiàn)表位的疫苗。本發(fā)明的另一方面涉及治療動物的方法，包括給予動物上述的疫苗。
附圖簡述

圖1圖解描述了涉及通過蛋白酶體來進行蛋白加工和表位呈遞的細胞部分。
圖2是看家蛋白酶體與免疫蛋白酶體的比較。
圖3圖解描述了被感染的細胞與pAPCs之間的表位同步。
圖4顯示了pAPCs和腫瘤細胞對不同表位的呈遞。
圖5顯示了pAPCs和被感染細胞對不同表位的呈遞。
圖6描述了由于IFN-γ的誘導，腫瘤細胞對看家和免疫表位的呈遞。
圖7顯示了誘導識別看家表位的T細胞對病毒感染細胞的攻擊。
圖8顯示了同時針對看家和免疫表位的雙重攻擊。
圖9描述了質(zhì)粒pVAX-EP1-IRES-EP2-ISS-NIS的組分。
圖10描述了質(zhì)粒pVAX-EP2-UB-EP1的組分。
圖11描述了質(zhì)粒pVAX-EP2-2A-EP1的組分。
圖12描述了質(zhì)粒pVAX-EP1-IRES-EP2的組分。
圖13描述了流式細胞儀分析的結果，證實了Melan-A表位結合了HLA。
圖14描述了流式細胞儀分析的結果，證實了酪氨酸酶肽207-216結合了HLA。
圖15描述了Melan-A(SEQ ID NO1)的序列，顯示I類HLA表位的群集。
圖16描述了SSX-2(SEQ ID NO2)的序列，顯示I類HLA表位的群集。
圖17描述了NY-ESO(SEQ ID NO3)的序列，顯示I類HLA表位的群集。
圖18描述了酪氨酸酶(SFQ ID NO4)的序列，顯示了通過序列線以上的BIMAS-NIH/Parker算法和序列線以下的SYFPEITHI/Rammensee算法進行預測的I類HLA表位的群集。
發(fā)明詳述本發(fā)明的實施方案提供了用來對靶細胞發(fā)動有效免疫反應的表位，疫苗和治療方法。本發(fā)明的主要基礎是這樣一個新穎的和意想不到的發(fā)現(xiàn)許多靶細胞呈現(xiàn)的表位與專門抗原呈遞細胞(pAPCs)呈現(xiàn)的表位不同。由于這種差別，pAPCs指導T細胞對在靶細胞上不被呈現(xiàn)的表位反應，T細胞因此無法識別靶細胞。本發(fā)明的方法和藥物可以使pAPCs呈遞出現(xiàn)在靶細胞上的相同表位，使得T細胞能夠正確識別并破壞靶細胞。
本發(fā)明的實施方案還提供了鑒定靶抗原的表位的方法，這些表位可以用來產(chǎn)生免疫上有效的疫苗。這些疫苗可以刺激免疫系統(tǒng)識別并破壞呈現(xiàn)被選擇表位的靶細胞。本發(fā)明的實施方案對于治療和預防癌癥和細胞內(nèi)寄生物的細胞感染特別有用，而且對治療和預防與其它病原體，毒素和致敏原相關的病癥特別有用。
某些類型的靶特別容易逃避免疫系統(tǒng)。包括許多種類的癌癥和被細胞內(nèi)寄生物感染的細胞，例如病毒，細菌和原生動物。研究者曾經(jīng)作了大量的工作來鑒定對產(chǎn)生有效的免疫反應有用的抗原和表位，但是收效不大。本發(fā)明提供了有效發(fā)現(xiàn)能夠有效對抗這種靶逃避現(xiàn)象的新一代有效表位的基礎。
本發(fā)明使選擇真正生物學相關的表位序列成為可能。具有生物學意義的表位(例如在刺激免疫反應中發(fā)揮作用)，必須對主要組織相容性復合物(MHC)受體肽的結合裂隙有親和性。在本領域中，眾所周知，有多種預測一個寡肽序列是否會具有MHC結合親和性的方法。然而，預測到具有MHC結合親和性的大多數(shù)序列沒有生物學相關性，因為它們實際上沒有在靶細胞或pAPC表面上呈現(xiàn)。
本發(fā)明的方法可以使疫苗設計者忽略那些盡管被預測具有MHC高結合親和性，但由于不能被靶細胞呈遞而根本沒用的肽。因此，本發(fā)明公開的方法和教導，為疫苗設計提供了一個較大的進步，這種進步將抗原序列分析的能力與免疫學基本事實相結合。此處講授的方法使得通過使用任何與需要的靶相應的多肽序列，簡單而有效的選擇對制造MHC I類和II類疫苗有意義的表位成為可能。
本發(fā)明的另一實施方案提供了用于疫苗和疫苗設計和表位的發(fā)現(xiàn)的表位簇區(qū)域(ECRs)。具體地，本發(fā)明的實施方案涉及對表位簇的鑒別，該表位簇用于產(chǎn)生指向靶細胞群的免疫活性組合物，并且用于不連續(xù)的看家表位和免疫表位的發(fā)現(xiàn)。在許多情況下，無數(shù)假定的I類MHC表位可以存在于單個靶相關抗原(TAA)中。這種假定的表位通常被發(fā)現(xiàn)在簇(ECRs)中，MHC表面抗原以相對高的密度分布在親本TAA的氨基酸序列的某些區(qū)域里。由于這些ECRs包括多個假定的表位，這些表位對于誘導免疫反應有著潛在的有用的生物活性，因此它們代表著一種非常好的原料，該原料被用于體內(nèi)或體外分析以鑒定對疫苗設計特別有用的表位。而且，由于表位簇本身可以在細胞內(nèi)被加工以產(chǎn)生活性MHC表位，所以這些表位簇可以在疫苗中被直接使用，表位簇中的一個或多個假定表位實際上被加工成活性MHC表位。
疫苗中ECRs的使用，為重組疫苗的制造提供了重要的技術進步，還在安全性上為現(xiàn)有的編碼整個蛋白序列的核酸疫苗提供了重要的有利條件。重組疫苗通常依靠微生物發(fā)酵罐中整個蛋白的昂貴的和工藝復雜的產(chǎn)物。ECRs提供了使用化學合成多肽的可供選擇的方法，極大地簡化了開發(fā)和生產(chǎn)，并且消除了多種安全上的考慮。類似地，使用編碼ECRs的核酸序列(通常，這是整個序列的相對短的區(qū)域)的能力，允許在開發(fā)和操作核酸基疫苗中使用合成寡核苷酸的化學方法，而不是使用涉及整個基因序列的、更昂貴的，耗時的，可能困難的分子生物學步驟。
由于與編碼整個蛋白(ECR從中被發(fā)現(xiàn))的核酸序列比較，ECR是由相對短的核酸序列編碼的，因而可以極大地提高核酸疫苗的安全性。在核酸疫苗領域的一個重要問題是這樣的事實疫苗的序列與被給予動物的序列之間的同源性程度，決定了疫苗序列整合到動物基因組中去的概率。核酸疫苗的主要安全問題是它們整合到基因組序列的潛能，這樣可能會導致基因表達異常和腫瘤轉(zhuǎn)化。食品與藥品管理局忠告核酸和重組疫苗應該含有盡可能少的與人類序列同源的序列。在傳送腫瘤相關抗原的疫苗的情況下，疫苗不可避免地含有與那些編碼患者腫瘤細胞中蛋白的核酸具有同源性的核酸序列。然而，最好限制這樣一些序列的使用，使其含有最低限度的為誘導治療性免疫反應所必需的表位的表達的序列。因此，ECRs的使用提供了雙重好處提供了最小同源區(qū)，同時又整合了具有潛在治療價值的多個表位。
在本發(fā)明的一些方面中，提供了編碼看家表位的核酸構建體?？醇冶砦?下面將會有非常詳細的描述)包括由周圍細胞的活性蛋白酶體產(chǎn)生的肽片段。本發(fā)明的基礎是這樣一個發(fā)現(xiàn)任何靶細胞相關抗原可以被分化加工成兩組不同的表位，用來被機體的I型主要組織相容性復合物(MHC)分子所呈遞?！懊庖弑砦弧北籶APCs呈遞，通常也被提呈在這樣的周圍細胞中，這些周圍細胞被急性感染或者被干擾素(IFN)分泌細胞活性免疫攻擊。相比之下，“看家表位”被所有的周圍細胞(通常包括瘤(癌)細胞和慢性感染細胞)呈遞。盡管宿主中存在機能免疫系統(tǒng)，但是這種被呈遞表位的不匹配或不同步性，成為癌癥和慢性感染的持續(xù)性和進展性的基礎。因此，在pAPCs和靶細胞中產(chǎn)生表位呈遞的同步性，以引發(fā)有效的、細胞毒性T細胞介導的免疫反應，是非常重要的。
能夠獲得同步性的最可靠手段就是給pAPCs提供看家表位。通常，通過提供一個以上的單一表位可以引發(fā)更強的反應。此外，一旦建立了對靶細胞有效地免疫反應，IFN的分泌會引起免疫蛋白酶體的表達，因此表位呈遞被轉(zhuǎn)換成了免疫表位。因為這個原因，在根據(jù)上面公開內(nèi)容而研制的疫苗中，除了看家表位，最好也包括免疫表位。以ECR的形式提供免疫表位更加有利。本發(fā)明的實施方案提供了以多種組合編碼看家表位和/或免疫表位的表達載體。優(yōu)選的表達構建體編碼至少一種能夠刺激對靶細胞發(fā)生免疫反應的表位。在本發(fā)明的一種實施方案中，靶細胞是瘤細胞。在另一種實施方案中，靶細胞是任何細胞內(nèi)被感染的宿主細胞。細胞內(nèi)感染物包括持續(xù)性病毒和任何其它具有細胞內(nèi)傳染期的傳染性有機體。
一些實施方案的核酸構建體涉及增強受試者的免疫系統(tǒng)并且使之對宿主內(nèi)存在的瘤細胞敏感化。另一些實施方案中，核酸構建體促進了對持續(xù)性病毒的感染和感染了細胞內(nèi)寄生物的細胞的根除。定義除非在其它情況下，從文章的前后關系中清楚本文術語的用法，下列的術語在本說明書中通常具有下文描述的意思。
專門抗原呈遞細胞(pAPC)-一種具有T細胞共刺激分子，而且能夠誘導T細胞反應的細胞。被清楚表征的pAPCs是樹突狀細胞，B細胞，巨噬細胞。
周圍細胞-不是pAPCs的細胞。
看家蛋白酶體-通常在周圍細胞中有活性，而且通常在DAPCs中不出現(xiàn)或者沒有很強活性的蛋白酶體。
免疫蛋白酶體-通常在pAPCs中有活性的蛋白酶體，免疫蛋白酶體在被感染組織中的一些周圍細胞中也有活性。
表位-能夠刺激免疫反應的分子或物質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)此處定義的表位包括但不必須限于多肽和編碼多肽的核酸，其中的多肽能夠刺激免疫發(fā)應。在其它的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)此處定義的表位包括但不必須限于呈現(xiàn)于細胞表面、非共價結合于I類MHC袋的肽，這樣它們可以與T細胞受體相互作用。
MHC表位-對哺乳動物I類主要組織相容性復合物(MHC)分子具有已知的或者預測的親和性的多肽。
ELA表位-對人類動物I類主要組織相容性復合物(MHC)分子具有已知的或者可預測的親和性的多肽。
看家表位-在優(yōu)選的實施方案中，看家表位被定義為多肽片段，該片段是MHC表位而且該片段呈現(xiàn)在這樣一種細胞上，在這種細胞中看家蛋白酶體為主要活性。在另一個優(yōu)選實施方案中，看家表位被定義為含有依照上述定義的看家表位的多肽，該多肽被一個到幾個附加的氨基酸側接。在另一個優(yōu)選實施方案中，看家表位被定義為編碼依照上述任何一個定義的看家表位的核酸。
免疫表位-在優(yōu)選的實施方案中，免疫表位被定義為多肽片段，該片段是MHC表位而且該片段呈現(xiàn)在這樣一種細胞上，在這種細胞中免疫蛋白酶體為主要活性。在另一個優(yōu)選實施方案中，免疫表位被定義為含有依照上述定義的免疫表位的多肽，該多肽被一個到幾個附加的氨基酸側接。在另一個優(yōu)選實施方案中，免疫表位被定義為包含表位簇序列的多肽，該多肽含有至少兩個對I類MHC具有已知的或者預測的親和性的多肽序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，免疫表位被定義為編碼依照上述任何一個定義的免疫表位的核酸。
靶細胞-被本發(fā)明的疫苗和方法所靶向的細胞。依照此定義的靶細胞的實例包括但不必要限于瘤細胞和寄居著細胞內(nèi)寄生物的細胞，例如，病毒，細菌和原生動物。
靶相關抗原(TAA)-靶細胞中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)或多肽。
腫瘤相關抗原(TuAA)-一種TAA，其中的靶細胞是瘤細胞。
要注意下面的討論闡明了發(fā)明者對發(fā)明操作的理解。但是并不能說該討論將本專利限制于權利要求中沒有闡明的任何特殊操作理論。不同的蛋白酶體產(chǎn)生不同的表位被I類MHC在pAPCs或周圍細胞表面所呈現(xiàn)的表位，是由蛋白酶體通過消化這些細胞中的蛋白而產(chǎn)生的。雖然有報道稱pAPCs與周圍細胞中的蛋白酶體并不是相同的，但是這種不同的顯著性迄今并不被人認同。本發(fā)明基于這樣一個事實當pAPCs和周圍細胞加工特定的TAA時，在pAPCs中有活性的蛋白酶體所產(chǎn)生的表位片段，與在周圍細胞中有活性的蛋白酶體所產(chǎn)生的表位片段不同。為了便于參考，而且依照上述的定義，在pAPCs中主要活性的蛋白酶體在此稱為“免疫蛋白酶體”，而在周圍細胞中有正?；钚缘牡鞍酌阁w在此稱為“看家蛋白酶體”。
不能過分夸大pAPCs和周圍細胞對TAAs差別加工的意義。這種差別加工為“為什么某些靶細胞對免疫系統(tǒng)的識別和攻擊有抗性”提供了統(tǒng)一標準的解釋。盡管pAPCs能夠攝取從靶細胞中流出的TAAs，并且將它們呈遞到其表面，但是pAPCs將因此刺激CTLs的產(chǎn)生來識別“免疫表位”(免疫蛋白酶體加工TAA而得到的表位)，而靶細胞呈現(xiàn)“看家表位”(通過看家蛋白酶體產(chǎn)生的明顯不同的TTA片段)。結果，在生理條件下的CTL反應被誤導，遠離了靶細胞上的表位。
由于CTL反應是由pAPCs誘導的，按照定義，它們靶向免疫表位而不是看家表位，因此不能識別靶細胞，這樣靶細胞可以在體內(nèi)存留。這種基本的細胞免疫反應的“表位區(qū)域化”，就是一些腫瘤細胞能夠持續(xù)形成腫瘤的原因，也是一些病毒和細胞內(nèi)寄生物能夠慢性感染細胞卻沒有被免疫系統(tǒng)根除的原因。關于傳染物，通常它們會導致它們所感染細胞的免疫蛋白酶體表達。這會導致在細胞表面產(chǎn)生與那些pAPCs呈遞給免疫系統(tǒng)相同的表位。這樣，傳染會導致在免疫系統(tǒng)和被感染細胞之間產(chǎn)生“表位同步性”，隨后感染細胞被破壞，并且從體內(nèi)清除出傳染物。在一些傳染物中，特別是那些能夠建立慢性傳染的傳染物中，它們在其感染的細胞中演化出了一種防止免疫蛋白酶體表達的方法。這些細胞中的蛋白酶體保持為看家形式，從而防止表位的同步性和防止CTL的攻擊。有重要的證據(jù)表明實際上所有慢性傳染物都使用一種共同的機制。
克服CTLs無法識別并根除某些靶細胞的一種方法是提供能夠“同步”表位呈遞的疫苗和治療方法。本文中的表位同步指的是使pAPCs呈遞看家表位，引起CTLs識別在靶細胞上呈現(xiàn)的看家表位，從而攻擊并消除靶細胞。
因此，本發(fā)明的實施方案對于處理包括實體瘤和淋巴瘤在內(nèi)的腫瘤疾病有用。本發(fā)明其它的實施方案可用于治療持續(xù)性病毒感染和寄生蟲感染，其中的傳染物有細胞內(nèi)傳染期。適當?shù)厥┯门c這種靶細胞相應的看家表位，可以激活特定的、針對靶細胞的細胞毒性T細胞反應。表位差別在癌癥中的作用在一些實施方案中，本發(fā)明涉及治療腫瘤性疾病的方法。癌癥是由單個異常細胞后代的進行性的，失控的生長而導致的。此處用到的術語“癌癥”包括腫瘤性疾病，瘤細胞，腫瘤，腫瘤細胞，惡性腫瘤和任何轉(zhuǎn)化的細胞，同時包括實體瘤和彌散腫瘤疾病。在歷史上，癌細胞曾經(jīng)通常被認為逃避了免疫系統(tǒng)的檢測和破壞，因為癌細胞含有與其它體內(nèi)非腫瘤細胞相同的遺傳物質(zhì)。體內(nèi)癌細胞與健康細胞的遺傳一致性或相似性，被認為在區(qū)別癌細胞和腫瘤細胞方面引起了困難，因此免疫系統(tǒng)無法發(fā)動有效地免疫反應，正如體內(nèi)癌細胞的持續(xù)性存留所顯明的。
相反，已經(jīng)有多種腫瘤相關抗原(TuAAs)被描述并且的確引發(fā)了免疫反應。無數(shù)的研究已經(jīng)描述腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)可以在體外殺死呈遞衍生于多種TuAAs的肽的靶細胞。然而，就像下面的進一步詳細討論中所描述的那樣，由于表位的差別，TILs無法控制癌癥，所述的表位是由下面的細胞產(chǎn)生和呈遞的誘導CTL活性的細胞，pAPC，和期望的靶細胞，即，腫瘤細胞。為了理解這種差別，必須理解蛋白酶體的功能和動力學。
所有細胞含有降解蛋白的蛋白酶體。這些占大約1％細胞總蛋白含量的蛋白酶體，被用來調(diào)控細胞中蛋白的半衰期。在蛋白降解的過程中，蛋白酶體產(chǎn)生絕大部分涉及I類抗原呈遞的肽段，而且蛋白酶體的切割方式影響了被呈遞在I類分子上的抗原表位的有效性(圖1)。這樣，細胞的蛋白酶體活性產(chǎn)生了MHC表位。然而，蛋白水解酶的活性在pAPCs中與在周圍細胞中相比，是明顯不同的。作為細胞免疫反應的一部分，pAPCs含有這樣的蛋白酶體，該蛋白酶體在感染時或者在接觸了不同細胞因子，特別是干擾素(IFN)后，組成性地結合那些典型情況下只在周圍細胞中表達的亞單位。如上所述，pAPCs和周圍細胞的不同蛋白酶體活性在此分別稱為免疫和看家蛋白酶體。
免疫和看家蛋白酶體具有在類似但不同的位置切割蛋白的能力。免疫蛋白酶體結合幾種使其與其看家蛋白酶體相區(qū)別亞單位。這些亞單位包括LMP2，LMP7，和MECL1，這些亞單位替代了看家蛋白酶體的催化亞單位，和PA28α，PA28β，這些亞單位提供調(diào)控功能(圖2)。總的來說，這些亞單位的結合引起免疫蛋白酶體與看家蛋白酶體的活性在數(shù)量上和質(zhì)量上的差別。盡管存在證據(jù)證明看家和免疫蛋白酶體產(chǎn)生的MHC表位，在看家和免疫蛋白酶體之間存在著明顯的不同，但是迄今這些差別僅在數(shù)量上進行了闡明。其它人認為免疫蛋白酶體介導的最終效應是促進產(chǎn)生更多的肽，而不是不同的肽。
在免疫和看家蛋白酶體之間的抗原加工的本質(zhì)上的區(qū)別，對疫苗設計有重要意義。IFN-γ是由T淋巴細胞產(chǎn)生的，它涉及促進細胞免疫反應的誘導并且誘導免疫蛋白酶體表達(如上所述)。特別是，IFN還可以在細胞被病原體感染的情況下，由任何其它細胞產(chǎn)生。在自然狀態(tài)下，病毒感染會典型地導致被感染細胞產(chǎn)生IFN，IFN隨后誘導細胞從看家蛋白酶體構型轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖叩鞍酌阁w構型。一種對此現(xiàn)象的解釋為根據(jù)被呈遞的抗原全部組分，用感染和隨后的IFNE調(diào)節(jié)來調(diào)整感染細胞，而pAPC呈遞的抗原全部組分參與刺激針對病毒的免疫反應。這樣使被感染細胞以與pAPCs中發(fā)生的抗原加工相同的方式，同時加工其內(nèi)源性“自我”蛋白(由該細胞正常表達)和涉及感染物的那些蛋白(非我)。將被感染細胞的蛋白酶體從看家構型轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖邩嬓停瑢е卤桓腥炯毎蚿APC細胞之間發(fā)生“表位同步”(圖3)。
對TuAAs特異的MHC I類限制性CTLs是針對癌癥免疫反應的重要組成部分。TuAAs是腫瘤特異T細胞反應的有用的靶子，它們不在正常細胞表面表達，或者它們被腫瘤細胞過表達，或者它們是腫瘤細胞的重要特征。對于本領域的技術人員，了解并且可以很容易地通過文獻獲得或者商購到多種TuAAs。
在一些腫瘤中，確實已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們在免疫蛋白酶體的IFN-γ誘導中存在缺陷。在這些情況中，CTL有可能靶向那些來自于被pAPC加工的TuAAs的免疫表位。盡管這些患者中有高數(shù)量的CTL對該免疫表位特別有活性，但是CTL卻不能發(fā)現(xiàn)癌細胞上的表位。疾病發(fā)展，到最后積聚的CTL無法定位靶細胞，出現(xiàn)功能障礙(Lee，等Nature Medicine(1999)5[6]677-685)。通過給pAPC提供看家表位，可以使pAPCs呈遞的表位和腫瘤呈遞的表位同步化，并且可以活化CTL群，這些CTL群識別那些呈遞在腫瘤上的看家表位。
因此，pAPCs中的免疫蛋白酶體和在周圍細胞中的看家蛋白酶體產(chǎn)生性質(zhì)上不同的表位，這一發(fā)現(xiàn)為為什么TILs不能根除腫瘤細胞提供了解釋。上述的加工機制解釋了T淋巴細胞是如何找到它們進入瘤塊的路徑的和為什么它們對腫瘤細胞相對不起作用。pAPCs的免疫蛋白酶體和腫瘤細胞的看家蛋白酶體之間的不同抗原加工，可以解釋在患有進行性癌癥的患者體內(nèi)，能夠觀察到特異針對TuAAs的高頻度出現(xiàn)的T淋巴細胞。Lee，等Nature Medicine(1999)5[6]677-685.(圖4)。
由于蛋白酶體活性的差別，包括腫瘤細胞和一些被病毒或其它細胞內(nèi)寄生物感染細胞在內(nèi)的周圍靶細胞(所有這些細胞表達看家蛋白酶體)，必須呈現(xiàn)與通過pAPCs調(diào)節(jié)T細胞而識別的表位信號不同的表位信號。鑒于本發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了令人感興趣的蛋白酶體免疫調(diào)節(jié)作用。此發(fā)現(xiàn)為免疫系統(tǒng)，特別是為pAPCs的操作提供了方法，該方法的目的是誘導由細胞介導的、對靶細胞發(fā)動有效地和致死地攻擊。
抗原加工的差異，解釋了為什么對TuAAs特異的CTLs常常會在TILs中被發(fā)現(xiàn)卻沒有根除疾病。T淋巴細胞反應主要是針對已經(jīng)被pAPCs加工的TuAAs。在TILs中發(fā)現(xiàn)的CTLs拼命地靶向那些呈現(xiàn)在pAPCs上的I型TuAAs，但卻不能靶向腫瘤細胞(圖4)。
腫瘤細胞在體內(nèi)的行為，也就是遷移、抗原流出、和炎癥反應誘導等，會引起強烈的免疫反應。不幸的是，腫瘤細胞和pAPCs之間不同抗原加工的自然機制，導致腫瘤表位隔離——即腫瘤具有與pAPCs不同的加工TuAA的表位標記，因此腫瘤抗原從這樣的表位中被“隔離”，所述的表位被pAPCs誘導的CTLs所識別。預測和對抗此表位隔離效應的能力，對于形成新一代的治療性癌疫苗非常重要。克服表位隔離就會使表位同步。表位差異在病毒感染和其它細胞內(nèi)寄生物感染中的作用為了在宿主有機體體內(nèi)建立慢性感染，持續(xù)性病原體使用了很多機制。一個常見的特征就是降低或改變抗原表達。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及治療和預防多種病原體引起的細胞內(nèi)感染。這些病原體的實例包括，但不僅僅限于任何病毒，細菌，原生動物，朊病毒或其它在宿主體內(nèi)具有細胞內(nèi)感染期的有機體。
pAPCs呈遞的病毒抗原起始于使用蛋白酶體將病毒抗原消化成肽。在蛋白酶體將蛋白消化成肽以后，一些肽被負載到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的I型復合物上并且被傳送到細胞表面。在細胞表面上，CTLs表面的T細胞受體識別I型一肽復合物，被感染的細胞被殺死。
皰疹病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒通過限制病毒基因表達來逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)測和隨后對其的消除。某些病毒還可以通過其它機制來逃避免疫系統(tǒng)，包括在重要病毒肽中的病毒感染和抗原變異的“免疫特權”位點。雖然這些模型可以解釋某些病毒的存留，但是表位同步的概念或者與之相反的表位區(qū)域化的概念，提供了一種解決辦法。也就是，這個概念為疫苗提供了基礎，該疫苗用來指導針對任何病毒或其它細胞內(nèi)寄生物的有效的細胞免疫反應，所述的病毒或其它細胞內(nèi)寄生物通過阻斷宿主細胞的免疫蛋白酶體表達或通過防止感染細胞和pAPCs之間的有效的表位同步來逃避免疫系統(tǒng)(圖5)。
