專利名稱：具有抗炎活性和抗動脈粥樣硬化活性的藿香提取物以及含有從所述提取物中分離和提純 ...的制作方法
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本發(fā)明涉及一種組合物，它含有藿香和通過分離提純方法從藿香中獲得的椴素(tilianin)，用于抗炎和抗動脈粥樣硬化；而且更特別地涉及藿香提取物和通過分離提純方法由其中獲得的椴素，它們不僅可有效地預防和治療炎性疾病，而且可有效地預防和治療與炎性反應相關的動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病，這是因為它們在抑制一種炎性反應因子-補體系統(tǒng)的活性、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達、一氧化氮(NO)的產(chǎn)生方面具有良好的作用。它們還可顯著地減輕炎性反應所致動脈粥樣硬化的發(fā)展。
本發(fā)明的背景當組織或細胞出現(xiàn)損害，或者人體被外來物質(例如細菌、霉菌、病毒、各種引起變態(tài)反應的物質)引起感染時，它通常出現(xiàn)炎性反應，表現(xiàn)為一系列復雜的生理反應，諸如酶的活化、炎癥介導物質的分泌、體液的滲出、細胞移動和組織損傷，它們與局部血管、體液中的所有各種炎癥介導因子和免疫細胞有關，而且還表現(xiàn)出外在癥狀，諸如紅斑、水腫和發(fā)熱。正常情況下，炎性反應除去外來感染源，使損害組織再生，并且恢復機體功能，但是，當抗原未被除去，或者因為內(nèi)在物質，炎性反應過度或連續(xù)發(fā)生時，炎性反應則變成疾病(過敏性疾病、慢性炎癥)的主要病理癥狀，而且成為輸血、藥物應用和器官移植等治療過程中的主要障礙。
涉及本發(fā)明相關的炎性反應的因素的作用描述如下。
補體系統(tǒng)是體液的一種主要因子，它在免疫反應的早期激活并增強炎癥反應。補體系統(tǒng)激活過程中產(chǎn)生的活性蛋白(過敏毒素、C3a，C4a，C5a)和綴合蛋白質(膜攻擊復合體(MAC))與各種炎性疾病(風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合征、阿耳茨海默氏病)相關，而且經(jīng)常成為器官移植中超急性排斥反應的直接原因。
ICAM-1是內(nèi)皮細胞表面上表達的細胞粘附分子組中的一種典型的蛋白質。正常情況下，它表達的水平非常低，但是當它受到諸如TNF-a、干擾素-γ和白介素-1β等的細胞因子的炎癥介導分子刺激時，其表達水平快速提高，以在粘附血液中移動的諸如單核細胞或淋巴細胞的炎性細胞和將炎性細胞移動至炎性組織中發(fā)揮作用。因此，在早期當炎性細胞移動并聚集在炎性組織上時，ICAM-1的表達在炎癥的增強中起重要的作用。
VCAM-1是內(nèi)皮細胞表面上表達的細胞粘附分子組中的一種。當在與人動脈粥樣硬化的進程相似的動物模型(載脂蛋白E缺陷鼠，ApoE-/-)中造成動脈粥樣硬化損傷時，VCAM-1在血管內(nèi)皮細胞中的表達快速增長。而且，VCAM-1表達的增長直接與血漿中膽固醇-低密度脂蛋白(膽固醇-LDL)的濃度相關。因此，當動脈粥樣硬化損害引起時，血管內(nèi)皮細胞中表達的VCAM-1粘附血液中的單核細胞和淋巴細胞，并且那些炎癥細胞聚集在血管內(nèi)皮細胞下，因此在動脈粥樣硬化損害的發(fā)展中起重要的作用。
