人pkm2抗原決定簇多肽、抗體及其在檢測(cè)試劑盒上的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明為一種人PKM2抗原決定簇多肽、抗體及其在診斷試劑盒上的應(yīng)用。本發(fā)明的PKM2抗原決定簇多肽,為正文陳述的多肽片段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本發(fā)明的PKM2抗體,是由本發(fā)明的PKM2抗原決定簇多肽制備而成。本發(fā)明的PKM2抗體可應(yīng)用于制備PKM2體外診斷試劑盒。
【專利說(shuō)明】
人PKM2抗原決定簇多肽、抗體及其在檢測(cè)試劑盒上的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及人PKM2抗原決定簇多肽、抗體及其在 檢測(cè)試劑盒上的應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸岵a(chǎn)生一個(gè)ATP分子,是葡萄糖 形成丙酮酸即糖酵解代謝最后一步反應(yīng)的催化剎,也是糖酵解的限速酶之一。ATP、長(zhǎng)鏈脂 肪酸、乙酰-CoA、丙氨酸都對(duì)該酶有抑制作用;而果糖-1,6-二磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸對(duì) 該酶與都有激活作用。
[0005] 丙酮酸激酶有四種同工酶--Ml、M2、L和R型,在正常細(xì)胞中,它們主要以四聚體 形式存在。丙酮酸激酶的表達(dá)有組織特異性,主要取決于細(xì)胞和組織的代謝情況。Ml型丙酮 酸激酶表達(dá)于能量消耗快速耗氧量大的組織,如肌肉和腦;L型丙酮酸激酶主要表達(dá)在糖異 生旺盛的組織,如肝臟和腎臟;R型丙酮酸激酶主要在紅細(xì)胞中表達(dá);而M2型丙酮酸激酶主 要在干細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等快速增殖的細(xì)胞中特異表達(dá)。丙酮酸激酶L型和R型由相同的基因 編碼,但它們的表達(dá)由不同的啟動(dòng)子控制。丙酮酸激酶Ml型和M2型則是Μ基因轉(zhuǎn)錄的同一 mRNA的不同剪切產(chǎn)物,它們之間只有21個(gè)氨基酸的差別。
[0006] 研究發(fā)現(xiàn):腫瘤的發(fā)生往往伴隨著腫瘤部位丙酮酸激酶同工酶類別的轉(zhuǎn)換。因?yàn)?相比于ATP的合成,腫瘤細(xì)胞生物大分子的合成更加旺盛;為維持其自身的快速增殖,腫瘤 細(xì)胞需要大量的糖代謝中間產(chǎn)物,比如3-磷酸甘油酸來(lái)用于氨基酸、磷脂的合成。因此,月中 瘤發(fā)生往往表現(xiàn)為其來(lái)源的正常組織特異性丙酮酸激酶的變化,比如腦組織中PKM1,肝臟 中PKL消失,而PKM2大量表達(dá)。
[0007] 在正常細(xì)胞中,PKM2主要以四聚體形式存在,然而在腫瘤細(xì)胞和組織中PKM2主要 以二聚體形式存在。這兩種存在形式的區(qū)別在于:四聚體形式下的PKM2與其底物磷酸烯醇 式丙酮酸(PEP)有很高的親和力,而二聚體形式下PKM2與PEP親和力卻很低,這意味著四聚 體的PKM2有很高的活性而PKM2二聚體則幾乎無(wú)活性。腫瘤中主要以二聚體形式存在導(dǎo)致了 腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖代謝中間體的高濃度,對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要的作用。腫瘤細(xì)胞內(nèi)PKM2 四聚體與二聚體的比例受細(xì)胞內(nèi)1,6_二磷酸果糖濃度的調(diào)節(jié)而上下波動(dòng)。1,6_二磷酸果糖 是糖代謝的中間產(chǎn)物,由于腫瘤細(xì)胞PKM2的高度二聚體化,1,6-二磷酸果糖等中間產(chǎn)物無(wú) 法進(jìn)一步往下游產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致了 1,6_二磷酸果糖的高濃度。而當(dāng)1,6_二磷酸果糖濃度高 到一定值時(shí),抑制型二聚體將結(jié)合1,6_二磷酸果糖導(dǎo)致構(gòu)形轉(zhuǎn)變,重新聚合形成四聚體,使 PEP催化生成丙酮酸,進(jìn)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)供給能量。當(dāng)1,6_二磷酸果糖濃度下降到最低值 時(shí),聚合的四聚體又將轉(zhuǎn)化變成二聚體。腫瘤細(xì)胞PKM2的這種激活型四聚體和抑制型二聚 體的相互轉(zhuǎn)化在腫瘤適應(yīng)環(huán)境不斷改變的氧含量和營(yíng)養(yǎng)條件中起著至關(guān)重要的作用,強(qiáng)大 的糖代謝能力和PKM2的存在使腫瘤細(xì)胞能在低氧環(huán)境下生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)移。