由于任何被病原體感染的細胞通常會導致感染細胞產(chǎn)生IFN，所以典型地，被感染組織內(nèi)的蛋白酶體從看家構型轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖邩嬓汀Ｒ蚨?，根?jù)呈現(xiàn)于被感染細胞表面的抗原全部組分，感染具有對感染細胞進行調(diào)整的作用，并且pAPC表面的抗原的全部組分參與刺激針對病毒或其它細胞內(nèi)病原體的免疫反應。當病毒感染的細胞或寄生物感染的細胞被誘導表達免疫蛋白酶體，而不是看家蛋白酶體時，結果就是被感染細胞和pAPCs之間“表位同步”，進而由CTL根除感染的細胞。
但是，某些病毒和其它細胞內(nèi)寄生物可以下列方法來逃避T細胞識別負調(diào)節(jié)那些對T細胞有效識別感染細胞所必需的宿主分子的表達。存在證據(jù)顯示許多慢性病毒感染干擾了IFN級聯(lián)(見表1)。因此，由于看家蛋白酶體、免疫蛋白酶體和表位區(qū)域化的作用，在許多慢性感染中，本發(fā)明的一些實施方案同樣適用于對任何相關細胞內(nèi)寄生物的疫苗的設計，這些寄生物包括但不僅僅限于病毒，細菌和原生動物。所有細胞內(nèi)寄生物都是這種疫苗設計的靶。這些細胞內(nèi)寄生物包括但不僅僅限于病毒例如腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，人類皰疹病毒6，水痘—帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I或人T細胞白血病病毒II；細菌例如衣原體，李司忒氏菌，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次體，分支桿菌屬；原生動物例如利什曼蟲屬，錐蟲屬，弓形體和瘧原蟲。
表1
獲得表位同步的疫苗和方法如上討論，有效地細胞免疫基于pAPCs和被感染周圍細胞之間的同步化表位呈遞。在缺少表位同步的時候，即使T細胞被導向TAAs，靶細胞也不能被T細胞所識別。由于可以避免表位同步，癌細胞和寄居有持續(xù)性細胞內(nèi)寄生物的細胞逃避細胞內(nèi)免疫反應?！白匀坏摹北砦煌桨ㄔ诒桓腥炯毎械拿庖叩鞍酌阁w活化，這樣被感染的細胞呈遞免疫表位并且因此可以被經(jīng)pAPCs誘導的T細胞識別。但是癌癥和感染了持續(xù)性細胞內(nèi)寄生物的細胞沒有活化的免疫蛋白酶體，因此不能被正常的誘導的T細胞所識別。
因此，本發(fā)明優(yōu)選實施方案的疫苗和方法提供了一種“倒轉(zhuǎn)(reverse)”表位同步，造成pAPCs呈遞看家表位來面對靶細胞不呈現(xiàn)免疫表位的情況(圖6和7)。某些實施方案還通過誘導pAPCs同時呈現(xiàn)對應于被選擇靶細胞的看家表位和免疫表位，提供了的第二波表位同步。這樣，在這些雙重表位實施方案中，一旦靶細胞被識別看家表位的T細胞有效攻擊，靶細胞中的免疫蛋白酶體加工的轉(zhuǎn)換，不會導致免疫識別的損失。這是因為疫苗中存在免疫表位，該免疫表位的作用是誘導識別免疫表位的T細胞群。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及引起pAPC和pAPCs群呈遞看家表位的疫苗和方法，所述的看家表位與呈現(xiàn)在特殊靶細胞上的表位相符合。在一種實施方案中，表位是由特殊腫瘤類型的看家蛋白酶體加工的TuAA表位。在另一種實施方案中，看家表位是由病毒感染細胞的看家蛋白酶體加工的病毒相關表位。這促進了特異T細胞對靶細胞的反應。pAPCs的多個表位同時表達，對應于不同的誘導狀態(tài)(攻擊前和攻擊后)，可以在靶細胞呈現(xiàn)看家或免疫表位的時候，引發(fā)CTL對靶細胞的有效地反應。
通過在pAPC上同時呈現(xiàn)看家表位和免疫表位，該實施方案可以使細胞毒性T細胞對靶細胞的反應最優(yōu)化。伴隨著雙重表位表達，當腫瘤細胞在IFN的誘導下，其看家蛋白酶體轉(zhuǎn)換為免疫蛋白酶體的時候，pAPCs仍然可以連續(xù)維持對免疫型表位的CTL反應，IFN可以由例如腫瘤浸潤CTLs產(chǎn)生。
在優(yōu)選實施方案中，用包含看家表位的疫苗對患者進行免疫。許多優(yōu)選的TAAs只與靶細胞相關，特別是被感染的細胞。在另一種實施方案中，許多優(yōu)選的TAAs是在轉(zhuǎn)化細胞中失控的基因表達的結果，但是也可以在睪丸、卵巢和胎兒組織中發(fā)現(xiàn)。在另一種實施方案中，有用的TAAs在靶細胞中比在其它細胞中以更高的水平表達。在另一種實施方案中，TAAs與其它細胞比較，在靶細胞中并不差異表達，但是由于它們涉及細胞的特殊功能而且可以將靶細胞從其它大多數(shù)周圍細胞中區(qū)別出來，所以仍然是有用的；在這些實施方案中，同樣呈現(xiàn)TAA的健康細胞可能也會附帶地被誘導的T細胞反應所攻擊，但是這樣的附帶傷害比靶細胞所引起傷害要小得多。
當瘤細胞是靶的時候，優(yōu)選的抗原包括TuAAs。適合使用的蛋白抗原包括分化抗原例如MelanA(MART-I)，gp 100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，，和腫瘤特異的多系抗原(multilineage antigens)例如MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，和PRAME。類似地，TuAAs包括過表達的癌基因，和突變的腫瘤抑制基因例如p53，H-Ras，HER-2/neu。此外，染色體易位產(chǎn)生的獨特的TuAAs例如BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，和病毒抗原例如EB病毒抗原EBNA，并且包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它有用的蛋白抗原包括但是不僅僅限于TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23Hl，PSA，TAG-72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16。對于本領域的技術人員，這些和其它的TuAAs和病原相關抗原可以通過文獻獲得或者商購。
在另一的實施方案中，TAA是對病毒特異的抗原。見表2。在本發(fā)明的另一種實施方案中，TAA是對非病毒細胞內(nèi)寄生物特異的抗原。寄生物特異的抗原的實例包括核酸，蛋白，或其它與細胞內(nèi)寄生物相關的基因產(chǎn)物。適用的核酸和蛋白可以在NCBI分類數(shù)據(jù)庫中找到，網(wǎng)址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/。此網(wǎng)址提供了對寄生物和其它病原體基因產(chǎn)物的更為詳細的描述。
推測起來，多數(shù)由蛋白酶體或其它蛋白酶活性處理的蛋白加工產(chǎn)物，對特殊MHC受體肽結合裂隙只有很少的或沒有親和性。可是，通過細胞表面的MHC，可能會出現(xiàn)一定豐度的、具有這種親和性的加工產(chǎn)物。相反，如果特定的寡肽序列不能完整地從細胞的抗原加工活性中出現(xiàn)，它就不能被呈遞到細胞表面，這與此序列對MHC的預測親和性無關。
完全集中在MHC親和性上的疫苗設計是根本錯誤的。僅僅因為肽具有MHC結合親和性這樣一個事實，并不能保證這樣的肽將會成為功能免疫原。為了提供能夠誘導對TAA進行有效免疫反應的表位，肽必須具有MHC結合親和性而且肽必須是細胞肽產(chǎn)生系統(tǒng)的產(chǎn)物。本發(fā)明的方法同時利用了MHC結合親和性分析和抗原加工分析方法來鑒別感興趣的新表位。使預測的或已知的MHC結合與抗原蛋白水解加工相關聯(lián)為了鑒定作為免疫化合物的、潛在有效的表位，只是對MHC結合進行預測通常是不利的，因為許多預測結合的片段在細胞中實際上從來沒有形成。本發(fā)明的實施方案將MHC結合分析與蛋白水解加工分析結合了起來，來鑒定同時具有MHC親和性和正確蛋白水解加工兩個重要性質(zhì)的有用表位。同時具有這些特性的肽段是疫苗和免疫治療的有力的候選肽段。缺乏其中任何一種性質(zhì)的肽段都不太可能成為有效表位。
本發(fā)明的實施方案能夠鑒定用于疫苗的、衍生于TAAs的表位。靶抗原可能衍生于瘤細胞，感染了病毒或其它細胞內(nèi)寄生物的細胞，或者感染了其它致病物質(zhì)如細菌，真菌，原生動物，病毒，朊病毒，毒素，毒液，過敏源等等的細胞。簡而言之，本方法的實施方案可以被應用于實際上所有的蛋白序列，以鑒定其中的能夠通過蛋白水解作用產(chǎn)生的并且能夠結合于MHC的表位。因此，本發(fā)明不限制于任何特殊的靶或疾病，相反，本發(fā)明包括從任何有用的來源來發(fā)現(xiàn)生物學相關的MHC表位。
在優(yōu)選實施方案中，TAA是瘤細胞的特征，而且因此被定義為腫瘤相關抗原(TuAA)。優(yōu)選的TuAAs包括分化抗原例如MelanA(MART-I)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，p15；通常過表達的胚胎抗原；過表達的癌基因和突變的腫瘤抑制基因例如p53，Ras，HER-2/neu；染色體易位產(chǎn)生的獨特TuAAs例如BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR1，和病毒抗原例如EB病毒抗原(EBVA)和人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它感興趣的抗原包括前列腺特異抗原(PSA)，前列腺干細胞抗原(PSCA)，MAAT-1，GP-100，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，RAGE，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，TAG-72，CA19-9，CA72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p15，p16。也可以考慮其它靶抗原。
本領域中有許多眾所周知的方法可以用來鑒定TuAAs，這些技術的實例包括差異雜交，包括使用微排列技術；減數(shù)雜交克?。换蛘咴趍RNA水平或者在蛋白表達水平表達的差異顯示；EST測序；SAGE(基因表達序列分析)。這些核酸技術已經(jīng)被Carulli，J.P.等在J.Cellular Biochem Suppl.30/31286-296，1998.中綜述。蛋白的差異顯示包括，例如，對從正常組織和腫瘤組織中細胞溶解物的二維聚丙烯酰胺膠電泳的比較，對腫瘤中獨特的或過表達的蛋白斑點定位，從膠中回收蛋白，和使用傳統(tǒng)的生化技術或者質(zhì)譜分析測序技術鑒定蛋白。鑒定TuAAs的另外一種技術是SEREX技術，在 ，.，Sahin，U.，和Pfreundschuh，M.，的“人類腫瘤抗原的血清學分析分子定義及其意義”，Molecular Medicine Today，3342，1997.中討論。對這些方法和其他方法的使用，給本領域的技術人員提供了這樣的技術，這些技術對于鑒定產(chǎn)生看家與免疫I類表位的有用抗原和用于疫苗的II類表位的有用抗原是必需的。但是，在實施本發(fā)明時，并不是必須要鑒定新的TuAA或TAA。更確切地說，本發(fā)明的實施方案使得從任何相關蛋白序列中鑒定出有用的表位成為可能，不管這個序列是新的還是已知的。對MHC結合的TAA片段的分析為了鑒定生物學上相關的表位，TAA中對MHC具有已知的或預測的親和性的片段被鑒別出來?？梢杂迷S多不同的技術來分析TAA的氨基酸序列，這些技術用來鑒定對MHC肽結合裂隙具有已知的或預測的親和性的肽段。在本發(fā)明的一種實施方案中，使用計算機算法來分析TAA片段，預測它們結合到MHC肽結合裂隙的能力。MHC的每一個等位基因都對一個特殊的表位結合結構域特異。因此，對于任何特定的MHC等位基因，可以篩查候選肽段與其的預測的親和性。用于此目的的合適的計算機算法的實例包括Hans-Georg Rammensee，Jutta Bachmann，Niels Emmerich，Stefan Stevanovic的萬維網(wǎng)頁SYFPEITHIMHC配體和肽基元的因特網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(http∥access viasyfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)。從此方法得到的結果在Rammensee等的“MHC Ligands and Peptide Motifs，”Landes BioscienceAustin，TX，224-227，1997.中討論。另一個感興趣的站點是“http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind，”，此站點也包含合適的算法。該站點中的方法在Parker等的“Scheme for ranking potential HLA-A2binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains，”J.Immunol.152163-175.中討論。
使用NIH(Parker)算法和本發(fā)明的方法來選擇肽段將使用各種可能的駐留時間來顯示結合序列。在一種實施方案中，將選擇具有無限駐留時間的肽。在另一種實施方案中，將選擇駐留時間為25分鐘或更多時間的肽段來顯示結合序列。在另一種實施方案中，將選擇駐留時間為15分鐘或更多時間的肽段來顯示結合序列。在另一種實施方案中，將選擇駐留時間為10分鐘或更多時間的肽段來顯示結合序列。也可以考慮9，8，7，6，5，4，3，2，和1分鐘的駐留時間。
作為預測算法的一種選擇，一些標準的體外受體結合親和性分析可以用來鑒定對MHC特殊等位基因有親和性的肽。因此，通過本發(fā)明的這種方法，可以將起初的肽片段群范圍縮小到只包括那些對所選擇的MHC等位基因有實際的或預測的親和性的肽。
起初，用于分析的候選肽可以包括來自TAA全部蛋白序列的大約6-24個鄰接氨基酸的每一種可能序列。在優(yōu)選實施方案中，序列的長度可以是7-20個氨基酸。在更優(yōu)選方案種，序列的長度可以是8-15個氨基酸。對于通過預測對MHC I的親和性來鑒定片段的序列分析方法，最優(yōu)選的實施方案是分析TAA的9或10個鄰接氨基酸片段的所有可能序列。片段的MHC親和性分析，可以通過體外進行或通過片段計算機分析來進行。
在下面的表3-5中，報告了所選擇的常見MHC I等位基因，及其近似出現(xiàn)頻度。
表3.HLA-A抗原的估計基因出現(xiàn)頻度
d基因頻率b標準誤差表4.HLA-B抗原的估計基因出現(xiàn)頻度
a基因頻率b標準誤差c觀察到的基因數(shù)是零表5.HLA-DR抗原的估計基因出現(xiàn)頻度
a基因頻率b標準誤差表3，4和5來源于北美群體HLA基因和單倍體頻率The NationalMarrow Donor Program Donor Registry，Mori，M.等確定具有MHC親和性的片段是否是有用表位如上所述，本方法的最初步驟是從最初的肽片段群中選擇出帶有實際的或預測的MHC親和性的肽亞群。進一步對這些選擇的片段進行分析以確定哪些片段可以由細胞在體內(nèi)條件下產(chǎn)生，所述的體內(nèi)條件可以導致肽與被選擇的MHC等位基因結合。所有同時符合MHC親和性和正確蛋白水解加工這兩個標準的肽被叫做“被發(fā)現(xiàn)的表位”。許多方法可以被用來確定哪些肽段可以在體內(nèi)被蛋白水解加工所產(chǎn)生。這些方法包括從被溶解的MHC和完整細胞中洗脫，蛋白水解切割基元的計算機測序分析，和對由細胞蛋白水解機制所產(chǎn)生的實際肽段進行體外分析。
在優(yōu)選實施方案中，可以產(chǎn)生一系列的在中間含有單個的或者簇集的候選肽序列的合成肽。這樣的肽的典型長度范圍為大約10個到75個氨基酸。在優(yōu)選實施方案中，合成肽的長度為大約20-60個氨基酸。在更優(yōu)選實施方案中，簇的長度為大約30-40個氨基酸。通過使用標準肽合成化學，包括t-Boc保護化學(t-Boc protection chemistry)，F(xiàn)moc保護化學(Fmoc protection chemistry)等，本領域的普通技術人員可以生產(chǎn)出用于以后篩選的候選肽群。
作為選擇，可以在體外通過蛋白酶消化或化學切割TTA或其片段來產(chǎn)生含有候選肽的肽片段。用來制備這些TAAs片段的蛋白酶消化可以使用很多已知的蛋白酶，包括但不僅限于蛋白酶體蛋白酶，胰蛋白酶，-糜蛋白酶，波蘿蛋白酶，梭菌蛋白酶，彈性蛋白酶，內(nèi)切蛋白酶，外切蛋白酶，蛋白酶K，無花果蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，血纖維蛋白溶酶，嗜熱菌蛋白酶，凝血酶，胰蛋白酶，組織蛋白酶和其它酶。也可以使用化學方法來產(chǎn)生候選肽。用于切割肽鍵的適合的化學制劑或化學反應包括弱酸切割，溴化氰，羥胺，亞碘?；郊姿?，2-硝基-5-氰硫基苯甲酸鹽等等。在一種實施方案中，可以使用未被片段化的TAA，盡管使用特別大的起始序列會使分析復雜化。
不管含有候選肽的片段是如何產(chǎn)生的，確定哪些肽是由細胞機制制造的是重要的。在本發(fā)明的一種實施方案中，蛋白酶體消化被用來估計細胞表位產(chǎn)生。在這個實施方案中，純化免疫蛋白酶體和看家蛋白酶體，用于體外使用以評價由這兩種蛋白酶體天然產(chǎn)生的抗原的所有成分。
通常，通過使用親和純化法從細胞抽提物中制備蛋白酶體。在優(yōu)選實施方案中，使用標準技術來制備細胞溶解產(chǎn)物。如果紅血球不是最初的原料，就用超速離心法來清除細胞溶解物。而后，使用任何一種純化技術(包括多種形式的層析法)，將制備的細胞溶解產(chǎn)物從其它細胞組分中純化出來。
在一種實施方案中，用親和層析法來純化蛋白酶體。將細胞溶解產(chǎn)物加到含有單克隆抗體(mAb)的親和柱，所述的單克隆抗體對應一種蛋白酶體的亞單位。而后沖洗柱子以將結合的蛋白酶體從其它細胞材料中純化出來。沖洗后，將蛋白酶體從柱子上洗脫下來。根據(jù)標準底物上的蛋白含量和蛋白水解活性來表征洗脫液。
同時使用看家和免疫蛋白酶體的切割分析，從多種TAA中產(chǎn)生I類表位。被pAPCs呈遞的表位與免疫蛋白酶體切割產(chǎn)物相對應，而被腫瘤細胞和被細胞內(nèi)寄生物慢性感染的細胞呈遞的表位則與看家蛋白酶體的切割產(chǎn)物相對應。一旦進行了消化反應，產(chǎn)生的特殊分子種類就被鑒定出來。在優(yōu)選實施方案中，這是由質(zhì)譜分析來完成的。這樣允許快速鑒定由兩種蛋白酶體中的任何一種所產(chǎn)生的天然肽片段。在另一種實施方案中，通過使用計算機模型(此計算機模型基于相關蛋白溶解活性的切割基元)，來預測對靶抗原或其片段所進行的切割，這些切割是通過使用免疫和看家蛋白酶體或者通過使用內(nèi)體蛋白酶/溶酶體蛋白酶(見下面)進行的。
由于I類MHC在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起始折疊的時候，主要裝載蛋白酶體來源的肽，II類MHC的結合裂隙被此區(qū)域中所謂的恒定鏈(Ii)所阻斷。II類MHC的肽的裝載主要在內(nèi)體區(qū)域中，利用內(nèi)體蛋白酶和溶酶體蛋白酶所產(chǎn)生的肽進行。因此，如果需要體外鑒定MHC II類表位時，可以用來自內(nèi)體和/或溶酶體片段的蛋白酶制劑替代蛋白酶體。多種用來完成這一替代的方法在文獻中有描述。例如在Kido & Ohshita，Anal.Biochem.，23041-7(1995)；Yamada，等，J.Biochem.(Tokyo)，951155-60(1984)；Kawashima，等，Kidney mt.，54275-8(1998)；Nakabayshi & Ikezawa，Biochem.mt.161119-25(1988)；Kanaseki & Ohkuma，J.Biochem.(Tokyo)，110541-7(1991)；Wattiaux，等，J.Cell Biol.，78349-68(1978)；Lisman，等，Biochem.J.17879-87(1979)；Dean，B.，Arch.Biochem.Biophys.，227154-63(1983)；Overdijk，等，Adv.Exp.Med.Biol.，101601-10(1978)；Stromhaug，等，Biochem.J.，Biochem.J.，335217-24(1998)；Escola，等，J.Biol.Chem.27127360-5(1996)；Hammond，等，Am.J.Physiol.，267F516-27(1994)；Williams & Smith，Arch.Biochem.Biophys.305298-306(1993)；Marsh，M.，Methods Cell Biol.，31319-34(1989)；和Schmid & and Mellman，Prog.Clin.Biol.Res.，27035-49(1988)中均公開了制備合適的蛋白水解制劑的方法。
在另一種實施方案中，用來決定細胞機制產(chǎn)生哪些表位的消化作用發(fā)生在表達TAA或其片斷的細胞中。對于I型表位，優(yōu)選用，例如蛋白印跡，來確定由細胞表達的蛋白酶體類型。隨后，產(chǎn)生的MHC表位可以從溶解的和純化的MHC中洗脫下來，在Falk，K.等Nature 351290，1991中有描述，或者直接從完整細胞中洗脫下來，在美國專利5,989,565中有描述。隨后用質(zhì)譜法鑒定洗脫的片段。靶蛋白片段分析將用質(zhì)譜法測定的分子種類與上面預測的候選肽相比較。在I型表位的情況中，期望的分子種類與候選肽等長度或者比候選肽長，而且有共同的C末端；至少25個氨基酸的N末端修飾可以不依賴于蛋白酶體而發(fā)生(Craiu，A.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9410850-55，1997)。II類MHC對其所結合的肽的長度非常耐受，所以，基本標準并不是正確末端的產(chǎn)生，而是表位中間沒有被切割。
