專利名稱：抗血管增生的多肽的制作方法
相關(guān)專利申請的交叉參考資料此項(xiàng)發(fā)明已于2000年11月28日向美國專利局提出專利申請，專利號碼60/253725。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域該項(xiàng)發(fā)明主要涉及血管增生(angiogenesis)，更明確的說，是指和血漿酶原(plasminogen)有關(guān)而能抑制血管增生的多肽，以及這種多肽的生成和使用方法。
相關(guān)技術(shù)概述血管增生是指新血管的生成，這個(gè)過程涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell)的繁殖、移位，基膜(basement membrane)的降解退化，以及新血管組織之間的復(fù)雜協(xié)調(diào)(參考文獻(xiàn)Ji et al.，F(xiàn)ASEB J.121731-1738，1998)。在諸如胚胎器官生成，成年人傷口愈合這類常規(guī)進(jìn)程中，血管增生為正在生成的新組織提供了必要的血管支援。然而，在患病的狀況下，新血管的生成卻可以加速發(fā)病的過程，它可以加快癌癥腫瘤，糖尿病性視網(wǎng)膜病，組織和器官畸形，心臟血管病癥的發(fā)展與進(jìn)程(參考文獻(xiàn)(Folkman，Nat.Med.127-31，1995)。以癌癥腫瘤而言，愈來愈多的證據(jù)指出，腫瘤的生長和致死率主要取決于血管增生，若能抑制血管增生就能抑制腫瘤的生長(參考文獻(xiàn)Folkman，F(xiàn)orum(Genova)959-62，1999；Folkman，Adv.Cancer.Res.43175-203，1985)。
許多血管增生抑制劑，也就是抗血管增生的物質(zhì)，已經(jīng)被確認(rèn)出來，其中包括血管增生阻斷素(angiostatin)，血小板敏感蛋白(thrombospondin)，以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤源性血管生成抑制因子(參考文獻(xiàn)Folkman，1995 supra)。這其中，血管增生阻斷素，這是一個(gè)分子重量為38kDa的血漿酶原片斷，被證明具有非常強(qiáng)的抑制血管增生的活性，因此它能夠抑制腫瘤的生長(參考文獻(xiàn)O’Reilly etal.Nat.Med.2689-692，1996；O’Reilly et al.，Cell 79315-328，1994)。相較之下，完整的血漿酶原，反而不具有抑制血管增生的活性(Id.)。
血管增生阻斷素(angiostatin)具有血漿酶原所含有的五個(gè)三環(huán)二硫連鎖圈(亦即所謂的kringle結(jié)構(gòu)域)中的前四個(gè)三環(huán)二硫連鎖圈。通過對血漿酶原各個(gè)片斷的活性研究，血管增生阻斷素所含有的四個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域，以及在血漿酶原中所發(fā)現(xiàn)的第五個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域(血管增生阻斷素中并沒有該結(jié)構(gòu)域)，現(xiàn)已被確認(rèn)具有抑制血管增生的活性。研究報(bào)告指出，從血漿酶原的蛋白質(zhì)水解和重組技術(shù)所獲得的血漿酶原kringle 5結(jié)構(gòu)片斷，展現(xiàn)出非常強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性(參考文獻(xiàn)Cao et al.，J.Biol.Chem.27222924-22928，1997)。同樣的，重組kringle 1結(jié)構(gòu)片斷和重組kringle 3結(jié)構(gòu)片斷也展現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性，而kringle 2結(jié)構(gòu)片斷的抑制活性較弱，kringle 4結(jié)構(gòu)片斷的抑制活性則最差(參考文獻(xiàn)Cao et al.，J.Biol.Chem.27129461-29467，1996；U.S.Patent No.6,024,688 to Folkman et al.)。不同的是，兼含kringle 2和kringle 3的結(jié)構(gòu)片斷所表現(xiàn)出來的抑制活性卻很弱，但兼含kringle 1-3的較大型血管增生阻斷素片斷，則比兼含kringle 1-5的血管增生阻斷素的抗-增生活性來的更強(qiáng)而有力(Id.)。
由於根據(jù)單一kringle結(jié)構(gòu)所具有的活性，并不能準(zhǔn)確地推測出兼含多個(gè)kringle結(jié)構(gòu)的血漿酶原片斷，其所具有的抗-血管增生的活性，因此早期發(fā)表的研究報(bào)告并未指出，兼含多個(gè)kringle結(jié)構(gòu)的血漿酶原片斷，是否具有抗-血管增生的活性。此外，血管增生阻斷素本身是在還原條件下被分離從而獲得的一種物質(zhì)，一般咸信這種物質(zhì)乃是一種非-自然產(chǎn)生的片斷，它需要通過前文所提的蛋白質(zhì)水解和重組技術(shù)才可以獲得。這類非-自然產(chǎn)生的多肽，可能會在某一主體身上產(chǎn)生免疫反應(yīng)或不良副作用，而自然生成的片斷，則很可能不會產(chǎn)生這種現(xiàn)象。再者，從早期研究報(bào)告所發(fā)表的蛋白質(zhì)水解和重組片斷的三度空間結(jié)構(gòu)，亦不能準(zhǔn)確的推測出，一個(gè)功能為內(nèi)生性血管增生劑的自然生成血漿酶原片斷的三度空間結(jié)構(gòu)。是以，鑒別及分離出嶄新的，自然生成的，具有強(qiáng)而有效的抗-血管增生活性，而且只有很小，甚或不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)和某些副作用的血漿酶原多肽片斷，乃是眾望所歸之事。
發(fā)明概要發(fā)明者成功的發(fā)現(xiàn)了一些嶄新的，自然生成的血漿酶原片斷。其中一個(gè)片斷為A61，這個(gè)分子的重量大約是61kDa，這是通過在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯(SDS-polyacrylamide)膠體電泳分析法得到的(參考文獻(xiàn)Kassam，G.etal.，(2001)Journal of Biological Chemistry 2768924-8933)。人體A61有391個(gè)氨基酸，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。第二個(gè)自然生成的片斷是A61的少量變異同族體，血漿酶原被細(xì)胞裂解后，在生成A61時(shí)，同時(shí)也生成了少量的變異同族體。這種變異同族體含有394個(gè)氨基酸，其核苷酸序列為SEQ ID NO2。在此，我們將這種變異同族體統(tǒng)稱為A61。我們所發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)自然生成的片斷，在此稱之為p22(Kwon，M.et al.，(2001)Biochemistry 4013246-13253)。P22的分子重量大約為22kDa，人體中的p22含有103個(gè)氨基酸，其核苷酸序列為SEQ ID NO3。

圖1和SEQ ID NO4陳列的是完整的人體血漿酶原序列，其它片斷均是由這個(gè)人體血漿酶原所衍生出來的。A61，它的少量變異同族體，以及p22均展現(xiàn)出抗-血管增生的活性，這種活性能夠在體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，它們并且還在體內(nèi)展現(xiàn)出抗癌的活性。
(0008)這項(xiàng)發(fā)明意欲包括各類脊椎動物所有的A61和p22分子，其中更主要的是研究哺乳類動物，尤其是人類。從已知的廣大物種的血漿酶和血漿酶原的序列，我們可以很容易的推斷出那些是非人類物種的序列。A61和p22的對偶質(zhì)變異體亦包括在這項(xiàng)發(fā)明之中。
(0009)A61和p22與血管增生阻斷素(angiostatin)有數(shù)點(diǎn)不同之處。首先，A61和p22是自然形成的分子，無論在健康人群還是癌癥患者的血漿內(nèi)，它們都存在。第二，它們都是血漿酶自體消化的分裂產(chǎn)物，因此，氨基-末端和羧基-末端，乃是由血漿酶原分子內(nèi)的血漿酶的分裂位置來決定。與血管增生阻斷素不同的是，人體p22由血漿酶原的賴氨酸-78延伸至賴氨酸-180，是以，它乃是由103個(gè)連續(xù)的血漿酶原氨基酸所組成。人體A61由血漿酶原的賴氨酸-78延伸至賴氨酸-468，它同時(shí)還包含一個(gè)由賴氨酸-78延伸至精氨酸-471的少量變異體，是以，它分別含有391和394個(gè)連續(xù)的氨基酸。因此，p22含有kringle 1結(jié)構(gòu)域以及一部分血漿酶原的kringle 2序列，A61則含有kringle 1-4結(jié)構(gòu)域以及一部分血漿酶原的kringle5序列。
(00010)另外，與血管增生阻斷素(angiostatin)不同的是，當(dāng)缺少自由硫氫基供體或血漿還原酶時(shí)，這些片斷還是可以在體外從血漿酶和血漿酶原中備制。由于人體血漿酶原的現(xiàn)成可用性，以及血漿酶具有自動分解蛋白質(zhì)使其轉(zhuǎn)化為p22和A61的本質(zhì)，因此不論是在無細(xì)胞系統(tǒng)下，或是將血漿酶原與細(xì)胞相接觸，都能很容易產(chǎn)生微克以上的這些片斷。運(yùn)用一些在這個(gè)領(lǐng)域里廣為人知的方法，可以將A61和p22多肽，從具有血漿酶原的細(xì)胞培養(yǎng)液中純化出來，例如利用固定化的賴氨酸或具有血漿酶結(jié)合功能的賴氨酸衍生物進(jìn)行的親和色譜法，厭水交互層析法，凝膠過濾層析法，以及離子交換層析法。親和色譜法也可以利用其它固定化的配基進(jìn)行，例如利用血漿酶原kringle結(jié)構(gòu)域的抗體(但不僅限于此)。當(dāng)使用固定化的賴氨酸來進(jìn)行純化時(shí)，不管是經(jīng)過涌流餾分還是洗脫餾分得到的p22組分，都表現(xiàn)出抑制血管增生的活性。當(dāng)使用厭水交互層析法純化時(shí)，經(jīng)洗脫餾分得到的p22組分，也表現(xiàn)出這種活性，在這種方法中，用辛烷基—瓊脂糖(OctylSepharose)作厭水固相原模。
(00011)這些片斷與血管增生阻斷素，以及其它具有抗-血管增生活性的血漿酶原片斷相比，其光譜的特征是不相同的。尤其是，它們在自體熒光光譜和圓二色散儀光譜(Circular Dichroism)中的差異，表明了p22的kringle結(jié)構(gòu)域，與重組kringle 1結(jié)構(gòu)，在立體結(jié)構(gòu)組成上明顯不同。p22在圓二色散儀光譜中所顯示的波段為+227.5和-202.7，而血漿酶原kringle 1片斷的波段則為+227.5和-197.4。這表示p22和血漿酶原kringle 1結(jié)構(gòu)兩者的三度空間結(jié)構(gòu)是不相同的。
這些片斷與血管增生阻斷素的生物活性也不同。當(dāng)采用牛的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作為測定系統(tǒng)時(shí)，若要達(dá)到50％細(xì)胞增殖的抑制效果，需要使用35nM的A61，或14nM的p22。此外，通過在老鼠身上所進(jìn)行的Lewis肺癌細(xì)胞測定發(fā)現(xiàn)，p22和A61都能有效抑制體內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤(metastatic tumors)的生長。和血漿酶原相比較，使用2.5毫克/公斤/每日的p22和A61，能更有效的抑制肺轉(zhuǎn)移癌的生長過程。因此，A61和p22可以用來治療人類和其它哺乳類動物的癌癥。
因此，這項(xiàng)發(fā)明的落實(shí)表現(xiàn)之一是，分離和純化A61和p22多肽血漿酶原片斷。將這些片斷的序列，與人體血漿酶原序列SEQ ID NO4放在一起進(jìn)行序列對比，便可以確認(rèn)出這些片斷，其中氨基-末端的氨基酸，為人體血漿酶原的賴氨酸-78，羧基-末端的氨基酸，為人體血漿酶原的賴氨酸-180(p22)，或賴氨酸-468(A61)，或精氨酸-471(A61少量變異體)。這些片斷是自然生成的，從非人類物種提取的片斷與人體血漿酶原序列SEQ ID NO4相比，兩者至少有60％的相同性，也可以有至少75％、80％、90％、而最好是有95％的相同性。
這項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)落實(shí)表現(xiàn)是，被分離出來的A61和p22多肽，分別含有在血漿酶氨基末端的102、391或394個(gè)氨基酸。這種血漿酶可以是脊椎動物的血漿酶，也可以是哺乳類動物的血漿酶，最好是人類的血漿酶。圖1和SEQ ID NO4陳列了一個(gè)人體血漿酶原序列。這種多肽與血漿酶原序列SEQ ID NO4相比，至少有60％的相同性，也可以有至少75％、80％、90％、而最好是有95％的相同性。
另一個(gè)落實(shí)表現(xiàn)所提供的是，被分離出來的A61和p22多肽，其序列為SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3，或者它們的保守變異替代物的序列。所謂保守變異替代物是指，與SEQ ID NO1-3序列相比，其多肽具有一個(gè)或數(shù)個(gè)保守氨基酸替代物。由於保守氨基酸替代物與原氨基酸支鏈的化學(xué)性質(zhì)相似，是以它們彼此可以互換。
另一個(gè)落實(shí)表現(xiàn)所提供的是，該項(xiàng)發(fā)明的各類形式表現(xiàn)比較
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)落實(shí)表現(xiàn)提供的是，一個(gè)A61或p22多肽與一個(gè)細(xì)胞毒素因子的結(jié)合體。在這個(gè)結(jié)合體中，A61或p22多肽不僅提供抗-血管增生的效用，而且還可以將相結(jié)合的細(xì)胞毒素，帶到出現(xiàn)血管增生現(xiàn)象的部位，例如生長中的腫瘤。在某些情況下，這些結(jié)合體可以是融合蛋白，而且融合蛋白的核酸分子編碼也包括在內(nèi)。這些結(jié)合體也包括帶有這些核酸分子編碼的核酸分子載體(vector)，以及被這些核酸分子轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞。
這項(xiàng)發(fā)明的另一項(xiàng)落實(shí)表現(xiàn)提供的是，一個(gè)A61或p22的核酸分子，這個(gè)核酸分子包括可轉(zhuǎn)譯成被分離出來的A61或p22多肽的多聚核苷酸序列。第一種包含可轉(zhuǎn)譯為含有391個(gè)連續(xù)氨基酸的A61多肽的多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列至多含有1173個(gè)連續(xù)核苷，此序列可轉(zhuǎn)譯為血漿酶原。另外一種可轉(zhuǎn)譯為包含394個(gè)連續(xù)氨基酸的A61多肽的多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列至多包含1182個(gè)連續(xù)核苷，此序列可轉(zhuǎn)譯為血漿酶原。還有一種可轉(zhuǎn)譯為含有103個(gè)連續(xù)氨基酸的p22多肽的多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列至多包含309個(gè)連續(xù)核苷，此序列可轉(zhuǎn)譯為血漿酶原。該項(xiàng)發(fā)明并且提供了含有此種核苷酸的載體，以及含有此種載體的真核和原核細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是哺乳類動物的細(xì)胞，例如人類的，鼠類的，或者牛的。原核細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如E.coli細(xì)胞。除此以外，載體可以是質(zhì)粒(plasmid)或病毒。
此外，這項(xiàng)發(fā)明的另一項(xiàng)落實(shí)表現(xiàn)提供的是，A61和p22核酸或是與其互補(bǔ)的309，1173或1182個(gè)核苷的核酸，這些核酸分別與SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQID NO7序列至少有90％的相同性。另一項(xiàng)落實(shí)表現(xiàn)所提供的是，在嚴(yán)格的反應(yīng)條件下，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7序列與這些含有309，1173或1182個(gè)核苷的核酸，會產(chǎn)生雜交。
這項(xiàng)發(fā)明同時(shí)提供了A61或/和p22多肽血漿酶原片斷的制備方法。A61和p22可以通過細(xì)胞媒介法或無細(xì)胞法制備。細(xì)胞媒介法是，用脊椎動物細(xì)胞去接觸血漿酶原，運(yùn)用在培植中所進(jìn)行的自體分解，去制造血漿酶原的A61或/和p22片斷，然后將A61或/和p22片斷從分解后的物質(zhì)中分離出來。哺乳類動物的細(xì)胞更合適，最好是直接用諸如HT-1080或海拉(HeLa)細(xì)胞等人體細(xì)胞。另一種可以被應(yīng)用的細(xì)胞是牛毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞。這里所用的血漿酶原可以是谷氨酸-血漿酶原，也可以是賴氨酸-血漿酶原。任何適當(dāng)?shù)姆蛛x方法都可以使用，包括親和色譜法，這個(gè)方法使用的是固定化的賴氨酸或者具有能夠與血漿酶相結(jié)合的賴氨酸衍生物。此外，可以通過厭水交互層析法和凝膠過濾層析法等色譜技術(shù)去進(jìn)行純化。
在無細(xì)胞法中，先將血漿酶原活化劑與血漿酶原混合物一起培育以備制A61。然后將A61從混合物中分離出來。p22的備制法則是，將A61與血漿酶以及諸如二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)等還原劑共同培育，然后將p22從培育混合物中分離出來。此外，也可以通過將A61與內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物(annexinII tetramer)的內(nèi)皮細(xì)胞受體子組共同培育去制備p22。
這項(xiàng)發(fā)明也為哺乳類動物抗-血管增生的治療提供了一些方法。這些方法包括給于哺乳類動物足以抑制血管增生作用的A61和/或p22含量。這個(gè)方法可以應(yīng)用在任何涉及非必要血管增生的疾病和狀況，尤其是癌癥腫瘤細(xì)胞的生長。這里所指的哺乳類動物最好是人類，A61和/或p22也最好是人類的多肽。A61和p22也可以和其它因子混合起來治療特殊疾病，例如用來治療癌癥的其他抗癌因子。
這項(xiàng)發(fā)明的另一項(xiàng)落實(shí)表現(xiàn)是，這項(xiàng)發(fā)明提供了一個(gè)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方法。這項(xiàng)方法包括使用適量的A61或p22，或是它們的結(jié)合物，去抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
茲將這項(xiàng)發(fā)明的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)綜述如下這項(xiàng)發(fā)明提供了一種嶄新的抗-血管增生的物質(zhì)，這種物質(zhì)對治療那些因?yàn)樾纬蓪θ梭w有害的新血管而導(dǎo)致的疾病，例如因癌癥腫瘤而產(chǎn)生的新血管，是非常有用的；由於這項(xiàng)發(fā)明所提供的這種物質(zhì)是在體內(nèi)自然形成的，因此接受這種物質(zhì)的人體，較不會產(chǎn)生免疫性反應(yīng)；這項(xiàng)發(fā)明所提供的這種抗-血管增生的物質(zhì)是非常有效的，由於這些物質(zhì)是在接受這種物質(zhì)的人體內(nèi)自然形成的，因此會產(chǎn)生不良副作用的可能性將減低；這項(xiàng)發(fā)明所提供的生產(chǎn)新的抗-血管增生多肽的方法非常簡單，而且產(chǎn)量很高；這套嶄新而有效的，用來治療涉及到血管增生方面疾病的方法，使用的是嶄新的成分。
圖形概述圖1陳列的是，人體血漿酶原先驅(qū)物質(zhì)的氨基酸序列，從蛋氨酸-1到氨基乙酸-19(M-1到G-19)是信號縮氨酸鍵；從谷氨酸-20到天門冬酸-810是谷氨酸-血漿酶原；從賴氨酸-97到天門冬酸-810是賴氨酸-血漿酶原；從賴氨酸-97到賴氨酸-487，以及從賴氨酸-97到精氨酸-490是兩種A61的同族體；從賴氨酸-97到賴氨酸-199是p22。
圖2陳列的是，人體血漿酶原先驅(qū)物質(zhì)的核酸序列，核酸55-111是信號縮氨酸鍵的編碼；核酸112-2484是谷氨酸-血漿酶原的編碼；核酸343-2484是由一部分谷氨酸-血漿酶原所組成的賴氨酸-血漿酶原的編碼；核酸343-1515和343-1524是由一部分谷氨酸-血漿酶原或賴氨酸-血漿酶原所組成的兩種A61同族體的編碼；核酸343-651是由一部分谷氨酸-血漿酶原或賴氨酸-血漿酶原所組成的p22的編碼。
圖3陳列的是，在無細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)所進(jìn)行的A61的產(chǎn)生和分離過程，然后采用在還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法及考馬斯氏藍(lán)色染色法染色去進(jìn)行分析(A)，采用在非還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法及考馬斯氏藍(lán)色染色法染色去進(jìn)行分析(B)，以及采用以一個(gè)單克隆抗體作初級抗體去認(rèn)識人體血漿酶原kringles 1-3結(jié)構(gòu)的免疫印跡法(WesternBlotting)去進(jìn)行分析(C)。
圖4陳列的是，血漿酶原分裂為A61的時(shí)間進(jìn)程分析，采用在還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法及考馬斯氏藍(lán)色染色法染色去進(jìn)行分析(A)，以及采用在非還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法及考馬斯氏藍(lán)色染色法染色去進(jìn)行分析(B)。