[0008] 多項(xiàng)研究已證實(shí),腫瘤發(fā)生過(guò)程中PKM2通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和 轉(zhuǎn)移。用肌肉組織特異的Ml型丙酸激酶取代M2型丙酮酸激酶,降低了胖瘤細(xì)胞糖酵解代謝 的速率,減少了小鼠成瘤的幾率和瘤塊的體積;用抑制劑抑制M2型丙酮酸激酶的活性,也能 降低糖酵解代謝的速率,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),甚至殺傷種瘤細(xì)胞。
[0009] 在腫瘤發(fā)生過(guò)程中,由于腫瘤細(xì)胞的壞死和轉(zhuǎn)移,腫瘤細(xì)胞中的PKM2能釋放進(jìn)入 血液、尿液中,而消化道腫瘤的PKM2亦能隨著腫瘤患者的糞便排出。此外,由于在正常狀況 下PKM2-般很難被檢測(cè)到,只有在發(fā)生腫瘤時(shí)PKM2才能從壞死的腫瘤細(xì)胞中釋放入血、尿, 因此檢測(cè)PKM2的量還可評(píng)估化療效果的好壞以及腫瘤預(yù)后的判斷。因此,檢測(cè)PKM2可以用 于腫瘤診斷、抗腫瘤療效評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷。
[0010]檢測(cè)PKM2較理想的方法即是免疫測(cè)定,但前提是必須制備針對(duì)PKM2的特異性抗 體,而M2型丙酮酸激酶與其他同工酶差別較小。制備特異識(shí)別PKM2而不結(jié)合其他丙酮酸激 酶同工酶的抗體就成為研究的關(guān)鍵。
[0011]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)離體組織或體液或尿液PKM2水平,提供具有親 水、抗原性強(qiáng)、易于合成、特異性強(qiáng)的免疫源性的人PKM2抗原決定簇多肽,其為如下兩種多 肽片段之一, (1) Leu-Ala-Pr〇-Ile-Thr-Ser-Asp-Pr〇-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala(SEQ ID NO·1),即 LAPITSDPTEATAVGA; (2) Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu-Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys(SEQ ID NO.2),即ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK〇
[0013] 采用的優(yōu)化措施包括: 上述 1^11-厶1&-?1'〇-116-1111-361-厶8卩-?1'〇-1'111-6111-厶1&-1'111-厶1&-\^1-617-厶1&的1^端 或C端還具有Tyr。
[0014] 上述 Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu- 4811-116-1^11-1'印-1^11-厶8口-171-1^8的1^端或〇端還具有丁5^〇
[0015]本發(fā)明的多肽片段SEQ ID NO. 1是人PKM2蛋白C端的一段16個(gè)氨基酸的殘基,在該 肽段的N端、C端分別加上Tyr則組成多肽片段(3)、多肽片段(4),如下: (3) Y-LAPITSDPTEATAVGA (4) LAPITSDPTEATAVGA-Y 多肽片段SEQ ID N0.1在N端或C端加 Tyr是為了通過(guò)BDB(雙偶氮聯(lián)苯胺二氯化物扮8_ 虹32〇1:丨26此6112丨(1;[116(1;[011101^(16)交聯(lián)到血蘭蛋白(1(1^)上作為抗原制備抗體,171'加在~ 端產(chǎn)生抗多肽C端抗體,Tyr加在C端,產(chǎn)生抗多肽N端抗體。
[0016]本發(fā)明的多肽片段SEQ ID N0.2是人PKM2蛋白N端的一段25個(gè)氨基酸殘基,在該肽 段的N端、C端分別加上Tyr則組成多肽片段(5)、多肽片段(6),如下: (5) Y-ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK (6) ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK-Y 多肽片段SEQ ID N0.2在N端或C端加 Tyr是為了通過(guò)BDB(Bis_diazotizedbenzidine dichloride)交聯(lián)到血蘭蛋白(KLH)上作為抗原制備抗體,Tyr加在N端產(chǎn)生抗多肽C端抗 體,Tyr加在C端,產(chǎn)生抗多肽N端抗體。
[0017] 本發(fā)明的還提供一種特異性強(qiáng)的人PKM2抗體,由SEQIDN0.1或SEQIDN0.2任意 一種多肽片段制備而成的多克隆抗體或單克隆抗體,即提供能與人PKM2抗原決定簇多肽特 異性結(jié)合的抗體。