隨后，合成被選擇的消化產(chǎn)物并在分析方法中(如HPLC對消化等分)將其用作標準。這提供了對消化產(chǎn)物同一性的進一步檢查，而且使得其產(chǎn)量得到確定。在很少的情況下，多于一種的潛在的產(chǎn)物可能具有十分類似的質(zhì)量和化學性質(zhì)，使它們不能被這些方法可靠地區(qū)分開。在這些情況下，可以收集HPLC峰并且進行直接測序。對MHC結合肽的分析合成表位并測試其與MHC受體結合的能力。例如，在一種優(yōu)選分析中，呈現(xiàn)MHC I受體的細胞可以用于測定與被標記了放射性核素的候選肽的結合親和性。另一種優(yōu)選方法使用基于細胞培養(yǎng)的分析來測量肽與MHC I結合的能力。在該分析中，使用抗原加工相關轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)缺陷的細胞來確定候選肽是否有結合到MHC I受體的能力。TAP-細胞具有這樣的表型I類MHC蛋白不總是能夠正確折疊，因此降低或破壞了MHC I的表面表達。當細胞充滿了能夠結合到MHC I裂隙的外源肽的時候，受體的表達被恢復。這可以通過例如RIA，F(xiàn)ACS等幾種方法來監(jiān)控。通過使用TAP-細胞，本領域中的技術人員可以在不需要進行詳細結合親和性分析的情況下，篩查大量的用于受體結合的可能的候選肽。
本發(fā)明中各種實施方案中的分析方法，對于檢查由各種方法產(chǎn)生的候選肽非常有用。例如，所述的分析可以用來評價通過體外方法或者計算機分析產(chǎn)生的復合候選肽，以鑒定那些具有MHC受體結合特性的候選序列。本發(fā)明中此實施方案的優(yōu)選候選肽是這樣的肽早已明確它們是看家和/或免疫蛋白酶體的蛋白水解的產(chǎn)物。顯示的或預測的與MHC結合的切割產(chǎn)物，無論是體內(nèi)切割產(chǎn)物還是體外切割產(chǎn)物，都被適當?shù)胤Q為“發(fā)現(xiàn)的表位”。此處公開了與本發(fā)明相關的表位簇。ECRs被加工到pAPCs中的MHC結合表位免疫系統(tǒng)不斷地觀察體內(nèi)是否出現(xiàn)外來抗原，部分是通過pAPCs的活性。pAPCs吞噬在細胞外環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，將所發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)從多肽的形式加工成為短一些的、長度大約是3-23個氨基酸的寡肽，并且將一些所得到的肽通過pAPCs的MHC復合物，呈遞給T細胞。例如，溶解的腫瘤細胞將其細胞物質(zhì)(包括各種蛋白)，釋放到細胞外環(huán)境中。這些釋放的蛋白可以被pAPCs吞噬并加工為分散的肽，而后通過MHC呈現(xiàn)到pAPCs的表面。通過這種機制，不是整個靶蛋白呈現(xiàn)在pAPCs的表面，而是只有靶蛋白的一個或更多分散片段呈現(xiàn)為MHC結合表位。如果T細胞識別了被呈現(xiàn)的表位，該T細胞被活化而且引起免疫反應。
類似地，pAPCs上的清道夫受體(scavenger receptor)可以攝取裸露的核酸序列或含有靶核酸序列的重組有機體。核酸序列被攝取到pAPC中，隨后引起編碼產(chǎn)物的表達。如上，當ECR可以被加工到一種或多種有用的表位時，這些產(chǎn)物可以被作為MHC表位呈遞，供T細胞識別。
結合MHC的表位常常以簇的形式不均一地分布在蛋白序列中。本發(fā)明的實施方案涉及對靶蛋白特殊區(qū)域中的表位簇區(qū)域(ECRs)的識別。候選ECRs可能是不同蛋白水解酶的天然底物，而且可能被加工到一種或多種呈現(xiàn)在pAPC表面的MHC表位中。與傳遞整個蛋白或者生物制劑傳統(tǒng)疫苗相比，ECRs可以作為疫苗給予，以很高的概率引起至少一種表位呈現(xiàn)在MHC上，而不需要使用全長序列。ECRs在鑒定分散MHC結合表位中的應用鑒定用于疫苗的假定MHC表位通常包括使用分析蛋白或基因序列的可用的預測性算法來預測肽段對MHC的親和性。這些算法根據(jù)預測的親和性或其它與MHC結合相關的特性，對假定表位進行排序。此種分析的典型算法包括Rammensee和NIH(Parker)算法。可是已經(jīng)證明，將自然呈現(xiàn)在細胞表面的表位從那些通過使用這些算法預測的假定表位中分離出來，是一個困難且繁重的過程。ECRs在表位鑒定過程中的應用，可以大大簡化鑒別分散的MHC結合表位的任務。
在優(yōu)選實施方案中，在自動肽合成器上合成ECR多肽，隨后，使用蛋白水解酶體外消化這些合成的ECRs，所用的這些蛋白水解酶參與加工用于表位呈遞的蛋白。而后，使用質(zhì)譜和/或分析HPLC來鑒別消化產(chǎn)物，并使用體外MHC結合研究來評價這些產(chǎn)物實際結合MHC的能力。一旦ECRs中含有的表位顯示出結合了MHC，就可以將它們整合到疫苗中或者用于診斷，或者以分散表位的形式或者以ECRs結合的形式。
在這種優(yōu)選實施方案中對ECR的使用(因為序列相對短，它可以通過化學合成生產(chǎn))，比起在其他情況下所需要使用整個蛋白的情況來說，是一個重要的進步。這是因為必須使用重組表達載體體系和/或復合物純化步驟才能夠生產(chǎn)整個蛋白。使用化學合成的ECRs如此簡單，使得分析和鑒定大量的表位成為可能，而與當前使用的其它方法相比，大大降低了操作過程的時間和費用。使用定義的ECR同時也大大簡化了對消化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析，因為ECR消化產(chǎn)物僅是整個蛋白消化產(chǎn)物的一小部分。
在另一種實施方案中，編碼ECRs的核酸序列被用來表達細胞或細胞系中的多肽，以評價哪些表位呈現(xiàn)在表面。可以使用多種方法來檢測表面的表位。優(yōu)選實施方案包括細胞溶解和MHC親和純化，隨后對肽從MHC洗脫和分析；或從完整細胞洗脫表位；(分別地，F(xiàn)aLk，K.等Nature351290，1991，和美國專利5,989,565)。在一種對肽(以此種方法從MHC中洗脫的肽)進行分析的靈敏方法中，使用毛細或納毛細HPLC ESI質(zhì)譜分析和在線測序。含有ECRs的靶相關抗原可以限定ECRs的TAAs，包括那些來自TuAAs的TAAs，包括胎性癌，睪丸癌，失控基因(deregulated genes)，來自錯誤易位的融和基因，分化抗原，胚胎抗原，細胞周期蛋白，突變的腫瘤抑制基因和過表達的基因產(chǎn)物，包括癌基因。此外，ECRs可以衍生于病毒基因產(chǎn)物，特別是那些與導致慢性疾病或者致瘤相關的病毒，例如皰疹病毒，人乳頭狀瘤病毒，人類免疫缺陷病毒，和人T細胞白血病病毒。ECRs還可以衍生于寄生生物的基因產(chǎn)物，例如錐蟲，利什曼蟲，和其它細胞內(nèi)的或寄生的生物。
一些TuAA包括α-胎蛋白，癌胚抗原(CEA)，衍生于食道癌的NY-ESO-1，和SSX基因，SCP-1，PRAME，MART-1/MelanA(MART-1)，gp 100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，p15；過表達的癌基因，和突變的腫瘤抑制基因例如p53，Ras，HER-2/neu；染色體易位產(chǎn)生的獨特腫瘤抗原例如BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR1，和病毒抗原，EBNA1，EBNA2，HPV-E6，-E7；前列腺特異抗原(PSA)，前列腺干細胞抗原(PSCA)，MAAT-1，GP-100，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，RAGE，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23Hl，TAG-72，CA 19-9，CA72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p15，和p16。
對于病原體和腫瘤，還可以考慮許多其它TAAs。就TuAAs來說，本領域中有許多熟知的和可用的方法可以被用來鑒別那些與正常細胞相比，在瘤細胞中分化表達的基因與基因產(chǎn)物。這些技術的實例包括使用微排列技術的差異雜交，減數(shù)雜交克??；或者在mRNA水平，或者蛋白表達水平的差異顯示；EST測序；和SAGE(基因表達的序列分析)。這些核酸技術在Carulli，J.P.等，J.Cellular Biochem Suppl.30/31286-296，1998中被綜述。蛋白的差異顯示包括，例如，腫瘤和正常組織細胞溶解物的二維聚丙烯酰胺凝膠電泳比較，定位腫瘤中獨特的和過表達的蛋白質(zhì)漬點，從膠中回收蛋白，和使用傳統(tǒng)的生化技術或者質(zhì)譜分析測序技術鑒定蛋白。額外的鑒定TuAAs的技術是SEREX技術，在 ，.，Sahin，U.，and Pfreundschuh，M.，“人類腫瘤抗原的血清學分析分子限定及其意義”，Molecular Medicine Today，3342，1997中討論。
這些方法和其他方法的使用，給本領域的技術人員提供了這樣的技術，這些技術對于鑒定包含在靶細胞內(nèi)的基因和基因產(chǎn)物是必需的，所述的這些基因和基因產(chǎn)物可以被用作產(chǎn)生本發(fā)明表位的可能侯選蛋白。但是，在本發(fā)明的實施中，并不是必須要鑒定新的TuAA或TAA。更確切地說，本發(fā)明的實施方案使得從任何相關蛋白序列中鑒定出有用的表位成為可能，不管這個序列是新的還是已知的。蛋白序列分析來鑒定表位簇在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，ECRs的鑒定包括兩個主要步驟1.鑒定好的假定表位；和2.限定任何簇的范圍，其中表位定位在這些簇中。這兩個步驟中的每一個步驟都有多種優(yōu)選實施方案，并且第一個步驟中選擇的實施方案可以與第二個步驟中選擇的實施方案任意組合。此處公開的每一個步驟中的方法和實施方案僅僅是例證性的，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領域的技術人員能理解這些可以用來分析特異TAA的特殊方法，而且可以依照本發(fā)明用很多方法來實現(xiàn)這種分析。
用來鑒別好的假定表位的優(yōu)選實施方案包括使用任何可用的預測性算法，這些算法用來分析蛋白或基因的序列以預測肽段對MHC的親和性，或者根據(jù)預測的親和性或其它與MHC結合相關的特征來給假定表位排序。如上所述，可以用于這種類型分析的典型算法包括Rammensee和NIH(Parker)算法。同樣，可以通過直接或間接分析MHC結合來鑒定假定表位。為了選擇“好的”假定表位，有必要根據(jù)預測軟件報告的得分或者根據(jù)分析得到的結合親和性而設定截斷(cut off)點。在一些實施方案中，這種截斷是絕對的。例如，該截斷可以基于測定的或者預測的表位與所選擇的MHC等位基因之間的分離半衰期。在這些情況下，截斷的實施方案可以是任何大于例如0.5分鐘的分離半衰期；在優(yōu)選實施方案中，大于2.5分鐘；在更優(yōu)選實施方案中大于5分鐘；在非常嚴格的實施方案中，可以大于10或20或25分鐘。在這些實施方案中，好的假定表位是那些被預測或者被鑒別為具有良好MHC結合特征的表位，限定在定義截斷點的期望的一邊。同樣，截斷可以基于表位與所選擇的MHC等位基因之間的測定的或預測的結合活性。此外，絕對截斷可以僅僅是假定表位的一個選擇的數(shù)字。
在其它實施方案中，截斷是相對的。例如，可以用選擇的假定表位總數(shù)的百分比來建立截斷，該截斷用來將候選序列定義為好的假定表位。表位排序的性質(zhì)還是來自測定的或預測的MHC結合；用于這種決定的性質(zhì)可以是任何與MHC結合相關的或指示的性質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，可以將好的假定表位的鑒別結合排序候選序列的多種方法。在這樣的實施方案中，典型的好的表位是這樣的表位，它們或者基于不同的方法和參數(shù)，一致被認為是好的表位；或者至少在其中的一種方法中得到特別高的排序。
當幾種好的表位被鑒定出來時，可以通過它們之間的相對位置分析來確定用于疫苗或疫苗設計的最理想的簇。此分析基于TAA序列中所選擇表位的特征的密度。將這樣的區(qū)域叫做ECRs該區(qū)域具有特征的最高密度，或者具有高于某種選擇截斷的密度。本發(fā)明不同的實施方案使用不同的特征來進行密度分析。例如，一種優(yōu)選的特征只是出現(xiàn)任何好的表位(用任何合適的方法所定義的那樣)。在這個實施方案中，在密度分析中平等地處理所有高于截斷的假定表位，最好的簇是這樣的簇具有最高密度的好的假定表位/氨基酸殘基的簇。在另一種實施方案中，優(yōu)選的特征基于以前被用于計分的參數(shù)或用于排序假定表位的參數(shù)。在這種實施方案中，具有比另一種假定表位分數(shù)高一倍的假定表位，相對于另外的假定表位，在密度分析中被雙倍加權。其它的實施方案還考慮到得分或排序，只是進行了減權處理，例如，在密度分析中，使用得分的log或者平方根來給予一些假定表位比其它更多的權數(shù)。
依照所要分析的TAA的長度，可能的候選表位的數(shù)量，好的假定表位的數(shù)量，好的假定表位得分的可變性，和在任何特定分析中變得明顯的其它因素，本發(fā)明的各種實施方案可以單獨使用或者結合使用來鑒定在特定應用中最有用的ECRs。使用復合方法的迭代分析或平行分析在許多情況下有益。ECRs是鑒定真EMHC表位提高效率的工具，并且是將MHC表位有效“包裝”到疫苗中的工具。因此，此處描述的任何實施方案，或者基于本發(fā)明的、本領域內(nèi)的技術人員非常清楚的其它實施方案，對于提高通過在疫苗和疫苗設計中使用ECRs而不是使用整個TAAs所作的這些努力的效率，非常有用。
由于許多或大多數(shù)TAAs具有預測的MHC表位的低密度區(qū)域，所以使用ECRs提供了一種有價值的方法學，該方法學避免了在疫苗和表位鑒定方法中包含低表位密度區(qū)域。這樣有用的ECRs也可以被定義為不是整個TAA的TAA的任何部分，這些部分具有比整個TAA更高的假定表位密度，或者比任何具有特別低密度的假定表位的TAA區(qū)域更高的假定表位密度。因此，在本發(fā)明的此部分中，ECR可以是具有升高的表位密度的任何TAA片段。在一些實施方案中，ECR可以包括大約80％TAA長度的區(qū)域。在優(yōu)選實施方案中，ECR可以包括大約50％TAA長度的區(qū)域。在更優(yōu)選實施方案中，ECR可以包括大約30％TAA長度的區(qū)域。在最優(yōu)選實施方案中，ECR可以包括5％-15％TAA長度的區(qū)域。
在本發(fā)明的另一方面中，ECR可以根據(jù)絕對長度定義。因此，依照這種定義，9聚物(9-mer)表位的最小簇包括10個氨基酸殘基并且是具有8個共有氨基酸的兩個重疊9聚物。在優(yōu)選實施方案中，簇的長度在大約15-75個氨基酸之間。在更優(yōu)選實施方案中，簇的長度在大約20-60個氨基酸之間。在最優(yōu)選實施方案中，簇的長度在大約30-40個氨基酸之間。
實際上，如上所述，ECR鑒定可以使用簡單密度函數(shù)例如表位的數(shù)目除以那些表位跨度的氨基酸的數(shù)目。并不是必須要求表位重疊，但是單個表位的值是沒有意義的。如果只使用百分比截斷的單個值，而不使用表位預測的絕對截斷，在此步驟設定單一界限來限定簇是可能的?？墒牵瑫r使用絕對截斷和使用不同的百分比截斷來執(zhí)行第一步驟，可以在候選肽的總密度中產(chǎn)生變量。這些變量可能需要進一步計算或處理。例如，對于任何特定長度的蛋白，只考慮三個候選表位，與考慮30個候選表位相比，兩個表位的重疊對于前者更有意義?？紤]到這個特點，為了提高計算的意義，給予特殊簇的權數(shù)還可以除以實際被考慮的可能肽段部分。這將結果度量為親本蛋白中預測的表位的平均密度。
類似地，一些實施方案將好的假定表位的得分基于蛋白中每個氨基酸所考慮的肽的平均數(shù)。所得到的比率代表了這樣一種因素，通過這種因素，假定簇中預測表位的密度與蛋白中的平均密度不同。因此，ECR在一種實施方案中被定義為任何含有兩個或更多比率超過2的預測表位，也就是說，任何具有兩倍表位平均密度的區(qū)域。在其它實施方案中，如果比率超過1.5，3，4或5，或更多，此區(qū)域就被定義為ECR。
用靶蛋白中每個氨基酸的肽平均數(shù)來計算ECR的出現(xiàn)，可以使高度聚集的ECRs更加突出，而不用考慮單個組分的得分/親和性。這對于使用基于得分的截斷最為合適?？墒牵痪哂猩倭繑?shù)目高排序候選者的ECR可以比具有幾個密集但排序較低的候選者，更有生物學意義，特別是在只有小百分比的候選肽總數(shù)被指定為好的假定表位的時候。這樣，在一些實施方案中，考慮這些單個肽的得分是合適的。在上述的計算中，這可以非常容易地通過用假定簇中肽的得分之和，替代假定簇中肽的數(shù)目來完成。
這種得分和的方法對于含有高得分表位的分散填充的簇更加靈敏。因為由BIMAS-NIH/Parker算法產(chǎn)生的分數(shù)(即分離半衰期)的寬范圍可以導致單個高得分的肽，使其它可能的表位的貢獻相形見絀，在這一過程中優(yōu)選使用分數(shù)的log值，而不是分數(shù)本身。
多種其它運算在一種或另一種條件下可以被修改。一般而言，建立表位密度函數(shù)以使其與假定簇中預測的表位的數(shù)目，得分，排序成比例，并且與氨基酸的數(shù)目或者包含在假定簇中的蛋白片段成反比。作為選擇，被選擇數(shù)目的鄰接氨基酸的一個窗口可以用來評價函數(shù)。無論哪種情況，函數(shù)都要被整個蛋白中的所有預測的表位評價。如果假定簇(或窗口)與整個蛋白的值的比率大于例如1.5，3，4或5，或更多，ECR被定義。對MHC結合的靶基因產(chǎn)物的分析一旦TAA被鑒定出來，就可以使用蛋白序列來鑒定對MHC肽結合裂隙具有已知的或者預測的親和性的假定表位。肽片段的試驗可以體外進行，或者使用可以由計算機分析的序列來確定的肽片段與MHC受體結合。在本發(fā)明的一種實施方案中，對基于靶蛋白氨基酸序列的肽段進行分析，分析它們結合MHC肽結合裂隙的預測的能力。用于此目的合適的計算機算法的實例包括Rammensee/SYFPEITHI和NIH(Parker)站點，這些實例在以前的“表位發(fā)現(xiàn)部分”中作過討論。
作為預測性算法的選擇，可以使用許多標準的體外受體結合親和性分析來鑒定對特定MHC等位基因有親和性的肽。因此，通過使用本發(fā)明此部分的方法，可以將起始的肽群范圍縮小到這樣的范圍只包括含有對選擇的MHC等位基因具有實際或預測親和性的假定表位的肽段。所選擇的MHC的常見的等位基因，及其大約出現(xiàn)頻度，示于上面的表3-5中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，預測的表位通常聚集在TAA氨基酸序列的一個或多個特殊區(qū)域。對這些ECRs的鑒別，為設計刺激細胞免疫的有效疫苗，提供了一個簡單并且實用解決方法。對于需要免疫表位的疫苗，ECR被作為疫苗是直接有用的。這是因為pAPCs的免疫蛋白酶體可以對該簇進行正確的加工，釋放一個或多個含有的MHC結合肽，以同樣方法，含有免疫蛋白酶體的細胞加工和呈遞衍生于完全TAA的肽。該簇也是一種有用的原材料，用來鑒定由活躍在周圍細胞中的看家蛋白酶體產(chǎn)生的看家表位。對疫苗設計的額外考慮在人群中存在著無數(shù)的MHC I等位基因。因此，在優(yōu)選實施方案中，疫苗設計可以考慮患者的MHC I基因型，以傳遞含有對特殊患者MHC等位基因有合適結合親和性的表位。由于患者的相關基因座可能是純和的或者是雜合的，所以在本發(fā)明的一些實施方案中，優(yōu)選對單個MHC I等位基因最理想的表位，而在其它實施方案中，可以優(yōu)選對應不同MHC等位基因的表位。主要的I類MHC類型的部分列表(每種通常由復合等位基因編碼)和它們大約的出現(xiàn)頻度，在表6中報告。
表6
在本發(fā)明的另一種實施方案中，給pAPCs提供看家表位和表位簇。表位簇是含有或者編碼至少兩條具有對MHC I有已知的或者預測的親和性的序列。雖然優(yōu)選將看家表位以完全被加工的狀態(tài)提供給pAPCs，或者作為一種前體提供給pAPCs(以某種方式設計該前體，以使其可以在pAPCs中被加工為有效的看家表位)，免疫表位可以被pAPCs從更大的前體加工而成。這是因為免疫蛋白酶體在pAPC中有組成性活性，而且完全有能力將大概任何長度的合適前體加工成“正確”的免疫表位。
為了提供免疫表位，可能的表位通常但不總是在含有多個表位的TAA的分散片段的簇中被發(fā)現(xiàn)。僅僅給pAPC提供含有一個可能表位簇的多肽，或者編碼簇的核酸，或者表達簇的重組重組的有機體，就能夠使pAPCs產(chǎn)生至少一種合適的免疫表位。由于表位簇通常對超過一種的I類MHC等位基因含有可能的表位，所以在許多實施方案中，可以使用單個簇來產(chǎn)生對超過一種I類MHC等位基因有用的免疫表位。
在優(yōu)選實施方案中，給一位患者接種疫苗，該疫苗含有來源于所選擇TAA的看家表位。該看家表位可以是多肽，或者編碼多肽的核酸，或者被設計來表達分散表位的重組的有機體。除了這一含有看家表位(或者是多肽，核酸，或是重組重組的有機體)的“最小”的疫苗之外，本發(fā)明的實施方案包括額外含有一種或多種其它看家表位或者一種或多種免疫表位或者其任意組合的疫苗。這些表位可以衍生于相同TAA，或者衍生于不同的TAAs。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括疫苗的給予方法，該疫苗包含看家表位以誘導治療性免疫反應。疫苗給予患者的方法可按照本領域公知的方法進行。對給予TAAs表位的方法沒有限制，包括經(jīng)皮膚的，結節(jié)內(nèi)，結節(jié)周，經(jīng)口的，靜脈內(nèi)的，真皮內(nèi)的，肌肉內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，和粘膜給予。一種誘導CTL反應的特別有用的疫苗傳送方法，在PCT出版物No.WO 99/01283中公開，題目為“一種誘導CTL反應的方法”，申請日為1998年7月10日。
因為表位同步系統(tǒng)在誘導細胞介導的免疫反應中有用，所以誘導特異的T細胞對靶細胞進行反應的疫苗，同樣包含在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中。該疫苗含有能夠有效引起pAPC或pAPCs群呈現(xiàn)看家表位的看家表位濃度。有利地，疫苗可以包含多個看家表位，或者一種或多種任選地與一種或多種免疫表位結合的看家表位。疫苗制劑所含有的肽和/或核酸的濃度，要足以引起pAPCs呈現(xiàn)表位。該制劑優(yōu)選含有表位的總濃度大約為1μg-1mg/100μl疫苗制劑。本發(fā)明可使用常規(guī)的肽疫苗和/或核酸疫苗的劑量和配量，而且劑量服法在本領域被人熟知。在一種實施方案中，有利地，成人的單次劑量可以為該組合物的1-5000μl，一次給予或多次給予，例如2，3，4或更多劑量給予，間隔為1周，2周，1個月或更多。在特別優(yōu)選實施方案中，該組合物被連續(xù)給予，通過使用胰島素注射器，直接給予到淋巴結，給予率為至少1μl每小時，持續(xù)超過幾天。這種給予可以階段性反復進行以保持CTL反應，在PCT出版物No.WO 99/01283.中有更全面的描述。