圖5陳列的是，在免疫印跡法中，使用兔子的抗鼠血漿酶抗體(A)或單克隆抗人體血漿酶原Kringle 1-3結(jié)構(gòu)的抗體(B)去比較A61和老鼠血清的血漿酶原片斷。
圖6陳列的是，在正常老鼠、有腫瘤的老鼠、經(jīng)過腫瘤切除的老鼠的血清中所呈現(xiàn)的一個(gè)可測量的類似A61的血漿酶原片斷。
圖7陳列的是，在普通志愿者(A)和癌癥患者(B)中含有的血清血漿酶原片斷與A61之間的比較。
圖8陳列的是A61的圓二色散儀光譜。
圖9陳列的是在含有及不含有Tran-4-氨甲環(huán)酸(AMCHA)的條件下，A61的內(nèi)部熒光光譜。
圖10陳列的是，A61對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞繁殖的抑制。
圖11陳列的是，經(jīng)由測量皮下注射了Lewis肺癌的老鼠，其肺重量在一段期間內(nèi)的變化，證明了A61可以抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。
圖12陳列的是，在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的p22。
圖13陳列的是，由HT-1080細(xì)胞所產(chǎn)生的新血漿酶原片斷(p22)的鑒定。
圖14陳列的是，p22的結(jié)構(gòu)圖解。
圖15陳列的是，p22和kringle 1結(jié)構(gòu)(K1)的圓二色散儀光譜。
圖16陳列的是，p22和重組kringle 1結(jié)構(gòu)的自身熒光光譜。
圖17陳列的是，p22和重組kringle 1結(jié)構(gòu)對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞繁殖的抑制。
圖18陳列的是，p22抑制雞的絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)上新血管的形成。
圖19陳列的是，對老鼠肺中轉(zhuǎn)移性腫瘤生長的抑制。
圖20陳列的是，A61與annexinII四聚物結(jié)合。
圖21陳列的是，當(dāng)海拉細(xì)胞(HeLa cells)被一個(gè)含有反義鏈(antisense)的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物(annexinII tetramer)的p11子組中后，p22和A61的產(chǎn)量減少了。
圖22陳列的是，從A61中產(chǎn)生p22需要血漿酶和內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物。
發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)這項(xiàng)發(fā)明，嶄新的、自然生成的血漿酶原片斷被發(fā)現(xiàn)了。這里所提的嶄新的多肽是指A61和p22。由於這類多肽表現(xiàn)出抗-血管增生的活性，因此用它們?nèi)ブ委熀陀泻π卵苤纬捎嘘P(guān)的疾病，是非常有用的。
血漿酶原是血漿中的單鏈醣蛋白，其濃度為2μM。(參考文獻(xiàn)Wohl et al.，Thromb.Res.27523-535，1982；Kang et al.，Trends Cardiovasc.Med.9092-102，1999)人類的這種血漿酶原多肽含有791個(gè)氨基酸(圖1，氨基酸19-810)。通過對賴氨酸-77-賴氨酸-78鍵的血漿酶水解作用，天然谷氨酸-血漿酶原可以很容易轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?血漿酶原(圖1，氨基酸79-810)。血漿酶原是血漿酶的先驅(qū)物質(zhì)，這種物質(zhì)是一種，運(yùn)用組織血漿酶原活化物或尿激酶活化物(urokinase-type plasminogen activator)，去切斷精氨酸-561和纈氨酸-562之間的血漿酶原后，所形成的蛋白酶。二硫共價(jià)鍵將血漿酶的這兩條多肽鏈連接起來。其中較大的一條多肽鏈(或者稱為血漿酶A鏈)含有5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)，這個(gè)多肽鏈也是在血漿酶原的賴氨酸-77和賴氨酸-78之間分裂后，所形成的一條從賴氨酸-78到精氨酸-561的多肽鏈。較小的一條多肽鏈或B鏈，則是由血漿酶原纈氨酸-562到精氨酸-79l所組成的。血漿酶原和血漿酶二者均通過氨基末端的Kringle結(jié)構(gòu)域與纖維蛋白相連，其中每一個(gè)結(jié)構(gòu)域都是由二硫鍵所連成的三個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(三環(huán)二硫連鎖圈)。此處所指的血漿酶原，包括人類的谷氨酸-血漿酶原和賴氨酸-血漿酶原以及人類序列的等位基因變異體。另外還包括非人類哺乳類動物和非哺乳類脊椎動物的血漿酶原的直系同源物，這其中有許多是這個(gè)領(lǐng)域中已知的直向同源物。
這項(xiàng)發(fā)明中的A61和p22多肽及多聚核苷酸序列，各自有一部分符合血漿酶原的多肽序列和多聚核苷酸序列。這里所謂的“符合”(corresponds to)是指一個(gè)多肽序列與所論及的參考多肽序列相同，或者一個(gè)多聚核苷酸的序列與所論及的參考多聚核苷酸序列，全部或部分屬于同源多肽或核苷酸(這里是指相同，不是指嚴(yán)格的指在進(jìn)化上相關(guān))。在這里所謂的“互補(bǔ)”(complementary to)是指，互補(bǔ)序列與所論及的參考序列不相同，但是其所包含的一個(gè)嘌呤和嘧啶 ，與所論及的參考序列的嘌呤和嘧啶 是明確配合的。例如，“TATAC”核酸序列和“TATAC”參考序列是相同的，但與“GTATA”參考序列則是互補(bǔ)的。
A61有主要和次要兩種多肽變異體，主要變異體的序列含有391個(gè)氨基酸(SEQID NO1)，這是從血漿酶原的賴氨酸-78到賴氨酸-468。而次要變異體序列含有394個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)，是從血漿酶原的賴氨酸-78到精氨酸-471。雖然人體A61變異體被證實(shí)和一部分人體血漿酶原的序列相同，但是這里所謂的A61意圖包括非人類哺乳類動物以及非哺乳類脊椎動物的直系同源物序列。將血漿酶原直系同源物序列與人體血漿酶原序列進(jìn)行序列對比，然后確認(rèn)出代表A61多肽的那一部份分子，如此可以很容易為這些A61的直系同源物分子序列定位。另一種方法是將A61直系同源多肽和與人體A61進(jìn)行序列相對比。一般相信，非人類哺乳類動物的直系同源A61多肽序列和人體A61序列相比，至少有75％是相同的，亦即至少有75％的氨基酸是相同的，非哺乳類脊椎動物的A61直系同源多肽序列和人體A61序列相比，至少有60％是相同的。
p22的序列是血漿酶原從賴氨酸-78到賴氨酸-180的103個(gè)氨基酸組成(SEQ IDNO3)。雖然人體p22被證實(shí)和一部分人體血漿酶原的序列相同，這里所謂的p22包括其來自非人類哺乳動物以及非哺乳類脊椎動物的直系同源物。該p22的直系同源物分子序列，可以通過血漿酶原直系同源物序列與人體血漿酶原序列之間的對比來決定。另外一種方法是，將假設(shè)的p22的直系同源物分子和人體p22進(jìn)行對比。一般相信，非人類哺乳類動物的直系同源p22多肽序列和人體p22序列相比，至少有75％是相同的，亦即至少有75％的氨基酸是相同的，非哺乳類脊椎動物的p22直系同源多肽序列和人體p22序列相比，至少有60％是相同的。
辨別對應(yīng)序列的序列對比方法，在這個(gè)領(lǐng)域里廣為人知，這些方法可以鑒別橫向同源物(Paralog)和直向同源物(ortholog)的序列。例如，在Lasergene生物計(jì)算軟件(DNASTAR，INC，Madison，Wis.)中輸入了數(shù)種序列并列對比的Clustal法(參考文獻(xiàn)Higgins et al，Cabios 8189-191，1992)，可以對兩種或數(shù)種序列進(jìn)行序列對比。這種方法對多種序列的并列對比方式非常先進(jìn)，它采用從一系列成對的對比組合中計(jì)算出來的相似數(shù)據(jù)，去匯聚變得越來越大的對比組合群。只要找到最大的序列對比數(shù)據(jù)，便可獲得最佳的序列對比組合，而該數(shù)據(jù)是從對比中各殘基分?jǐn)?shù)的平均值得出來的，而各殘基的分?jǐn)?shù)則來自于殘基重量表，此重量表代表某一氨基酸在兩個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)內(nèi)發(fā)生變化的或然率。序列對比中空置的及過長的間隔會降低序列對比的數(shù)據(jù)。該軟件所使用的數(shù)據(jù)自動設(shè)定母數(shù)如下多種序列對比(Multiple Alignment)的空置間隔處罰＝10；多種序列對比的過長間隔處罰＝10；雙序列對比(pairwise alignment)的k-tuple值＝1；雙序列對比的空置間隔處罰＝3；雙序列對比的窗口值＝5；雙序列對比留存下來的對角值＝5。該軟件所使用的殘基重量表是PAM250(參考文獻(xiàn)Dayhoff et al.，inAtlas of Protein Sequence and Struc ture，Dayhoff，Ed.，NBRF，Washington，Vol.5，suppl.3，p.345，1978)。
進(jìn)一步陳述人體A61的特徵，A61多肽的分子重量大約是61kDa，這是通過在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析得到的。用來檢查分子二級結(jié)構(gòu)的循環(huán)二象光譜顯示，A61多肽在202nm處有一道很強(qiáng)的負(fù)波段，在227nm處有一道弱的正波段。對二級結(jié)構(gòu)內(nèi)含所進(jìn)行的分析顯示，A61多肽含有kringle結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)具有與自由賴氨酸殘基和羧基末端賴氨酸殘基相結(jié)合的功能。將A61多肽在體外與牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一起培育，A61多肽表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的生物活性，要達(dá)到50％抑制管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果所需要的A61濃度(IC50)為35±10nM。更甚者，當(dāng)A61的用量為2.5mg/kg時(shí)，它能夠抑制在老鼠體內(nèi)因注射Lweis肺癌細(xì)胞而產(chǎn)生出的轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。
進(jìn)一步陳述人體p22的特徵，p22多肽的分子重量大約是22kDa，這是通過在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析得到的。循環(huán)二象光譜顯示，p22多肽在202.7nm處有一道很強(qiáng)的負(fù)波段，在227.5nm處有一道弱的正波段。與之相比，重組Kringle多肽則在197.4nm處有一道很強(qiáng)的負(fù)波段，在227.5nm處有一道弱的正波段，這顯示p22與重組kringle 1多肽的二級結(jié)構(gòu)不同。針對p22生物活性所進(jìn)行之評估顯示，將p22多肽在體外與牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一起培育，要達(dá)到50％抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果所需要的p22濃度(IC50)為14.3±2.3nM。更甚者，當(dāng)p22的用量為2.5mg/kg時(shí)，它能夠抑制在老鼠體內(nèi)因注射Lweis肺癌細(xì)胞而產(chǎn)生出的轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。
此項(xiàng)發(fā)明中的A61和p22多肽是自然生成的，因?yàn)锳61和p22被發(fā)現(xiàn)存在于正常人和癌癥患者的血清中。這里所謂的“自然生成”是指，這種物質(zhì)存在于大自然中，而且可以在脊椎動物體內(nèi)找到這種物質(zhì)。這種物質(zhì)可能在體內(nèi)一直存在或是間歇性存在，或者只有在特定的生理或病理?xiàng)l件下才會存在。這種“自然生成”的物質(zhì)其特定樣品，可能并不存在于脊椎動物的體內(nèi)，但是卻可以通過一些諸如化學(xué)合成，重組等方式得到，只要所得到的物質(zhì)與脊椎動物體內(nèi)的物質(zhì)相同即可。相較之下，和脊椎動物體內(nèi)物質(zhì)不相同的“人造”物質(zhì)，則不被認(rèn)為是“自然生成”的物質(zhì)。
此項(xiàng)發(fā)明并且包括A61和p22多肽的變異體，和A61與p22多肽相比，A61和p22多肽變異體具有包含保守氨基酸替代物的序列。所謂保守變異替代物指的是，與原氨基酸具有相似的化學(xué)性質(zhì)和/或相似的支鏈，是以它們彼此可以互換。例如一群包括丙胺酸(alanine)、纈氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、異亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、色氨酸(tryptophan)、苯基丙氨酸(phenylalanine)和甲硫氨酸(methionine)在內(nèi)的中性及厭水性氨基酸；一群包括氨基乙酸(glycine)、絲氨酸(serine)、蘇氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)、半胱氨酸(cysteine)、天冬酰胺酸(asparagine)和谷氨酰胺酸(glutamine)在內(nèi)的中性及有極性氨基酸；一群包括賴氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)和組氨酸(histidine)在內(nèi)的堿性氨基酸；一群包括天(門)冬氨酸(aspartic acid)和谷氨酸(glutamic acid)在內(nèi)的酸性氨基酸；一群包括氨基乙酸(glycine)、丙胺酸(alanine)、纈氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)和異亮氨酸(isoleucine)在內(nèi)的帶有脂肪性質(zhì)支鏈的氨基酸；一群包括絲氨酸(serine)和蘇氨酸(threonine)在內(nèi)的帶有脂肪質(zhì)羥氫氧基支鏈的氨基酸；一群包括天冬酰胺酸(asparagine)和谷氨酰胺酸(glutamine)在內(nèi)的含有氨基化合物支鏈的氨基酸；含有苯基丙氨酸(phenylalanine)、酪氨酸(tyrosine)和色氨酸(tryptophan)在內(nèi)的含有芳香族支鏈的氨基酸；一群包括半胱氨酸(cysteine)和甲硫氨酸(methionine)在內(nèi)的含有硫支鏈的氨基酸。較佳的保守氨基酸替代物是纈氨酸(valine)-亮氨酸(leucine)-異亮氨酸(isoleucine)，苯基丙氨酸(phenylalanine)-酪氨酸(tyrosine)，賴氨酸(lysine)-精氨酸(arginine)，丙胺酸(alanine)-纈氨酸(valine)，天冬酰胺酸(asparagine)-谷氨酰胺酸(glutamine)，谷氨酸(glutamic acid)-天(門)冬氨酸(asparticacid)，亮氨酸(leucine)-甲硫氨酸(methionine)以及谷氨酰胺酸(glutamine)-組氨酸(histidine)。
此項(xiàng)發(fā)明中的A61多肽內(nèi)也包括糖基化的A61。將一條碳水化合物支鏈結(jié)合在氨基酸上可形成醣蛋白，最常見的糖蛋白是，糖被聯(lián)接在氨基族群中天冬酰胺酸(asparagine)上的氮聯(lián)低聚糖。較少見的糖蛋白是，糖被聯(lián)接在羥氫基族群中絲氨酸或蘇氨酸上的氧聯(lián)低聚糖。糖基出現(xiàn)在任何一個(gè)或數(shù)個(gè)這些支鏈上，均會增加分子的分子重量。
將被分離和純化出來的此項(xiàng)發(fā)明中的A61和p22多肽，與量非常少并且和體內(nèi)其它物質(zhì)混合在一起的A61和p22多肽相互比較。這里所謂一個(gè)“分離”的物質(zhì)或者“實(shí)質(zhì)上純凈”的物質(zhì)，尤其是多肽和多聚核苷酸，乃是指該物質(zhì)至少包含大約50％摩爾基數(shù)上的所有大分子物種。被分離和實(shí)質(zhì)上純化的物質(zhì)，包含組合中大約80％至90％以上的所有大分子物種則更佳。該物質(zhì)最好是純化到具有本質(zhì)上的同質(zhì)性，以至于用傳統(tǒng)探測方式探測不出組合中的污雜質(zhì)物種，而且組合在本質(zhì)上包含一個(gè)單一大分子物種。溶劑物種，小分子(＜500Daltons)和元素離子物種，不屬于大分子物種。
制備A61和p22多肽的方法也包括在此項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。A61和p22可以用細(xì)胞培育法和無細(xì)胞法生成。
A61可以通過血漿酶的自體分解作用在體外制備。在以前的研究工作中，A-鏈上的血漿酶原片斷，是在含有血漿酶原，u-血漿酶原活化劑以及硫氫基載體N-乙酰基-L-半胱氨酸的無細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)生成的(參考文獻(xiàn)Gately et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9410868-10872，1999；Fitzpatrick et al，Biochemistry391021-1028，2000)。相較之下，此項(xiàng)發(fā)明中A61的A-鏈血漿酶原片斷，則是由u-血漿酶原活化劑在不含有硫氫基載體的條件下培育而產(chǎn)生的。反應(yīng)產(chǎn)物可以通過L-賴氨酸-瓊脂糖親和法與凝膠滲入層析法進(jìn)行純化。我們已經(jīng)指出，用這種方式生產(chǎn)的A61會產(chǎn)生兩個(gè)片斷，一個(gè)片斷的分子重量很明顯是61和64kDa，這是通過變性后，在還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法及考馬斯氏藍(lán)色染色法得到的。另一個(gè)片斷的分子重量很明顯是50kDa，這是通過變性后，在非還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法及考馬斯氏藍(lán)色染色法得到的。采用這種方法，每100mg的血漿酶原一般可以回收51mg的A61。
透過細(xì)胞系統(tǒng)也可以產(chǎn)生A61。這些細(xì)胞最好是哺乳類動物的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以來自正常組織，也可以來自含有癌細(xì)胞的組織。合適的哺乳類動物細(xì)胞被放在含有谷氨酸-血漿酶原或賴氨酸-血漿酶原的媒質(zhì)中培育一整夜，這樣由細(xì)胞產(chǎn)生的血漿酶原片斷便形成了?？梢允褂迷谶€原條件或非還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法和免疫印跡法，去辨認(rèn)A61片斷。我們發(fā)現(xiàn)HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞、牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、以及較為次要的選擇，海拉細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞，都能生成A61。血漿酶原的A61片斷可以用處理過的細(xì)胞培養(yǎng)，再通過親和色譜法進(jìn)行純化。
p22血漿酶原片斷也可以在體外制備。制備的方法是將A61與血漿酶和一個(gè)諸如碘化麝香草酚(dithiothreitol)的還原因子放在一起培育。含有p22的血漿酶原片斷于是通過A61的降解而產(chǎn)生了。微克量的p22可以使用一個(gè)L-賴氨酸-瓊脂糖柱，從反應(yīng)混合物中分離純化出來。
透過細(xì)胞-傳媒系統(tǒng)也可以用來產(chǎn)生p22。這些細(xì)胞最好是哺乳類動物的細(xì)胞。將谷氨酸-血漿酶原或賴氨酸-血漿酶原，與HT1080人體纖維肉瘤細(xì)胞放在一起培育，可以產(chǎn)生A61和p22。通過在還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法，以及使用一個(gè)L-賴氨酸-瓊脂糖柱所進(jìn)行的純化，可以辨認(rèn)出p22片斷為一質(zhì)量為22kDa的片斷。
A61多(聚)核苷酸和p22多(聚)核苷酸也包括在此項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。這類多(聚)核苷酸分別是A61多肽和p22多肽的編碼。人體血漿酶原先驅(qū)物質(zhì)的人體核酸序列編碼陳列在圖2中。兩種人體A61同源物的序列編碼為核酸343-1515(SEQ ID NO5)和核酸343-1524(SEQ ID NO6)。人體p22的序列編碼為343-651(SEQ ID NO7)。在這個(gè)領(lǐng)域中廣為人知的是，由于氨基酸有重復(fù)編碼的存在，所以A61和p22多肽的其它核酸序列編碼，也包括在此項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。
A61多肽的多(聚)核苷酸編碼和p22多肽的多(聚)核苷酸編碼，也包括人體多肽直向變異體的序列編碼。除此之外，此項(xiàng)發(fā)明還包括了非人類哺乳類動物多肽和非哺乳類脊椎動物多肽的多(聚)核苷酸序列編碼。
除了SEQ ID NO5-7序列外，由于此類多(聚)核苷酸與SEQ ID NO5-7序列當(dāng)中的任何一個(gè)序列，至少有90％的相同性，因此它們可以被辨認(rèn)出來。所謂90％的相同性是指，和對照序列的長度相同并且至少有90％的核苷酸相同。這些和SEQ IDNO5-7序列當(dāng)中任何一個(gè)序列，至少有90％相同性的序列，可轉(zhuǎn)譯成A61多肽或p22多肽，這些A61多肽或p22多肽具有抑制血管增生的活性，更好的是，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。A61多(聚)核苷酸可以轉(zhuǎn)譯為帶有391個(gè)氨基酸的A61多肽的編碼，和帶有394個(gè)氨基酸的A61多肽的編碼，它分別帶有1173個(gè)連續(xù)核苷酸或1182個(gè)連續(xù)核苷酸。p22多(聚)核苷酸則可轉(zhuǎn)譯為帶有103個(gè)連續(xù)氨基酸的p22多肽的編碼。是以，具體而言，一個(gè)A61多肽可以包含1173個(gè)連續(xù)核苷基或1182個(gè)連續(xù)核苷，它和SEQ ID NO5或SEQ ID NO6也至少有90％的核苷酸是相同的。同樣地，一個(gè)p22多肽可以包含309個(gè)連續(xù)核苷酸，它和SEQ ID NO7至少有90％是相同的。
在嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO5、6、或7序列進(jìn)行雜交的核酸序列，也包括在這項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。更好的是，這類多(聚)核苷酸可轉(zhuǎn)譯成A61或p22多肽，并且表現(xiàn)出抗-血管增生的活性。在嚴(yán)格條件或特別嚴(yán)格的條件下，科學(xué)家得以區(qū)分出，某一多(聚)核苷酸序列，是否為A61或p22多肽的多(聚)核苷酸序列編碼。這個(gè)領(lǐng)域里具有一般技術(shù)的科技人員，可以根據(jù)諸如溫度、離子力強(qiáng)度、時(shí)間長度、以及甲酰胺(formamide)的濃度(參考文獻(xiàn)Sambrook et al.，Molecular Cloning，2nd Ed.，1989)等在雜交過程和清洗過程中用來嚴(yán)格控制雜交的已知基本要素，去選擇適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件。
含有A61或p22多(聚)核苷酸的載體(vectors)，以及含有真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的載體，也包括在這項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。這些細(xì)胞可以是哺乳類動物的細(xì)胞。這些哺乳類動物的細(xì)胞可以是，例如人類、鼠科動物或牛的細(xì)胞。原核細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如E.coli細(xì)胞。此外，載體可以是，例如質(zhì)粒(plasmid)或病毒。
這項(xiàng)發(fā)明也包括體液和組織內(nèi)A61多肽和p22多肽的檢驗(yàn)方法，以此檢驗(yàn)諸如癌癥及血管增生的情況。這里所謂的“檢驗(yàn)”意指，發(fā)現(xiàn)病人體內(nèi)某種疾病的存在，將該疾病與其它疾病區(qū)分開，估計(jì)該疾病的可能后果和恢復(fù)情況，監(jiān)視疾病的發(fā)展或復(fù)發(fā)情況，決定病人的治療方法和治療目標(biāo)。這種檢驗(yàn)方法包括，但不限于，任何一種這個(gè)領(lǐng)域里已知的蛋白質(zhì)檢驗(yàn)方法在內(nèi)，例如免疫擴(kuò)散法(immunodiffusion)，免疫電泳法(immunoelectrophoresis)，免疫化學(xué)法(immunochemical methods)，結(jié)合物-配基(binder-ligand)測定法，免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemical techniques)，凝集與補(bǔ)體測定(參考文獻(xiàn)Basic and Clinical Immunology，Sites and Terr.eds.，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.pp.217-262，1991)。最好是結(jié)合物-配基免疫測定法，這些方法包括反應(yīng)抗體與一個(gè)或數(shù)個(gè)A61多肽或p22多肽抗原表位，以及有標(biāo)識的A61多肽或p22多肽或它們的衍生物之間的交叉反應(yīng)。
這里所指的A61或p22多肽衍生物是指，一個(gè)多肽的某個(gè)特定氨基酸被除去、或替換、或改變?yōu)樾薷倪^或不尋常的氨基酸，然而A61或p22多肽衍生物的生物特性和A61或p22是相同的，多肽衍生物可以和抗A61或p22的抗體交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)是指一個(gè)抗體和不是產(chǎn)生此抗體之抗原間的反應(yīng)。
測量病體內(nèi)A61和p22標(biāo)準(zhǔn)的試劑組(kits)，也包括在這項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。這些檢驗(yàn)方法可以是任何一種，這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)已知的蛋白質(zhì)檢驗(yàn)方法，例如免疫擴(kuò)散法(immunodiffusion)，免疫電泳法(immunoelectrophoresis)，免疫化學(xué)法(immunochemical method)，結(jié)合物-配基測定，免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemical techniques)，凝集與補(bǔ)體測定法。這些試劑組還包括進(jìn)行測定所需之適當(dāng)試劑。
A61和p22的抗體，也包括在這項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。這些抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。多克隆抗體可以從被免疫的兔子，或者注射過抗原并且按時(shí)注射后續(xù)抗原的其他動物身上取得。收集這些動物的血液，而且其血清經(jīng)化驗(yàn)?zāi)軌虻挚辜兓腁61或p22多肽。當(dāng)使用諸如雞、火雞等鳥類物種時(shí)，抗體可以從蛋的蛋黃中提取出來?？梢酝ㄟ^Milstein和Kohler法去制備單克隆抗體，此法是熔解從免疫老鼠身上取得的脾細(xì)胞，這些老鼠帶有諸如骨髓和淋巴細(xì)胞等持續(xù)復(fù)制性的腫瘤細(xì)胞(參考文獻(xiàn)Milstein and Kohler，Nature 256495-497，1975；Gulfre and Milstein，Methods in EnzymologyImmunochemical Techniques731-46，Langone and Banatis eds.，Academic Press，1981)。然后通過限制稀釋法去克隆該雜交瘤細(xì)胞，并通過酵素聯(lián)免疫吸附測定(ELIAS)、放射免疫測定(RIA)或生物測定進(jìn)行抗體生產(chǎn)的化驗(yàn)。
特定抗體，不論A61或p22的多克隆抗體或單克隆抗體，都可以通過上面所描述的任何一種適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ〉?。例如，鼠類動物和人類的單克隆抗體可通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)，其它如A61或p22多肽，或一個(gè)含有免疫活性的A61或p22多肽片斷，或一個(gè)抗-突變抗體，或動物體內(nèi)所產(chǎn)生的可以辨識且結(jié)合到A61或p22多肽的抗體片斷。這些抗體可以是任何種類的抗體，例如，但是不限于，IgG，IgA，IgM，IgD和IgE，或者鳥類的抗體，包括IgY和任何來自次綱目中的抗體。
這項(xiàng)發(fā)明并且包括治療和預(yù)防血管增生疾病與狀態(tài)的方法。這類血管增生疾病與狀態(tài)包括固體腫瘤；諸如白血球過多癥等血腫瘤；轉(zhuǎn)移性腫瘤；諸如血管瘤(hemangiomas)、聲帶神經(jīng)瘤(acoustic neuromas)、神經(jīng)纖維瘤(neurofibromas)等良性瘤；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)；牛皮癬(psoriasis)；諸如糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathyof prematurity)、黃斑部變性(macular degeneration)、角膜移植排斥(cornealgraft rejection)、血管增生性青光眼(neovascular glaucoma)、晶體后組織增生(retrolental fibroplasias)、潮紅(rubeosis)等視覺性血管增生疾??；Osler-Webber綜合征；心肌血管增生；空斑血管增生；毛細(xì)管擴(kuò)張；血友病患者的關(guān)節(jié)?。谎芙琴|(zhì)瘤；傷口肉芽；腸粘連(Intestinal adhesions)；克隆氏癥；動脈硬化癥；硬皮??；以及肥厚性疤痕(Hypertrophic scars)，也就是瘢痕瘤(keloid)。
治療病患的方法是，給患病的哺乳類動物足以抑制血管增生劑量的A61和/或p22。此方法可以適用于任何涉及非必要血管增生的疾病與狀態(tài)，特別是癌癥腫瘤的生長。這里所謂的哺乳類動物最好是人類，并且A61和/或p22最好是人體多肽。A61和/或p22也可以和一些其他因子結(jié)合起來，治療一些特殊疾病，例如，其他治療癌癥的抗癌物質(zhì)。
細(xì)胞毒素的因子也可以和A61或p22結(jié)合起來，成為治療癌細(xì)胞的一種組合。這類細(xì)胞毒素因子包括篦麻毒素，脫氧核糖核酸酵素(亦稱DNase)，白喉毒素，假單胞菌外毒素，核糖核酸酵素等等。
基因治療法也包括在此項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)。這包括將此項(xiàng)發(fā)明中的多聚核苷酸，或該多聚核苷酸在載體系統(tǒng)中的組合，例如，可以將多聚核苷酸片斷，傳送到病人特定細(xì)胞內(nèi)的無感染性病毒載體等?；瘜W(xué)方法也可以用來傳送多聚核苷酸，其中包括與微脂粒(liposome)相結(jié)合，以及與脂肪感染素(lipofectin)或與細(xì)胞感染素(cytofectin)連結(jié)在一起。
體內(nèi)體外連合方法(ex vivo)亦包括在此項(xiàng)發(fā)明的范疇內(nèi)，這包括將此項(xiàng)發(fā)明中的多聚核苷酸傳送到病體的細(xì)胞內(nèi)，然后將經(jīng)此處理過的細(xì)胞，注入病人體內(nèi)。A61或p22亦可用來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。這些細(xì)胞可以用于細(xì)胞體內(nèi)，也可用于細(xì)胞體外。這種方法包括將適量的A61或p22或者它們的一個(gè)組合物，傳送到細(xì)胞內(nèi)，以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
此項(xiàng)發(fā)明還包括A61或p22多肽或多聚核苷酸的治療或制藥成分。該成分包括，可接受的制藥配方中，其所蘊(yùn)含的能夠治療病人血管增生疾病或狀態(tài)的有效含量?？赏ㄟ^藥物的標(biāo)準(zhǔn)傳遞途徑去使用該藥物配方，例如局部性，透過皮膚，進(jìn)入腹膜腔內(nèi)，頭骨內(nèi)，大腦室內(nèi)，大腦內(nèi)，陰道內(nèi)，子宮內(nèi)，口服性，直腸內(nèi)，靜脈內(nèi)，脊椎內(nèi)，皮下，或者肌肉內(nèi)等途徑。A61和p22分子也可以和一些可以提供較佳制藥或藥效性質(zhì)的因子結(jié)合或連結(jié)在一起。例如，A61和p22可以和聚乙二醇連接，以提供更理想的藥物(代謝)動力學(xué)參數(shù)。這個(gè)領(lǐng)域里已知的傳送方法有利用迷你滲透泵將藥物傳送到腫瘤部位的定點(diǎn)傳送法等等。外用法可以和注射法產(chǎn)生一樣快的效果，也可以使其在一定時(shí)間內(nèi)慢慢注入或慢慢釋放，以發(fā)揮作用。
這項(xiàng)發(fā)明中的配方組合，通常是依藥品調(diào)配的方式來使用。這些調(diào)配方式均是在制藥界廣為人知的方式。其中一種較佳的方式乃是使用生理鹽水作工具，其他可以被制藥界接受的傳送工具也可以使用，例如其它無毒的生理溶液，5％的葡萄糖溶液，無菌水，或其它類似溶液。適當(dāng)?shù)木彌_液也應(yīng)列入配方組合中。當(dāng)需要時(shí)，這些溶液可以被棟干后，儲存在消過毒的容器里以備后用，當(dāng)要使用時(shí)，加入無菌水即可用來注射。主要溶液可以是水溶性的也可以是非水溶性的。這項(xiàng)發(fā)明中的配方組合，可以是一個(gè)在生物學(xué)上和母體相容的固體或半固體聚合體，例如，一個(gè)可以被植入需要治療的細(xì)胞組織內(nèi)的聚合體。這項(xiàng)發(fā)明中的配方組合可以被植入體內(nèi)，定點(diǎn)治療某一特定的腫瘤所在部位，或?qū)⑵渲踩胫T如腫瘤所在部位等處慢慢釋放其藥性，亦或?qū)⑵渲踩塍w內(nèi)某處以使血管增生阻斷素得以規(guī)律性的慢慢釋放。
傳送工具可以包括制藥界-可接受的，用來修正或保持配方pH值，滲透性，粘性，透明度，顏色，無菌性，穩(wěn)定性，稀釋比率，或氣味的賦形劑。同樣的，傳送工具可以包括其它制藥界-可接受的，用來修正或保持穿透血-腦障礙所使用之賦形劑的釋放性，或吸收性，或滲透性。非經(jīng)腸的給藥法通常使用這類賦形劑去配藥，不論是單劑量或復(fù)劑量形式的藥，或是連續(xù)不間斷的或間歇式的直接注入腦脊髓液形式的藥。
相同劑量的重復(fù)使用需根據(jù)該配方的藥物動力學(xué)的代謝參數(shù)，以及服用途徑來決定。
我們認(rèn)為，含有A61和p22的某些配方可以口服。這些配方最好是放在膠囊中而且是用適當(dāng)?shù)膫魉凸ぞ吲渲频墓腆w藥物。列舉一些適當(dāng)?shù)膫魉凸ぞ?，賦形劑，或稀釋液的例子，這包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、硅化鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、凝膠、糖漿、甲基纖維素、甲基-基苯甲酸丙脂、云母、鎂、硬脂酸鹽、水、礦物油等等類似物質(zhì)。該物質(zhì)還可以包括潤滑劑、濕潤劑、乳化劑和懸浮劑，防腐劑，甜味劑或調(diào)味劑。當(dāng)病人接受醫(yī)學(xué)界廣為人知的程序進(jìn)行治療后，可以將這些配方調(diào)配為具有加速，維持或者延緩藥效釋放的作用。這些配方亦可以包括具有削弱蛋白質(zhì)降解作用以及促進(jìn)吸收的一些物質(zhì)，例如表面活性劑。
藥物的特定劑量是根據(jù)患者的大約體重或表體面積或用藥部位體積來計(jì)算的。同時(shí)也必需根據(jù)所選擇的服藥途徑去記算藥物的劑量。而使用醫(yī)藥領(lǐng)域的一般性技述去進(jìn)一步確定治療所需的適當(dāng)劑量，乃是一種例行公事。醫(yī)藥領(lǐng)域里熟練的科技人員不必進(jìn)行太多的實(shí)驗(yàn)便可從事記算，這為此處所描述的定點(diǎn)細(xì)胞傳送法的測定準(zhǔn)備工作，提供了光明的前景。準(zhǔn)確劑量的確定必需和標(biāo)準(zhǔn)劑量-反應(yīng)研究工作結(jié)合在一起。一般皆知，實(shí)際的藥物用量乃是由開業(yè)醫(yī)生決定的，因?yàn)榘ú』嫉牟∏?，服用的藥物成分，年紀(jì)，體重，各個(gè)病人的反應(yīng)，病患癥狀的嚴(yán)重程度，以及所選擇的服藥途徑等相關(guān)因素，均需列入考慮。
這項(xiàng)發(fā)明的具體表現(xiàn)陳述在下面的例子里。至于該發(fā)明內(nèi)容所涉及到的其他具體表現(xiàn)，則是對該領(lǐng)域里熟練的科技人員而言，實(shí)乃是顯而易見的，有關(guān)這項(xiàng)發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容及實(shí)際操作所涉及到的考慮。這里所作的詳細(xì)描述以及所舉的例子，僅是供參考用的范例而已，這項(xiàng)發(fā)明所含蓋的范圍和精神，詳述在范例之后的發(fā)明項(xiàng)目中。
例一這個(gè)實(shí)例闡述的是A61血漿酶原片斷的產(chǎn)生和識別，血漿酶原斷片是在無細(xì)胞系統(tǒng)中由血漿酶(原)自動分解而生成的。
先前發(fā)表的研究論文(Gately et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9410868-10872；US Patent 5,801,012 to Soff et al.)指出，一個(gè)含有Kringle 1-4結(jié)構(gòu)，分子重量為50kDa的血漿酶原裂解產(chǎn)物(其分子量是通過在非還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法得出的)，是在含有血漿酶原，U-血漿酶原催化劑，以及硫氫基供體N-乙酰基-L-半胱氨酸的無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的。研究論文還指出，Kringle 1-4血漿酶原A-鏈片斷的形成，完全得仰賴諸如N-乙?；?L-半胱氨酸這類硫氫基供體的存在才行。
在重新檢視通過血漿酶自動分解而形成，含有kringle 1-4結(jié)構(gòu)的血漿酶原片斷，其對N-乙?；?L-半胱氨酸硫氫基供體的依賴程度時(shí)，此項(xiàng)發(fā)明的科學(xué)家們，出乎意料地觀察到，在沒有硫氫基供體的情況下，血漿酶(原)自體分解產(chǎn)生出嶄新的分子種類。這些分子種類包括一個(gè)分子重量為61kDa的主要片斷，以及一個(gè)分子重量為64kDa的次要分解片斷，這些分子被統(tǒng)稱為A61，以避免與血漿酶原片斷血管增生阻斷素(angiostatin)相混淆。
要產(chǎn)生A61須在以下條件中進(jìn)行在37℃的環(huán)境下，將「谷氨酸」血漿酶原(40μM)(不含硫氫基供體)放在緩沖液中培育一夜，該緩沖液含有50mM的三(釋甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH值為9.0)，20mM的L-賴氨酸，100mM的氯化鈉(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，0.17μM的雙鏈u-血漿酶原催化劑(尿酸激酶)，由此形成了當(dāng)中含有A61的混合液。在培育之后，用含有20mM Hepes(其pH值為7.4)以及140mM氯化鈉的緩沖劑稀釋四倍，在緩沖劑中加入1mM的二異丙基氟磷酸鹽，放到一個(gè)在使用前，已經(jīng)用含有20mM Hepes(其pH值為7.4)以及140mM氯化鈉的平衡緩沖液，先行平衡過的L-賴氨酸瓊脂糖親合色譜柱(Pharmacia公司)上。經(jīng)過5柱容量的平衡緩沖液清洗后，將色譜柱用具有0-125mMε-氨基-n-癸酸線狀傾斜度濃度變化的溶液加以處里后，一個(gè)單蛋白質(zhì)峰會被洗脫出來，然后將其匯集及濃縮。此單蛋白質(zhì)峰是通過監(jiān)測樣品在280nm紫外線下的吸光度觀察得到的。然后將這個(gè)濃縮的單蛋白質(zhì)峰放到一個(gè)，在使用前已經(jīng)用平衡緩沖液先行平衡過的Sephacryl-S-100型柱(Pharmacia公司)中，去進(jìn)行分離過程，一個(gè)單蛋白質(zhì)峰會被洗脫出來。先將這個(gè)蛋白質(zhì)峰的各洗脫成分匯集起來，然后將它們分成若干份，貯存在零下80℃的環(huán)境中準(zhǔn)備后用。從單蛋白質(zhì)峰采集出的標(biāo)本，是使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法去進(jìn)行分析的(SDS-PAGE；Laemmli，U.K.(1970)Nature 227680-685)。
至于蛋白質(zhì)印跡法，我們使用Bio-Rad公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移印跡(transblot)儀器，將微型膠體放在4℃中一小時(shí)，或?qū)⒋笮湍z體放在4℃中一整夜后，蛋白質(zhì)會從膠體轉(zhuǎn)移到0.45-μm孔徑的硝化纖維素薄膜上。然后將薄膜放在含有5％脫脂牛奶的TPBS(TPBS是一種磷酸鹽緩沖鹽液，其中含有137nM的氯化鈉，8mM的Na2HPO4，1.4mM的KH2PO4，2.7mM的KCl〔其pH值為8.0〕，以及0.1％的Tween-20清潔劑)溶液中，置于室溫一小時(shí)，然后在含有1％脫脂牛奶的TPBS溶液中，與初級抗體一起置于4℃中培育一整夜，初級抗體的稀釋過程如下將1mg/ml的單克隆抗人體血漿酶原kringle 1-3結(jié)構(gòu)的抗體稀釋5000倍；或?qū)?.1mg/ml的單克隆抗人體血管增生阻斷素的抗體(GF-47型)稀釋500倍；或?qū)⒍嗫寺】故笙逖茉錾钄嗨氐目贵w稀釋500倍。在室溫下，用TPBS溶液去洗滌印跡，至少6次(每次10分鐘)，然后在含有1％脫脂牛奶的TPBS溶液中，將抗鼠或抗兔辣根過氧化物-綴合二級抗體稀釋1000倍，置于37℃培育一小時(shí)。然后用TPBS溶液去洗滌薄膜，至少6次(每次10分鐘)，采用超靈敏試劑(Pierce公司)的化學(xué)發(fā)光去進(jìn)行顯相。
圖3陳列的是，在無細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)所進(jìn)行的A61的產(chǎn)生和分離過程。要產(chǎn)生A61須在以下條件中進(jìn)行將[谷氨酸]血漿酶原(40μM)放在緩沖液中培育，該緩沖液含有50mM的三(釋甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH值為9.0)，20mM的L-賴氨酸，100mM的氯化鈉(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，0.17μM的雙鏈u-血漿酶原催化劑(泳道一)。將該反應(yīng)混合液置于37℃環(huán)境中，培育一整液(泳道2)。將該混合劑用加入了1mM二異丙基氟磷酸鹽的平衡緩沖液稀釋四倍，放到一個(gè)在使用前，已經(jīng)用平衡緩沖液先行平衡過的賴氨酸-瓊脂糖柱上。經(jīng)過5柱容量的平衡緩沖液清洗后，將賴氨酸-瓊脂糖柱用具有0-125mMε-氨基-n-癸酸線狀傾斜度濃度變化的溶液加以處里。這些包括分子重量為61kDa和64kDa的血漿酶原片斷的組分被收集與匯集(泳道3)，通過超濾過程去濃縮，放到已經(jīng)用平衡緩沖液先行平衡過的Sephacryl凝膠滲透色譜柱上。隨后蛋白質(zhì)峰被匯聚起來(泳道4)。匯聚的各份組分是通過在還原條件下(A)與非還原條件下(B)所進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法來進(jìn)行分析的，并且用考馬斯氏藍(lán)色染色法去染色。另外，也可以通過在非還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法(SDS-PAGE)去分析各份組分，并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維薄膜上，然后采用抗人類血漿酶原Kringle 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體，去進(jìn)行免疫印跡法分析(圖3C)。