[0018] 本發(fā)明的還提供一種人PKM2抗體在制備人PKM2體外檢測(cè)診斷試劑盒上的應(yīng)用。 [0019]進(jìn)一步的優(yōu)化措施包括:上述劑盒采用SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0.2制備的任意一 種人PKM2抗體作為包被抗體。
[0020] 上述試劑盒還包括結(jié)合抗體,結(jié)合抗體為另一種人PKM2抗體,與包被抗體的多肽 來(lái)源不同。
[0021] 上述試劑盒還包括酶標(biāo)記的二抗。
[0022] 上述兩種多肽片段具有如下功能: ①具有免疫原性,且具有親水、抗原性強(qiáng)、易于合成。
[0023] ②與載體蛋白連接后作為抗原可刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體。
[0024] ③用這兩種多肽片段制備的抗體可特異性的與人PKM2結(jié)合。
[0025]
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027] 實(shí)施例:將本發(fā)明的任意一種PKM2抗原決定簇多肽(SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2) 與載體蛋白連接后作為抗原免疫動(dòng)物即可制備本發(fā)明的特異性的單克隆抗體或多克隆抗 體。
[0028] 如前所述依次制得PKM2抗原決定簇多肽片段和其特異性抗體后,即可將該抗體用 于制備人PKM2體外診斷試劑盒。將采用本發(fā)明的抗體制備的人PKM2體外診斷試劑盒進(jìn)行臨 床研究,在137例結(jié)直腸癌患者中,123例血清PKM2超過(guò)10U/ml,而正常受試者中對(duì)照平均 值為2 U/ml,二者比較p<0.001。若以2.5U/ml為劃定標(biāo)準(zhǔn),血清PKM2輔助診斷結(jié)直腸癌患 者的特異性為極高,靈敏度90%~95%。同時(shí),通過(guò)對(duì)24例結(jié)直腸癌患者追蹤研究發(fā)現(xiàn):血清 PKM2水平與直腸癌患者嚴(yán)重程度呈正相關(guān);血清PKM2水平高,患者預(yù)后效果較差。說(shuō)明血清 PKM2作為一種輔助診斷直腸癌的生化標(biāo)記物是切實(shí)可行性,也揭示了血清PKM2水平在出血 后判斷直腸癌的程度及患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。同時(shí)說(shuō)明本發(fā)明的多肽片段抗原 性強(qiáng),制備的抗體特異性強(qiáng)。
[0029] 將PKM2抗原決定簇多肽片段與載體蛋白連接后作為抗原免疫動(dòng)物制備特異性的 單克隆抗體。
[0030] ①抗原的制備:用碳二亞胺法將PKM2多肽片段(3)或(4)與載體血蘭蛋白(KLH)聯(lián) 接制備成PKM2抗原(3)或(4)。
[0031] ②免疫動(dòng)物:取上述制備的抗原與弗氏完全佐劑(基礎(chǔ)免疫)或弗氏完不全佐劑 (加強(qiáng)免疫)等體積混合,充分乳化后免疫Balb/c小鼠,腹腔注射,每次劑量為200ug/ml,免 疫4~5次,末次免疫后的第四天取尾靜脈血測(cè)定抗體效價(jià)。
[0032]③測(cè)定抗體效價(jià):用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià),結(jié)果顯示抗體效價(jià)達(dá)到1:30000以 上。
[0033]④雜交瘤細(xì)胞篩選:免疫動(dòng)物抗體效價(jià)符合要求后,取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤 細(xì)胞按常規(guī)方法用50%PEG(分子量4000)介導(dǎo)進(jìn)行融合,并用HAT條件培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。融合 后放入C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)9~11天后,孔內(nèi)出現(xiàn)較大的細(xì)胞克隆。11天開始用間接 ELISA進(jìn)行篩選。對(duì)陽(yáng)性的孔利用有限稀釋法進(jìn)行4次克隆化培養(yǎng),之后擴(kuò)增細(xì)胞、凍存、制 備腹水。
[0034]⑤腹水制備:將Balb/c小鼠用降植烷0.5ml/只處理,一周后腹腔接種雜交瘤細(xì)胞2 Χ?ο6個(gè)/只,十天后收集腹水。
[0035]⑥測(cè)定單克隆抗體效價(jià):用間接ELISA測(cè)定PKM2抗原制備的單克隆抗體效價(jià),結(jié)果 顯示單抗的效價(jià)達(dá)到1:30000以上。
[0036]將PKM2抗原決定簇多肽片段與載體蛋白連接后作為抗原免疫動(dòng)物制備特異性的 多克隆抗體。
[0037]①抗原的制備:用碳二亞胺法將PKM2多肽片段(5)或(6)與載體血蘭蛋白(KLH)聯(lián) 接制備成PKM2抗原(5)或(6)。
[0038]②免疫動(dòng)物:取上述制備的抗原與弗氏完全佐劑(基礎(chǔ)免疫)或弗氏完不全佐劑 (加強(qiáng)免疫)等體積混合,充分乳化后免疫新西蘭大白兔背部,每次劑量為200ug/ml,分20點(diǎn) 皮內(nèi)注射,免疫4~5次,末次免疫后的第四天取耳血測(cè)定抗體效價(jià)。