L-精氨酸被一氧化氮合酶(NOS)氧化后，NO與L-瓜氨酸一起產(chǎn)生。NO是一種介導分子，它與血管減壓、血小板的粘附和凝結、神經(jīng)傳遞、消化器官的運動有關，并通過影響血管系統(tǒng)與陰莖的勃起相關。而且NO防護微生物感染，不僅是通過在炎性細胞中產(chǎn)生，而且還通過在非炎性細胞中產(chǎn)生而獲得。同時，在產(chǎn)生NO中參與的一種NOS-誘導-NOS(iNOS)不依賴鈣和鈣調(diào)蛋白，并通過脂多糖(LPS)和細胞因子(IFN-γ，TNF等)的刺激而表達。因為環(huán)加氧酶-2(COX-2)也是通過這種刺激激活從而產(chǎn)生炎性介導分子、前列腺素，所以COX-2和iNOS的表達密切相關，因此所產(chǎn)生的NO也影響COX-2的表達。iNOS的表達選擇性地誘導巨噬細胞中NO的產(chǎn)生，因此誘導其它炎性反應的激活。所以，NO是炎性疾病中一種重要的因子。
動脈粥樣硬化是由遺傳條件引起的動脈變硬的一種疾病，這些條件與脂質代謝以及諸如飲食習慣、吸煙和缺乏鍛煉等環(huán)境條件相關，而且它可導致循環(huán)系統(tǒng)的疾病，諸如心臟病和腦血管疾病。動脈粥樣硬化早期發(fā)病的一種假說是“反應-損傷”假說，它指由于遺傳改變、過氧化物、高血壓、糖尿病、血漿高半胱氨酸濃度升高和微生物感染等因素，導致血管內(nèi)皮細胞不能保持正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而發(fā)生機能障礙。當血管內(nèi)皮細胞發(fā)生機能障礙時，細胞粘附分子的表達增高，細胞傳遞增強，然后免疫細胞、血小板和脂肪的粘附以及向組織的傳遞開始增強。炎性反應，諸如炎癥介導因子和免疫細胞的生長因子的分泌導致動脈粥樣硬化損害的發(fā)生。在這里，由于氧化作用、糖類結合、蓄積和糖蛋白結合等因素，導致血液中低密度脂蛋白(LDL)變成修飾LDL(MLDL)，它引起血管內(nèi)皮細胞和平滑肌的刺激和破壞。因此，當內(nèi)皮細胞上VCAM-1的表達和炎癥細胞的炎癥介導因子的釋放升高時，LDL溢出并蓄積至內(nèi)皮細胞下，蓄積的LDL和氧化的MLDL重復誘導諸如巨噬細胞、T-淋巴細胞等免疫細胞流入和激活的過程，結果損害處的炎癥增強。此后，流入至這個損害處的巨噬細胞、淋巴細胞釋放的水解酶、炎癥介導因子和生長因子使此斑點發(fā)生壞死。通過單核細胞流入至壞死灶的重復過程，平滑肌的運動和分化，以及纖維組織的形成，損害組織生長為一種纖維組織復合結構，它在壞死組織中覆蓋著纖維物質，核心部分是MLDL。從生長的損害組織中產(chǎn)生血栓，動脈變硬，并且發(fā)生循環(huán)系統(tǒng)疾病，諸如血流障礙物。因此，在血液中諸如膽固醇和LDL等的脂肪量升高時，發(fā)生動脈粥樣硬化，但僅僅是脂肪蓄積時，它并不發(fā)生。相反，動脈粥樣硬化是一種典型的炎性反應，其中內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞與脂肪涌入并蓄積在動脈內(nèi)皮細胞下，此后損害發(fā)展，以及最后細胞壞死等的一系列過程相關。
藿香是一種多年生植物，它屬于唇形科，分布在東北亞，包括朝鮮、日本、中國等地。在朝鮮，它主要野生在南部地區(qū)或在某些地區(qū)栽培。在中藥中，這種植物的地上部分稱為廣藿香(藿香的別名)，一本中國書“Myoneubyolok”說到“它解除機體的惡氣和外界疫毒，并治療假霍亂，即治療嘔吐和腸痙攣”。在普通人中，其葉子用作各種湯中的調(diào)料，諸如泥鰍湯，花用作蜜源。