在還原條件下，將染色色帶與在凝膠上用來測量尺寸的標(biāo)準(zhǔn)刻度分子相比較，可以確立此蛋白質(zhì)峰包含兩個(gè)分離物質(zhì)，這其中包括Mr61000的主蛋白質(zhì)和Mr64000的次蛋白質(zhì)。因此，這些A鏈斷片被統(tǒng)稱為A61。A61的濃度是用一個(gè)ε1％，280nm13.6以及質(zhì)量為61Kda的分子來決定的。100mg的谷氨酸血漿酶原可回收51mg的A61。將谷氨酸血漿酶原換成賴氨酸血漿酶原，也可回收差不多量的A61。
為了研究A61生產(chǎn)的機(jī)理，需在還原條件與非還原條件下，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法，去檢查從血漿酶原和u-血漿酶原活化劑產(chǎn)生A61的時(shí)間進(jìn)程。這些實(shí)驗(yàn)是，將「谷氨酸」血漿酶原(8.7μM)置于37℃的環(huán)境下，放在緩沖液中培育，該緩沖液含有50mM的三(釋甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH值為9.0)，100mM的氯化鈉(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，以及20mM的L-賴氨酸。如圖4所指，樣品在不同時(shí)間內(nèi)被提取出來，然后在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法樣品緩沖液中(有或沒有還原劑)，通過稀釋和加熱樣品使反應(yīng)停止，然后在還原或非原還環(huán)境下，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法去分析此樣品。
圖4陳列的是，血漿酶原分裂為A61的時(shí)間進(jìn)程分析?！腹劝彼帷寡獫{酶原(8.7μM)按前述方法培育。加入39nM的u-血漿酶原活化劑來激發(fā)該反應(yīng)。反應(yīng)的各組分在不同時(shí)間內(nèi)被提取出來，通過在還原條件下(圖4A)與非還原條件下所進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法(圖4B)進(jìn)行分析，并且用考馬斯氏藍(lán)色染色法去染色。PmH代表血漿酶重鏈，PmL代表血漿酶輕鏈。
圖4的數(shù)據(jù)顯示，加入u-血漿酶原活化劑(39nM)去激發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)進(jìn)行5分鐘后，〔谷氨酸〕血漿酶原(8.7μM)完全被轉(zhuǎn)化為血漿酶。不過，在這個(gè)反應(yīng)點(diǎn)觀察不到A61。在反應(yīng)進(jìn)行了大約1小時(shí)后，血漿酶重鏈和輕鏈的降解過程變得很明顯。反應(yīng)開始后大約2-4小時(shí)，由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法所得到的反應(yīng)產(chǎn)物顯示，A61很明顯的，在還原環(huán)境下，在凝膠表面有其Mr標(biāo)準(zhǔn)刻度大約為61,000和64,000的物質(zhì)，而在非還原環(huán)境下，在凝膠表面有其Mr標(biāo)準(zhǔn)刻度大約為50,000的物質(zhì)。
不同的實(shí)驗(yàn)證明了，無催化功能的人類血漿酶原重組體(S741C型)，在轉(zhuǎn)化成血漿酶后，是不會轉(zhuǎn)化成A61的(Horrevoets，A.J.G..et al.(1997)Journal ofBiological Chemistry 2722176-2182。然而此項(xiàng)發(fā)明并不局限于此理論，這些結(jié)果顯示，u-血漿酶原活化劑可以使血漿酶原通過分裂生成血漿酶，然后血漿酶通過自體分解產(chǎn)生A61。由於A61可以通過血漿酶自體蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)生，因此除了用u-血漿酶原活化劑使血漿酶原通過分裂生成血漿酶外，還可以通過其它方法生產(chǎn)血漿酶，例如采用其他諸如組織纖溶-血漿酶原活化劑或溶栓酶，將血漿酶原轉(zhuǎn)換成血漿酶，或者采用重組DNA法產(chǎn)生血漿酶，這些均是可通過自體蛋白質(zhì)溶解形成A61的血漿酶的其它生成方法。
血漿酶可以在無硫氫基供體的條件下進(jìn)行自身消化，并不是新發(fā)現(xiàn)。其他的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血漿酶自身消化涉及雙分子反應(yīng)，在該反應(yīng)中，重鏈、輕鏈都產(chǎn)生蛋白質(zhì)溶解現(xiàn)象[參考文獻(xiàn)〔Walther，P.J.，et al.，(1974)J.Biol.Chem.249，1173-1181；Grimard，M.(1976)Biochimie(Paris)58，1409-1412；Gaffney，P.J.，et al.，(1977)Haemostasis 6，72-88；Reddy，K.N.，and Wagner，C.J.(1980)Biochem.Biophys.Res.Commun.92，1016-1022；Jespersen，J.，et al.，(1986)Thromb.Res.41，395-404；Wu，H.L.，et al.，(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，8793-8795；Shi，G.Y.，and Wu，H.L.(1988)Thromb.Res.51，355-364〕。兩篇與人體血漿酶有關(guān)的自體分解過程是由Wu和其實(shí)究研同仁共同發(fā)表的(Shi，G.Y.，and Wu，H.L.(1988)Thromb.Res.51，355-364)。這些科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在微酸性溶液中，血漿酶輕鏈比血漿酶重鏈分裂得快。血漿酶輕鏈的分裂情況與血漿酶活性損失有關(guān)。在pH質(zhì)6.5至pH質(zhì)11.0的條件下，輕鏈和重鏈均被分裂。另一方面，當(dāng)pH質(zhì)為堿性時(shí)，重鏈更易分裂。分裂重鏈的分子重量為50,000(在還原條件下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法)或58,000(Shi，G.Y.，and Wu，H.L.(1988)Thromb.Res.51，355-364)。Mr58,000片斷的半羥基酸-終端是精氨酸530。這些資料導(dǎo)出了如下的理論，由于它們的血漿酶原結(jié)構(gòu)相似，半胱氨酸512和半胱氨酸536之間以及半胱氨酸462和半胱氨酸541之間的二硫鍵，能夠被氫氧基離子分裂。我們不希望此發(fā)明受理論所局限，半胱氨酸462和半胱氨酸541之間的二硫鍵片斷，很可能解釋了在沒有硫氫基供體或血漿酶還原酵素的條件下，血漿酶的自體分解作用是如何生成A61的。
例二這個(gè)實(shí)例闡述的是A61血漿酶(原)片斷的產(chǎn)生與識別，這些A61血漿酶原斷片是在體外，通過血漿酶原與細(xì)胞的接觸而產(chǎn)生的。
許多細(xì)胞可與血漿酶原結(jié)合，并在細(xì)胞表面將其轉(zhuǎn)化為血漿酶，早已是定論。反之，通過諸如u-血漿酶原活化劑等血漿酶原活化劑的作用，血漿酶原可以在細(xì)胞表面被轉(zhuǎn)化為血漿酶，近期發(fā)表的研究報(bào)指出，其他血漿酶原片斷也可以在細(xì)胞表面上生成[(參考文獻(xiàn)Gately，S.，et al.(1996)Cancer Res.564887-4890；O’Mahony，C.A.，et al.(1998)J.Surg.Res.7755-58；Westphal，J.R.，et al.(2000)Int.J.Cancer 86760-767]。將細(xì)胞表面生成的血漿酶原片斷和A61相比較，人體HT1080纖維肉瘤細(xì)胞與〔谷氨酸〕血漿酶原共同培育，而由細(xì)胞產(chǎn)生的血漿酶原片斷，則可通過在還原或非還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法和免疫印跡法進(jìn)行分析。
要在細(xì)胞的輔助下產(chǎn)生A61，需將人類HT1080細(xì)胞或者牛毛細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞，置于37℃的環(huán)境中，放在裝有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基的T75型組織培養(yǎng)瓶中生長(DMEMJRH Biosciences公司或GIBCO-BRL公司)，該培養(yǎng)基的補(bǔ)充液含有10％經(jīng)過熱處理過的牛胎兒血清，2mM，L-谷氨酰胺酸，10單位/毫升的青霉素G，10μM的鏈霉素硫酸鹽。將將每毫升含有大約1×105細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞加入24-井的組織培養(yǎng)盤中，置于37℃的環(huán)境內(nèi)，培育大約24小時(shí)后，會形成細(xì)胞單層。用磷酸鹽緩沖液(PBS，137nM NaCl，8mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，2.7mM KCl，pH值為8.0)將該細(xì)胞單層清洗3次，然后將0.5~8μM溶在DMEM培養(yǎng)基中的〔谷氨酸〕血漿酶原加入各井中，含有A61的混合物便在井中形成了。收集培育了一整夜的培養(yǎng)基(大約100毫升)，在4℃及2000xg的條件下，將其用離心機(jī)離心大約30分鐘，以除去細(xì)胞殘骸。經(jīng)過離心的樣品，其浮在表面的上層清液，被放到一個(gè)在使用前已經(jīng)用平衡緩沖液先行平衡過的L-賴氨酸-瓊脂糖親合色譜柱上。經(jīng)過5柱容量的平衡緩沖液清洗后，色譜柱經(jīng)由具有0-125mMε-氨基-n-癸酸的線狀傾斜度之濃度變化的溶液處里后，清洗出A61。在有還原劑或無還原劑的條件下，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法去分析樣品片斷，然后在免疫印跡法中采用抗人體血漿酶原Kringles 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體(如下)去分析該樣品片斷。包含A61的蛋白質(zhì)峰片斷被匯聚，濃縮起來。用交聯(lián)葡聚糖PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech公司)進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽，使其轉(zhuǎn)化到無內(nèi)毒素的PBS(Life Technologies，Inc.公司)溶液中，將它們分成若干份，冷凍在零下80℃的環(huán)境中。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法和免疫印跡法所進(jìn)行的分析指出，部分(并非全部)哺乳類動物的細(xì)胞種類能夠通過血漿酶(原)產(chǎn)生A61。
圖13陳列的是，A61用細(xì)胞所產(chǎn)生的血漿酶原片斷的比較。在這些實(shí)驗(yàn)中，將含有指定濃度之〔谷氨酸〕血漿酶原的DMEM培養(yǎng)基，與HT1080細(xì)胞一起培育。經(jīng)過一整夜的培育后，用15％在還原條件下(圖13A)和非還原條件下(圖13B)所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法分析該培養(yǎng)基，然后用抗人體血漿酶原Kringles 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體的免疫印跡法去進(jìn)行分析〔谷氨酸〕血漿酶原標(biāo)準(zhǔn)樣品(泳道1)；在無細(xì)胞條件下培育一整夜的〔谷氨酸〕血漿酶原(8μM)(泳道2)。將如下濃度的〔谷氨酸〕血漿酶原與HT1080細(xì)胞一起培育；0.5μM(泳道3)；1μM(泳道4)；2μM(泳道5)，4μM(泳道6)，8μM的〔谷氨酸〕血漿酶原(泳道7)；A61標(biāo)準(zhǔn)樣品(泳道8)。
如圖13C所示，在DMEM中，人體〔谷氨酸〕血漿酶原(8μM)與不同種類的細(xì)胞系培育一整夜。培育一整夜后，用12.5％在還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法分析該培養(yǎng)基，然后在免疫印跡法中用抗人體血漿酶原Kringles 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體去進(jìn)行分析。血漿酶原標(biāo)準(zhǔn)樣品(泳道1)以及A61標(biāo)準(zhǔn)樣品(泳道2)亦陳列在圖13C。，血漿酶(原)與下列細(xì)胞系相接觸而產(chǎn)生的血漿酶(原)和其分解物，乃是透過免疫印跡法分析獲得的HT1080細(xì)胞(泳道3)，海拉細(xì)胞(泳道4)，牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(泳道5)，或HUVECSs細(xì)胞(泳道6)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT1080細(xì)胞和BCE細(xì)胞均可將血漿酶(原)轉(zhuǎn)化成一種分子，這種分子與在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的A61，用免疫印跡法是無法區(qū)分的，首先，我們發(fā)現(xiàn)，人工培育的細(xì)胞能產(chǎn)生一種，其分子大小與A61相似的血漿酶原片斷，這表示由細(xì)胞所產(chǎn)生的主要A鏈片斷，至少包括4個(gè)完整的Kringle結(jié)構(gòu)。其次，牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生一個(gè)類似A61的蛋白質(zhì)，這一結(jié)果指出，并非只有癌細(xì)胞才可形成A鏈片斷。此外，由HT1080細(xì)胞或牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生，類似A61的血漿酶原片斷N-終端序列，證明了由細(xì)胞所產(chǎn)生的A61N-終端，與在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的A61是相同的。
為了證明經(jīng)由細(xì)胞與血漿酶原相接觸而產(chǎn)生的A61，其在體外對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，我們在下面的例5中，描述了抑制生長的實(shí)驗(yàn)過程。在這些實(shí)驗(yàn)中，人體〔谷氨酸〕血漿酶原(2.7μM)與HT1080細(xì)胞或牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞放在一起培育一整夜(圖13D)。用L-賴氨酸-瓊脂糖親合色譜柱，將A61從HT1080細(xì)胞(閉合環(huán))和牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(開環(huán))的人工培養(yǎng)基中純化出來。將由細(xì)胞產(chǎn)生的不同濃度的A61加入牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長受到A61的抑制程度，陳述在例5中。由HT1080細(xì)胞或牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的，與A61相似的蛋白質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗血管增生活性，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步支持了我們的論點(diǎn)未被激發(fā)的正常細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗血管增生的血漿酶原斷片。
由于在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的血漿酶(原)，以及由牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或HT1080細(xì)胞與血漿酶原相接觸而產(chǎn)生的血漿酶(原)，其分子和生物特性相同，因此一般咸信，這些方法全部可以用來生成A61。
例三這個(gè)實(shí)例闡述的是A61存在予健康或染病的哺乳類動物(包括老鼠在內(nèi))的血清中。
初期的研究認(rèn)為，通過在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法所獲得的，分子量為38000~43000的血管增生阻斷素片斷血漿酶原，存在于有Lewis肺癌腫瘤老鼠的尿及血清中，但不存在于正?；蚰[瘤被切除的老鼠的血清中(參考文獻(xiàn)O Reilly，M.S.，et al.，(1994)Cell 79315-328]。對此，我們檢查了血清以判斷類似A61的片斷是否存在。在這些實(shí)驗(yàn)中，將200μl的老鼠血清或人體血清，在室溫下，與50μl在使用前已經(jīng)用平衡緩沖液先行平衡過，而且平衡緩沖液與凝膠的比率為1∶1的L-賴氨酸-瓊脂糖凝膠懸浮液，一起培育30分鐘。將該凝膠用5柱容量的相同平衡緩沖液清洗。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法樣品緩沖液與凝膠共同煮沸，以洗堤粘附的蛋白質(zhì)，然后將每一個(gè)樣品取出20μl，用在非還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法和免疫印跡法進(jìn)行分析。
圖5將A61和存在于老鼠血清中的血漿酶原片斷作了比較，從老鼠體內(nèi)收集來的血清，用50μl的L-賴氨酸-瓊脂糖(凝膠)〔在混合了20mM Hepes(pH質(zhì)為7.4)，140mM NaCl的平衡緩沖液中平衡〕，在室溫下培育30分鐘。將該凝膠用5柱容量的平衡緩沖液清洗，與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法樣品緩沖液共同煮沸，用在非還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法進(jìn)行分析。然后用抗-老鼠血管增生阻斷素的兔子抗體(圖5A)或抗-人體血漿酶原Kringles 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作(圖5B)，去進(jìn)行免疫印跡法。圖5A所示泳道如下控制組老鼠血清(泳道1和泳道2)；從兩只長了14天Leuis肺癌腫瘤老鼠體內(nèi)取得的血清(見下面的例5)，(泳道3和泳道4)；從兩只腫瘤切除14天后的老鼠體內(nèi)取得的血清(泳道5和泳道6)。圖5B所示泳道如下A61標(biāo)準(zhǔn)樣品(泳道1)；長了14天腫瘤的老鼠(泳道2)；腫瘤切除3天后的老鼠(泳道3)；腫瘤切除6天后的老鼠(泳道4)；腫瘤切除9天后的老鼠(泳道5)；腫瘤切除12天后的老鼠(泳道6)；腫瘤切除15天后的老鼠(泳道7)。
A組試驗(yàn)結(jié)果在所有受測試的老鼠中是一致的，受測試組包含21只正常老鼠，9只長腫瘤的老鼠，29只腫瘤被切除的老鼠。
如圖6所示，圖5A和圖5B中所示，由免疫印跡法所得到的結(jié)果證明了，在正常的，長腫瘤的，以及腫瘤切除的老鼠血清中，均可檢測到類似A61的血清酶原片斷。在這些實(shí)驗(yàn)中，用抗-人體血漿酶原Kringle 1-3結(jié)構(gòu)的人體單克隆抗體(圖6，a’)或抗-老鼠癌細(xì)胞血管阻斷素的兔子抗體(圖6，b’)來檢測類似A61的血清酶原片斷。而用這些抗體標(biāo)記的老鼠血漿酶原片斷，在非還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法中，其分子量大約為50,000，也可以用抗人體Kringle 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體檢測出來(圖5C，a’)。與血管增生阻斷素不同的是，類似A61的蛋白質(zhì)既存在于正常動物的血清中，亦存在于長腫瘤動物的血清中，而且動物體內(nèi)的腫瘤在切除后3~15天內(nèi)，類似A61血漿酶原片斷的濃度，并沒有明顯的變化(圖5B，以及圖6，b’)。
由于健康與長腫瘤的老鼠血清中，存在類似A61的蛋白質(zhì)，接下來便是去調(diào)查，人體內(nèi)是否也存在類似A61的蛋白質(zhì)。圖7比較了A61與人體血清中的血漿酶原斷片。先將身體正常的志愿者(A)與癌癥病人(B)的冷凍血清解凍，然后與50μl的L-賴氨酸-瓊脂糖(凝膠)(在混合了20mM Hepes(pH質(zhì)為7.4)，140mM NaCl的平衡緩沖液中平衡)，在室溫下培育30分鐘。將該凝膠用5柱容量的平衡緩沖液清洗后，與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法樣品緩沖液共同煮沸，用在非還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法進(jìn)行分析。然后用抗-人體血管增生阻斷素的單克隆抗體去進(jìn)行免疫印跡法。A，血管增生阻斷素標(biāo)準(zhǔn)樣品(250ng)(泳道1)；A61標(biāo)準(zhǔn)樣品(250ng)(泳道2)；身體正常的實(shí)驗(yàn)室志愿者的血清(泳道3至泳道11)。B、血管增生阻斷素(Calbiochem公司)標(biāo)準(zhǔn)樣品(250ng)(泳道1)；A61標(biāo)準(zhǔn)樣品(250ng)(泳道2)；睪丸腫瘤(泳道3)；頭和頸腫瘤(泳道4至泳道5)；睪丸腫瘤(泳道6至泳道8)；頭和頸腫瘤(泳道9至泳道10)。