[0039]③測(cè)定抗體效價(jià):用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià),結(jié)果顯示抗體效價(jià)達(dá)到1:30000以 上。
[0040]④取血及分離血清:頸動(dòng)脈插管取血,分離血清。
[0041] ⑤分離純化抗體:硫酸銨沉淀后,再經(jīng)Protein G親和純化。
[0042]⑥抗體分裝后凍干,低溫保存。
[0043] 人PKM2單克隆抗體和多克隆抗體的特異性鑒定 以ELISA進(jìn)行檢測(cè)。分別以人PKM2蛋白、BSA、S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE為 檢測(cè)抗原包被EL ISA板,通過(guò)EL ISA分別檢測(cè)所制備的PKM2單克隆抗體或多克隆抗體與人 PKM2蛋白的特異性反應(yīng),以正常Balb/c小鼠血清或新西蘭大白兔血清作陰性對(duì)照,PBS液作 空白對(duì)照。結(jié)果:所有PKM2單克隆抗體和多克隆抗體分別只與PKM2反應(yīng)為陽(yáng)性,而與其他蛋 白反應(yīng)為陰性,說(shuō)明本發(fā)明所有PKM2單克隆抗體和多克隆抗體具有特異性。
[0044] 利用人PKM2單克隆和多克隆抗體制備PKM2體外診斷試劑盒 在本例實(shí)施中,將利用PKM2抗原決定簇多肽(1)制備的單克隆抗體(1)作為本試劑盒中 的包被抗體;將利用PKM2抗原決定簇多肽(2)制備的多克隆抗體(2)作為本試劑盒中的結(jié)合 抗體; PKM2體外診斷試劑盒的制備和操作如下: ①各種緩沖液及試劑的配制 A包被緩沖液:0.05M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液 Na2C03:16.0克 NaHC03:29·0克 NaCl:10克 蒸餾水溶至1000ml B樣品稀釋液/洗滌緩沖液:pH7 · 2的10 X roS-Tween20 Na2HP〇4-12H2〇:58 克 KH2P〇4:4克 NaCl:100克 KC1:4克 蒸餾水溶至l〇〇〇ml 加 Tween20:20ml C酶標(biāo)記物稀釋液: 10 X PBS-Tween20:10ml 小牛血清(FCS): 20ml 蒸餾水溶至l〇〇〇ml 酶穩(wěn)定劑:1克 生物防腐劑:1ml D顯色劑甲: 梓檬酸:35.5克 過(guò)氧化脲:10克 蒸餾水溶至l〇〇〇ml 加 Tween20:10ml E顯色劑乙: 檸檬酸:120克 EDTA-2Na:l克 TMB-2HC1:2克 蒸餾水溶至l〇〇〇ml F終止液:2M H2SO4 濃硫酸(95 ~98%) :22.2ml 蒸餾水:177.3ml 配時(shí)將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中,邊加邊搖勻。
[0045] ②預(yù)包被板的制備: 將PKM2單克隆抗體(1)溶于pH=9.6的0.05M的碳酸鹽緩沖液中,單抗?jié)舛葹?ug/ml,制 成預(yù)包被液,在酶標(biāo)板上每孔加入l〇〇ul,置4°C放置18~24小時(shí),取出,甩掉包被液,洗滌, 經(jīng)BSA室溫封閉1小時(shí)、過(guò)夜干燥后裝入鋁鉑袋中抽真空密封,并置于4°C保存。
[0046] ③結(jié)合抗體(即PKM2抗原決定簇多肽片段(2)制備的多克隆抗體)和辣根過(guò)氧化 物酶標(biāo)羊抗兔二抗?jié)舛却_定:結(jié)合抗體和酶標(biāo)二抗?jié)舛扔梅疥嚨味▽?shí)驗(yàn)確定。
[0047]④試劑盒的組成: A:預(yù)包被板:48/96孔 B:人PKM2標(biāo)準(zhǔn)品:7 X 1 · 0ml (濃度分別為:50U/ml、25U/ml、10U/ml、5U/ml、2 · 5U/ml、1U/ ml、0.5U/ml) C: PKM2 結(jié)合抗體:1 X 1 · 0ml (濃度:0 · 5mg/ml) D:酶標(biāo)二抗(HRP-IgG): 1 X 10ml (經(jīng)1:5000稀釋) E:濃縮洗滌液(10 X PBS-Tween20): 1 X 100ml F:樣品稀釋液:1 X 10ml G:顯色劑甲:lX6.0ml Η:顯色劑乙:lX6.0ml I:終止液:lX6.0ml ⑤試劑盒的操作步驟: 在預(yù)包被板的各孔中分別加入待檢血樣標(biāo)本以及標(biāo)準(zhǔn)品l〇〇ul/孔,均為雙孔,同時(shí)設(shè) 空白孔,37°C孵育60分鐘,用X 1洗滌液(PBS-TWeen20)洗滌5次,拍干。在各孔內(nèi)加入結(jié)合 抗體(g卩PKM2抗原決定簇多肽片段(1)多克隆抗體)100ul/孔,37°C孵育30分鐘,用XI洗 滌液(PBS-T Ween20)洗滌5次,拍干。再在各孔內(nèi)加入標(biāo)記有辣根過(guò)氧化酶的羊抗兔IgG抗 體100ul/孔,37°C孵育30分鐘,用XI洗滌液(PBS-T Ween20)洗滌5次,拍干。加入顯色劑 甲、乙液每孔各50ul,混勻,37 °C孵育15分鐘。加終止液50 ul/孔終止反應(yīng),用酶聯(lián)檢測(cè)儀 測(cè)定各孔的450nm處的吸光度。