本發(fā)明所公開的組合物和方法還可以考慮將助劑整合到制劑中以提高疫苗的性能。具體地說，設計在制劑中添加助劑，以提高pAPCs對表位的傳送或攝取。本發(fā)明考慮的助劑在本領域中被技術人員熟知，例如GMCSF，GCSF，IL-2，IL-12，BCG，破傷風類毒素，和骨橋接素/ETA-1。
在另一實施方案中，可以將與看家表位反應T細胞作為采用的免疫治療(adoptive immunotherapy)給予患者。這種T細胞最容易通過使用來自原初供體細胞的體外免疫得到，通過將患者用作供體也是可行的。體外免疫的技術在本領域中被人熟知，例如Stauss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897871-7875，1992；Salgaller等Cancer Res.554972-4979，1995；Tsai等，J.Iminunol.15 81796-1802，1997；和Chung等，J.Immunother.22279-287，1999。也可以考慮將免疫的供體或者患者本身用作T細胞原材料。(實例見Oelke，M.等Cliii cancer Res.61997-2005，2000；Gervois,N.等Clin cancer Res.61459-1467，2000；Valniori，D.等cancer.Res.592167-3173，1999；Tsai，V.等Crit.Rev.Immunol.1865-75，1998；Matsunaga，K.等Jpn..JJ Cancer Res.901007-1015，1999；van Elsas，A.等Eur J.Immwzol.261683-1689，1996；和Alters，S.E.等Adv.Exp.Med.Bio/.417519-524，1997)。一旦產(chǎn)生，可以通過使用本發(fā)明的疫苗和/或細胞因子來進行刺激，利用體外擴充以得到足夠數(shù)量的這種T細胞(實例見Kurokawa，T.等，Int.J.Cancer 91749-746，2001)。這些T細胞可以組成識別一個或多個表位的克隆或多克隆群。典型地，大約105-108數(shù)量級的細胞傳遞到小鼠中，108-1011數(shù)量級的細胞被傳遞到人體中(實例見Drobyski，W.R.等 Blood 972506-25 13，2001；Seeley B.M.等Otolaryngol.Head Neck Surg.124436-441，2001；20 Kanwar，J.R.等Cancer Res.611948-1956，2001；Plautz，G.E.等Clin.Cancer Res.62209-2218，2000；Plautz，G.E.等，.J.Neurosurg.8942-51，1998；和Plautz，G.E.等，Urology 54617-623，1999)。克隆和其它更富集的群體通常需要更少細胞的傳遞。識別的表位可以是看家表位或者是看家和免疫表位的結合。同樣可以預想，可以用遺傳工程在細胞系中表達克隆的TCRs，所述的細胞系適合用在采用的免疫治療當中。可以克隆有用TCRs的來源的實施例包括上述的T細胞，和用本發(fā)明的疫苗免疫了的HLA-轉(zhuǎn)基因小鼠。本領域的技術人員很清楚額外的變異。
在本發(fā)明的一些實施方案中，疫苗可以包括通過遺傳改造在宿主內(nèi)表達表位的重組有機體，例如病毒，細菌或者寄生蟲。例如，單核細胞基因李斯特桿菌(Listeria monocytogene)(革蘭陽性，兼性細胞內(nèi)細菌)是一種強有力的將TuAAs靶向免疫系統(tǒng)的載體。在優(yōu)選實施方案中，該載體可以被改造來表達看家表位以誘導治療反應。這種有機體的正常感染途徑是通過內(nèi)臟，而且可以經(jīng)口傳遞。在另一種實施方案中，編碼TuAA看家表位的腺病毒(Ad)載體可以用來誘導抗病毒和抗腫瘤反應。衍生于骨髓的樹突狀細胞可以被病毒構建體轉(zhuǎn)導并被隨后注入，或者病毒可以經(jīng)由皮下注射直接被傳送到動物體內(nèi)而引起可能的T細胞反應。另一種實施方案使用重組痘苗病毒，該病毒被設計成為編碼對應TAA看家表位的氨基酸序列。以微基因結構攜帶具有合適核苷酸替代構建體的痘苗病毒，可以指導看家表位的表達，引起治療性T細胞針對表位的反應。
依照本發(fā)明，在此公開了被用作疫苗的特別有用的核酸構建體。編碼表位的載體構建體本發(fā)明提供了用作治療性疫苗的核酸構建體。該構建體包括一個編碼區(qū)，該編碼區(qū)含有編碼多肽的序列。此多肽是TAA的表位。在一種優(yōu)選實施方案中，靶細胞是瘤細胞而且多肽是TuAA的表位或者表位的前體。在另一個實施方案中，靶細胞是任何感染了細胞內(nèi)寄生物的細胞。此處用到的術語“寄生物”包括任何有機體或者感染物例如在宿主體內(nèi)有細胞內(nèi)感染期的病毒。這些寄生物包括但不僅限于病毒例如腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，人類皰疹病毒6，水痘—帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I或人T細胞白血病病毒II；細菌例如衣原體，李司忒氏菌，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次體，分支桿菌屬，和原生動物例如利什曼蟲屬，錐蟲屬，弓形體和瘧原蟲。
該核酸構建體編碼的多肽可以包括TAA的看家表位。在優(yōu)選實施方案中，該核酸構建體編碼復合看家表位。當該構建體編碼這樣的復合表位時，所有的復合表位都可以與單個TAA的不同片斷對應，或者他們可以與不同TAAs相對應。在優(yōu)選實施方案中，該核酸構建體含有看家表位和免疫表位。在另一種優(yōu)選實施方案中，該核酸構建體含有看家表位和表位簇區(qū)域。
在疫苗構建體同時編碼看家和免疫表位的優(yōu)選實施方案中，疫苗可以刺激針對呈遞任何一種表位的靶細胞的免疫反應，—即，免疫反應可以識別最初呈現(xiàn)在靶細胞上的看家表位，并且隨后還可以在IFN誘導后，識別靶細胞上呈現(xiàn)的免疫表位。
有利地，該核酸構建體還可以包括第三或者第四或者更多序列，這些序列分別編碼第三或者第四或者附加表位。這些表位可以衍生于單個TAA或者衍生于兩個或者更多不同TAAs，而且可以是看家或者免疫表位的任何組合。可以通過設計這些構建體來使之編碼相應于任何蛋白酶體活性的表位，所述的蛋白酶體活性可以在任何靶細胞或pAPC的抗原加工中起作用。
編碼的MHC表位的長度優(yōu)選7-15個氨基酸，更優(yōu)選的長度為大約9或10個氨基酸。雖然通常與MHC I結合的肽的大小優(yōu)選9個氨基酸，短一些或者長一些的肽也可以在一些情況下結合MHC I。同樣，許多比9個氨基酸長得多的肽可以被細胞中固有的外肽酶或者其它蛋白酶所修飾，以產(chǎn)生能夠非常有效地結合MHC I的片段。含有免疫表位的肽的大小并不重要，只要序列包含此表位。這是因為pAPCs固有的免疫蛋白酶體，與外肽酶和其它蛋白酶協(xié)同修飾，以其正常的功能正確地加工全長TAAs以產(chǎn)生免疫表位。因此，編碼免疫表位的核酸序列實際上可以編碼大得多的前體，包括整個TAA。這種構建體優(yōu)選也可以編碼看家表位。
適用于本發(fā)明的TuAAs和其它TAAs的實例包括但不限于分化抗原例如MelanA(MART-I)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，和腫瘤特異的多系抗原例如MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，和PRAME。類似地，TuAAs包括過表達的癌基因，和突變的腫瘤抑制基因例如p53，H-Ras，HER-2/neu。此外，染色體易位產(chǎn)生的獨特TuAAs例如BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，和病毒抗原例如EB病毒抗原EBNA和人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它有用的蛋白抗原包括但是不僅僅限于TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，RAGE，NY-ESO，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16。對于本領域的技術人員，這些和其它的TuAAs和病原相關抗原可以通過文獻獲得或者商購。
在另一實施方案種，TAA是病毒特異的抗原。見上面的的表2。在本發(fā)明的另一種實施方案中，TAA是對非病毒細胞內(nèi)寄生物特異的抗原。寄生物特異的抗原的實例包括核苷酸，蛋白，和其它與細胞內(nèi)寄生物相關的基因產(chǎn)物。合適的核苷酸或者蛋白可以在NCBI分類數(shù)據(jù)庫中找到，網(wǎng)址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/。此網(wǎng)址提供了對寄生物和其它病原體基因產(chǎn)物的更為詳細的描述。
特別優(yōu)選的肽的長度大約是7-15個氨基酸。在Han-Georg Rammensee，Jutta Bachmann，和Stefan Stevanovic，的“MHC Ligands and PeptideMotifs，”Springer-Verlag，Germany，(1997)Landes Bioscience，Austin，Texas.中，提供了含有MHC結合基元的肽的廣泛列表。
被該構建體編碼的表位對一種或多種MHC I等位基因具有親和性。在一些實施方案中(這些實施方案中的患者是對MHC I雜合的)，該構建體可以編碼對應于不同MHC I等位基因的表位。
優(yōu)選的核酸構建體包括至少一個有效連接到該構建體編碼區(qū)5’末端的啟動子序列。本領域的技術人員能夠理解到可使用在哺乳動物細胞中有活性的任何啟動子。優(yōu)選的啟動子包括但不限于，CMV啟動子，SV40啟動子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子序列，并且還可以包括EF-1A，UbC，β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，該構建體可以包括兩個或者更多的有效連接到不同多肽編碼序列5’末端的啟動子。同樣，該構建體還可以使用增強子，核進入序列(nuclear import sequences)，免疫刺激序列(immunostimulatory sequences)，和細胞因子、選擇標記、報告分子等的表達盒，等等。此外，可以通過穩(wěn)定雜交的PNA肽核酸，將免疫刺激序列和其它調(diào)控序列加到載體上。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體還包括有效連接到編碼區(qū)3’末端的聚合A序列。圖9中描述了包括核進入序列和免疫刺激序列的核酸構建體。
在某些實施方案中，該核酸構建體編碼mRNA，該mRNA被翻譯成單個多肽，而后被切割。在這樣的一個實施方案中，多肽由表位線性排列組成，其中第一(N末端)序列為一個或多個免疫表位或者表位簇，而且第二(C末端)序列為看家表位，這樣，正確的看家表位的C末端被終止密碼確定，而且所有其它HLA表位末端被蛋白酶體加工和外肽酶修飾所確定。
在另一種優(yōu)選實施方案中，該核酸構建體編碼氨基酸序列，其中免疫表位或者表位簇被連接到泛素序列。泛素序列被類似地連接到看家表位。表位之間存在的泛素，促進了將免疫表位有效傳遞給蛋白酶體以進行表位加工。泛素序列(帶有或者不帶有N末端間隔物以保證前述肽的完整)位于第一和第二序列之間的結構中，或者位于任何其它表位編碼序列之間的結構中。這樣產(chǎn)生的序列1-泛素-序列2多肽在泛素-序列2連接處被泛素特異的加工蛋白酶快速(共翻譯)切割，產(chǎn)生序列1-泛素和序列2。(見圖10)生理學上，泛素主要作為一種信號，指導蛋白酶降解蛋白。它是真核細胞中最為保守的蛋白之一，在酵母和人類之間只有三個保守的氨基酸替代。盡管泛素的精確序列可能有些變化，但是優(yōu)選實施方案的序列用SEQ ID NO5代表。76個氨基酸長度的泛素具有兩個重要特征1、C末端的甘氨酸殘基，涉及蛋白底物的賴氨酸支鏈與泛素接合，和2、賴氨酸殘基，在48位，用來形成多-泛素鏈。
所有的泛素基因都是作為其它多肽的(包括其它泛素)融和體被合成的，從這種意義上說，泛素基因是獨一無二的。在酵母S.Cerevisiae中，鑒別出了4中泛素基因前三種(UBI1-3)融和到核糖體蛋白，第四種基因(UBI4)作為泛素序列的5個相同重復的融和體被合成。這樣，通過到處表達的泛素特異性水解酶，在共翻譯的蛋白水解加工后，天然地產(chǎn)生了無功能的泛素。這樣的天然有機體已經(jīng)通過在單個泛素部分和任何需要的多肽之間產(chǎn)生C末端融和體被利用。
泛素可以以兩種構象存在上述的第一種構象由單個泛素與任何所需多肽的線性融和組成，其中泛素的C末端甘氨酸，通過肽鍵，被連接到選擇的多肽的N末端氨基酸。第二種構象涉及通過形成甘氨酸-賴氨酸鍵，泛素部分與蛋白底物的接合。在這種情況下，泛素中賴氨酸的羧基被連接到暴露于溶劑的底物(或者另一個泛素部分)賴氨酸的ε(epsilon)支鏈。降解底物的泛素信號與第二種構象相關。這樣，在上述的序列1-泛素-序列2構建體中，典型地，蛋白酶體不靶向序列2。因此，序列2的位置被優(yōu)選用于完全加工的表位，或者只需要N末端修飾的表位，典型為看家表位。仍然連接在上述構建體中序列1上的泛素部分，可以在賴氨酸48位被聚遍在蛋白化(polyubiquitinated)，因此片段被靶向蛋白酶體得以加工，并且導致序列1中的含有的表位被釋放。應該注意到，如果超過兩個以上的序列被泛素部分線性連接到一起，那么通常只有最后的序列以序列2的方式工作；所有上游序列的加工類似于序列1的加工。在這個意義上，此處描述的構建體在pAPCs中表達，其中免疫蛋白酶體是主要活躍的，通過這些構建體對看家表位的正確表達，從序列2位置中的看家表位中獲益，或者從相對應位置中的看家表位中獲益，其中所述的相對應位置中的看家表位不需要pAPC中的蛋白酶體加工。
在另一種實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體可以含有編碼自動蛋白水解肽的序列。這些序列處在第一序列和第二序列之間或者在任何其它表位編碼序列之間。這些自動蛋白水解序列的實例包括inteins；還包括細小核糖核酸病毒，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒和其它腸道病毒，鼻病毒，心肌病毒和apthoviruse的3CPro和2APro蛋白酶，和equivalent cornoviridae蛋白酶。這些蛋白酶催化對該病毒家族制造的大前體多蛋白進行的翻譯后切割。
在一種實施方案中，自身催化蛋白序列被插入到兩個或多個表位之間。在另一實施方案中，該序列被插入到兩個或多個表位后，但是切割信號在表位之間被發(fā)現(xiàn)，這樣，它們被切割成兩個或者多個完全功能的表位。蛋白酶的類型并不重要，唯一重要的是合適的切割信號對于正確的表位加工應該是可用的。
因為切割位點和自身催化蛋白的序列是已知的(近來由Seipelt，J.等綜述Virus Research 62159-168，1999)，所以它們可以很容易地用來構建產(chǎn)生多蛋白和雙蛋白的載體。簡要的說，盡管其它非常臨近的位置也可能是重要的，但是3CPro主要將Q-G位點識別為切割信號。而且，一些這些病毒的3CPro并不完全遵守這種常用模式，這就給設計上提供了較大的靈活性。被這些需要強加的這種限制比實際更正式，特別是如果蛋白酶被置于表位之間表達的時候。在這種排列中，即使病毒蛋白酶沒能夠切割其N-末端，上游免疫表位仍可以被蛋白酶體加工釋放。用于C末端切割的主要殘基位于3CPro自身的內(nèi)側，如果有的話，通常留下正好1-4個殘基，被外肽酶修飾從看家表位下游的N末端去除。2APro可以以同樣方式使用，只是需要理解的是，雖然切割位點傾向于G-P，但是在這些病毒中有些更加易變。必須還要考慮2APro的表達可以導致宿主細胞的蛋白合成迅速，完全地關閉，這取決于它所衍生的病毒株。
嚴格的講，來自心肌病毒和apthoviruses(即口蹄疫病毒(FMDV))的2A蛋白不是蛋白酶，更確切的說，它在不導致翻譯終止的情況下，防止肽鍵在其C末端形成(Ryan，M.D.，等，Bioorganic Chemistry 2755-79，1999)。因此，通過將這些2A蛋白放置在表位之間，可以導致在單一讀碼框內(nèi)發(fā)生切斷。來自FMDV的2A蛋白是很小的，只有18個氨基酸，這使得它特別適合于復合表位表達。在圖11中描述了使用2A蛋白的質(zhì)粒。
在某些其它實施方案中，核酸構建體編碼被翻譯成2個或多個肽段的mRNA。在一種這樣的實施方案中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以含有一個或多個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列，這些序列位于第一和第二序列之間或者任何其它表位編碼序列之間。IRES序列被細小核糖核酸病毒天然地使用，用來指導mRNA的內(nèi)部帽-獨立翻譯。這些IRES序列還可以允許獨立翻譯兩個或者更多來自相同mRNA的連續(xù)開放閱讀框。盡管不同構建體的IRES序列可能不同，在SEQ ID NO6中提供了一種優(yōu)選實施方案的IRES序列。每個表達表位的C末端由終止密碼決定。因此，編碼看家表位和編碼免疫表位的序列順序并不重要，這為質(zhì)粒構建提供了靈活度。任選地，編碼看家表位的序列可以在IRES序列之前，而且編碼免疫表位的序列可以連接于另一個IRES序列的末端。這樣的載體還可以有用地編碼兩個或更多看家表位。它們還可以允許各種上述的單個多肽構建體相互結合，以有效地表達復合表位。見圖12。
在某些其它實施方案中，核酸構建體編碼兩種或更多mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。每種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以編碼單個表位或者上述實施方案中描述的任何雙或者復合表位轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。兩種或者多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能是使用復合啟動子的結果。本領域的技術人員很清楚，使用超過一個拷貝的單個啟動子會導致質(zhì)粒在繁殖中不穩(wěn)定。因此通常優(yōu)選使用兩種(或更多)不同的啟動子。
兩種或者多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也可能是使用雙向啟動子的結果。雙向啟動子可以在很多種類的有機物中發(fā)現(xiàn)。這些啟動子的實例包括來自人的PDGF-A，來自產(chǎn)黃青霉的pcbAB和pcbC，嗜神經(jīng)性JC病毒，來自小鼠，狗和人的BRCA1。盡管對雙向啟動子的深入研究最近才開展，但是有關它們的序列、調(diào)控方面的信息，和其它有關它們是如何工作方面的錯綜復雜的信息越來越多。例如，具有全部轉(zhuǎn)錄活性的人轉(zhuǎn)鈷胺素II啟動子需要含有GC盒和E盒的69個堿基對(bp)的片段。二肽酰肽酶IV啟動子可以從兩邊以同樣的效率激活轉(zhuǎn)錄。大鼠線粒體RNA伴侶蛋白60和10頭與頭相連并且公用一個雙向啟動子。因而，已經(jīng)以這樣一種方式鑒別、測序并且克隆出了多種起作用的雙向啟動子，該方式可以使它們被用于核酸構建體來表達兩個基因。
因此，在優(yōu)選實施方案中，該核酸構建體含有雙向啟動子(例如，上面列出的那些)，這些雙向啟動子被連接到編碼看家表位或者其前體的核酸序列上。在特別優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體含有雙向啟動子，這些雙向啟動子被連接到編碼多個看家表位的核酸序列上。在另一種實施方案中，核酸構建體含有雙向啟動子，這些雙向啟動子被連接到編碼看家表位和免疫表位的核酸序列上，或者被連接到表位簇區(qū)域的核酸序列上。此外，雙向啟動子可以被正調(diào)控或者負調(diào)控。
當核酸構建體含有超過一個表位的時候，雙向啟動子可以以相近的數(shù)量表達多個表位，或者一些表位可以比另一些表位的表達水平高。作為選擇，一種表位是可誘導的而另一種是組成型的。這樣，可以實現(xiàn)表位的暫時調(diào)控，其中一種表位在治療中表達的早而另一種表達的晚。表位表達分析文獻中描述的幾種方法可以用來確定表位是否呈現(xiàn)在pAPCs中。一種不直接但是功效大的方法是使用I型四聚物分析來確定T細胞在給予看家表位前和給予看家表位后，在動物中的出現(xiàn)頻度。響應一種表位的T細胞克隆性擴增，只有在表位被pAPCs呈遞給T細胞的時候，才優(yōu)先地發(fā)生。因此，在對動物給予看家表位前和給予看家表位后，對特異性T細胞相對于看家表位的出現(xiàn)頻度進行測量，是一種確定表位是否呈現(xiàn)于pAPC的方法。給予表位后，對表位特異的T細胞的出現(xiàn)頻度增加，這說明表位被呈現(xiàn)到pAPCs上。其它確定T細胞出現(xiàn)頻率的方法例如限制稀釋分析或ELISPOT可以以相同的方式評價pAPCs呈遞的看家表位。類似地，可以使用任何確定動物中T細胞出現(xiàn)頻度的方法。
確定呈遞在pAPCs上的看家表位的直接方法涉及將pAPCs從給予了表位的動物中純化出來。在用看家表位給動物接種以后，通過使用指向呈現(xiàn)在pAPCs上的特異標記的單克隆抗體和親和性純化，例如使用固定到磁珠上的單克隆抗體，可以從周圍血單核細胞，脾細胞，淋巴細胞中收獲pAPCs。這種收獲的最佳時間是不定的，可以取決于被接種的動物，疫苗的本性，和其它包括劑量，給予位點，藥代動力學等因素。可以使用這種技術來富集天然血和脾細胞制劑中的pAPCs。隨后可以將富集的pAPCs用于指向被產(chǎn)生的T細胞克隆的增殖分析，其中的T細胞克隆對感興趣的看家表位有特異性。將pAPCs與T細胞克隆共同溫浴并且監(jiān)測T細胞的增殖活性，例如通過測量T細胞整合的放射性胸腺嘧啶。增殖現(xiàn)象說明pAPCs上的看家表位刺激了對看家表位特異的T細胞。
下面實施例的意圖只是為了闡明目的，而不能理解為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。實施例實施例1.作為看家或者免疫表位的HLA表位的蛋白水解特件使用下面描述的步驟，制備了13個氨基酸或者更多的、在中心含有候選HLA表位的合成肽。蛋白酶體從表達各自類型蛋白酶體的細胞中制備，例如紅細胞和Raji細胞分別用來制備看家蛋白酶體和免疫蛋白酶體。用蛋白酶體制劑消化肽，并且用質(zhì)譜分析鑒定所得到的片段。如果在那些片段中有一個片段與HLA表位共C末端，并且由含有看家蛋白酶體的制劑以有意義的產(chǎn)量產(chǎn)生，那么該HLA表位就是看家表位。類似地，如果那些片段中有一個片段與HLA表位共C末端，并且由含有免疫蛋白酶體的制劑以有意義的產(chǎn)量產(chǎn)生，那么該HLA表位就是免疫表位。A肽的合成構建合成多肽或者重組多肽，在這些多肽中包含有HLA表位和至少兩個臨近其末端的殘基。這些被加到特定HLA表位末端的殘基，為的是要保證蛋白酶體復合物處在與細胞內(nèi)類似的加工環(huán)境中，從而提高了其正常執(zhí)行其蛋白水解功能的可能性。如果必要，可以增加通常在臨近HLA表位末端發(fā)現(xiàn)的額外的殘基，以增加肽的溶解性。