對藿香成分的研究報告到具有多種揮發(fā)油、倍半萜、二萜、三萜、類黃酮、phenylpropanoid和類胡蘿卜素。對藿香生理活性的研究報告到提取物的抗菌活性[Phytother.Res.14(3)，210-212，2000；J.Food Sci.Nutr.4(2)，97-102，1999]，抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(5)，520-523，1999；U.S.Pat.No.5776462]和對單胺氧化酶的抑制活性[The Pharmaceutical Societyof Korea 42(6)，634-638，1998]。另外還報告有揮發(fā)油的抗菌活性[中國藥學雜志35(1)，9-11，2000；Weishengwuxue Zazhi 18(4)，1-4，16，1998]和驅蚊活性[中國專利No.1044205]，類胡蘿卜素的抗癌活性[The Korean Society of Pharmacognosy 30(4)，404-408，1999]，二萜的抗癌活性[J.Nat.Prod.58(11)1718-1821，1995]和抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(1)，75-77，1999]，phenylpropanoid的抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(5)，520-523，1999]，抗氧化活性[The Korean Society of AgriculturalChemistry and Biotechnology 42(3)，262-266，1999]和抗補體活性[The Korean Society of Pharmacognosy 27(1)，20-25，1996；The Korean Society of Agricultural Chemistry andBiotechnology 39(2)，147-152，1996]。但是無論是國內(nèi)還是國外，尚未報告藿香提取物的抗炎和抗動脈粥樣硬化活性。
另一方面，已經(jīng)報告椴素存在于各種植物中，它是一種類黃酮金合歡素的葡萄糖-糖苷化合物。
對椴素生理活性的研究報告有抗氧化活性[J.Food Sci.Nutr.4(1999)，221-225；Indian J.Chem.，Sect.BOrg.Chem.Incl.Med.Chem 36B(1997)，1201-1203]和對黃嘌呤氧化酶的無任何抑制活性[J.Nat.Prod.51(1988)，345-348]。但是，無論是國內(nèi)還是國外尚未有關于椴素抗炎活性和抗動脈粥樣硬化活性的任何報告。
本發(fā)明的總結因此，本發(fā)明人研究了用于食品和藥物目的的天然原料藥物的抗炎活性和抗動脈粥樣硬化活性，以選擇不妨礙正常脂質代謝，并且可控制抗炎活性引起的動脈粥樣硬化損害進展的天然藥物。結果，本發(fā)明成功地發(fā)現(xiàn)了藿香提取物具有對各種炎性因子的抑制活性和良好的抗動脈粥樣硬化活性，它可顯著地減輕與炎性反應相關的動脈粥樣硬化的損害。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種藿香提取物和通過分離-提純從其中獲得的椴素，因為它們具有抗炎活性和抗動脈粥樣硬化活性，所以它們作為藥物和食品添加劑可有效地預防并治療炎性疾病、與炎性反應相關的動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病。
附圖的簡要描述附

圖1顯示椴素對內(nèi)皮分子誘導的劑量依賴效應。用10或100μM椴素將HUVECs預孵育2小時，并用TNF-a(10ng/ml)刺激16小時，對VCAM-1或同位型對照染色，用流式細胞術進行分析。
附圖2顯示藿香提取物對用膽固醇飲食喂養(yǎng)8周的Ldlr-/-鼠油紅O染色的主動脈瓣損傷區(qū)域中動脈粥樣硬化損傷的影響。心臟主動脈瓣的典型截面圖(×100)，(A)選自對照組，(B)選自1％藿香提取物飲食組。