[0048]⑥結(jié)果判定: 0D比值計(jì)算:待測(cè)標(biāo)本孔的0D值-空白孔的0D值 表一:標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的平均吸光度(0D )值
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的平均吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.986 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所檢測(cè)的樣本中的PKM2濃度結(jié)果。
[0049] 試劑盒可以特異性檢測(cè)出人PKM2蛋白,而不識(shí)別人PKM1蛋白和人PKML蛋白。
[0050] 血清中137例出血性腦卒中患者病人中,123例血清PKM2超過(guò)10U/ml,而正常受 試者中對(duì)照平均值為2 U/ml,二者比較p<0.001。若以2.5U/ml為劃定標(biāo)準(zhǔn),血清PKM2診斷 結(jié)直腸癌患者的特異性為98%,靈敏度90%~95%。
[0051] 盡管已結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明,然其并非用以限定本發(fā)明,任何本領(lǐng)域 技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下,能夠?qū)υ谶@里列出的主題實(shí)施各種改 變、同等物的置換和修改,因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所提出的權(quán)利要求限定的范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人PKM2抗原決定簇多肽,其特征是:為如下兩種多肽片段之一, DLeu-Ala-Pro-IIe-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala; 2)Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu- Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys 〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人PKM2抗原決定簇多肽,其特征是:所述的!^!!^]^-?!^-]:]^-111!-361-厶8卩-?1'〇-1'111-6111-厶1&-1'111-厶1&-\^1-617-厶1&的1^端或〇端還具有丁5^ 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人PKM2抗原決定簇多肽,其特征是:所述的4]^-1111-1^11-1^8-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu-Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Ly s的N端或C端還具有Tyr 〇4. 人PKM2抗體,其特征是:由權(quán)利要求1所述的任意一種多肽片段制備而成的多克隆抗 體或單克隆抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4制備的人PKM2抗體在制備人PKM2體外檢測(cè)診斷試劑盒上的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5制備的人PKM2抗體在制備人PKM2體外檢測(cè)診斷試劑盒上的應(yīng)用,其 特征是:所述試劑盒采用權(quán)利要求4所述的任意一種人PKM2抗體作為包被抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6制備的人PKM2抗體在制備人PKM2體外檢測(cè)診斷試劑盒上的應(yīng)用,其 特征是:所述的試劑盒還包括結(jié)合抗體,結(jié)合抗體為權(quán)利要求4所述的另一種人PKM2抗體, 與包被抗體的多肽來(lái)源不同。8. 根據(jù)權(quán)利要求7制備的人PKM2抗體在制備人PKM2體外檢測(cè)診斷試劑盒上的應(yīng)用,其 特征是:所述的試劑盒還包括酶標(biāo)記的二抗。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK105886483SQ201610120995
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年3月3日
【發(fā)明人】陶新博, 張守濤, 郭亞楠
【申請(qǐng)人】浙江聚康生物工程有限公司