由于其高疏水性，一些HLA表位呈現(xiàn)難溶性。一些肽特別難以純化，因為它們不溶于正常的層析洗脫液，或者由于它們不溶于消化緩沖液，因而一旦被純化，很難使用?？梢酝ㄟ^仔細選擇HLA表位周圍序列的哪一部分被包含在特定肽構建體中來避免這一問題，或者通過上一自然段提到的延長該序列來避免這一問題。如果HLA表位的臨近末端沒有可以幫助增加溶解性的殘基存在，可以用一個短的親水性序列來替代(例如-EAEAE)。這段序列要添加在HLA表位末端后的至少2-5個殘基，以保持蛋白酶體的天然末端切割位點。
在優(yōu)選實施方案中，使用標準Fmoc固相合成方法，在應用生物系統(tǒng)433A肽合成器上合成肽。合成器裝備有傳導回饋監(jiān)測系統(tǒng)(conductivityfeedback monitoring system)，該合成器可以增加序列的殘基延伸的反應時間，所述的殘基含有難于去保護和/或難于連接。合成了肽以后，使用三氟乙酸，在適當?shù)那宄齽┐嬖诘那闆r下，將肽從其支撐物上分離下來，用醚沉淀，而后凍干。
在首先用類似分析聯(lián)苯HPLC系統(tǒng)(similar analytical diphenyl HPLCsystem)形成一個梯度后，將粗肽在制備的聯(lián)苯HPLC柱(preparativediphenyl HPLC column)上純化。用電噴射質(zhì)譜測量法分析來自肽第一制備注射液的主要HPLC部分，以鑒定靶化合物。收集，集中并凍干來自后來注射液的相應的峰，用分析HPLC分析樣品的駐留時間和層析純度。這些被純化的肽為蛋白酶消化做好了準備。B、蛋白酶測定在下面的實施例2中，詳細描述了免疫或者看家蛋白酶體復合物的分離。
將純化的肽溶于適當?shù)木彌_液中，使?jié)舛却蠹s為1mM，而后加到大約2體積的蛋白酶體制劑中。制備復制消化液一份用于光譜測定分析，一份用于HPLC分析，使用陽性對照肽來制備額外的消化液，來證實所使用蛋白酶制劑的正常功能。下列肽適于被用作免疫蛋白酶體鑒定的對照肽MLLAVLYCLLWSFQTS(SEQ ID NO7)；HSYTTAEEAAGITILTVILGVL(SEQ ID NO8)；EAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPD(SEQ IDNO9)；EFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKI(SEQ ID NO10)；APEEKIWEELSVLEVFEGR(SEQ ID NO11)；和ELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO12).
帶有下劃線的殘基表示蛋白水解切割位點。肽FLWGPRALVETSYVK(SEQ ID NO13)適于用作看家蛋白酶體鑒定的對照肽。將消化液在37℃下平行溫育一段時間，而后加入三氟乙酸稀釋液停止消化，在干冰上凍結樣品。用Lasermat 2000(Finnigan Mat，LID，U.K.).基質(zhì)輔助的激光解吸-電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀分析一種復制消化液和陽性對照，其它的消化液留給HPLC。C.消化液的MALDI-TOF質(zhì)譜分析或者使用“肽”軟件(Lighthouse Data)，或者可以從ThermoBioanalysisLtd.，U.K.得到的軟件來對消化液進行分析。此軟件可以產(chǎn)生所有可能片段的序列和分子量，這些可能片段能夠同時滿足具有任何預測表位的正確C末端；而且含有該表位的全長序列或者更長的序列。
例如，如果HLA表位包含的肽是下面的序列AAMLLAVLYCLLSEIAAAEEE，其中帶下劃線的序列是HLA表位，那么該程序?qū)⑺邢旅娴男蛄需b定為可能有用的序列，而且會給每個序列指定分子量。
AAMLLAVLYCLLSEIAMLLAVLYCLLSEIMLLAVLYCLLSEILLAVLYCLLSEILAVLYCLLSEIAVLYCLLSEI
如果MALDI-TOF的結果顯示一種或多種這些分子量呈現(xiàn)在消化混合物中，那么就將相應的肽合成，純化，用質(zhì)譜儀鑒定，而后將其用于分析HPLC以同時建立標準駐留時間和質(zhì)量與峰面積的近似比率。隨后，使用相同的分析HPLC方法將保留的消化液稀釋在適當?shù)娜軇┲胁⑶易⑷?。如果消化液產(chǎn)生了駐留時間與標準駐留時間相同的好的產(chǎn)量峰，那么基本上可以確定這是由于消化液中的存在的那個序列導致的。如果出現(xiàn)了由其他可能產(chǎn)生片段所引起的模糊(這些片段會產(chǎn)生相同或者類似質(zhì)譜測量結果)，那么可以收集所懷疑的組分并且將它們用于C末端測序以確定同一性。實施例2.蛋白酶體復合物的純化。A.來自血細胞的蛋白酶體濃縮的紅血球袋來自地方血庫(HemaCare，Van Nuys，CA)。將每個袋子里的物質(zhì)倒入200ml離心管中，用PBS沖洗3遍，通過下列方式?jīng)_洗在Megafuge2.0水平轉(zhuǎn)頭(Heraeus，Southplainfield，NJ)中，以2000RPM在室溫下離心10分鐘。在最后一遍沖洗后，樣品被集中到一個容器中，以使試管中的可變形降低到最小，而后將其重新分到幾個離心管中。細胞被以2000RPM的轉(zhuǎn)速再次離心10分鐘。吸出剩余的PBS。將片狀沉淀物儲存在-70℃直到使用。B.來自腫瘤細胞的蛋白酶體復合物Raji細胞(一種Burkitt淋巴瘤細胞系)，是從ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)得到的。該細胞使用標準的細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)，而且用干擾素-γ(100-500U/ml)刺激(Pharmingen，San Diego，CA)。通過在培養(yǎng)物上使用免疫組織化學方法和通過對細胞裂解物樣品的SDS-PAGE，分別確證免疫蛋白酶體亞單位的表達。離心收集細胞，用PBS清洗，儲存在-70℃直到使用。C.蛋白酶體復合物的進一步加工將血細胞或者淋巴瘤細胞的片狀沉淀(冰凍的)在37℃水浴融化，在每個試管中加入雙蒸水。將細胞懸液在40ml鄧氏勻漿器中勻漿。此外，對于腫瘤細胞，勻漿的細胞在2000rpm下離心以去除細胞碎片。將上清液在40℃，10,000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，而后進一步在T-1270轉(zhuǎn)子(Sorval，Newtown，CT)中，40℃條件下以50,000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。
將勻漿通過濾膜以去除碎片，而后集中在一起。在集中的勻漿樣品中加入68％的蔗糖溶液。室溫下，將抗體-瓊脂糖凝膠制劑與勻漿在轉(zhuǎn)子中培育3個小時。將該懸液離心并用TBS清洗3遍，進一步在真空漏斗中清洗超過6-8遍。在PBS(pH7.6)中洗脫蛋白酶體，而且測定洗脫液的光密度。在40℃，使用纖維素膜MWCO 1000，在20mM的Tris溶液(pH7.6)中將蛋白酶體制劑透析過夜。第二天，通過微孔ULTRAFREE-1離心裝置(Millipore，Danbury，CT)的超濾作用，濃縮蛋白酶體制劑。而后將濃度為4mg/ml的蛋白酶體等分儲存在-20℃直到使用。通過對熒光底物或者對照肽(生產(chǎn)已知片段的對照肽)的消化作用，來測試蛋白酶體的活性和特異性。下面的肽適合作為用于免疫蛋白酶體測定的對照肽MLLAVLYCLLWSFQTS(SEQ ID NO14)；HSYTTAEEAAGITILTVILGVL(SEQ ID NO15)；EAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPD(SEQ ID NO16)；EFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKI(SEQ ID NO17)；APEEKIWEELSVLEVFEGR(SEQ ID NO18)；和ELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO19). 帶有下劃線的殘基表示蛋白切割位點。肽FLWGPRALVETSYVK(SEQ ID NO20)適于用作看家蛋白酶體鑒定的對照肽。D.蛋白酶制劑的定量和活性分析酶聯(lián)免疫反應(ELISA)被用來給上述的蛋白酶制劑定量。ELISA技術在本領域中被人熟知，而且在Ausubel，等的“分子生物學簡短方案(Short Protocols in Molecular Biology)”3rdEd.，Unit 11.2(1997)中被概論。產(chǎn)生單克隆抗人蛋白酶體抗體的雜交瘤細胞(MCP-21)，是從歐洲細胞培養(yǎng)收藏中心((ECACC)，UK)獲得的，并且該細胞通過使用標準細胞培養(yǎng)技術和設備保存。雜交瘤添加物(Gibco BRL，Rockville，MD)被加入到抗體產(chǎn)生細胞中。在大約2-3公升體積中，當細胞密度達到500,000細胞/ml的時候，通過離心作用去除細胞并收集上清液。通過使用Lambda 20分光光度計(Perkin Elmer，Norwalk，CT)來測定光密度(O.D.)，階段性地監(jiān)測培養(yǎng)基中mAb的分泌。
將上清液通過蛋白G瓊脂糖凝膠柱(Amersham/Pharinacia BiotechPiscataway，NJ)。用PBS清洗柱子，抗體被洗脫在pH 2.2的0.1M甘氨酸緩沖液中。在280nm處測定洗脫部分的光密度，收集陽性部分。在4℃，將抗體在2升的PBS中透析2天并且儲存直到使用。
將抗體結合到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠4B(Amersham Pharmaciabiotech，Piscataway，NY)上。用pH＝4的0.1M醋酸鈉鹽溶液，和pH＝8的0.1M硼酸鈉鹽溶液交替清洗5-7遍，最后懸浮于pII＝8的Tris緩沖鹽溶液(TBS)中。該制劑在4℃儲存直到使用。實施例3.使用算法模型產(chǎn)生預測的MHC I肽裂隙結合肽通過使用運算法則，產(chǎn)生了大量的候選MHC I結合肽，這些結合肽產(chǎn)生自人癌胚細胞抗原前體(CEA)的氨基酸序列(GENBANKACCESSION P06731)。如上所述，這種特殊的算法可以在＜＜htr//134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm＞＞中得到。一旦得到了算法，就可以提供CEA的氨基酸序列。接下來，選擇感興趣的表位長度(十體)和特定的MHC等位基因(H2-Db)的參數(shù)。隨后，提交數(shù)據(jù)來進行算法分析。結果見表7。
表7對H2-Db有預測親和性的CEA片段
上面的表任意去除小于15的得分。該算法可以產(chǎn)生小于15的得分。實施例4.使用免疫和看家蛋白酶體來消化肽前體以確定由蛋白水解消化產(chǎn)生的片段使用433A ABI合成器合成肽。使用Fastmoc化學，以0.25m摩爾的量產(chǎn)生肽。測定這些肽的溶解性，一旦溶解，制備2mM的溶液并且等分成25-30μl，-20℃儲存用于以后使用。進行定時的消化反應(典型地，由2μl的肽和4μl的蛋白酶體組成)，用t＝0作為對照，而且用水代替蛋白酶體與肽培育作為進一步對照。反應在37℃進行，通過在干冰上加入10％的TFA(三氟乙酸)來終止反應。而后用下面實施例5中描述的MALDI-TOF質(zhì)譜法(MS)分析冰凍的樣品。
在MS分析前，通過使用ZIP-TIP方法(Millipore，Boston，MA)，可以任選地對消化液執(zhí)行除鹽步驟。ZIP-TIP是一種特殊設計的、含有硅球樹脂床的吸管尖。樣品結合到用0.1％TFA預平衡過的尖上，而后，用50％乙腈1％TEA洗脫緩沖液洗脫。實施例5.用HPLC和質(zhì)譜測量法對相關蛋白水解片段進行鑒定和定量A治療學上感興趣序列的鑒定將感興趣的蛋白的氨基酸序列輸入計算機，使用Rammensee等的算法來產(chǎn)生9或10個氨基酸長度的、預測結合特殊HLA受體的序列。該算法還根據(jù)這些預測表位與結合基元的匹配程度將其排序。
而后構建合成肽(該合成肽含有被鑒定的可能表位的序列)使之包含表位候選序列和臨近其末端的至少3-5個殘基。這些加到特定HLA表位末端的殘基是要保證蛋白酶體復合物處在與細胞內(nèi)類似的加工環(huán)境中，從而提高了其正常執(zhí)行其蛋白水解功能的可能性。如果必要，可以增加通常在臨近HLA表位末端發(fā)現(xiàn)的額外的殘基，以增加肽的溶解性。
使用標準Fmoc固相合成方法，在應用生物系統(tǒng)433A肽合成器(應用生物系統(tǒng)，Norwalk，CT)上合成肽。合成器裝備有傳導回饋監(jiān)測系統(tǒng)(conductivity feedback monitoring system)，該合成器可以增加序列的殘基延伸的反應時間，所述的殘基含有難于去保護和/或難于連接。合成了肽以后，使用三氟乙酸，在適當?shù)那宄齽┐嬖诘那闆r下，將肽從其支撐物上分離下來，用醚沉淀，而后凍干。
而后將粗肽以0.5mg/ml的濃度溶解到適合的溶劑中。而后，使用0.1％TFA水-乙腈梯度在Shimadzu分析反相HPLC系統(tǒng)(Shimadzu科學儀器哥倫比亞，MD)上對5微升(5μl)該溶液進行分析。典型地，C-18硅柱(Machery-Nagel #720051.40，(Machery-Nagel GmbH，Germany))用于親水性肽，苯基硅柱(Vydac #219TP5415(The Separations Group，Inc.，Hesperia，CA))用于疏水性肽。所使用的梯度變化范圍為從親水性肽的0-40％乙腈，到疏水性肽的30-70％乙腈。隨后，使用類似的梯度和上述柱子(Machery Nagel #715802，和Vydac 219TP5 10)的半制備形式(semi-preparative versions)，將肽在Varian Prostar HPLC系統(tǒng)(Varian，Inc.，PaloAlto，CA)中純化。使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀來分析來自肽第一制備注射液的主要HPLC部分，以鑒定需要的組分。收集，集中并凍干來自后來注射液的相應的峰，用使用上述系統(tǒng)的分析HPLC來分析樣品的駐留時間和層析純度。這些被純化的肽為蛋白酶消化做好了準備。B.蛋白酶體測定通過上述的Levy方法(Morel，S.，等，免疫12107-117(2000)，和此處引用的文獻)分離免疫或看家蛋白酶體復合物。將純化的肽溶于適當?shù)木彌_液中，使?jié)舛却蠹s為1-2mM，而后加到大約2體積的蛋白酶體制劑中。所選擇的緩沖液必須使肽溶劑化而并不干擾消化過程。如前所述，制備額外的消化液用來作陽性對照肽，以證實所使用蛋白酶制劑的正常功能。將它們在37℃下平行溫育至120分鐘，而后加入三氟乙酸稀釋液停止消化；立刻用質(zhì)譜儀分析樣品，或者將它們在干冰上凍結直至用于分析。也可以通過將樣品置于冰上來中斷消化反應，用質(zhì)譜儀立即分析。C.消化液的MALDI-TOF質(zhì)譜分析在樣品載玻片上，將大約0.5μl的每種消化液與等體積的基質(zhì)溶液(70％EtOH中有10mg/ml的二羥基苯酸，pH＝2-3)直接混合，在大約40°C使其風干。而后將樣品在被適合分子量標準校準了的LasermatTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀(Thermo Bioanalysis，Santa Fe，NM)上分析。
用于蛋白酶體分析的計算機程序(或者是“肽”軟件(LighthouseData)，或者是“Dynamo”(ThermoBioanalysis Ltd.，U.K.))產(chǎn)生了所有可能片段的序列和分子量，這些可能片段能夠同時滿足具有任何預測表位的正確C末端；含有該表位的全長序列或者更長的序列。
如果MALDI-TOF的結果顯示一種或多種這些分子量呈現(xiàn)在消化混合物中，那么就將相應的肽合成，純化，用MALDI-TOF鑒定，而后將其用于分析HPLC以同時建立標準駐留時間和質(zhì)量與峰面積的近似比率。這些步驟與上述那些步驟很類似。而后，將復制的蛋白酶體消化液稀釋在適當?shù)娜軇┲胁⑶沂褂孟嗤姆治鯤PLC方法進行分析。如果消化液產(chǎn)生了駐留時間與標準駐留時間相同的好的產(chǎn)量峰，那么基本上可以確定這是由于消化液中的存在的那個序列導致的。如果出現(xiàn)了由其他可能產(chǎn)生片段所引起的模糊(這些片段會產(chǎn)生相同或者類似質(zhì)譜測量結果)，那么可以收集所懷疑的組分并且將它們用于C末端測序以確定同一性。分析HPLC同樣重要地提供了消化液中肽產(chǎn)物的相對準確的定量，這就可以確定某一特定肽究竟是消化的主要產(chǎn)物還是次要產(chǎn)物，這顯示了表位是否可以由蛋白酶體有效地生產(chǎn)。使用上述的方法，看家表位被鑒別出來。圖13顯示了流式細胞分析的結果，來證實這些表位與HLA結合。該測定的結果在實施例6中討論。實施例6.被選擇肽的MHC結合能力的確定依照Stauss等的方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17)7871-5(1992))分析候選肽對HLA-A2.1的結合。將T2細胞(該細胞在其表面表達空的或者不穩(wěn)定的MHC分子)清洗2遍并以5×106細胞/ml的濃度懸浮于無血清的完全Iscove’s modified Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)中。加入β2微球蛋白(Sigma，St.Louis，MO)使?jié)舛葹?μg/ml，將細胞分布到96孔U型底板中使細胞濃度為5×105細胞/孔。將肽以100，10，1和0.1μg/ml的濃度加入。將板輕柔搖動2分鐘，而后在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4個小時。用IMDM清洗兩遍以去除未結合的肽，而后加入飽和數(shù)量的單克隆抗體W6/32(Sigma)。在4℃培養(yǎng)30分鐘后，用添加了2％熱失活FCS，0.1％(w∶v)疊氮化鈉，pH7.4-7.6(著色緩沖液)的PBS清洗細胞，在4℃下與結合了異硫氰酸熒光素(FITC)的羊F(ab’)抗鼠免疫球蛋白G(Sigma)一起培養(yǎng)30分鐘，而后象以前那樣清洗4遍。將細胞重懸于著色的緩沖液并且通過加入四分之一體積的2％仲甲醛來使之固定。使用FACScan(BectonDickinson，San Jose，CA)，對被肽結合所穩(wěn)定的表面HLA-A2.1分子進行流式細胞分析。
實驗結果見圖14。使用上述討論的方法，發(fā)現(xiàn)由蛋白酶體消化所鑒定的候選酪氨酸酶看家表位(酪氨酸酶207-216，F(xiàn)LPWHRLFLL SEQ IDNO78)與HLA-A2.1結合的程度，與已知A2.1結合物FLPSDYFPSV(SEQID NO79)(陽性對照)的結合程度類似。將HLA-B44結合肽AEMGKYSFY(SEQ ID NO80)作為陰性對照。從陰性對照獲得的熒光，與在分析中沒有使用肽時所獲得的信號類似。陽性對照肽與陰性對照肽選自通用免疫學方案(Current Protocols in Immunology)p.18.3.2，John Wiley和Sons，紐約，1998.中的表18.3.1。實施例7.腫瘤，組織樣品，永生化細胞系，或腫瘤細胞系中的HLA表位的洗脫并不是通過體外蛋白水解來產(chǎn)生HLA表位，而是可以通過質(zhì)譜分析方法，在這些表位從腫瘤，組織樣品，腫瘤細胞系或其它永生化細胞系的HLA中被洗脫后，對其進行鑒定。盡管可以使用許多這樣的方法，但是從細胞表面鑒定表位的最有力的一種方法包括毛細或者非毛細HPLCESI質(zhì)譜分析和在線測序，該方法在出版文獻中有描述。溶解的HLA和完整細胞的洗脫步驟分別描述在Falk，K.等Nature 351290，1991和美國專利5,989,565中。但是，在文獻中沒有描述如何鑒別那些表達在細胞(經(jīng)歷肽洗脫和分析的細胞)中的蛋白酶體的類型，進而確定所鑒別的表位是否是看家表位，這是制造有效疫苗所需要的。為了明確地鑒別HLA表位是看家表位或者是免疫表位，通常必須要知道源細胞所表達的是哪種蛋白酶體。優(yōu)選使用蛋白印跡法來評價蛋白酶體的表達，該方法在下面詳述，還可以用RT-PCR，免疫組織化學，或者原位雜交方法來評價蛋白酶體的表達。實施例8.干擾素誘導測試區(qū)別看家表位和免疫表位的另一種分析方法，是測定抗肽CTL殺死表達所述TAA的細胞的能力。IFN可以被用于誘導免疫蛋白酶體的表達(假設其并不是組成性表達的)，而且被誘導的細胞和未被誘導的細胞的CTL識別能夠進行比較。如上，蛋白酶體的類型應該由例如蛋白印跡法確定。如果干擾素誘導的細胞被優(yōu)先殺死，那么肽組成免疫表位。如果干擾素未誘導的細胞被優(yōu)先殺死，那么肽組成看家表位。一些表位可以同時被兩種蛋白酶體以不同的效率產(chǎn)生，在這種情況下要同時觀察兩種類群的細胞溶解活性。因為它們呈現(xiàn)在周圍靶細胞中，所以這些表位被分類為看家表位。實施例9使用人周圍血單核細胞(PBMCs)或腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)鑒定看家表位通過使用出版文獻中描述的常用方法，可以使用從患者組織活檢中分離的TILs，或者使用來自供體或患者血液的PBMCs來鑒定表位。為了鑒定看家表位，需要證實用于測試被PBMCs或TILs活性殺死的靶細胞只表達看家蛋白酶體而且不以有意義的水平表達免疫蛋白酶體。使用一組這樣的肽抗原來體外刺激來自供體血的PBMCs該抗原對所使用的血細胞上表達的I類HLA等位基因具有預測的親和性。每一個PBMC樣品都用特異I型肽抗原刺激一周，優(yōu)選結合使用細胞因子例如IL-2或者IL-12來提高T細胞活性。該刺激至少要重復3次以誘導T細胞特異指向該肽的無性擴增。使用這樣的靶細胞執(zhí)行標準的鉻釋放分析已知該靶細胞表達含有表位的蛋白而且只表達看家蛋白酶體。使用鉻釋放來測定殺死靶細胞的證據(jù)，證據(jù)顯示用于刺激PBMCs的肽，被作為看家表位呈現(xiàn)在靶細胞表面。因此，表達這種蛋白的腫瘤成為含有這種表位的疫苗的候選靶。實施例10.用蛋白印跡法鑒定看家蛋白酶體和/或免疫蛋白酶體下面的方案都是起始于一張薄膜，感興趣細胞中抽提出來的蛋白在進行了電泳分離后，被轉(zhuǎn)移到這張薄膜上。