如圖7所示，與血管增生阻斷素不同的是，每個(gè)受檢者的血清中，均存在類似A61的血漿酶原片斷。由于它存在健康與非健康的老鼠和人體的血清中，由此推斷，與血管增生阻斷素不同的是，類似A61的血漿酶原片斷是哺乳類動物血清的正常組分，而使用在此描述的技術(shù)，可以將該片斷分離。此發(fā)明并不局限于已知理論，血清中所產(chǎn)生的類似A61的分子，乃是透過血漿酶的自體分解而形成的。盡管血清中所產(chǎn)生的類似A61的分子，其生物活性尚未經(jīng)過測試，但是我們可以采用諸如配基親合法，膠體過濾法，離子交換法，反相法，以及厭水交互色譜法等色譜法的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，去進(jìn)一步分離該血清組分。
例四這個(gè)實(shí)例闡述的是A61的生物化學(xué)和生物物理特性。
由于A61很容易大量生產(chǎn)，因此A61的N-末端序列和C-末端序列可以被確認(rèn)出來。只要使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)去操作商業(yè)設(shè)備，便可確認(rèn)末端序列。通過Edman降解法我們確認(rèn)出N-末端序列，通過Hewlett-Packard公司出產(chǎn)的HP G1000A型C-末端蛋白質(zhì)定序器，以及Applied Biosystems公司出產(chǎn)的477C Procise C型C-末端蛋白質(zhì)定序器我們確認(rèn)出C-末端序列。從這些定序器獲得的結(jié)果相當(dāng)一致。Hewlett-Packard公司出產(chǎn)的HP G1000A型C-末端蛋白質(zhì)定序器，使用的是化學(xué)2.0版，它采用二苯基磷酸同種硫氰酸鹽(diphenylphosphorylisothiocyanate)作活化劑(參考文獻(xiàn)Bailey，J.M.et al.(1992)Protein Sci.11622-1633)，采用鋰乙硫氨基酪酸鹽(lithium ethiolate)作裂解劑(美國專利號碼5,986,071 Graham et al.)， 這是一個(gè)修改過的裂解系統(tǒng)。Applied Biosystems公司出產(chǎn)的477C Procise C型C-末端蛋白質(zhì)定序器，則采用前述的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)試劑〔Boyd，V.L.(1992)Analytical Biochemistry 206344-352〕。
A61的N-末端序列為賴氨酸78-谷氨酸83。主要的和次要的C-末端序列分別為賴氨酸468-氨基乙酸465和精氨酸471-氨基乙酸467(表1)。是以，將N-末端和C-末端序列和已知的血漿酶原序列進(jìn)行對比，我們可以確定血漿酶的蛋白質(zhì)自體水解分裂點(diǎn)為賴氨酸77-賴氨酸78，賴氨酸468-氨基乙酸469，和精氨酸471-氨基乙酸472。因此，A61的主要種類含有賴氨酸78-賴氨酸468的初級氨基酸序列。而A61的次要種類則含有賴氨酸78-精氨酸471的初級氨基酸序列。從這個(gè)氨基酸序列預(yù)測出來的平均分子重量為44.1Kda。
表Ia—人體A61的氨基-末端序列和羧基-末端序列
a文中所述在非細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)自人體血漿酶原和uPA的人體A61。A61C-序列A與C-序列B的庫爾比率為2∶5。
N-末端和C-末端序列的確定，使得包含賴氨酸78-賴氨酸468氨基酸序列的A61<p>表II本發(fā)明的多核苷酸和多肽(全長，除非另有說明)
*編碼序列的坐標(biāo)在括號中示出。第一列表示所鑒定的4個(gè)PCIPs家族，而第二列表示所鑒定的每一種家族的各種核酸形式。還標(biāo)出了新的分子。
含有編碼人、大鼠和猴PCIPs的核苷酸序列的質(zhì)粒于1998年11月7日交由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏并且給予了上述保藏號。上述保藏物將根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏物的國際認(rèn)可的布
表II縮寫說明如下K指kringle結(jié)構(gòu)；r指氨基酸殘基，MME指巨噬細(xì)胞金屬彈性酶。表II的編號方式是依據(jù)人體血漿酶原序列(791個(gè)殘基)，其中不包括19個(gè)，結(jié)束于蛋氨酸-19，開始于谷氨酸-1(Forsgren et al.，1987)的氨基酸信號縮氨酸。分子量是通過在還原條件下與非還原條件下(*)所進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法獲得的。A鏈片斷的抗血管增生阻斷素的活性，IC50，是指要達(dá)到50％抑制牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果所需之A鏈片斷的濃度。為了直接比較抗血管增生阻斷素的活性，我們匯集了一些實(shí)驗(yàn)報(bào)告的相關(guān)結(jié)果(Cao etal.，1996)。問號(？)代表C-末端序列尚未被確定的結(jié)構(gòu)。
為了研究A61轉(zhuǎn)譯后被修飾的可能性(除了蛋白質(zhì)水解分裂之外)，我們使用以母體基質(zhì)作支援的激光解吸電離(MALDI)質(zhì)譜測定器的技術(shù)，去測量A61的分子重量。我們采用的是Voyager DE-STR型(PE Biosystems公司)的MALDI質(zhì)量分光計(jì)去獲得質(zhì)譜圖。在作該項(xiàng)分析時(shí)，A61的樣品須分四次，每次以4-μl為一次量，單獨(dú)加入預(yù)先平衡過的ZipTips(Millipore公司)中，以除去鹽分并達(dá)到特定濃度。然后用2μl再結(jié)晶過的Sinapinic(3，5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)母體基質(zhì)溶液，從尖端洗堤每份樣品，每次將1μl的樣品洗堤到具有100-井位的不銹鋼樣品板上。將樣品板放到質(zhì)量分光計(jì)中后，采用線性MALDI法去獲取樣品的質(zhì)譜圖。在該線性MALDI法中，采用20-kV的加速電壓，氮激光(337nm，UV波長)，以及350-ns的萃取延緩時(shí)間。每組數(shù)據(jù)均經(jīng)過除雜信號過濾，拂平線曲兩次，中央化后，再去除同位素，以除去源自質(zhì)心-變異物光譜的同位素。A61的質(zhì)譜圖顯示，在大約1-kDa寬度范圍內(nèi)，有一條很寬的特徵群。當(dāng)中央化并去除同位素后，群中主要種類被拂平其分子重量為46,616道爾頓。這個(gè)測量出來的分子重量，比用氨基酸序列推測出來大約為44.1kDa的平均分子質(zhì)量大得多。用質(zhì)譜法測量出來的A61片斷的分子重量為44.6-kDa，用蛋白質(zhì)氨基酸序列推測出來A61片斷的分子重量為44.5kDa，兩相比較后得知，A61和其母體分子，血漿酶原，很類似，它亦會被糖基化(參考文獻(xiàn)Hayes，M.L.，and Castellino，F(xiàn).J.(1979)J.Biol.Chem.2548772-8776；Hayes，M.L.，and Castellino，F(xiàn).J.(1979)J.Biol.Chem.2548777-8780)。血漿酶原在kringle 3結(jié)構(gòu)處含有與N相連的醣類殘基，在kringle 2-kringle 3的Ser249連結(jié)處以及kringle 3-kringle 4的Thr346連結(jié)處含有與O相連的醣類。糖基化作用所扮演的角色我們并不清楚，但是針對A-鏈片斷所作的研究顯示，糖基化的程度可能會影響蛋白質(zhì)在循環(huán)過程中的生物活性，甚或會使其生命周期減半(參考文獻(xiàn)Pirie-Shepherd，S.R.(1999)J.Lab.Clin.Med.134，553-560)。
A61的氨基酸序列與其它A-鏈片斷的比較，陳列在表II中。表中的比較數(shù)據(jù)證明A61是一個(gè)嶄新的A-鏈片斷。分子序列則顯示，與目的為抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的血管增生阻斷素和其他血漿酶原斷片不同的是，A61乃是由血漿酶原的前四個(gè)kringles結(jié)構(gòu)，加上kringle 4-kringle 5結(jié)構(gòu)的連結(jié)域，以及kringle 5結(jié)構(gòu)的7個(gè)殘基所組成。
有了大量的A61后，我們得以研究A61的二級結(jié)構(gòu)。為了明嘹A61的二級結(jié)構(gòu)，我們測了A61分子樣品的圓二色散儀光譜(圖8)。我們通過Jasco J-810型分光偏振計(jì)測得該圓二色散儀光譜。使用分光偏振計(jì)前，須先用再結(jié)晶的氨鹽基d-10-camphorsulfonate水溶液校正分光偏振計(jì)。將A61(0.4-0.6mg/ml)置于10mM的三(釋甲基)氨基甲烷緩沖液(pH值為7.5)，150mM的氯化鈉，含有或不含有配基的條件下，在室溫中，培育20分鐘。將樣品(0.1ml)放在石英試管(長度為0.5mm)中掃描，掃描的波長范圍為178~260nm，掃描速度為20nm/min，頻帶寬度為1nm，反應(yīng)時(shí)間為4秒鐘。將掃描所得的三個(gè)波長加以平均，以此獲得蛋白質(zhì)的圓二色散儀光譜，減去緩沖液的掃描結(jié)果，或者在適當(dāng)情況下，減去緩沖液中配合基的掃描結(jié)果，以此校正蛋白質(zhì)的圓二色散儀光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Δε(M-1- cm-1)表示?？赏ㄟ^CDsstr 1.8版計(jì)算機(jī)程式(參考文獻(xiàn)Johnson，W.C.(1999)Proteins 35307-312)對A61的二級結(jié)構(gòu)內(nèi)容進(jìn)行評估。
在A61的遠(yuǎn)-紫外線圓二色散儀光譜圖中，在波長202nm處有一道很強(qiáng)的負(fù)波段，在波長227nm處有一道較弱的正波段。這個(gè)光譜和已發(fā)表的包含A-鏈片斷的其他kringle結(jié)構(gòu)的光譜很相似，例如kringle 4結(jié)構(gòu)的光譜[參考文獻(xiàn)Cleary，S.，et al.(1989)Biochemistry 281884-1891；Castellino，F(xiàn).J.，et al.(1986)Arch.Biochem.Biophys.247312-320；Misselwitz，R.，et al(1994)Int.J.Biol.Macromol.16187-194]。圓二色散儀光譜對二級結(jié)構(gòu)內(nèi)容的分析結(jié)果是，大約有21％為鏈狀型，14％為扭轉(zhuǎn)型，18％為31-螺旋狀型，8％為310-螺旋狀型，以及40％為無序型。A61不包含任何α-螺旋結(jié)構(gòu)，這點(diǎn)和其他包含kringle結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)體是很相似的。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在無細(xì)胞系統(tǒng)中缺乏硫氫基供體的條件下所產(chǎn)生的A61并不會導(dǎo)致分子改變其本性。
圖8陳列的是A61的圓二色散儀光譜圖。這是在20℃，10mM三(釋甲基)氨基甲烷緩沖液(pH值為7.5)，150mM氯化鈉的條件下所進(jìn)行的波長掃描。A61的蛋白質(zhì)濃度為8.5μM，穿過各點(diǎn)的線代表最吻合由二級結(jié)構(gòu)各計(jì)算組合的平均值推算出來的數(shù)據(jù)。
通過CDsstr所進(jìn)行的遠(yuǎn)-紫外線圓二色散儀光譜分析，其結(jié)果顯示A61中缺乏α-螺旋結(jié)構(gòu)，CDsstr是一種最近才出來的計(jì)算機(jī)程序[參考文獻(xiàn)Johnson，W.C.(1999)Proteins 35307-312]?？偟膩碚f，A61的二級結(jié)構(gòu)相當(dāng)于其他含有kringle結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。最近，我們發(fā)現(xiàn)包含kringle結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)其實(shí)含有相當(dāng)多的31-螺旋結(jié)構(gòu)。由于視覺上不易看見，因此早先的X-射線結(jié)構(gòu)論文報(bào)告中并沒有提及該結(jié)構(gòu)。然而，遠(yuǎn)-紫外線圓二色散儀光譜對31-螺旋結(jié)構(gòu)卻非常敏感。A61中含有31-螺旋結(jié)構(gòu)的論點(diǎn)，和近期論文報(bào)告中所提，諸如血漿酶原等其他含有kringle結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中含有31-螺旋結(jié)構(gòu)的論點(diǎn)乃是一致的[參考文獻(xiàn)Marti，D.N.，et al.，(1999)Biochemistry 3815741-15755]。在賴氨酸或賴氨酸同類物存在的條件下，A61的內(nèi)部熒光放射光譜會增加，我們由此推斷，A61的kringle結(jié)構(gòu)其功能乃是十分活躍的。
通過內(nèi)部熒光放射光譜學(xué)可以研究A61的kringle結(jié)構(gòu)的功能。我們采用Perkin-Elmer Life Sciences公司所出產(chǎn)，配備了恒溫保存器的LS 50B型熒光分光計(jì)，去收集激發(fā)光譜和放射光譜。激發(fā)光譜和放射光譜的縱切寬度分別設(shè)定在5nm和10nm處。上述光譜是在以下條件下收集起來的在25℃的環(huán)境下，將A61(3.7μM)置于緩沖液中，緩沖液包括20mM的Hepes(pH質(zhì)為7.4)以及140μM的氯化鈉，其中含有或不含有配基。由於加入配基會導(dǎo)致些微析釋，因此數(shù)據(jù)要加以修正。
圖9陳列的是含有及不含有反式(trans)-4-氨基甲基環(huán)已胺羧酸(AMCHA)的A61內(nèi)部熒光光譜。圖中包括無配合基(實(shí)線)的，以及被AMCHA浸透(虛線)的A61的激發(fā)光譜(Ex)與放射(Em)光譜。光譜是在以下條件下測定的20℃，20μM的Hepes(pH質(zhì)為7.4)和140μM的氯化鈉。A61的濃度為3.7μM。
諸如ε-氨基-n-山羊酸的賴氨酸型兩性離子，與血漿酶原kringle結(jié)構(gòu)相結(jié)合后，可使內(nèi)部蛋白質(zhì)熒光增強(qiáng)大約7％左右[參考文獻(xiàn)Violand，B.N.，et al.(1978)J.Biol.Chem.2535395-5401]。這導(dǎo)致我們?nèi)z查，由A61與淺在配基相接觸所造成的A61在內(nèi)部熒光光譜中的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。圖8陳列的是A61的內(nèi)部熒光放射光譜。激發(fā)與放射最大值分別出現(xiàn)在283nm和342nm處。與諸如ε-氨基-n-山羊酸以及N-乙?；?L-賴氨酸(它和C-末端賴氨酸的結(jié)構(gòu)相仿)等賴氨酸和其它賴氨酸類似物相結(jié)合，可以使內(nèi)部熒光放射光譜大為增強(qiáng)。的結(jié)果可使內(nèi)部熒光發(fā)射光譜(強(qiáng)度)增加很多，AMCHA酸使放射光譜的熒光強(qiáng)度增加了27％，與其他物質(zhì)相比，這是最多的。但是N-乙?；?L-賴氨酸甲酯(一種和內(nèi)部賴氨酸殘基的結(jié)構(gòu)相仿的賴氨酸類似物)卻未能使放射光譜的熒光強(qiáng)度發(fā)生太大的變化。表III中歸納總結(jié)了這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由於A61的內(nèi)部熒光放射光譜在賴氨酸或賴氨酸類似物存在的條件下會增強(qiáng)，因此A61的kringles結(jié)構(gòu)其功能是活躍的，它并且能與自由賴氨酸殘基或C-末端賴氨酸殘基相結(jié)合，但不能與內(nèi)部賴氨酸殘基相結(jié)合。
例五這個(gè)實(shí)例闡述的是A61的生物特性。
要檢測A61對內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響，需將牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCE細(xì)胞)與A61相接觸。做這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將細(xì)胞放在DMEM(JRH Biosciences公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的補(bǔ)充液包括10％的小牛血清，2mM L-谷氨酸鹽，10單位/毫升的青霉素G，10μM的鏈霉素硫酸鹽，以及3ng/nl的堿性纖維質(zhì)母細(xì)胞生長因子(bFGF；Calbiochem)。然后將第3代細(xì)胞至第5代細(xì)胞放到24-井的組織培養(yǎng)盤中(3000個(gè)細(xì)胞/每井)，在37℃的環(huán)境中，培育24小時(shí)。換用含有5％小牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，其中含有或不含有A61(由無細(xì)胞法產(chǎn)生的)，而A61在使用的前一刻，已經(jīng)用Detoxe-膠體柱(Pierce公司)除去內(nèi)毒素〔通過Pyrotell鱟變形細(xì)胞裂解測定(Pyrotell Limulus amoebocyte lysate assay)(Associates of Cape Cod，Inc.，F(xiàn)almouth，MA)內(nèi)毒素的濃度低于45pg/ml(0.4內(nèi)毒素單位/ml)〕。在含有A61的條件下，將細(xì)胞培育30分鐘后，加入最終濃度為1ng/ml的堿性纖維質(zhì)母細(xì)胞生長因子，繼續(xù)將細(xì)胞培育72小時(shí)，細(xì)胞受胰蛋白酶作用，在Isoton II溶液中再度懸浮，以計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)。
當(dāng)使用上述方法測定A61對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響時(shí)，其結(jié)果顯示，A61對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制效果，和其劑量密切相關(guān)(圖9)。從血漿酶原產(chǎn)生的A61，要達(dá)到50％的抑制效果，在無外生硫氫基供體條件下備制的A61，其濃度需為35±10nM(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝4)。A61濃度大約為200nM時(shí)，其對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，可達(dá)到最大的抑制效果。在具有硫氫基供體N-乙?；腚装彼釛l件下備制的A61，對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用具有相同的抑制效果。然而，IC50為35nM比Soff及其工作同仁所發(fā)表的IC50為300nM[參考文獻(xiàn)Gately，S.，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，10868-10872]要低相當(dāng)多，因而它代表了相當(dāng)大的改進(jìn)。濃度高達(dá)2μM的A61對HT1080纖維肉瘤細(xì)胞，海拉細(xì)胞，以及293細(xì)胞等數(shù)種非內(nèi)皮細(xì)胞的增殖沒有抑制效果。
圖10陳列了A61的生物活性。A、對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制性。將牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞在如下的條件中進(jìn)行培育，1ng/ml的堿性纖維質(zhì)母細(xì)胞生長因子以及各種濃度的A61，其中A61可在具有(開環(huán))，或不具有(閉環(huán))硫氫基供體N-乙?；腚装彼岬臈l件下備制。經(jīng)過72小時(shí)的培育后，牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受胰蛋酶作用，在Isoton II溶液中再度懸浮，以Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)。B、對體內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤生長的抑制性。在原始腫瘤切除之后，立即將磷酸鹽-緩沖液鹽水或含有A61的磷酸鹽-緩沖液鹽水(2.5mg/kg/day)注射到老鼠的腹膜中。在特定時(shí)間間隔下摘除肺部，然后比較肺部的重量。
我們用Lewis肺癌腫瘤測定(參考文獻(xiàn)O’Reilly et al的US Patent5.776,704)去研究A61在體內(nèi)的抗腫瘤活性。培育Lewis肺癌細(xì)胞，當(dāng)癌細(xì)胞達(dá)到快速增長期時(shí)將之收集起來，并且再度懸浮于磷酸鹽-緩沖液鹽水。將大約106個(gè)細(xì)胞注射到6~8星期大的C57BL/6形雄鼠的背中部皮下組織中。當(dāng)老鼠體內(nèi)的腫瘤長到約為1500mm3大小時(shí)(約在注射14天之后)，將雄鼠隨機(jī)分為兩組。將第一組用外科手術(shù)去除腫瘤，將第二組施以虛擬的外科手術(shù)過程使其腫瘤雖經(jīng)處理但完好無損。將腫瘤去除組的雄鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組與控制組。對于試驗(yàn)組的老鼠，每日在其腹腔膜內(nèi)注射含有A61的磷酸鹽-緩沖液鹽水(劑量為2.5mg/kd/day)，對于控制組的老鼠，則僅注射磷酸鹽-緩沖液鹽水。腫瘤切除后的每隔3天將受試?yán)鲜髿⑺?，稱其肺重量。