附圖3顯示使用鼠巨噬細胞-2的單克隆抗體(MOMA-2，SerotecInc.NC.USA)后，膽固醇飲食喂養(yǎng)8周的Ldlr-/-鼠的主動脈瓣損傷處巨噬細胞蓄積的免疫化學染色(×100)，(A)為對照組，(B)為1％藿香提取物飲食組。
附圖4顯示椴素對膽固醇飲食喂養(yǎng)8周的Ldlr-/-鼠的主動脈瓣損傷處的動脈粥樣硬化損傷的影響。心臟主動脈瓣的典型截面圖(×40)，(A)選自對照組，(B)選自1％藿香提取物飲食組。
本發(fā)明詳細描述本發(fā)明涉及一個具有抗炎和抗動脈粥樣硬化活性的組合物，此組合物中包含藿香提取物和通過分離-提純從其提取物中獲得的椴素作為活性成分。
下面對本發(fā)明進行更詳細地描述。
按照本發(fā)明，藿香提取物或通過分離-提純獲得的椴素具有炎性因子的抑制活性，即抗補體活性，對ICAM-1和VCAM-1表達的抑制活性，以及對NO產(chǎn)生的抑制活性，這樣，由于其對炎性反應相關的動脈粥樣硬化損傷良好的抑制活性，所以它不僅對炎癥疾病，而且對動脈粥樣硬化均可進行有效地預防和治療。
因此，本發(fā)明包括藥物或食品添加劑，其含有的藿香提取物和通過分離-提純獲得的椴素作為活性成分。
下面更詳細地描述本發(fā)明的藿香提取物和椴素的分離-提純過程。
干燥整個藿香植物，用低級醇提取，然后濃縮，獲得藿香的提取物。此提取物的分餾收率約為干燥藿香重量的10-20％。因此，將所得藿香提取物懸浮在水中，充分搖動后用相同體積的正己烷分餾，并按此順序加入氯仿和低級醇分餾，然后獲得通過溶劑分餾的餾分。此處，低級醇為1到6個碳原子的烷基醇，需要的是正丁醇。通過溶劑分餾后進行諸如硅膠柱色譜法和高速液相色譜法的常規(guī)方法。或者可應用常用的分離-提純方法，諸如再結晶。
在如上述所述獲得的藿香提取物和通過分離-提純獲得的椴素中分別檢測角叉菜膠誘導的急性炎癥小鼠中對補體系統(tǒng)的抗補體活性，對ICAM-1表達的抑制活性，對VCAM-1表達的抑制活性和對NO產(chǎn)生的抑制活性，以及抗炎活性和動脈粥樣硬化損傷的抑制活性。
藿香提取物具有抗補體活性，它可強烈地抑制人抗免疫復合物血清的補體活性。而且，它強烈地抑制ICAM-1對THP-1單核細胞的白血病細胞(THP-1細胞)的表達，此THP-1細胞通過腫瘤壞死因子-a(TNF-a)誘導ICAM-1表達。而且，它對脂多糖(LPS)活化的小鼠單核細胞/巨噬細胞RAW264.7細胞的NO產(chǎn)生具有強烈的抑制活性。另外，它還在患有角叉菜膠誘導急性炎癥的小鼠中表現(xiàn)出強烈的抗炎活性，而且當用加入飼料中的1％藿香提取物飼養(yǎng)低密度脂蛋白受體缺乏鼠(LDLR-/-mice)時，對照組主動脈竇處的動脈粥樣硬化損傷明顯減輕。
另外，已證實藿香提取物己烷餾分具有上述強烈的抗補體活性和對ICAM-1表達的抑制活性，氯仿餾分具有強烈的對ICAM-1表達的抑制活性和對NO產(chǎn)生的抑制活性，丁醇餾分具有強烈的對ICAM-1表達的抑制活性。
同時，因為本發(fā)明包括藥物和食品添加劑，其所含藿香提取物和通過分離-提純獲得的椴素為活性成分，所以制備藥物和食品添加劑的方法與所熟知的方法一致。
因為藿香提取物和椴素是天然的形式，所以應用中可采用其自身的形式，但是也可以將其與制藥中所允許的載體、成形劑和稀釋劑混合制成粉末、顆粒、膠囊或注射劑。從很久以前藿香提取物就已經(jīng)用于食品和藥物，而且劑量不受限制，并且可根據(jù)內(nèi)吸收性、體重、患者年齡、性別、健康狀況、給藥時間、給藥方法、排泄率和疾病的程度進行改變。一般情況下，作為活性成分的藿香提取物(濃縮狀態(tài))和椴素的所想要的量為0.1-100mg/kg(體重)。因此，考慮到有效劑量的限制，必須制備含有本發(fā)明活性成分的組合物，而且一旦需要，例如觀察者或專家的決定和個人的要求，則可間斷地應用或進行幾次特殊給藥。