A.顯色方案1.室溫下，在軌道振動器(RT/shaker)上，在20ml PBS-T(磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4+0.1％吐溫-20)中洗膜5分鐘。
PBS(Sigma，Cat.No.P-3813)(自始至終，體積可以隨著容器類型的變化而變化).
2.在RT/shaker上，在3％H2O2的20mlPBS-T中，將膜培育5分鐘2ml 30％H2O2+18ml PBS-T3.在RT/shaker上，用PBS-T洗膜5分鐘，洗3遍。
4.在4℃，在RT/shaker上，在含有5％脫脂奶粉的20mlPBS-T中封閉過夜20ml PBS-T+1g奶5.在PBS-T中沖洗膜。
6.在RT/shaker上，將膜在5ml的、含有一抗(親和性研究產(chǎn)物公司，英國聯(lián)合王國(Affinity Research Products Ltd，UnitedKingdom))的封閉緩沖液里培育2小時α-LMP2抗血清(小鼠)(Cat.No.PW8205) 1∶5000α-LMP2抗血清(人)(Cat.No.PW 8345) 1∶10000
α-LMP7抗血清(Cat.No.PW8200) 1∶20000α-20S蛋白酶體α2亞單位單克隆抗體(Cat.No.PW 8105) 1∶1000這些條件只是對于前面的抗體。每種抗體的條件必須以經(jīng)驗確定。
7.按照步驟3清洗膜。
8.在RT/shaker上，將膜在5ml的、含有二抗(載體實驗室，有限公司.(Vector Laboratories，Inc.)，Burlingame，CA)的封閉緩沖液里培育30分鐘GARB(羊抗兔)(對于抗血清)(載體實驗室(Vector Laboratories)Cat.No.BA-1000)1∶2000馬抗鼠(對于單克隆抗體)(載體實驗室(Vector Laboratories)Cat.No.BA-2000)1∶10009.按照步驟3清洗膜。
10.將膜在5ml的、含有ABC(載體實驗室(Vector Laboratories)，Cat.No.PK-6100)的PBS-T里培育30分鐘至少在使用前30分鐘，如下制作ABCA＝5ul/1ml＝25ul/5mlB＝5ul/1ml＝25ul/5ml5ul A+5ul B＞混和＞4℃靜置＞加入990ul PBS-T使用前在PBS-T中稀釋ABC。
使用前，在PBS-T中稀釋ABC11.按照步驟3清洗膜。
12.檢測1)將5ml 0.2M的PB轉(zhuǎn)移到第一個15ml試管中0.4M磷酸緩沖液90.4ml磷酸二氫鈉(1M)619.2ml磷酸一氫鈉(0.5M)pH到7.4QS到1L
2)將2.8ml 0.2M的PB轉(zhuǎn)移到第二個15ml試管中3)將2ml 1％的葡萄糖轉(zhuǎn)移到第三個15ml試管中4)稱量6mg的ANS(銨基硫酸鎳)并且將其轉(zhuǎn)移到第一個15ml試管中；攪拌5)將110l的葡萄糖氧化酶(Sigma，Cat.No.G-6891)加入到eppendorf管中6)將110l的DAB基質(zhì)(Diaminobenzidine HCI，KPL，MarylandCat.No.71-00-46)加入到另一個eppendorf管中。
7)在通風櫥中混和5ml PB+2ml葡萄糖+1101 GO+1101 DAB+2.8ml 0.2M PB13.將檢測混合物加在膜上，設置定時器。記錄色原中的培育時間長度。14.在條帶變得清晰可見時，用0.2M PB將膜清洗3遍。15.在RT上，將膜在PBS中搖動過夜。
B.化學發(fā)光方案1.在TBS-T(Tris-緩沖鹽溶液pH7.6+0.1％吐溫-20)。Tri緩沖鹽溶液2.42g Tris堿(20mM)8g氯化鈉(137mM)3.8ml 1M氫氯酸2. 20ml的封閉緩沖液中封閉過夜(TBS-T/5％脫脂奶粉)4℃/振動器20ml TBS-T+1g奶體積取決于容器的類型3.用TBS-T沖洗膜2遍
4.在RT/shaker上，將膜在5ml的、含有一抗(親和性研究產(chǎn)物公司，英國聯(lián)合王國(Affinity Research Products Ltd，UnitedKingdom))的封閉緩沖液里培育2小時α-LMP2抗血清(小鼠)(Cat.No.PW8205) 1∶5000α-LMP2抗血清(人)(Cat.No.PW8345) 1∶10000α-LMP7抗血清(Cat.No.PW8200) 1∶20000α-20S蛋白酶體α2亞單位單克隆抗體(Cat.No.PW 8105)1∶10005.在RT/shaker上，在20ml TBS-T中清洗膜。
在室溫下，使用兩次TBS-T簡單地清洗膜兩次，而后使用新鮮的緩沖洗液將膜用15分鐘洗一遍，5分鐘洗兩遍。
6.在RT/shaker上，將膜在5ml的、被封閉液以1∶1000稀釋的HRP標記(辣根過氧化酶標記)的二抗(Amersham；Cat# NIlE 824 orNIF 825)里培育1小時。
7.按照步驟5清洗膜。
8.混和等體積的測試溶液1(Amersham，Cat#RPN2109)和測試溶液2(Amersham，Cat#RPN2109)混和(1ml+1ml)。
9.將過量的緩沖液從被清洗的膜中排出，將膜放置在一片SaranWrap上，蛋白面向上。加入測試試劑，覆蓋膜。
10.室溫培養(yǎng)1分鐘，不攪拌。
11.將過量的測試試劑排出，將膜轉(zhuǎn)移到Kodak Digital ScienceImage Station 440CF上，蛋白面向下。根據(jù)產(chǎn)品說明書對信號進行顯影并定量。
用下面的抗體，對看家一特異的亞單位(每個方案中的)的存在進行直接測定α-β1(Y)亞單位單克隆抗體(Cat.No.PW8140) 1∶1000α-β2(Z)亞單位單克隆抗體(Cat.No.PW8145) 1∶1000(親和性研究產(chǎn)物公司，英國聯(lián)合王國(Affinity Research Products Ltd，United Kingdom)).實施例11.看家表位疫苗的制備使用商用的肽合成器來合成被鑒定為看家表位的序列。用不同的方法制備感興趣的肽，肽的給予可以是單獨給予，或者與佐劑或細胞因子結合給予以得到刺激T細胞指向動物體內(nèi)表位的效果。佐劑如CFA，TEA，或者三聚氦胺；細胞因子如IL-2，IL-12，或者GM-CSF。肽也可以用控釋物質(zhì)，例如PLGA微球體或其它生物可降解物質(zhì)來制備，這些物質(zhì)改變了肽的藥代動力學，還提高了其免疫原性。通過使用這些物質(zhì)，還可以制備經(jīng)口傳送的肽，以促進在GALT(腸相關淋巴細胞組織)吸收的時候，啟動免疫反應。肽還可以粘附于微小金顆粒上，這樣可以使用“基因槍”來運送它們。
A.GMP級肽的合成使用FMOC或者tBOC固相合成方法來合成肽。合成以后，在適當保護清除劑存在的情況下，分別使用三氟乙酸或者氟化氫將肽從其支撐物上切割下來。用蒸發(fā)作用去除酸，用醚抽提肽以去除清除劑和原材料，而后凍干沉淀的肽。用HPLC，序列分析，氨基酸分析，反離子含量分析(counterion content analysis)和其它合適的方法來確定粗肽的純度。如果粗肽足夠純(純度大于或等于大約90％)，就可以使用它們。如果純化需要達到藥物物質(zhì)規(guī)范，那么使用下列的一種方法或幾種方法組合來純化肽再沉淀；反相，離子交換，大小排阻(size exclusion)或疏水作用色譜；或反流分布(counter-current distribution)。
B.藥物產(chǎn)品制劑將GMP級肽制作在腸胃外可接受的水的，有機的，水-有機的緩沖系統(tǒng)或者溶劑系統(tǒng)中，在這些系統(tǒng)中，它們同時保持著物理上、化學上的穩(wěn)定和生物潛能。通常，緩沖液或者緩沖液組合或者緩沖液和有機溶劑組合都是合適的。典型的pH范圍為6-9?？梢约尤胗袡C效應物或其它賦形劑來幫助溶解和穩(wěn)定肽。這些物質(zhì)包括去垢劑，脂類，共溶劑，抗氧化劑，螯合劑和還原劑。對于凍干制品，可以加入蔗糖或甘露醇或其它凍干酸。通過膜過濾將肽溶液滅菌，將肽溶液濾到其最終的封閉容器系統(tǒng)中，或者凍干用于臨床溶解，或者儲存直到使用。
實施例12.看家表位肽疫苗的運輸A.結節(jié)內(nèi)傳送(intranodal delivery)
使用用于胰島素傳送的小型泵系統(tǒng)(MiniMed；Northridge，CA)將這樣的一種制劑連續(xù)注射到腹股溝淋巴結，該制劑含有水性緩沖液中的肽，緩沖液中有抗微生物制劑，抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)細胞因子。注射時間超過數(shù)天，選擇這樣的注入周期為的是模擬自然注射過程中抗原呈遞的動力學。
B.控釋使用受控的PLGA微球體傳送肽制劑，這些微球體改變了肽的藥代動力學并且提高了免疫原性。該制劑被注射或者口服。
C.基因槍傳送制備肽制劑，其中的肽被粘到金微粒上。該顆粒被傳送到基因槍中，被加以很高的速度以穿透皮膚，基因槍攜帶粒子進入含有pAPCs的皮膚組織。
D.噴霧傳送肽制劑被作為噴霧劑吸入，這樣可以被肺中適當?shù)难芑蛘吡馨徒M織吸收。實施例13.核酸疫苗的制備攜帶型質(zhì)粒載體pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)含有卡那霉素抗性基因和CMV啟動子，將該質(zhì)粒修飾以加入兩個含有需要表位的序列。此外，該質(zhì)粒含有一個位于兩個表位之間的IRES序列，以使其在使用一個啟動子的情況下，兩個序列能夠同時表達。而后，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的大腸桿菌菌株，并將其鋪在選擇性培養(yǎng)基上。懸液培養(yǎng)基中長出幾個集落，用限制性圖譜鑒定陽性克隆。而后培養(yǎng)陽性克隆，將其等分到儲存瓶中，在-70℃儲存。
從這些細胞的一個樣品中，進行質(zhì)粒的小量制備(Q1Aprep Spin Mini-prepQiagen，Valencia，CA)，并且用自動熒光雙脫氧序列分析來確定該結構含有所需要的序列。其它的核酸疫苗載體和制劑在本說明書的前面部分和下面的實施例18-20中描述。實施例14.核酸疫苗的運送使用小型泵系統(tǒng)例如MiniMed胰島素泵將核酸疫苗注射到淋巴結中。將核酸構建體制備在這樣的水緩沖液溶液中，該緩沖液含有抗微生物制劑，抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)細胞因子。該核酸構建體的傳送時間超過數(shù)天，選擇這樣的注射周期是為了模擬自然注射過程中抗原呈遞的動力學。
任選地，使用控釋物質(zhì)例如PLGA微球體或者其它生物可降解物質(zhì)來傳送核酸構建體。這些物質(zhì)被注射或者口服。核酸疫苗的給予使用經(jīng)口傳輸，在吸收到GALT組織過程中引發(fā)免疫反應。作為選擇，使用基因槍來傳送疫苗，其中核酸疫苗粘附于微小金顆粒上。核酸構建體還可以以噴霧劑形式吸入，被肺內(nèi)的適當?shù)难芑蛄馨徒M織吸收。實施例15.pAPCs上的看家表位呈遞的分析A.四聚物分析I類四聚物分析用來確定在給予看家表位前后，動物體內(nèi)T細胞的出現(xiàn)頻度。對應于表位的T細胞的無性擴增，說明表位被pAPCs呈遞給了T細胞。在給予動物表位之前和之后，測量指向看家表位的特異性T細胞的出現(xiàn)頻度，可以確定表位是否呈現(xiàn)在pAPCs上。在給予表位后，如果表位特異的T細胞出現(xiàn)頻度增加，說明表位被呈遞在pAPCs。
B.增殖測定在用看家表位對動物進行免疫約24小時后，使用指向呈現(xiàn)在pAPCs上的特異性標記的單克隆抗體，從PBMCs，脾細胞或淋巴結細胞中收獲pAPCs，將其固定在磁珠上進行親和純化。使用此技術富集天然血或脾細胞制劑來得到pAPCs。而后將富集的pAPCs用來進行T細胞克隆的增殖測定，該T細胞克隆已經(jīng)產(chǎn)生并且對感興趣的看家表位特異。將pAPCs與T細胞克隆共培育，通過測定T細胞摻入放射性胸腺嘧啶的量來檢測T細胞的增殖活性。如果增殖，則說明pAPCs上的表位刺激了對看家表位特異的T細胞。實施例16.看家表位用于抗癌治療的有效性分析用替代末端(surrogate endpoint)或存活來確定癌癥治療中表位同步疫苗的效果。
A.T細胞出現(xiàn)頻度分析有用的替代末端是T細胞出現(xiàn)頻度的確定，所述的T細胞出現(xiàn)頻度是指向免疫中使用的看家表位的T細胞出現(xiàn)頻度。T細胞(該T細胞是指向使用于腫瘤免疫治療中的特異TuAA表位的T細胞)出現(xiàn)頻度升高的患者，與T細胞出現(xiàn)頻度沒有升高的患者(該患者被免疫了相同的表位)相比，有明顯好的存活性。使用四聚物分析，ELISPOT分析或者有限稀釋分析來評價在用表位免疫前后，T細胞對看家表位的出現(xiàn)頻度。此出現(xiàn)頻度顯示了疫苗中看家表位的抗癌作用。
B.腫瘤負擔/存活分析在用看家表位免疫前后，對存在腫瘤的動物進行腫瘤負擔評價。部分的或者完全的腫瘤退化表明了有效的治療干預，并且與增高的存活性相關。在實驗室環(huán)境中，將幾只動物平行地接種腫瘤。其中一些動物隨后用看家表位疫苗免疫。將用看家表位免疫的動物的存活率與那些接受了對照表位或者安慰劑的動物的存活率相比較，以確定疫苗的作用。
C.鉻釋放測定使用看家表位，對表達人I類MHC的遺傳工程動物進行免疫。使用人腫瘤靶或者被設計表達相同I類MHC的靶，將來自這些動物中的T細胞用于標準鉻測定。T細胞對靶的殺死，說明刺激患者體內(nèi)的T細胞可以有效地殺死表達類似TuAA的腫瘤。實施例17獨特看家表位的鑒定如此處所公開的那樣，在本發(fā)明的疫苗和方法中，有用的表位可以被很容易地鑒別出來。例如，三種不是由pAPCs產(chǎn)生的、獨特的看家表位被鑒定如下A.分離和純化分離免疫或看家蛋白酶體復合物。將純化的肽溶于適當?shù)木彌_液中，使?jié)舛却蠹s為1-2mM，而后加到大約2體積的蛋白酶體制劑中。所選擇的緩沖液必須使肽溶劑化而并不干擾消化過程。如前所述，制備額外的消化液用來作陽性對照肽，以證實所使用蛋白酶制劑的正常功能。將它們在37℃下平行溫育至120分鐘，而后加入三氟乙酸稀釋液停止消化；立刻用質(zhì)譜儀分析樣品，或者將它們在干冰上凍結直至用于分析。也可以通過將樣品置于冰上來中斷消化反應，用質(zhì)譜儀立即分析。
B.消化液的MALDI-TOF質(zhì)譜分析在樣品載玻片上，將大約0.5μl的每種消化液與等體積的基質(zhì)(70％EtOH中有10mg/ml的二羥基苯酸，pH＝2-3)溶液直接混合，在大約40℃使其風干。而后將樣品在被合適的分子量標準校準了的LasermatTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀(Thermo Bioanalysis，Santa Fe，NM)上分析。
用于蛋白酶體分析的計算機程序產(chǎn)生了所有可能片段的序列和分子量，這些可能片段能夠同時滿足具有任何預測表位的正確C末端；含有該表位的全長序列或者更長的序列。
如果MALDI-TOF的結果顯示一種或多種這些分子量呈現(xiàn)在消化混合物中，那么就將相應的肽合成，純化，用MALDI-TOF鑒定，而后將其用于分析HPLC以同時建立標準駐留時間和質(zhì)量與峰面積的近似比率。這些步驟與上述那些步驟很類似。而后，將復制的蛋白酶體消化液稀釋在適當?shù)娜軇┲胁⑶沂褂孟嗤姆治鯤PLC方法進行分析。如果消化液產(chǎn)生了駐留時間與標準駐留時間相同的好的產(chǎn)量峰，那么基本上可以確定這是由于消化液中的存在的那個序列導致的。如果出現(xiàn)了由其他可能產(chǎn)生片段所引起的模糊(這些片段會產(chǎn)生相同或者類似質(zhì)譜測量結果)，那么可以收集所懷疑的組分并且將它們用于C末端測序以確定同一性。使用上述方法，看家表位被鑒定出來。C.額外的獨特看家表位依照Stauss等的方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17)7871-5(1992))分析候選肽對HLA-A2.1的結合。將T2細胞(該細胞在其表面表達表達空的或者不穩(wěn)定的MHC分子)清洗2遍并以5×106細胞/ml的濃度懸浮于無血清的完全Iscove’s modified Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)中。加入β2微球蛋白使?jié)舛葹?μg/ml，將細胞分布到96孔U-底板中使細胞濃度為5×105細胞/孔。將肽以100，10，1和0.1μg/ml的濃度加入。將板輕柔搖動2分鐘，而后在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4個小時。用IMDM清洗兩遍以去除未結合的肽，而后加入飽和數(shù)量的單克隆抗體W6/32(Sigma)。在4℃培養(yǎng)30分鐘后，用補充了2％熱失活FCS，0.1％(w∶v)疊氮化鈉，pH7.4-7.6(著色緩沖液)的PBS清洗細胞，在4℃下與結合了異硫氰酸熒光素(FITC)的羊F(ab’)抗鼠免疫球蛋白G(Sigma)一起培養(yǎng)30分鐘，而后象以前那樣清洗4遍。將細胞重懸于著色的緩沖液并且通過加入四分之一體積的2％仲甲醛來使之固定。使用FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)，對被肽結合所穩(wěn)定的表面HLA-A2.1分子進行流式細胞分析。
使用上述討論的方法，發(fā)現(xiàn)由蛋白酶體消化所鑒定的候選酪氨酸酶看家表位(酪氨酸酶207-216，F(xiàn)LPWHRLFLL SEQ ID NO78)與HLA-A2.1結合的程度，與已知A2.1結合物FLPSDYFPSV(SEQ ID NO79)(陽性對照)的結合程度類似。將HLA-B44結合肽AEMGKYSFY(SEQ ID NO80)作為陰性對照。從陰性對照獲得的熒光，與在分析中沒有使用肽時所獲得的信號類似。陽性對照肽與陰性對照肽選自通用免疫學方案(CurentProtocols in Immunology)p.18.3.2，John Wiley和Sons，紐約，1998.中的表18.3.1。實施例18.pVAX-EP1-TRES-EP2的構建概述此構建體的起始質(zhì)粒是從Invitrogen.(Carlsbad，CA)購買的pVAX1。表位EP1和EP2由GIBCO BRL(Rockville，MD)合成。IRES從由Clontech(Palo Alto，CA)購買的pIRES中切下。
步驟1.用EcoRI和NotI消化pIRES。用瓊脂糖凝膠分離消化的片段，通過凝膠純化來純化IRES片段；2.用EcoRI和NotI消化pVAX1。凝膠純化pVAX1片段；3.建立含有純化的pVAX1和IRES片段的連接反應；4.用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α；5.挑選4個集落進行小量制備；6.對小量制備的DNA進行限制酶消化分析。一個被IRES插入的重組集落被用來進一步插入EP1和EP2。該中間結構稱為pVAX-IRES；7.合成EP1和EP2；8.將EP1亞克隆到pVAX-IRES的AfiII和EcoRI位點之間，制備出pVAX-EP1-IRES；9.將EP2亞克隆到pVAX-EP1-IRES的SalI和NotI位點之間，制備出pVAX-EPI-IRES-EP2；10.對EP1-IRES-EP2插入物測序以確證其序列。實施例19.pVAX-EP1-IRES-EP2-ISS-NIS的構建概述此構建體的起始質(zhì)粒是pVAX-EP1-IRES-EP2(實施例18)。被引入該構建體的ISS(免疫刺激序列)(SEQ ID NO82)是AACGTT，使用的NIS(代表核進入序列)(SEQ ID NO81)是SV40 72bp重復序列。ISS-NIS由GIBCO BRL合成。見圖9。
步驟1.用NruI消化pVAX-EP1-IRES-EP2。凝膠純化線性質(zhì)粒；2.合成ISS-NIS；3.建立含有純化的線性pVAX-EP1-IRES-EP2和合成的ISS-NIS片段的連接反應；4.用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α；5.挑選集落進行小量制備；6.對小量制備的質(zhì)粒進行限制酶消化；7.對含有插入物的質(zhì)粒進行測序。實施例20pVAX-EP2-UB-EP1的構建概論此構建體的起始質(zhì)粒是從pVAX1(Invitrogen)。EP1和EP2由GIBCOBRL合成。在該構建體中編碼76個氨基酸的野生型泛素cDNA是從酵母克隆而來的。步驟1.使用酵母mRNA進行RT-PCR。設計引物來擴增酵母泛素的整個編碼序列。
2.用瓊脂糖凝膠分析RT-PCR產(chǎn)物。凝膠純化預測大小的條帶。
3.將純化的DNA條帶亞克隆到pZERO1的EcoRV位點，將得到的克隆命名為pZERO-UB；4.測序pZERO-UB的幾個克隆。在進一步操作前確定泛素的序列。
5.合成EP1和EP2；6.連接EP2，泛素和EP1，并且將該插入物克隆到pVAXI的BamHI和EcoRI位點之間，使之處于CMV啟動子的控制下。
7.通過測序，確認插入物EP2-UB-EP1的序列。TRES(SEQIDNO6)AATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTITCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAA參考文獻Clontech PT3266-5UBIQUITIN(SEO ID NO5)ATGCAGATTTTCGTCAAGACTTTGACCGGTAAAACCATAACATTGGAAGTTGAATCTTCCGATACCATCGACAACGTTAAGTCGAAAATICAAGACAAGGAAGGTATCCCTCCAGATCAACAAAGATTGATCTTTGCCGGTAAGCAGCTAGAAGACGGTAGAACGCTGTCTGATTACAACATTCAGAAGGAGTCCACCTTACATCTIGTGCTAAGGCTAAGAGGTGGC參考文獻Ozkaynak，E.，F(xiàn)inley，D.，Solomon，M.J.and Varshavsky，A.，The yeast ubiquitingenesa family of natural gene fusions.EMBO J.6(5)，1429-1439(1987).NIS(SEQ ID NO81)TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACC參考文獻Dean DA，Dean BS，Muller S，Smith LC，Sequence requirements for plasmid nuclearimport.Exp.Cell Res.253(2)713-22(1999).ISS(SEQ ID NO82)AACGTT參考文獻Sato Y，Roman M，Tighe H，Lee D，Corr M，Nguyen M，Silverman GJ，Lotz M，Carson DA and Raz E，Immunostimulatory DNA sequences necessary for efiective intradermalgene immunization.Scienee，273352-354(1996).