腫瘤被切除，僅注射過磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠，其肺重量隨著時(shí)間的增長而逐漸增加(圖11)。在腫瘤切除18天后，與老鼠腫瘤的總重量相關(guān)聯(lián)的老鼠肺重量，達(dá)到770±42mg(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝4)。兩相對照下，每日注射含有A61劑量的老鼠，其平均肺重量僅增加到250±14mg(±表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝4)。正常老鼠與腫瘤長了18天的老鼠，其平均肺重量分別為191±25mg(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝4)和199±20mg(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝4)。腫瘤切除的老鼠，其肺重量的增加和可觀察到的轉(zhuǎn)移性焦點(diǎn)值的增加，彼此是一致的。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了A61是一種很強(qiáng)的抗腫瘤因子。我們不希望此發(fā)明受以下理論所局限，我們認(rèn)為，A61的抗腫瘤活性乃是基于A61的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性，這證明A61在體內(nèi)具有抗血管增生的活性。2.5mg/kg/day的抗腫瘤活性所需劑量，比Soff及其工作同仁所提出的15mg/kg/day的抗腫瘤活性所需劑量[參考文獻(xiàn)Gately，S.，et al.，(1997)Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.94，10868-10872]要低相當(dāng)多。因此，A61作為一種抗腫瘤因子，其抗腫瘤效力的提高，代表它的抗腫瘤效力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越其它抗血管增生血漿酶原衍生物的抗腫瘤效力。
例六這個(gè)實(shí)例闡述的是，用無細(xì)胞法從A61中產(chǎn)生p22的過程。
生物界近來逐漸浮現(xiàn)出一種新觀點(diǎn)某些無活性的先驅(qū)蛋白質(zhì)能夠在體內(nèi)分裂，以產(chǎn)生有生物活性的片斷。例如，絲氨酸蛋白酶激肽釋放酶(kallikrein)經(jīng)蛋白水解后產(chǎn)生微肽原(kinonogen)，可導(dǎo)致一種有效的血管擴(kuò)張物質(zhì)—緩繳肽(bradykinin)的釋放(參考文獻(xiàn)Schmaier，2000 Curr.Opin.Hematol.7261-265)。相同的道理，膠原質(zhì)(collagen)XVIII經(jīng)蛋白質(zhì)水解后，可導(dǎo)致一種有效的抗血管增生物質(zhì)—蛋白質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin)的產(chǎn)生(參考文獻(xiàn)0’Reilly et al.，1997 EXS 79273-294)。具有生物調(diào)控功能的蛋白質(zhì)水解過程這個(gè)新觀點(diǎn)，強(qiáng)烈表現(xiàn)在血漿酶原分裂系統(tǒng)中，在血漿酶原中，分子的蛋白質(zhì)水解分裂，能夠產(chǎn)生多樣的蛋白酶，血漿酶，或經(jīng)進(jìn)一步分裂后，能夠產(chǎn)生抗血管增生的血漿酶原片斷。雖然通過血漿酶(原)的蛋白質(zhì)水解消化或者基因重組技術(shù)，可以在體外產(chǎn)生許多不同的血漿酶原片斷，但是我們還不清楚，在生理環(huán)境下能夠產(chǎn)生什么樣的抗血管增生的血漿酶原片斷。所有已知的抗血管增生的血漿酶原片斷，至少包含一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域。
Kringle結(jié)構(gòu)域是小型的蛋白質(zhì)區(qū)域，它大約包含80個(gè)氨基酸，并且有一個(gè)很有特色的三-二硫化物鍵結(jié)構(gòu)。這些區(qū)域被認(rèn)為是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位，在這些單位的N-末端和C-末端有一個(gè)半胱氨酸殘基。在尿激酶(參考文獻(xiàn)Gunzler et al.，1982 Hoppe Seylers.Z.Physiol.Chem.3631155-1165.)和因子XII(參考文獻(xiàn)McMullen and Fujikawa，1985J.Biol.Chem.2605328-5341)中有一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，在組織型-血漿酶原活化劑及凝血素中有兩個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域(參考文獻(xiàn)Pennica et al.，1983)，在肝細(xì)胞生長因子中有四個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域(參考文獻(xiàn)Tashiro et al.，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.873200-3204)，在血漿酶原中有五個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，在阿樸脂蛋白(a)中有四十個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域(參考文獻(xiàn)McLean et al.，1987 Nature 330132-137；Castellino and McCance，1997 Ciba Found Symp.2 1246-60；Castellino andBeals，1987 J.Mol.Evol.26358-369)。Kringle結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一是它與賴氨酸的結(jié)合位置。總的來說，Kringle結(jié)構(gòu)中與賴氨酸的結(jié)合位置與標(biāo)靶蛋白質(zhì)的C-末端賴氨酸殘基，彼此會進(jìn)行交互作用。例如，通過與暴露的賴氨酸支鏈相連接，血漿酶原的Kringle結(jié)構(gòu)域與纖維素彼此會進(jìn)行交互作用。此外，血漿酶原的Kringle結(jié)構(gòu)域，可以通過與諸如annexinII四聚物的C-末端賴氨酸的受體蛋白質(zhì)相結(jié)合，或與它們主要的血漿抑制劑，α2-抗血漿酶相結(jié)合(參考文獻(xiàn)Kassam et al.，1998 Biochemistry 3716958-16966；Longstaff and Gaffney，1991 Biochemistry 30979-986；Christensen et al.，1996 FEBS Lett.38758-62)的方式和細(xì)胞表面相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證明，通過Kringle結(jié)構(gòu)與內(nèi)鏈賴氨酸殘基的交互作用，Kringle結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)分子間的交互作用(參考文獻(xiàn)Ryan and Keegan，1985 Biochim.Biophys.Acta 830187-194；Menhart et al.，1995 Biochemistry 341482-1488；McCance and Castellino，1995 Biochemistry349581-9586；Takada et al.，1993 Thromb.Res.50285-294)。
血漿酶原的Kringles結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛深入的研究。這些Kringle結(jié)構(gòu)有48％~50％的相同性，但是它們的功能并不相同。例如，Kringle結(jié)構(gòu)與模仿C-末端賴氨酸的結(jié)構(gòu)而形成的N-乙酸基-L-賴氨酸的結(jié)合力，依大小次序?yàn)镵ringle1＞Kringle4＞Kringle2。Kringle5與該賴氨酸相似物的結(jié)合力很弱，Kingle3則不能與該賴氨酸相似物相結(jié)合(參考文獻(xiàn)Marti et al.，1997)。有趣的是，Kringle1，Kringle2，Kringle4，Kringle5結(jié)構(gòu)與模仿內(nèi)鏈賴氨酸所形成的賴氨酸相似物的結(jié)合力相似(參考文獻(xiàn)Marti et al.，1997 Biochemistry 3815741-15755)。血漿酶原的Kringle結(jié)構(gòu)可能有非常明確的結(jié)合伙伴。例如，Kringle2結(jié)構(gòu)只與A組的鏈狀球菌表面蛋白質(zhì)的內(nèi)鏈賴氨酸，PAM，相結(jié)合(參考文獻(xiàn)Marti et al.，1997 Biochemistry3815741-15755)。同樣地，Kringle4結(jié)構(gòu)只與α2-抗血漿酶原的C-末端賴氨酸殘基相結(jié)合(參考文獻(xiàn)Christensen etal.，1996 FEBS Lett.38758-62)。
此項(xiàng)發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞能將血漿酶原轉(zhuǎn)化成一種新型的，分子量為22kDa的片斷，這種片斷具有抗腫瘤的活性，此即為p22。p22是在生理環(huán)境下所形成的最小的血漿酶原片斷。由於p22片斷中只包含一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，所以這個(gè)發(fā)明的重要優(yōu)點(diǎn)是，p22的結(jié)構(gòu)簡單，它的氨基酸序列很短，而且它沒有糖基化，這兩點(diǎn)對進(jìn)一步研究與生產(chǎn)p22提供了方便。迄今為止，p22是在生理環(huán)境下所產(chǎn)生的最小的血漿酶原片斷。由于p22片斷只含有一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，因此未來對這個(gè)蛋白質(zhì)的抗增殖活性所作的結(jié)構(gòu)-功能分析，將會比針對含有多個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域的血漿酶原片斷(例如A61)所作的類似研究更容易進(jìn)行。血漿酶原的Kringle結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是重組的蛋白質(zhì)，這使得它們的生物活性得以和p22的生物活性進(jìn)行對比。通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖測定，每一個(gè)血漿酶原Kringle結(jié)構(gòu)域各有其不同的抗增殖活性。Kringle5、Kringle1和Kringle3結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，Kringle2表現(xiàn)出較弱的抑制活性，而Kringle4則不具備抑制活性(參考文獻(xiàn)Cao et al 1996.，J.Biol.Chem.27129461-29467；Cao et al.，1997 J.Biol.Chem.27222924-22928)。這些Kringle結(jié)構(gòu)對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制功能也各不相同。Kringle5、Kringle4表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，Kringle2和Kringle3表現(xiàn)出較弱的抑制活性，Kringle1則幾乎沒有抑制的活性(參考文獻(xiàn)Ji et al.，1998 Biochem Biophys Res Commun 247414-419；Ji et al.，1998FASEB J.121731-1738)。有趣的是，抑制活性的強(qiáng)弱與Kringle結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)，但是抑制活性的強(qiáng)弱與Kringle結(jié)構(gòu)中賴氨酸的結(jié)合位置似乎關(guān)系不大(參考文獻(xiàn)Ji et al.，1998 Biochem Biophys Res Commun 247414-419；Caoet al.，1996 J.Biol.Chem.27129461-29467)。
要在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生p22，須將在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的A61(7μM)與0.1μM的血漿酶以及包含20mM Hepes緩沖劑(pH值為7.4)、140mM氯化鈉、和100μM二硫蘇糖醇的緩沖液，置于37℃環(huán)境中，一起培育2小時(shí)。加入1mM Pefabloc(Roche公司)使反應(yīng)停止，將混合物放到一個(gè)在使用前，已經(jīng)用含有20mM Hepes(其pH值為7.4)以及140mM氯化鈉的平衡緩沖液，先行平衡過的L-賴氨酸-瓊脂糖色譜柱上。將從賴氨酸-瓊脂糖柱上收集起來的流動組分，再放入一個(gè)在使用前，已經(jīng)用含有20mM Hepes(其pH值為7.4)以及4M氯化鈉的平衡緩沖液，先行平衡過的辛基-瓊脂糖樹脂上。從辛基-瓊脂糖色譜柱上收集起來的流動組分可產(chǎn)生毫克量的純化蛋白質(zhì)(其中產(chǎn)量的多少取決于例1中所敘述的紫外吸光度)。該蛋白質(zhì)的Mr為22,000，這是使用例1中敘述的，在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法分析出來的。這個(gè)被稱之為p22的純化蛋白質(zhì)，在20mM Hepes(pH值為7.4)，20mM氯化鈉的條件下，進(jìn)行透析。經(jīng)透析后的p22蛋白質(zhì)被分成數(shù)份，儲存于-70℃的環(huán)境中，以供后用。
圖12陳列了無細(xì)胞系統(tǒng)中p22的產(chǎn)生過程。將A61(泳道1)和血漿酶(0.1μM)以及二硫蘇糖醇(100μM)置于37℃中，培育2小時(shí)(泳道2)。用L-賴氨酸-瓊脂糖色譜柱純化p22(泳道3)，將其濃縮(泳道4)，用辛基-瓊脂糖色譜柱進(jìn)一步純化p22(泳道5)。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法去分析樣品，然后用考馬斯氏藍(lán)色染色法去染色分析，便可看到蛋白質(zhì)染色帶。
例七這個(gè)實(shí)例闡述的是，通過在細(xì)胞體外與A61接觸，以產(chǎn)生p22的過程。
要在細(xì)胞的輔助下產(chǎn)生p22，需將人類HT1080細(xì)胞，放在DMEM(GIBCO-BRL公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的補(bǔ)充液包括10％經(jīng)過熱處理過的牛胎兒血清，10單位/毫升的青霉素G，10μM的鏈霉素硫酸鹽。將每毫升含有大約1×105細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞，加入24-井組織培養(yǎng)盤中的每一個(gè)井中，置于37℃的環(huán)境內(nèi)，培育大約24小時(shí)，然后會形成細(xì)胞單層。用DMEM培養(yǎng)基將該細(xì)胞單層清洗3次，然后將0.5~8μM溶在DMEM培養(yǎng)基中的〔谷氨酸〕-血漿酶原加入各井中。經(jīng)過大約18小時(shí)的培育后，將媒質(zhì)物除去，并用含有β-巰基乙醇還原劑的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法樣品緩沖液將其稀釋，然后用例1中所描述的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠電泳分析法和免疫印跡法去進(jìn)行分析。
當(dāng)在免疫印跡法中采用抗人體血漿酶原Kringles 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體時(shí)，我們可以檢測到一個(gè)分子量約為22,000的蛋白質(zhì)。此外，如果改變加入細(xì)胞內(nèi)血漿酶原的濃度，p22的劑量也會隨之改變。例如，當(dāng)血漿酶原的濃度為1μM時(shí)，我們觀察到p22的產(chǎn)量，大約為循環(huán)中之血漿酶原的生理濃度。
當(dāng)用〔賴氨酸〕-血漿酶原代替〔谷氨酸〕-血漿酶原時(shí)，我們得到類似的結(jié)果。其他諸如BCE細(xì)胞，海拉細(xì)胞等細(xì)胞，亦可轉(zhuǎn)化為p22。然而，在同樣的試驗(yàn)條件下，人體臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)沒有產(chǎn)生可以檢測到的p22。此外，基于p22在還原條件下所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法中的極動性，它比人體血漿酶原的重組Kringle 1結(jié)構(gòu)(rK1)稍微大一些，但是比分子量分別為38,000或25,000的重組Kringle 1-3結(jié)構(gòu)或重組Kringle 2-3結(jié)構(gòu)小一些〔參考文獻(xiàn)Rejante，M.R.and Llinas，M.(1994)European Journal ofBiochemistry 221939-49；An，S.S.et al.，(1998)Protein Sci.71947-1959〕。因此，我們推斷p22是一種僅含有一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域的新型血漿酶原片斷。
圖13陳列了由HT-1080細(xì)胞所產(chǎn)生的新型血漿酶原片斷(p22)的確認(rèn)過程。(A)在含有指定濃度〔谷氨酸〕-血漿酶原的DMEM培養(yǎng)基中培育HT-1080細(xì)胞。經(jīng)過一整夜的培育后，用15％膠體濃度，在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法去分析該媒質(zhì)物，然后在免疫印跡法中采用抗人體血漿酶原Kringles 1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體去進(jìn)行分析。在無細(xì)胞的條件下，培育一整夜的〔谷氨酸〕-血漿酶原(8μM)(泳道1)，及A61標(biāo)準(zhǔn)樣品(泳道7)。將HT-1080細(xì)胞和以下濃度的〔谷氨酸〕血漿酶原一起培育0.5μM(泳道2)；1μM(泳道3)；2μM(4)；4μM(泳道5)；8μM(泳道6)。(B)在含有(A)項(xiàng)指定濃度〔賴氨酸〕血漿酶原的DMEM培養(yǎng)基中，培育HT-1080細(xì)胞。(C)在含有8μM〔谷氨酸〕血漿酶原的DMEM培養(yǎng)基中，培育HT-1080細(xì)胞(泳道5)，BCE細(xì)胞(泳道6)，人體臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(泳道7)，經(jīng)過一整夜的培育后，用12.5％膠體濃度，在還原條件下進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法去分析該媒質(zhì)物，然后在免疫印跡法中采用抗人體血漿酶原Kringles1-3結(jié)構(gòu)的單克隆抗體作為初級抗體去進(jìn)行分析。用〔賴氨酸〕血漿酶原去培育海拉細(xì)胞(泳道8)。其它的標(biāo)準(zhǔn)樣品顯示如下血漿酶原(泳道1)；A61(泳道2)；p22(泳道3)；重組Kringle 1結(jié)構(gòu)(泳道4)。
例八這個(gè)實(shí)例闡述的是p22的生物化學(xué)和生物物理特性。
為了確認(rèn)能分裂產(chǎn)生p22的血漿酶(原)區(qū)域，我們用Edman降解法去分析，經(jīng)由HT-1080細(xì)胞作用而產(chǎn)生的p22其N-末端序列。p22的N-末端相當(dāng)于血漿酶原的賴氨酸78。然而，由于p22比血漿酶(原)的Kringle 1大一些(見圖12)，因此我們推斷，p22內(nèi)含有血漿酶(原)的Kringle 1結(jié)構(gòu)，以及一些能在血漿酶(原)第一個(gè)和第二個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)間，建立連接的氨基酸殘基。
用前述A61所使用的分析方法，去分析在無細(xì)胞系統(tǒng)所產(chǎn)生的p22其N-末端序列。這項(xiàng)分析顯示，p22的N-末端氨基酸，和A61一樣，也是表IV中所陳列的賴氨78。如前所述，人體p22是由人體抗血管增生血漿酶原片斷，A61，以及尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激激活劑(uPA)在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的。
表IV人體p22的氨基-末端及羧基-末端序列
而且，經(jīng)由將血漿酶原和HT1080細(xì)胞一起培育所產(chǎn)生的p22，和在無細(xì)胞系統(tǒng)中所產(chǎn)生的p22相比，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法是不能將它們區(qū)別開的(圖12)。用前述A61所使用的方法去分析C-末端序列，結(jié)果顯示采用血漿酶原與細(xì)胞接觸法或無細(xì)胞系統(tǒng)法所產(chǎn)生的p22，其C-末端均是賴氨酸180。因此，p22乃是一個(gè)從賴氨酸78延伸至賴氨酸180的新型血漿酶原片斷，它包含了6個(gè)N-末端殘基，血漿酶原Kringle1結(jié)構(gòu)，Kringle1、Kringle2連接區(qū)的3個(gè)殘基，以及Kringle2結(jié)構(gòu)的15個(gè)殘基。
圖14陳列的是p22的結(jié)構(gòu)圖形。圖中用英文字母縮寫去標(biāo)示各氨基酸。陰影區(qū)域代表p22的結(jié)構(gòu)。
不同氨基酸的3個(gè)字母和1個(gè)字母的縮寫如下丙胺酸-ala-A；精氨酸-arg-R，無冬酰胺酸-asn-N；天門冬氨酸-asp-D，半胱氨酸-cys-C；谷氨酸鹽-gln-Q；谷氨酸-glu-E；氨基乙酸-gly-G；組氨酸-his-H；異亮氨酸-ile-I；亮氨酸-leu-L；賴氨酸-lys-K；蛋氨酸-met-M；苯基丙氨酸-phe-F；脯氨酸-pro-P；絲氨酸-ser-S；蘇氨酸-thr-T；色氨酸-trp-W；酪氨酸-tyr-Y；纈氨酸-val-V。