同時，當將藿香提取物和椴素制備為食品添加劑時，它們可包括在諸如飲料、口香糖、油酥點心等食品中。
如上述含有藿香提取物和椴素作為活性成分的藥物和食品添加劑善于預防和治療炎性疾病、動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病。
下面應用實施例對本發(fā)明進行詳細的描述，然而，本發(fā)明的范圍將不限制在下面的實施例中。
制備實施例1藿香提取物的制備和應用溶劑分餾采集、干燥和精細剪切農(nóng)場中栽培的30kg藿香的地上部分，然后將其保持在甲醇(120L)中3天。將提取物(30kg)濃縮3遍，獲得提取物(3.5kg)。然后將一些提取物(2.5kg)懸浮在水(10L)中，并用正己烷(10L)分餾2遍。結果，獲得380g正己烷餾分。隨后，按上述方法用氯仿和正丁醇對其進行分餾，并濃縮。結果，獲得590g氯仿餾分，450g正丁醇餾分和980g水餾分。
制備實施例2從藿香中分離-提純椴素采集、干燥和精細剪切農(nóng)場中栽培的藿香地上部分后，獲得30kg原料。將其保持在甲醇(120L)中3天，通過將其(30kg)提取3遍，獲得提取物(3.5kg)。
然后將一些提取物(2.5kg)懸浮在水(10L)中，用氯仿(10L)分餾，并重復此步驟2遍，除去氯仿餾分。隨后，按照上述方法用正丁醇對其進行分餾，獲得450g正丁醇餾分。將吸附于硅膠(1kg)的正丁醇餾分(150g)接受填充有硅膠(4kg)的柱色譜法(25×75cm)，然后用氯仿-甲醇混合物(甲醇比例5％～10％)洗脫含椴素的餾分。將剩余的餾分(300g)保持在甲醇(10L)中，并用甲醇將此處獲得的沉淀沖洗數(shù)遍，獲得含椴素超過90％的沉淀。應用高速液相色譜法將上述2種方法獲得的純椴素與含化合物的椴素分離開。
實施例1抗補體活性采用Meyer等[Kabat，E.A.和Mayer M.M.(1961)《試驗免疫化學》第2版Charles and Thomas，USA]的方法的改良方法進行補體系統(tǒng)的抗補體活性的測定，試驗方法如下。
用明膠-佛羅那緩沖溶液(1.8mM巴比妥鈉，3.1mM巴比妥酸，0.1％明膠，0.141M鹽，0.3％疊氮化鈉，0.5mM氯化鎂，0.15mM氯化鈣，pH7.3)沖洗新鮮綿羊紅細胞3遍，然后將其濃度調(diào)整為5×108細胞數(shù)/ml。在上述緩沖溶液中將抗體(抗綿羊紅細胞基質兔抗血清，S-1389，Sigma)稀釋至1/100，與相等體積的綿羊血細胞稀釋溶液混合，在37℃的孵化器中緩慢攪拌1小時，制備出致敏紅細胞(EA)，用冷緩沖溶液將其沖洗2遍，并將濃度調(diào)整至5×108細胞數(shù)/ml。從人血液中獲得的補體(血清)在2500×g下離心后，將其在緩沖液中稀釋至1/90，與40μl EA溶液、80μl補體稀釋溶液和80μl緩沖溶液混合，并將其置于37℃孵化器中進行反應。然后在離心后，立即在504nm下測定100μl上層溶液的吸光度。按照濃度測定每個抗體和補體(血清)的吸光度，并測定50％溶血(標準溶血)發(fā)生的抗體和血清(補體)的稀釋濃度。隨后，將融化在DMSO中的試驗樣品在80μl緩沖溶液中稀釋至2.5％，為達到標準溶血將其加入，然后將吸光度的測定重復3遍，并計算吸光度的下降。然后用此，將對試驗樣品溶血的抑制活性轉化為抗補體活性。

結果，藿香提取物的正己烷餾分和氯仿餾分顯示高的抗補體活性，如表1所示。
表1
實施例2對ICAM-1表達的抑制活性下面是對THP-1細胞的ICAM-1表達抑制活性的試驗方法。