實施例21-24都與由HLA-A2.1呈遞的9聚表位的預測有關，盡管該步驟同樣適用于任何HLA型，或者任何表位長度，在這個步驟中，可以使用預測性算法或者MHC結合分析。實施例21.Melan-A/MART-I(SEQ ID NO1)這種黑色素瘤腫瘤相關抗原(TAA)的長度為118個氨基酸。在100個可能的9聚中，通過SYFPEITHI/Rammensee算法計算，其中的16個9聚為16分。(見表8)。它們占可能肽的14.5％而且代表了蛋白的平均表位密度為0.136每氨基酸。它們當中有12個重疊，覆蓋了SEQ ID NO1的22-49的氨基酸，在這里，簇的表位密度為0.428，如上所述，兩者之間的比率為3.15。另外兩個預測的表位重疊氨基酸SEQ ID NO1的56-69的氨基酸，所得到簇的表位密度為0.143，這與平均值的差別不大，比率僅為1.05。見圖15。
表8Melan-A/MART-1(SEQ ID NO1)的SYFPEITHI(Rammensee算法)結果
用BIMAS-NIH/Parker算法，將9聚體(這些9聚體被預測的半分離時間是5分鐘)限制分析為只剩下了5個。(見表9)。蛋白中的表位的平均密度現(xiàn)在只有0.042每氨基酸。3個重復肽覆蓋了SEQ ID NO1的31-48氨基酸，另外兩個覆蓋了SEQ ID NO1的56-69個氨基酸，如上，分別得到的比率為3.93和3.40。(見表10)表9Melan-A/MART-1(SEQ ID NO1)的BIMAS-NIH/Parker算法結果
表10Melan-A/MART-1(SEQ ID NO1)的預測的表位簇
實施例22.SSX-2/HOM-MEL-40(SEQ ID NO2)這種黑色素瘤腫瘤相關抗原(TAA)的長度為188個氨基酸。在180個可能的9聚體中，通過SYFPEITHI/Rammensee算法計算，其中的11個9聚體為16分。(見表11)。它們占可能肽的6.1％而且代表了蛋白的平均表位密度為0.059每氨基酸。它們中有3個重疊，覆蓋了SEQ ID NO2的99-114的氨基酸，在這里，簇的表位密度為0.188，如上，兩者之間的比率為3.18。在SEQ ID NO2的16-28，57-67，和167-183氨基酸，同樣存在預測表位的重疊對，得到的比率分別是2.63，3.11和2.01。還有一個額外的預測表位簇覆蓋了SEQ ID NO2的5-28氨基酸。對含有3個表位的SEQ ID NO25-28區(qū)域進行評價，得到表位的密度為0.125，比率為2.14。(見表12)。
用BIMAS-NIH/Parker算法，將9聚體(這些9聚體被預測的半分離時間是5分鐘)限制分析為只剩下了6個。(見表13)。蛋白中的表位的平均密度現(xiàn)在只有0.032每氨基酸。只有一個單對重疊，在SEQ ID NO2的167-180，比率為4.48。但是，如果區(qū)域(SEQ ID NO2的41-65氨基酸)被評價得到的比率為2.51(這個值代表了與平均值有實質(zhì)不同)，那么排序名次最高的肽與另一個預測的表位接近。(見圖16和表14)。
表11SSX-2/HOM-MEL-40(SEQ ID NO2)的SYFPEITHI(Rammensee算法)結果
表12計算(表位)(SEQ ID NO2)
表13BIMAS-NIH/Parker算法(SEQ ID No2)
表14計算(表位)(SEQ ID NO2)
實施例23.NY-ESO(SEQ ID NO3)該腫瘤相關抗原(TAA)的長度為180個氨基酸。在172個可能的9聚體中，通過SYFPEITHI/Rammensee算法計算，其中的25個9聚體為16分。(見表15)。它們占可能肽的14.5％而且代表了蛋白的平均表位密度為0.136每氨基酸。但是它們的分布非常不同。近一半蛋白是空的，在起始的78個氨基酸中，只有一個預測的表位。與Melan-A不同，在Melan-A中，存在高度重疊肽的非常緊湊的簇，而在NY-ESO中重疊很少而且延伸到絕大部分蛋白剩下的部分。一組19個重疊肽覆蓋了SEQ ID NO3的108-174的氨基酸，所得到的比率為2.04。另外5個預測的表位覆蓋了SEQ ID NO3的79-104的氨基酸，比率僅為1.38。(見表16)。
如果相反，研究者只考慮預測表位排名最靠前的5％，在這種情況下是9個肽，研究者可以檢查好的簇是否被所預測的、不大可能結合MHC的肽所隱藏。當只考慮這些預測的表位的時候，我們可以看到SEQ ID NO3的區(qū)域108-140包含6個重疊態(tài)，比率為3.64。在SEQ ID NO3的148-167區(qū)域，還有2個附近的肽，比率為2.00。這樣可以把大簇SEQ ID NO3的108-174斷開成為兩個覆蓋了很多相同序列的小簇。(見表16)。
用BIMAS-NIH/Parker算法，將9聚體(這些9聚體被預測的半分離時間是5分鐘)限制分析為只剩下了14個。(見表17)。蛋白中的表位的平均密度現(xiàn)在只有0.078每氨基酸。觀察到一個單組的10個重疊肽，覆蓋了SEQ ID NO3的144-171氨基酸，比率為4.59。所有14個肽處在SEQ ID NO3的86-171區(qū)域之間，該區(qū)域是總蛋白中平均表位密度的2.09倍。雖然這個大簇比我們期望的大，但是相對于研究整個蛋白，它仍然提供了明顯的有利條件。(見圖17和表18)。
表15NY-ESO(SEQ ID NO3)的SYFPEITHI(Rammensee)算法結果
表16計算(表位/氨基酸)(SEQ ID NO3)
表17NY-ESO(SEQ ID NO3)的BIMAS-NIH/Parker算法結果
表18計算(表位/氨基酸)(SEQ ID NO3)
實施例24.酪氨酸酶(SEQ ID NO4)這種黑色素瘤腫瘤相關抗原(TAA)的長度為529個氨基酸。在521個可能的9聚體中，通過SYFPEITHI/Rammensee算法計算，其中的52個9聚體為16分。(見表19)。它們占可能肽的10％而且代表了蛋白的平均表位密度為0.098每氨基酸。存在有5組重疊肽，每組肽都含有2-13個預測表位，比率分別從2.03到4.41。還有額外的7組重疊肽，每組含有2-4個預測的表位，比率分別從1.20到1.85。在SEQ ID NO4的區(qū)域444-506中的17個肽(包括上面的13個重復肽)組成了一個比率為2.20的簇。(見表20)。
用BIMAS-NIH/Parker算法，將9聚體(這些9聚體被預測的半分離時間是5分鐘)限制分析為只剩下了28個。(見表21)。蛋白中的表位的平均密度現(xiàn)在只有0.053每氨基酸。在此密度下，任何重疊都代表超過兩倍的表位平均密度。存在有5組重疊肽，每組肽都含有2-7個預測表位，比率分別從2.22到4.9。(見表22)。在這些簇中，只有3個簇能被兩個算法共同得到。這些簇中有幾個，但不是全部，可以通過評價含有其的區(qū)域和鄰近被預測的表位將其擴大。見圖18。
表19酪氨酸(SEQ ID NO4)的SYFPEITHI/Rammensee算法結果
表20計算(表位/氨基酸)(SEQ ID NO4)
表21BIMAS-NIH/Parker算法(SEQ ID NO4)
表22計算(表位/氨基酸)(SEQ ID NO4)
序列表<110>CTL免疫治療公司約翰，J.，L.西馬德戴維，C.戴蒙德雷向東<120>抗原呈遞細胞中的表位同步<130>CTLIMM.004VPC<150>US 09/561,572<151>2000-04-28<150>US 09/561,571<151>2000-04-28<150>US 09/561,074<151>2000-04-28<150>US 09/560,465<151>2000-04-28<160>82<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>118<212>PRT<213>智人<400>1Met Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly1 5 10 15His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile20 25 30Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys35 40 45Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val50 55 60Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln Glu Gly Phe Asp65 70 75 80His Arg Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu Lys Asn Cys Glu Pro Val85 90 95Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser100 105 110Pro Pro Pro Tyr Ser Pro115<210>2<211>188<212>PRT<213>智人<400>2Met Asn Gly Asp Asp Ala Phe Ala Arg Arg Pro Thr Val Gly Ala Gln1 5 10 15Ile Pro Glu Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile Ala Lys Tyr Phe20 25 30Ser Lys Glu Glu Trp Glu Lys Met Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr35 40 45Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr Lys Leu Gly Phe Lys50 55 60Ala Thr Leu Pro Pro Phe Met Cys Asn Lys Arg Ala Glu Asp Phe Gln65 70 75 80Gly Asn Asp Leu Asp Asn Asp Pro Asn Arg Gly Asn Gln Val Glu Arg85 90 95Pro Gln Met Thr Phe Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile Met100 105 110Pro Lys Lys Pro Ala Glu Glu Gly Asn Asp Ser Glu Glu Val Pro Glu115 120 125Ala Ser Gly Pro Gln Asn Asp Gly Lys Glu Leu Cys Pro Pro Gly Lys130 135 140Pro Thr Thr Ser Glu Lys Ile His Glu Arg Ser Gly Pro Lys Arg Gly145 150 155 160Glu His Ala Trp Thr His Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val Ile165 170 175Tyr Glu Glu Ile Ser Asp Pro Glu Glu Asp Asp Glu180 185<210>3<211>180<212>PRT<213>智人<400>3Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly20 25 30Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala35 40 45Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
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Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe305 310 315 320Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys Ala Ala325 330 335Asn Phe Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser Pro Leu Thr340 345 350Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu His Ile355 360 365Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala Asn Asp Pro370 375 380Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp385 390 395 400Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala Asn Ala405 410 415Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile Pro Leu420 425 430Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp435 440 445Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp Tyr Ile450 455 460Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp Leu Leu Gly465 470 475 480Ala Ala Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly Leu Val485 490 495Ser Leu Leu Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu Glu Lys Gln500 505 510Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His515 520 525Leu<210>5<211>228<212>DNA<213>釀酒酵母<400>5atgcagattt tcgtcaagac tttgaccggt aaaaccataa cattggaagt tgaatcttcc 60gataccatcg acaacgttaa gtcgaaaatt caagacaagg aaggtatccc tccagatcaa 120caaagattga tctttgccgg taagcagcta gaagacggta gaacgctgtc tgattacaac 180attcagaagg agtccacctt acatcttgtg ctaaggctaa gaggtggc 228<210>6<211>581<212>DNA<213>腦心肌炎病毒<400>6aattccgccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag 60gccggtgtgc gtttgtctat atgtgatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga 120gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg 180ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt 240gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca 300ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc 360agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat 420tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc 480ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga 540accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata a 581<210>7<211>16<212>PRT<213>智人<400>7Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln Thr Ser1 5 10 15<210>8<211>22<212>PRT<213>智人<400>8His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Thr Ile Leu Thr1 5 10 15Val Ile Leu Gly Val Leu20<210>9<211>24<212>PRT<213>智人<400>9Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu1 5 10 15Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp20<210>10<211>24<212>PRT<213>智人<400>10Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys1 5 10 15Val Leu His His Met Val Lys Ile20<210>11<211>19<212>PRT<213>智人<400>11Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe1 5 10 15Glu Gly Arg<210>12<211>16<212>PRT<213>智人<400>12Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr1 5 10 15<210>13<211>15<212>PRT<213>智人<400>13Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys1 5 10 15<210>14<211>16<212>PRT<213>智人<400>14Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln Thr Ser1 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10<210>36<211>10<212>PRT<213>智人<400>36Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly1 5 10<210>37<211>10<212>PRT<213>智人<400>37Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala1 5 10<210>38<211>10<212>PRT<213>智人<400>38Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu1 5 10<210>39<211>10<212>PRT<213>智人<400>39Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>智人<400>40Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val1 5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>智人<400>41Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys1 5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>智人<400>42Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu1 5 10<210>43<211>10<212>PRT<213>智人<400>43Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>智人<400>44Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>智人<400>45Asn Pro Pro Thr Thr Ala Lys Leu Thr Ile1 5 10<210>46<211>10<212>PRT<213>智人<400>46Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>智人<400>47Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser1 5 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權利要求
1.一種含有第一看家表位的疫苗，其中的看家表位衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原。
2.權利要求1中的疫苗，該疫苗包含核酸構建體，其中的核酸構建體編碼看家表位。
3.權利要求1或者2的疫苗，其中的靶細胞是瘤細胞。
4.權利要求3的疫苗，其中的瘤細胞選自白血病，癌，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。