用例四中所述，A61所采用的方法去分析p22及重組Kringle1結(jié)構(gòu)(Kringle1結(jié)構(gòu)乃是血漿酶原的一個(gè)單結(jié)構(gòu)片斷，Carnegie Melon大學(xué)的Dr.M.Llinas贈送)，結(jié)果顯示p22不會被糖基化。用p22的氨基酸列序推算出來的p22分子重量為Mr11,825。相較之下，用例四中所述的質(zhì)譜法測量出來的p22分子重量則為Mr11,821。由於用p22的氨基酸列序推算出來的p22分子重量，與用質(zhì)譜法測量出來的p22分子重量非常接近，因而排除了p22被糖基化，以及轉(zhuǎn)譯后蛋白質(zhì)被修飾的可能性。對照之下，用氨基酸列序推算出來的重組Kringle1結(jié)構(gòu)的分子重量為Mr9,926，用質(zhì)譜法測量出來的重組Kringle1結(jié)構(gòu)的分子重量為Mr9,815。推算數(shù)據(jù)與測量數(shù)據(jù)的差異證明，重組Kringle1結(jié)構(gòu)與p22結(jié)構(gòu)明顯不同。
采用例一中所描述的圓二色散儀(CD)光譜去檢測p22(以及重組Kringle1結(jié)構(gòu)以進(jìn)行對比)的二級結(jié)構(gòu)。p22的圓二色散儀光譜圖中，我們觀察到在227.5nm處有一道正波段，在202.7nm處有一道很強(qiáng)的負(fù)波段，這顯示p22中的蛋白質(zhì)沒有α-螺旋結(jié)構(gòu)。在200nm附近的負(fù)橢圓率，與p22二級結(jié)構(gòu)中存在的聚脯氨酸-螺旋結(jié)構(gòu)(31-螺旋結(jié)構(gòu))是一致的。通過變數(shù)挑選法(參考文獻(xiàn)Johnson，W.C.(1999)Proteins 35307-312)估計(jì)p22的二級結(jié)構(gòu)物，結(jié)果顯示p22大約包含17％的31-螺旋結(jié)構(gòu)(見表IV)。相較之下，重組Kringle1結(jié)構(gòu)的圓二色散儀光譜，在227.5nm處出現(xiàn)一道正波段，在197.4nm處出現(xiàn)一道很強(qiáng)的負(fù)波段。
表Vp22次級結(jié)構(gòu)和K1結(jié)構(gòu)之比較
圖15陳列的是p22及K1的圓二色散儀光譜。波長掃描是在20℃，10mM三(釋甲基)氨基甲烷緩沖液(pH值為7.5)，150mM氯化鈉的條件下進(jìn)行的。p22及K1的濃度分別為41μM和25μM。穿過各點(diǎn)的線代表最吻合由二級結(jié)構(gòu)各計(jì)算組合的平均值所推算出來的數(shù)據(jù)。
我們采用內(nèi)部熒光光譜去研究p22 Kringle結(jié)構(gòu)的功能。用例一中所描述的方法去取得p22及重組Kringle1結(jié)構(gòu)的內(nèi)部熒光光譜。p22內(nèi)部熒光的激發(fā)光譜最大值與放射光譜最大值，分別為283nm和332nm。相較之下，重組Kringle1結(jié)構(gòu)內(nèi)部熒光的激發(fā)光譜最大值與放射光譜最大值則分別為283nm和229nm，將賴氨酸的類似物反式(trans)-4-氨基甲基環(huán)已胺羧酸(AMCHA)與p22相結(jié)合后，p22的內(nèi)部熒光放射光譜大為增強(qiáng)(22％)。然而，將重組Kringle1結(jié)構(gòu)與AMCHA相結(jié)合后，重組Kringle1結(jié)構(gòu)的內(nèi)部熒光放射光譜雖然增強(qiáng)了20％，但是重組Kringle1結(jié)構(gòu)的發(fā)射光譜最大值卻從339nm轉(zhuǎn)移到331nm。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，p22的Kringle結(jié)構(gòu)域與重組Kringle1結(jié)構(gòu)二者截然不同。雖然我們不希望被理論所束縛，數(shù)據(jù)資料指出，p22的N-末端或C-末端的氨基酸，與p22的Kringle結(jié)構(gòu)域彼此會進(jìn)行交互作用，且前者對后者有調(diào)節(jié)作用。
圖16陳列的是p22及重組Kringle1結(jié)構(gòu)的內(nèi)部熒光光譜。其中包括無配合基的激發(fā)光譜(Ex)與放射光譜(Em)(以實(shí)線表示)，以及被1mM AMCHA浸透過的A61(以虛線表示)，光譜需在20mM Hepes(pH值為7.4)，140mM氯化鈉中，20℃的條件下進(jìn)行測量。p22與Kringle1結(jié)構(gòu)的濃度分別為25mM和10mM。
例九這個(gè)實(shí)例闡述的是，p22的生物活性。
按照例一中所示方法培育BCE細(xì)胞，以此檢查p22對內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制效果，只要將用無細(xì)胞法產(chǎn)生的A61代之以p22便可。我們觀察到，p22的劑量會左右BCE細(xì)胞生長的抑制幅度。要達(dá)到50％的抑制效果(IC50)，所需的p22濃度為14.3±2.3nM(±表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝3)，要達(dá)到最大的抑制效果，所需的p22濃度為50nM。然而和IC50＝35nM的A61以及IC50＝39.5±9.7nM(±表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝3)的重組Kringle1結(jié)構(gòu)比較起來，p22的IC50較低些。
圖17陳列了p22與重組Kringle1結(jié)構(gòu)對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。在含有1ng/ml堿性纖維質(zhì)母細(xì)胞生長因子(bFGF)的條件下，將不同濃度的p22或重組Kringle1結(jié)構(gòu)與BCE細(xì)胞一起培育。經(jīng)過72小時(shí)的培育后，BCE細(xì)胞受到胰蛋白酶作用，懸浮于Isoton II溶液中，然后用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p22對牛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有很強(qiáng)的抑制作用。
為了確定p22在細(xì)胞體內(nèi)是否具有抗血管增生阻斷素的活性，我們檢測了p22對小雞絨膜尿囊膜(簡稱CAMS)上新生血管生長的影響。做該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將受精3天的白色來亨雞蛋(Lillydale公司，Calgary，Alberta Canada)打破，將含有蛋黃的小雞晶胚放入100×20mm的培養(yǎng)皿中。將其置于37℃環(huán)境中，5％二氧化碳的條件下，培育3天后，將含有磷酸鹽-緩沖液鹽水(簡稱PBS；137mM NaCl，8mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，2.7mM KCl，pH7.4)的甲烷基木纖維質(zhì)或5μg的p22(8.3μM濃度中的70μl)移植到小雞絨膜尿囊膜上。經(jīng)過48小時(shí)的培育后，在立體顯微鏡下分析晶胚和小雞絨膜尿囊膜在無血管地帶的形成機(jī)理，將影像放大40倍后拍照。比較當(dāng)采用磷酸鹽-緩沖液鹽水作為控制組時(shí)，5μg的p22在相同環(huán)境下對血管生長的抑制效果。
圖18陳列了p22對小雞絨膜尿囊膜上新生血管的抑制作用。將含有磷酸鹽-緩沖液鹽水或是含有5μg的p22的甲烷基木纖維質(zhì)圓盤，移植到6天大的小雞晶胚的小雞絨膜尿囊膜上。經(jīng)過48小時(shí)的培育后，在立體顯微鏡下分析無血管地帶的形成機(jī)理。所得照片代表10項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。A、C格中的虛線圓指出了甲烷基木纖維質(zhì)圓盤的位置。(A)經(jīng)含有p22的甲烷基木纖維質(zhì)圓盤處理過的小雞絨膜尿囊膜。用箭頭將無血管區(qū)標(biāo)示出來。(B)在A格中標(biāo)示”R”的插入放大圖，陳列的是無血管區(qū)附近的復(fù)原血管(以箭頭標(biāo)示)。(C)用含有磷酸鹽-緩沖液鹽水的甲烷基木纖維質(zhì)圓盤作為小雞絨膜尿囊膜的控制組。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了p22具有抗血管增生的活性。
我們用Lewis肺癌腫瘤測定(參考文獻(xiàn)O’Reilly et al的US Patent5.776,704)去研究p22在體內(nèi)的抗腫瘤活性。培育Lewis肺癌細(xì)胞，當(dāng)癌細(xì)胞達(dá)到快速增長期時(shí)將之收集起來，并且再度懸浮于磷酸鹽-緩沖液鹽水。將大約106個(gè)細(xì)胞注射到6~8星期大的C57BL/6形雄鼠的背中部皮下組織中。當(dāng)老鼠體內(nèi)的腫瘤長到約為1500mm3大小時(shí)(約在注射14天之后)，將雄鼠隨機(jī)分為兩組。將第一組用外科手術(shù)去除腫瘤，將第二組施以虛擬的外科手術(shù)過程使其腫瘤雖經(jīng)處理但完好無損。將腫瘤去除組的雄鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組與控制組。對于試驗(yàn)線的老鼠，每日在其腹腔膜內(nèi)注射含有p22的磷酸鹽-緩沖液鹽水(劑量為2.5mg/kd/day，也就是說，使用500μl濃度為8.3μM的p22)，對于控制組的老鼠，則僅注射磷酸鹽-緩沖液鹽水。14天后將所有受試?yán)鲜髿⑺溃Q其肺重量，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移性焦點(diǎn)的數(shù)值。
僅注射磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠，在腫瘤切除后，其肺重量為38±4(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝18)轉(zhuǎn)移性焦點(diǎn)值，而注射含有p22磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠，其肺重量則為3±2(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝18)轉(zhuǎn)移性焦點(diǎn)值。原始腫瘤切除后僅被注射磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠，其肺重量會隨著時(shí)間的增長而增加，在原始腫瘤切除14天后，其肺重量達(dá)到646.5±123mg((±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝18)。和僅注射磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠肺重量不同的是，每日被注射p22的老鼠，其平均p22到191.8±31mg(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝18)。相較之下，正常老鼠或原始腫瘤長了14天的老鼠，其肺重量分別為191±25mg(±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝5)及199±20mg(±為標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝10)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了p22是一種有效的抗轉(zhuǎn)移因子。
圖18陳列了老鼠肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤生長的抑制過程。在原始腫瘤切除之后，立即將磷酸鹽-緩沖液鹽水或含有p22的磷酸鹽-緩沖液鹽水(2.5mg/kg/day)注射到老鼠的腹膜中。實(shí)驗(yàn)表明，p22能抑制肺轉(zhuǎn)移性焦點(diǎn)值的生長(A)，并且在原始腫瘤切除之后(C)，阻止肺重量的增加(B)。在老鼠體內(nèi)原始腫瘤被切除14天之后，用視覺比較注射了磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠與注射了含有p22磷酸鹽-緩沖液鹽水的老鼠的肺部。圖18也陳列了正常老鼠與長了主要腫瘤老鼠的肺重。我們不希望此發(fā)明受以下理論所局限我們認(rèn)為，p22的抗轉(zhuǎn)移活性乃是基于p22的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性，這證明p22在體內(nèi)具有抗血管增生的活性。
例十這個(gè)實(shí)例闡述的是，內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物(簡稱annexinII四聚物)所拌演的血漿酶原細(xì)胞外受體的角色，以及它在血漿酶原片斷的形成過程中所起的作用。
對于與Ca2+-結(jié)合的蛋白質(zhì)而言，內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物是血漿酶原的主要細(xì)胞外受體。該四聚物能調(diào)節(jié)血漿酶原轉(zhuǎn)化為血漿酶的過程，以及血漿酶的自體蛋白質(zhì)水解過程(參考文獻(xiàn)Kassam et al.，Biochimitry 37，16958-16966，1998a；Kassam et al.，J.Biol.Chem.2734790-4799，1998b；Fitzpatrick et al.，Biochemistry 391021-1028，2000；Kang et al.，Trends Cardiovasc.Med.992-102，1999)。這些研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物能與組織血漿酶原活化劑，血漿酶原，以及血漿酶緊密結(jié)合。我們并且發(fā)現(xiàn)，可以抗血管增生的血漿酶原片斷A61也能與該四聚物緊密結(jié)合(見圖20)。在該項(xiàng)研究中，須將塑料盤的每個(gè)井涂上磷脂，和內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物一起培育，然而充分洗滌。將各種不同濃度的125I-A61，放在涂有內(nèi)皮細(xì)胞受體回聚物的井中進(jìn)行培育，其培育條件包括井中不含有(黑白實(shí)心圓點(diǎn))及含有1mg/ml牛血清蛋白(黑白實(shí)心正方塊)，或者含有10nM的氨基山羊酸(空心圓點(diǎn))。
由於血漿酶原或血漿酶是抗血管增生血管酶原片斷的先驅(qū)物質(zhì)，因此A61、p22，以及其他任何會影響內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物或其子組(annexinII或p11)活性的因子，均會影響抗血管增生血漿酶原片斷的產(chǎn)生與毀壞。例如，由於海拉細(xì)胞被一個(gè)含有反義鏈的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物的p11子組中，因而造成細(xì)胞外內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物的減少，如此一來，p22的產(chǎn)量就減少了(見圖21)。在上述研究中，海拉細(xì)胞是被一個(gè)含有反義鏈的p11的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的。用血漿酶原培育海拉細(xì)胞，培育特定時(shí)間后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳分析法去分析血漿酶原片斷。有趣的是，當(dāng)海拉細(xì)胞被一個(gè)含有有義鏈的p11的表達(dá)載體，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染后，并造成p11子組的細(xì)胞外濃度增加時(shí)，p22的產(chǎn)量會增加(見圖22)。因此，我們認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞受體四聚物(及/或)其內(nèi)皮細(xì)胞受體或p11子組，通過調(diào)節(jié)它們在細(xì)胞表面的形成過程，在抗血管增生血漿酶原片斷的效果上，拌演了關(guān)鑒性的角色。
我們所得到的體外數(shù)據(jù)，同樣支持以下結(jié)論annexin四聚物參與了A61及p22的生產(chǎn)過程。如圖22所陳列，只有在加入annexin四聚物之后，和A61一起培育的血漿酶，才會產(chǎn)生p22。這說明了，在A61到p22的血漿酶裂解過程中，annexin四聚物是必要因素。
由於A61與annexin四聚物之間會進(jìn)行交互作用(陳列在圖22中)，因此我們認(rèn)為，annexin四聚物可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞上抗血管增生血漿酶原片斷的細(xì)胞毒素作用，其方式是拌演它們的細(xì)胞外受體的角色。
從以上的闡述我們可以看出，這項(xiàng)發(fā)明具有很多優(yōu)點(diǎn)，它并且獲得了一些前瞻性的結(jié)果。
由於上述的方法及組合可以在許多變化后，仍不脫離這項(xiàng)發(fā)明的范疇，因此包含在上列描述中的所有事項(xiàng)，僅應(yīng)視為這項(xiàng)發(fā)明的說明，而非這項(xiàng)發(fā)明的范疇介限。
上列詳細(xì)說明中所引用的參考資料，僅供參考而已。此處針對所有參考資料所作的討論，只不過總結(jié)這些參考資料作者的看法，并非意指其中任何參考資料構(gòu)成了前述的技術(shù)。本發(fā)明的申請者對所有引用參考資料的準(zhǔn)確性及適切性，保留質(zhì)疑的權(quán)利。
序列表序列表&lt;110&gt;大衛(wèi)M.崴斯曼(Waisman，David M)&lt;120&gt;抗血管增生的多肽&lt;130&gt;7368-000002&lt;140&gt;PCT/US01/44515&lt;141&gt;2001-11-01&lt;150&gt;US60/253725&lt;151&gt;2000-11-28&lt;160&gt;8&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;391&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人(Homo sapiens)&lt;400&gt;1Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg1 5 10 15Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser20 25 30Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser35 40 45Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln50 55 60Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys65 70 75 80Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn85 90 95Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala100 105 110Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe115 120 125Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu130 135 140
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Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser35 40 45Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln50 55 60Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys65 70 75 80Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn85 90 95Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala100 105 110Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe115 120 125Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu130 135 140Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu145 150 155 160Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr165 170 175Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala180 185 190Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro195 200 205His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp210 215 220Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His225 230 235 240Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys245 250 255Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro260 265 270Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser275 280 285Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser290 295 300Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr305 310 315 320Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp325 330 335Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr340 345 350Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro355 360 365Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp370 375 380