在CO2孵化器(5％CO2、相對濕度95％、37℃)中用加入10％胎牛血清(Gibco BRL 26140-079，F(xiàn)BS)的RPMI-1640肉湯(RPMI-1640，Gibco BRL 23400-021，1.62％；0.2％NaHCO3；1％混合有青霉素和鏈酶素的抗菌劑)培養(yǎng)THP-1細胞。在DMSO中融化試驗樣品，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋至5％以下，并加入反應溶液，達原先的5％，以使終溶液中此融化樣品的DMSO濃度不超過0.25％。將200μl THP-1細胞(2.5×105細胞/ml)分入96孔板的每個孔中，每個孔中添加了在恒濃度下制備的10μl溶液。在37℃的CO2孵化器中將其培養(yǎng)1小時后，加入TNF-a(終濃度10ng/ml)，誘導ICAM-1表達，并在CO2孵化器中再培養(yǎng)16小時。準備反應溶液，加入25μl戊二醛緩沖溶液(PBS中戊二醛濃度為2.08％)，以分離非特異性結合部分，使細胞處于良好狀態(tài)，用PBST(PBS中tween-20濃度0.005％)沖洗，加入3％脫脂乳。再次沖洗后，按順序加入一抗(抗人ICAM-1)和二抗(抗鼠IgG過氧化物酶綴合物)，加入200μl著色用底物溶液(OPD過氧化物酶底物(Sigma P-9187)，在0.05M磷酸鹽-枸櫞酸鹽緩沖液中)，然后加入50μl 3M HCl，5-10分鐘后停止反應。然后，在測定490 nm下的吸光度和TNF-a引起THP-1細胞ICAM-1的表達后，計算樣品所致表達的抑制率。
表2
如表2所示，藿香提取物、其溶劑餾分和椴素對ICAM-1表達的抑制活性低于抗炎藥物地塞米松，但是正己烷餾分和氯仿餾分特別顯示出良好的抑制活性。地塞米松是一種甾類藥物，它與其它甾類藥物一樣，具有良好作用的同時，長期使用會出現(xiàn)副作用(腎功不全、炎癥加重、糖尿、肌肉萎縮、生長抑制、骨質疏松等)。但是藿香提取物和椴素沒有這些副作用。
實施例3對VCAM-1表達的抑制活性下面是對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)VCAM-1表達的抑制活性的試驗方法。
用加入100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的EGM-2 Bulletkit肉湯培養(yǎng)基[盒內(nèi)含500ml瓶裝內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)基-2(EBM-2，Clonetics CC-3156，MD，USA)]在CO2孵育器中培養(yǎng)HUVEC。在DMSO中融化試驗樣品，其在終反應溶液中的濃度保持在0.1％以下。每組所用的HUVEC為兩培養(yǎng)皿(ψ10cm，2×106個細胞)，并在樣品處理前交換肉湯培養(yǎng)基。首先，將終濃度100μM和10μM的椴素預處理2小時。然后，將每組TNF-a處理為10ng/ml，并誘導VCAM-1表達16小時。用PBS沖洗2遍，并用胰蛋白酶(0.025％)作用5分鐘后，收集細胞。將收集的細胞在15ml試管中離心后，除去上層溶液，用PBS懸浮細胞沉淀物，再次離心細胞并沖洗。用PBS沖洗細胞2遍后，將細胞懸浮在100μl加入0.5.％BSA(牛血清白蛋白)的PBS中，并加入鼠抗人單克隆抗體(Rb 1/9；1μg/ml)。誘導單克隆抗體與冰上的細胞結合30分鐘后，用冷PBS沖洗這些細胞3遍，并在含有FITC(異硫氰酸熒光素)的冰中孵育40分鐘，此處FITC與山羊F(ab’)2抗-鼠IgG結合，其在PBS中的稀釋度為1∶25(W/W)。然后用1％低聚甲醛固定細胞，并通過FACScan(Bio-Rad，USA)分析，測定試驗樣品對VCAM-1表達的抑制活性。
表3和附圖1顯示對椴素處理的HUVEC組的VCAM-1表達的抑制活性，并證實對VCAM-1表達具有強烈的抑制作用。
表3