5.權利要求3的疫苗，其中的抗原選自MelanA(MART-I)，gp 100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16，TAGE，PSMA，PSCA，CT7，端粒酶，43-9F，5T4，791Tgp72，α-胎蛋白，β-HCG，BCA225，BTAA，CA125，CA15-3(CA27.29\BCAA)，CA195，CA242，CA-50，CAM43，CD68\KP1，CO-029，F(xiàn)GF-5，G250，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB/70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG16，TA-90(Mac-2結合蛋白\親環(huán)蛋白C-相關蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP，TPS，和GA733-2\KSA。
6.權利要求1或者2的疫苗，其中的靶細胞被細胞內(nèi)寄生物感染。
7.權利要求6的疫苗，其中的細胞內(nèi)寄生物是病毒。
8.權利要求7的疫苗，其中的病毒選自腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒I，單純皰疹病毒II，人類皰疹病毒6，水痘-帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I和人T細胞白血病病毒II。
9.權利要求7的疫苗，其中的抗原是病毒相關抗原。
10.權利要求6的疫苗，其中的微生物是細菌，原生動物，真菌，或者朊病毒。
11.權利要求10的疫苗，其中的細胞內(nèi)寄生蟲選自衣原體，李司忒氏菌屬，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次氏體屬，分支桿菌屬，利什曼原蟲屬，錐蟲屬(Trypanasoma)，弓形蟲屬和瘧原蟲。
12.權利要求10的疫苗，其中的抗原是寄生蟲相關抗原。
13.權利要求1或者2的疫苗，其中的看家表位包含或者編碼大約6-23個氨基酸長度的多肽。
14.權利要求13的疫苗，其中多肽的長度為9-10個氨基酸。
15.權利要求1的疫苗，其中的看家表位包含核酸。
16.權利要求1的疫苗，其中的看家表位包含合成的多肽。
17.以上權利要求中任何一項的疫苗，其中的疫苗還包含至少一種選自緩沖劑，去垢劑，表面活性劑，抗氧化劑或還原劑的組分。
18.以上權利要求中任何一項的疫苗，其中的看家表位對至少一種MHC等位基因特異。
19.權利要求18的疫苗，其中的等位基因編碼A2型。
20.權利要求18的疫苗，其中的等位基因編碼的類型選自A1，A3，A11，和A24。
21.權利要求18的疫苗，其中的等位基因編碼的類型選自A26，A29，B7，B8，B14，B18，B27，B35，B44，B62，B60，和B51。
22.以上權利要求中任何一項的疫苗，該疫苗還包含免疫表位。
23.權利要求22的疫苗，其中的免疫表位衍生于與靶細胞相關的第二抗原。
24.權利要求21的疫苗，其中第一抗原與第二抗原相同。
25.權利要求22，23，或者24的疫苗，其中的看家表位對MHC第一等位基因特異，而且免疫表位對MHC第二等位基因特異。
26.權利要求25的疫苗，其中第一等位基因與第二等位基因相同。
27.權利要求25的疫苗，其中第一等位基因與第二等位基因不相同。
28.權利要求22-27中任何一項的疫苗，其中疫苗包含表位簇，而且其中的表位簇包含免疫表位。
29.權利要求28的疫苗，其中的表位簇包含或者編碼一定長度的多肽，其中多肽的長度為至少10個氨基酸。
30.權利要求29的疫苗，其中的多肽的長度小于大約60個氨基酸。
31.權利要求28的疫苗，其中的表位簇衍生于與靶細胞相關的第二抗原。
32.權利要求31的疫苗，其中第一抗原與第二抗原相同。
33.權利要求31或者32的疫苗，第二抗原具有一定長度，其中，該表位簇由具有一定長度的多肽組成或編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于第二抗原長度的大約80％。
34.權利要求33的疫苗，其中多肽的長度小于第二抗原長度的大約50％。
35.權利要求34的疫苗，其中多肽的長度小于第二抗原長度的大約20％。
36.以上權利要求中任何一項的疫苗，還包含第二看家表位，其中的第二看家表位衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原。
37.權利要求36的疫苗，其中第一抗原與第二抗原相同。
38.權利要求36的疫苗，其中第一抗原與第二抗原不同。
39.權利要求36的疫苗，其中第一靶細胞與第二靶細胞相同。
40.權利要求36的疫苗，其中第一靶細胞與第二靶細胞不同。
41.制備疫苗的方法，包含的步驟有通過鑒定多肽片段來選擇第一看家表位，所述的多肽片段被或者可以被看家蛋白酶體從第一抗原產(chǎn)生，所述的第一抗原與第一靶細胞或者靶病原體相關；和制備包含或者編碼被選擇看家表位的疫苗組合物。
42.一種分離的T細胞，該T細胞表達對MHC-肽復合物特異的T細胞受體，所述的MHC-肽復合物包含第一看家表位，其中該看家表位衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原。
43.包含權利要求42的T細胞的T細胞克隆。
44.包含權利要求42的T細胞的T細胞多克隆群體。
45.由體外免疫生產(chǎn)的權利要求42的T細胞。
46.從免疫動物中分離的權利要求42的T細胞。
47.一種產(chǎn)生過繼免疫治療的方法，包括將權利要求42-46中任何一項的T細胞與藥學上可接受的佐劑，載體，稀釋劑，或賦形劑相結合。
48.權利要求42-46中任何一項的T細胞在用于過繼免疫治療藥物生產(chǎn)中的用途。
49.一種發(fā)現(xiàn)表位的方法，包括下面的步驟，從與宿主中的靶相關的抗原的肽片段群中選擇表位，其中的肽片段對宿主的主要組織相容性復合物受體肽結合裂隙具有已知的或者預測的親和力，其中被選擇的表位與宿主細胞抗原的蛋白酶剪切產(chǎn)物相對應。
50.權利要求49的方法，其中的靶是靶細胞，其中的主要組織相容性復合物受體是I類主要組織相容性復合物受體，其中蛋白酶剪切產(chǎn)物是蛋白酶體切割產(chǎn)物，而且其中的宿主細胞是靶細胞。
51.權利要求49的方法，其中的主要組織相容性復合物受體是II類主要組織相容性復合物受體。
52.權利要求51的方法，其中的靶選自瘤細胞，病原體，毒素，毒液和過敏源。
53.一種發(fā)現(xiàn)表位的方法，包括的步驟有從靶細胞提供一段序列，其中的序列編碼或者包含該靶細胞中表達的蛋白；鑒定該蛋白的肽片段群，其中肽片段群的成員對主要組織相容性復合物I類受體肽結合裂隙具有已知的或者預測的親和性；從肽片段群中選擇表位，其中的表位與在靶細胞中有活性的蛋白酶體產(chǎn)物相對應。
54.權利要求50或者53的方法，其中的靶細胞是瘤細胞或者抗原呈遞細胞。
55.一種發(fā)現(xiàn)表位的方法，包括下列步驟提供瘤細胞和序列，其中的序列含有或者編碼與瘤細胞相關的抗原。鑒定抗原的肽片段群，其中的肽片段群被預測對主要組織相容性復合物I類受體肽結合裂隙具有親和性；從肽片段群中選擇表位，其中的表位經(jīng)過體外分析，被確定為是瘤細胞中有活性的蛋白酶體的蛋白酶體切割反應產(chǎn)物。
56.權利要求52，54，或者55的方法，其中的瘤細胞選自白血病，癌，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。
57.權利要求52，54，55或者56的方法，其中的抗原選自MelanA(MART-I)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，和p16。
58.權利要求50或者53的方法，其中的靶細胞被細胞內(nèi)寄生物感染。
59.權利要求52的方法，其中病原體是細胞內(nèi)寄生物。
60.權利要求58或者59的方法，其中的細胞內(nèi)寄生物是病毒。
61.權利要求60的方法，其中的病毒選自腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒I，單純皰疹病毒II，人類皰疹病毒6，水痘-帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I和人T細胞白血病病毒II，輪狀病毒，呼腸孤病毒，細小核糖核酸病毒、肝DNA病毒屬(hepadnavirus)、腺病毒，和乳多空病毒。
62.權利要求60的方法，其中的抗原選自腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒I，單純皰疹病毒II，人類皰疹病毒6，水痘-帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I和人T細胞白血病病毒II。
63.權利要求52的方法，其中的病原體選自細菌，真菌，病原動物和朊病毒。
64.權利要求58的方法，其中的細胞內(nèi)寄生物是細菌，原生動物，真菌，或者朊病毒。
65.權利要求63或者64的方法，其中的病原體或者細胞內(nèi)寄生物選自衣原體，李司忒氏菌屬，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次氏體屬，分支桿菌屬，利什曼原蟲屬，錐蟲屬(Trypanasoma)，弓形蟲屬和瘧原蟲。
66.權利要求58的方法，其中的抗原是寄生物相關抗原。
67.權利要求50，53，或者55的方法，其中的蛋白酶體是看家蛋白酶體。
68.權利要求50，53，或者55的方法，其中的蛋白酶體是免疫蛋白酶體。
69.權利要求49或者51的方法，其中的蛋白酶剪切含有宿主溶酶體中的蛋白酶活性。
70.權利要求49或者51的方法，其中的蛋白酶剪切含有宿主內(nèi)體中的蛋白酶活性。
71.權利要求49-70中任何-項的方法，其中的親和性由體外結合分析確定。
72.權利要求49-70中任何-項的方法，其中的親和性由算法確定。
73.權利要求49-72中任何一項的方法，其中的產(chǎn)物由體外結合分析確定。
74.依照權利要求49-73的任何一項的方法發(fā)現(xiàn)的表位。
75.權利要求74的表位，該表位含有序列SEP ID NO78。
76.MHC I類限制的表位，該表位通過使用包含下列步驟的方法發(fā)現(xiàn)確定靶細胞表達的蛋白酶體的類型，和鑒定該靶細胞表達的表位。
77.權利要求76的表位，其中在確定步驟中包含的技術選自RT-PCR，ELISA，蛋白質(zhì)印跡，聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫組織化學，和用純化自所述靶細胞的蛋白酶體切割標準基質(zhì)。
78.權利要求76的表位，其中的確定步驟包含將未處理的靶細胞與γ-干擾素處理的靶細胞相比較。
79.權利要求76的表位，其中在鑒定步驟中包含的技術選自肽洗脫，體外蛋白水解，質(zhì)譜分析法，HPLC，氨基酸序列測序，和免疫反應性的確定。
80.權利要求79的表位，其中免疫反應性的確定包含一種檢測條件的鑒定方法，所述的條件選自細胞毒性，增殖，和細胞因子產(chǎn)生。
81.包含權利要求74-80中任何一項的表位的疫苗。
82.一種表位簇，該簇衍生于靶相關抗原，該簇包含或者編碼至少兩段對MHC受體肽結合裂隙具有已知的或者預測的親和性的序列，其中的簇是抗原的不完全片斷。
83.權利要求82的表位簇，其中的靶細胞是瘤細胞。
84.權利要求82的表位簇，其中的靶是被細胞內(nèi)寄生物感染的細胞。
85.權利要求84的表位簇，其中的細胞內(nèi)寄生物是病毒。
86.權利要求84的表位簇，其中的細胞內(nèi)寄生物是細菌或者原生動物。
87.權利要求82的表位簇，其中的靶是病原體。
88.權利要求87的表位簇，其中的病原體選自病毒，細菌，真菌，原生動物，朊病毒，毒素，毒液，和過敏源。
89.權利要求82的表位簇，其中的MHC受體是I類HLA受體。
90.權利要求82的表位簇，其中的MHC受體是II類HLA受體。
91.權利要求82的表位簇，其中的簇包含或者編碼具有一定長度的多肽，該長度至少是10個氨基酸。
92.權利要求91的表位簇，其中多肽的長度小于大約75個氨基酸。
93.權利要求82的表位簇，抗原具有一定的長度，其中的簇由具有一定長度的多肽組成或者編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于大約80％抗原的長度。
94.權利要求93的表位簇，抗原具有一定的長度，其中的簇由具有一定長度的多肽組成或者編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于大約50％抗原的長度。
95.權利要求94的表位簇，抗原具有一定的長度，其中的簇由具有一定長度的多肽組成或者編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于大約20％抗原的長度。
96.一種發(fā)現(xiàn)表位簇的方法，包含的步驟有提供一段靶相關抗原的序列；基于對MHC受體肽結合裂隙的已知的或者預測的親和力，給序列中的候選肽打分，以鑒定假定的MHC表位；和鑒定抗原中的表位簇，其中的簇包含至少兩個假定的MHC表位，而且其中的簇所包含的假定MHC表位的密度要比整個抗原中假定MHC表位的密度要高。
97.權利要求96的方法，其中的靶細胞是瘤細胞。
98.權利要求96的方法，其中的靶是被細胞內(nèi)寄生物感染的細胞。
99.權利要求98的方法，其中的細胞內(nèi)寄生物是病毒。
100.權利要求98的方法，其中的細胞內(nèi)寄生物是細菌或者原生動物。
101.權利要求96的方法，其中的靶是病原體。
102.權利要求96的方法，其中的MHC受體結合裂隙是I類HLA受體結合裂隙。
103.權利要求96的方法，其中的MHC受體結合裂隙是II類HLA受體結合裂隙。
104.權利要求96的方法，其中的簇包含或者編碼具有一定長度的多肽，該長度至少是10個氨基酸。
105.權利要求104的方法，其中多肽的長度小于大約75個氨基酸。
106.權利要求96的表位簇，抗原具有一定的長度，其中的簇基本上是由具有一定長度的多肽組成或者編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于大約80％抗原的長度。
107.權利要求106的表位簇，抗原具有一定的長度，其中的簇基本上是由具有一定長度的多肽組成或者編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于大約50％抗原的長度。
108.權利要求107的表位簇，抗原具有一定的長度，其中的簇基本上是由具有一定長度的多肽組成或者編碼具有一定長度的多肽，其中多肽的長度小于大約20％抗原的長度。
109.一種核酸構建體，它包含第一編碼區(qū)域，其中的第一編碼區(qū)域包含至少編碼第一多肽的第一序列，其中的第一多肽包含衍生于與第一靶細胞相關的第一抗原的第一看家表位。
110.權利要求109的核酸構建體，其中的第一編碼區(qū)還包含編碼至少一個第二多肽的第二序列，其中的第二多肽包含衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原的第二表位。
111.權利要求110的核酸構建體，其中的第一多肽和第二多肽是鄰接的。
112.權利要求110的核酸構建體，其中的第一多肽和第二多肽不是鄰接的。
113.權利要求110的核酸構建體，其中的第二多肽是看家表位。
114.權利要求110的核酸構建體，其中的第二多肽是免疫表位。
115.權利要求110的核酸構建體，其中的第一抗原和第二抗原是相同的。
116.權利要求110的核酸構建體，其中的第一抗原和第二抗原是不相同的。
117.權利要求110的核酸構建體，其中的第一靶細胞和第二靶細胞是相同的。
118.權利要求110的核酸構建體，其中的第一靶細胞和第二靶細胞不是相同的。
119.權利要求109的核酸構建體，其中的第一靶細胞是瘤細胞。
120.權利要求119的核酸構建體，其中的瘤細胞選自白血病，癌，淋巴瘤，星形細胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，黑色素瘤，Wilm氏瘤，膀胱癌，乳癌，結腸癌，肝細胞癌，胰腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌，胃癌，宮頸癌，睪丸癌，腎細胞癌，和腦癌。
121.權利要求119的核酸構建體，其中的第一抗原選自MART-I/MelanA，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，h4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，b-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16，p15，NY-ESO，SSX基因家組成員的產(chǎn)物，CT-7，和SCP基因家組成員的產(chǎn)物。
122.權利要求109的核酸構建體，其中的靶細胞被細胞內(nèi)寄生物感染。
123.權利要求122的核酸構建體，其中的細胞內(nèi)寄生物是病毒。
124.權利要求123的核酸構建體，其中的病毒選自腺病毒，巨細胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒I，單純皰疹病毒II，人類皰疹病毒6，水痘一帶狀皰疹病毒，乙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，乳頭狀瘤病毒，細小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙型肝炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，人T細胞白血病病毒I和人T細胞白血病病毒II。
125.權利要求122的核酸構建體，其中的細胞內(nèi)寄生物是細菌，原生動物，真菌，或者朊病毒。
126.權利要求125的核酸構建體，其中的細胞內(nèi)寄生物選白衣原體，李司忒氏菌屬，沙門氏菌屬，軍團菌屬，布魯氏菌屬，柯克斯菌屬，立克次氏體屬，分支桿菌屬，利什曼原蟲屬，錐蟲屬(Trypanasoma)，弓形蟲屬和瘧原蟲。
127.權利要求109的核酸構建體，該構建體還包括與第一編碼區(qū)有效連接的第一啟動子序列。
128.權利要求127的核酸構建體，其中的啟動子衍生于巨細胞病毒(CMV)、SV40、或者逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復序列(LTR)。
129.權利要求127的核酸構建體，其中的啟動子是雙向啟動子。
130.權利要求127的核酸構建體，該構建體還包括與第二編碼區(qū)有效連接的第二啟動子序列。
131.權利要求109的核酸構建體，該構建體還包括與第一編碼區(qū)有效連接的聚合A序列。
132.權利要求110的核酸構建體，該構建體還包括內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列。
133.權利要求132的核酸構建體，其中的IRES序列位于第一和第二編碼序列之間。
134.權利要求110的核酸構建體，該構建體還包含泛素序列。
135.權利要求134的核酸構建體，其中的泛素序列位于第一和第二編碼序列之間。
136.權利要求110的核酸構建體，該構建體還包括一段編碼自催化肽的序列。
137.權利要求136的核酸構建體，其中的自催化肽編碼序列位于第一編碼序列和第二編碼序列之間。
138.權利要求109的核酸構建體，其還包含選自增強子，核進入序列，免疫刺激序列，和細胞因子、選擇標記、或者報告分子的表達盒。
139.權利要求109的核酸構建體，其中第一多肽的長度為大約7-15個氨基酸。
140.權利要求109的核酸構建體，其中第一多肽的長度為大約9或者10個氨基酸。
141.權利要求109的核酸構建體，其中第二多肽的長度為大約9或者10個氨基酸。
142.權利要求110的核酸構建體，其中第二多肽是大約10—大約75個氨基酸長度的表位簇。
143.權利要求110的核酸構建體，其中的第一表位具有對第一MHC等位基因的結合親和性，并且其中的第二表位具有對第二MHC等位基因的結合親和性。
144.權利要求143的核酸構建體，其中的第一等位基因和第二等位基因是相同的。
145.權利要求143的核酸構建體，其中的第一等位基因和第二等位基因是不同的。
146.權利要求109的核酸構建體，其還包含至少一個第二編碼區(qū)，其中的第二編碼區(qū)包含一個編碼至少一個第二多肽的第二序列，其中的第二多肽包含衍生于與第二靶細胞相關的第二抗原的第二表位。
147.權利要求146的核酸構建體，其中所述的第一和第二編碼區(qū)被有效地連接到單個雙向啟動子的任一側。
148.權利要求146的核酸構建體，其中的至少一個編碼區(qū)包含編碼多個多肽的多個序列，其中的每個多肽含有至少一個衍生于與靶細胞相關的抗原的表位。
149.權利要求129的核酸構建體，其中的雙向啟動子還被有效地連接到第二序列，該第二序列編碼一種佐劑。
150.權利要求136的核酸構建體，其中的編碼的多肽具有自動蛋白水解活性。
151.權利要求136的核酸構建體，其中的編碼的多肽抑制肽鍵形成。
152.含有權利要求109-151中任何一項的核酸構建體的疫苗。
153.一種制作疫苗的方法，其包含下面的步驟制備含有權利要求109-151中任何一項的核酸構建體的疫苗組合物。
154.根據(jù)權利要求41或者153的方法制造的疫苗。
155.一種治療動物的方法，其包含將權利要求1-40，81，152，或者154中任何一項的疫苗給予動物。
156.權利要求155的方法，其中的給予步驟包括選自經(jīng)皮膚，結節(jié)內(nèi)，結節(jié)周，經(jīng)口，靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，和粘膜的傳送模式。
157.權利要求155的方法，其還包括一個分析步驟來確定靶細胞狀態(tài)的特征指示。
158.權利要求157的方法，其包括第一分析步驟和第二分析步驟，其中第一分析步驟先于所述的給予步驟，并且第二分析步驟在所述的給予步驟之后。
159.權利要求158的方法，其還包括將在第一分析步驟中確定的特征與在第二分析步驟中確定的特征相比較以獲得結果。
160.權利要求159的方法，其中的結果選自靶細胞數(shù)量的減少、包含靶細胞的腫瘤的質(zhì)量和大小的減小、或者感染靶細胞的細胞內(nèi)寄生物的數(shù)量或者濃度的降低。
161.看家表位在疫苗生產(chǎn)中的用途，該疫苗用于權利要求155-160中任何一項的治療方法中。
全文摘要
本發(fā)明公開了誘導針對癌細胞和細胞內(nèi)寄生物感染細胞的免疫反應的方法和疫苗。公開了含有看家表位的疫苗?？醇冶砦皇怯芍車毎械目醇业鞍酌阁w，而不是由專門抗原呈遞細胞的看家蛋白酶體形成的。含有看家表位的疫苗可以因此指導針對靶細胞的免疫反應，所述的看家表位衍生于靶細胞相關抗原。本發(fā)明也公開了治療方法，該方法包括含有看家表位疫苗的給予。
文檔編號A61K39/02GK1440462SQ01812119
公開日2003年9月3日 申請日期2001年4月27日 優(yōu)先權日2000年4月28日
發(fā)明者約翰·J·L·西馬德, 戴維·C·戴蒙德, 雷向東 申請人:麥康公司