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Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser115 120 125Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser130 135 140Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln145150 155 160Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys165 170 175Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn180 185 190Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala195 200 205Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe210 215 220Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu225 230 235240Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu245 250 255Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr260 265 270Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala275 280 285Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro290 295 300His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp305 310 315 320Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His325 330 335Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys340 345 350Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro355 360 365Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser370 375 380Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser385 390 395 400Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr405 410 415Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp420 425 430Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr435 440445Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro450 455 460
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權(quán)利要求
1.一種被分離出來的A61或p22多肽。
2.第1項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的A61或p22多肽，是哺乳類動物血漿酶原的一個(gè)片段，將它與人體血漿酶原SEQ ID NO4序列進(jìn)行排列對比，其中氨基末端的氨基酸與SEQ ID NO4序列的賴氨酸-78相對應(yīng)，羧基末端的氨基酸與SEQ ID NO4序列的賴氨酸-180，賴氨酸-468或精氨酸-471相對應(yīng)。
3.第2項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的A61或p22多肽，至少有90％的序列和SEQ ID NO4序列是相同的。
4.第3項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的A61或p22多肽，至少包含一個(gè)自由硫氫基。
5.第1項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的A61或p22多肽為一種A61多肽時(shí)，在一個(gè)IC50不超過35nM的情況下，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
6.第1項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的A61或p22多肽為一種p22多肽時(shí)，在一個(gè)IC50不超過14nM的情況下，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
7.一種被分離出來的多肽含有血漿酶氨基末端103、391或394個(gè)連續(xù)氨基酸。
8.第7項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，乃是一種自然生成的多肽。
9.第8項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，至少有90％的序列和人體血漿酶氨基末端SEQ ID NO8序列是相同的。
10.第7項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，其血漿酶乃是一種序列為SEQ ID NO8的人體血漿酶。
11.第7項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，其多肽中至少包含一個(gè)自由硫氫基。
12.第7項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽為一種A61多肽時(shí)，其IC50(達(dá)到50％抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果的濃度)在不超過35nM的情況下，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
13.第7項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽為一種p22多肽時(shí)，其IC50(達(dá)到50％抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果的濃度)在不超過14nM的情況下，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
14.被分離出來的多肽其序列為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3或是一種保守替代變異體的序列。
15.第14項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，乃是一種自然生成的多肽。
16.第15項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，至少有90％的序列和SEQID NO4序列是相同的。
17.第14項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽，其多肽中至少包含一個(gè)自由硫氫基。
18.第14項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽為一種A61多肽時(shí)，在一個(gè)IC50不超過35nM的情況下，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
19.第18項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的被分離出來的多肽為一種p22多肽時(shí)，在一個(gè)IC50不超過14nM的情況下，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
20.一種被分離出來的p22分子，其IC50(達(dá)到50％抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果的濃度)在不超過14nM的情況下，能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，它在循環(huán)二象光譜大約227.5nm處有一道正光帶，大約202.7nm處有一道負(fù)光帶。
21.一種被分離出來的多肽，含有391個(gè)連續(xù)氨基酸，至少有90％的序列和SEQ ID NO1序列是相同的；或是含有394個(gè)連續(xù)氨基酸，至少有90％的序列和SEQID NO2序列是相同的；或是含有103個(gè)連續(xù)氨基酸，至少有90％的序列和SEQ IDNO3序列是相同的。
22.一種包含A61或p22和一種細(xì)胞毒素因子的結(jié)合物。
23.在第22項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的結(jié)合物中，A61或p22是通過交叉連結(jié)物質(zhì)和細(xì)胞毒素相結(jié)合的。
24.在第23項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的結(jié)合物中，細(xì)胞毒素因子為篦麻毒素，脫氧核糖核酸素酶，白喉毒素，假單胞菌外毒素或核糖核酸酵素。
25.第23項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的結(jié)合物，是一種溶合蛋白質(zhì)。
26.一個(gè)核酸包含以下的成分至多包含1173個(gè)核苷的第一種多聚核苷酸序列編碼，此編碼可轉(zhuǎn)譯為血漿酶原，這種多聚核苷酸可轉(zhuǎn)譯為帶有391個(gè)連續(xù)氨基酸，至少有90％的序列和SEQ ID NO1序列相同的第一種多肽的序列；或者至多包含1182個(gè)核苷的第二種多聚核苷酸序列編碼，此編碼可轉(zhuǎn)譯為血漿酶原，這種多聚核苷酸可轉(zhuǎn)譯為帶有394個(gè)連續(xù)氨基酸，至少有90％的序列和SEQ ID NO2序列相同的第二種多肽的序列；或者至多包含309個(gè)核苷的第三種多聚核苷酸序列編碼，此編碼可轉(zhuǎn)譯為血漿酶原，這種多聚核苷酸可轉(zhuǎn)譯為帶有103個(gè)連續(xù)氨基酸，至少有90％的序列和SEQ ID NO3序列相同的第三種多肽的序列。
27.第26項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的核苷酸，可轉(zhuǎn)譯為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列編碼。
28.一個(gè)含有第26項(xiàng)訴求項(xiàng)目中所提核苷酸的載體。
29.一個(gè)含有第28項(xiàng)訴求項(xiàng)目中所提載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
30.第28項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的細(xì)胞是哺乳類動物的細(xì)胞。
31.一個(gè)核酸或其互補(bǔ)核酸，包含309個(gè)核苷，至少有90％的序列和SEQ ID NO5序列是相同的；或者包含1173個(gè)核苷，至少有90％的序列和SEQ ID NO6序列是相同的；或者包含11182個(gè)核苷，至少有90％的序列和SEQ ID NO7是相同的。
32.第31項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的核酸或其互補(bǔ)核酸，它含有SEQ ID NO5，SEQID NO6，或SEQ ID NO7序列。
33.一個(gè)核酸或其互補(bǔ)核酸，包含309個(gè)核苷，并在嚴(yán)格條件下可以與SEQ IDNO5序列進(jìn)行雜交；或包含1173個(gè)核苷，并在嚴(yán)格條件下可以與SEQ ID NO6序列進(jìn)行雜交；或包含1182個(gè)核苷，并在嚴(yán)格條件下可以與SEQ ID NO7序列進(jìn)行雜交。
34.備制A61和/或p22的方法，這些方法包括將血漿酶原與脊椎細(xì)胞相接觸；培育細(xì)胞，用以制造一種含有A61和/或p22的混合物；從混合物中分離出A61和/或p22。
35.第34項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其脊椎動物細(xì)胞是一種哺乳類動物細(xì)胞。
36.第35項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其哺乳類動物細(xì)胞是人體細(xì)胞。
37.第36項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其人體細(xì)胞是HT1080細(xì)胞。
38.第37項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其人體細(xì)胞是海拉細(xì)胞。
39.第34項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其哺乳類動物細(xì)胞是牛毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞。
40.第34項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其血漿酶原中含有谷氨酸-血漿酶原。
41.第34項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其血漿酶原中含有賴氨酸-血漿酶原。
42.第34項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其分離方法包括用親合色譜法進(jìn)行分離。
43.備制A61的方法，這些方法包括將血漿酶原與血漿酶原活化劑相結(jié)合以形成一種混合物，在堿性的溶液中培育混合物，如此便可制成A61；從混合物中分離出A61。
44.第43項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其血漿酶原活化劑是u-血漿酶原活化劑。
45.第43項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其堿性溶液的pH值大約是9。
46.第43項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其培育時(shí)間至少需要2小時(shí)左右。
47.第43項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其分離方法包括用親合色譜法所進(jìn)行的分離。
48.備制p22的方法，這些方法包括將A61與血漿酶以及一種還原劑相結(jié)合，以形成一種混合物；培育混合物，如此便可制成p22；從混合物中分離出p22。
49.第48項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其還原劑是二硫蘇糖醇。
50.第48項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其培育時(shí)間至少需要1小時(shí)。
51.第48項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其培育溫度為37℃。
52.第48項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其分離方法包括用親合色譜法所進(jìn)行的分離。
53.備制p22的方法，這些方法包括將A61與血漿酶以及annexin II四聚物相結(jié)合，以形成一種混合物；培育混合物，如此便可制成p22；從混合物中分離出p22。
54.第53項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其培育時(shí)間至少需要1小時(shí)。
55.第53項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其培育溫度為37℃。
56.第53項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其分離方法包括用親合色譜法所進(jìn)行的分離。
57.對需要接受抗-血管增生治療的哺乳類動物，其治療方法包括給該哺乳類動物使用足以抑制血管增生份量的A61、p22或其混合物。
58.第58項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其哺乳類動物是指人類。
59.第58項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其足以抑制血管增生的A61的份量，是指人體使用的份量。
60.第58項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其足以抑制血管增生的p22的份量，是指人體使用的份量。
61.第57項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其A61或p22是哺乳類動物血漿酶原的一個(gè)片斷，將它與人體血漿酶原SEQ ID NO4序列進(jìn)行排列對比，其中氨基末端的氨基酸與SEQ ID NO4序列的賴氨酸-78相對應(yīng)，羧基末端的氨基酸與SEQ ID NO4序列的賴氨酸-180，賴氨酸-468或精氨酸-471相對應(yīng)。
62.第57項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其A61或p22與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3以及它們的保守替代變異體序列中的任何一組序列，至少有90％的序列相同而且長度是相同的。
63.第62項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其A61或p22的序列為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。
64.第57項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其哺乳類動物所患的疾病包括癌癥，血管瘤，聲帶神經(jīng)瘤，纖維神經(jīng)瘤，沙眼，化膿的肉芽瘤，結(jié)膜的毛細(xì)管擴(kuò)張，牛皮癬，硬皮病，動脈硬化癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克隆氏癥，子宮內(nèi)膜異位癥，胞胖癥，化膿肉芽瘤，潮紅，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，血管增生性青光眼，晶體后組織增生癥，移植排斥，心肌血管增生，新生血管班塊，血友病患者的關(guān)節(jié)病，血管纖維瘤，以及傷口肉芽。
65.第64項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其疾病是指癌癥，A61、p22或其混合物，乃是與含有氨甲葉酸(methotrexate)，米托蒽醌(mitozantrone)，紫衫醇(paclitaxol)，長春堿(vinblastinc)，5-氟脲嘧啶(5-fluoruracil)，順氯氨鉑(cisplatin)，甲酰四氫葉酸(leucovorin)，環(huán)磷酰西安(cyclophosphamide)以及溶瘤病毒(oncolytic virus)在內(nèi)的一種抗癌劑一起使用。
66.第65項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其溶瘤病毒為一種呼腸孤病毒(reovirus)，皰疹病毒(herpes virus)或一種腺病毒(adenovirus)。
67.一種抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的方法，該方法包括給予細(xì)胞足以抗-增殖的A61，p22或其混合物的份量。
68.第67項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種哺乳類動物的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
69.第68項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其哺乳類動物的血管內(nèi)皮細(xì)胞是指人類的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
70.第67項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其A61或p22是哺乳類動物血漿酶原的一個(gè)片斷，將它與人體血漿酶原SEQ ID NO4序列進(jìn)行對比，其中氨基末端的氨基酸與SEQ ID NO4序列的賴氨酸-78相對應(yīng)，羧基末端的氨基酸與SEQ ID NO4序列的賴氨酸-180，賴氨酸-468或精氨酸-471相對應(yīng)。
71.第67項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其A61或p22與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3以及它們的保守替代變異體序列當(dāng)中的任何一組序列，至少有90％的序列相同而且長度是相同的。
72.第71項(xiàng)訴求項(xiàng)目中提及的方法，其A61或p22的序列為SEQ ID NO1，SEQID NO2或SEQ ID NO3。
全文摘要
此處公告的專利是具有抗－血管增生作用的A
文檔編號C12N9/68GK1498223SQ01819642
公開日2004年5月19日 申請日期2001年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月28日
發(fā)明者大衛(wèi)·M·崴斯曼, 大衛(wèi) M 崴斯曼, 卡薩姆, 吉薩·卡薩姆, M·翁 申請人:大衛(wèi)·M·崴斯曼, 大衛(wèi) M 崴斯曼, 吉薩·卡薩姆, M·翁