實施例4對NO產(chǎn)生的抑制活性下面是對鼠單核細胞/巨噬細胞RAW264.7(RAW264.7細胞)NO產(chǎn)生的抑制活性的試驗方法，此細胞的活化是由脂多糖誘導的。
用Sherman等的方法(Sherman et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.191，1301-1308，1993)的改良方法進行此試驗。測定RAW264.7細胞的NO3產(chǎn)生和樣品對其產(chǎn)生的抑制率，NO3是NO的一種穩(wěn)定的氧化物。將LPS(10μg/ml)加入在Dulbecco’s ModifiedEagle’s培養(yǎng)基(Gibco BRL，USA，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，10％FBS，6g/L HEPES，3.7g/L NaHCO3)中培育的RAW264.7細胞中，并誘導活化，然后在CO2孵化器(5％CO2、相對濕度95％、37℃)中培育RAW264.7細胞48小時。然后，離心(1000rpm，10分鐘)此培養(yǎng)基，獲得上層溶液，將100μl Griess試劑(37.5mM對氨基苯磺酸、12.5mM二鹽酸化N-(1-萘基)乙二胺、6.5mM鹽酸)加入此上層溶液中，在室溫下培育10分鐘，然后通過分光光度計在540nm下測定吸光度。應用NO3濃度吸光度相關系數(shù)計算RAW264.7細胞產(chǎn)生的NO3濃度，其相關系數(shù)是通過在0-50μM中制備的硝酸鹽得出的。在DMSO中融化試驗樣品，并在LPS處理前2小時加至RAW264.7細胞中，濃度達0.1％，然后通過測定反應后NO3濃度，計算樣品對NO3產(chǎn)生的抑制率。
NO濃度的標準等式＝吸光度(540nm)×179.4215-8.5221
結果，如表4中所示，在藿香提取物、氯仿餾分和正丁醇餾分中發(fā)現(xiàn)對NO產(chǎn)生的高的抑制活性。
表4
實施例5角叉菜膠誘導急性炎癥模型的抗炎活性試驗動物為雄性Sprague-Dawley大鼠(210-220g)，角叉菜膠為炎癥試劑，研究試驗樣品對水腫模型的水腫抑制率。試驗方法如下。
200mg/kg藿香提取物懸浮在水中，用作試驗樣品，用其飼養(yǎng)每只鼠，1小時后，在鼠后腿附近皮下給予0.1ml的在0.85％鹽水中的1％角叉菜膠懸浮液。給藥后的5小時中，測定每組7只鼠的模型足底的厚度，每小時測定1次。同時，一起測定對照組(鹽水)模型足底的厚度，并根據(jù)對照組隨時間水腫的加重，研究樣品組水腫的抑制率。
表5顯示角叉菜膠誘導的急性炎癥模型中藿香提取物的抗炎活性。從給藥的2小時開始，藿香表現(xiàn)出較強的抗炎活性，對水腫的抑制作用持續(xù)了測定的5小時。
表5
實施例6對動脈粥樣硬化損害的抑制活性下面詳細描述動脈粥樣硬化損害的抑制活性的試驗方法。
步驟I)鼠的飼養(yǎng)和藿香提取物應用于鼠的試驗將所用的模型，雌性LDLR-/-鼠(6-8周，平均體重16.8g)隨機分入2組，每組各10只。一組以高膽固醇飲食(15％脂肪，1.25％膽固醇，0.5％Na-膽酸鹽)飼養(yǎng)，另一組以添加了0.1％和1％試驗樣品的上述飲食飼養(yǎng)。在試驗期間，鼠可自由地進食水和食物。
步驟II)模型動脈粥樣硬化損害的測定試驗進行8周后，通過眼睛對所有鼠采血。然后，用PBS(磷緩沖溶液)灌流鼠的心臟和動脈10分鐘，隨后用低聚甲醛灌流5分鐘。此過程后，摘除心臟和動脈，浸入10％中性福爾馬林中24小時，將其置于OCT培養(yǎng)基(10.24％聚乙烯醇，4.26％聚乙二醇，80.5％非反應成分，w/w，Life Science International，英格蘭，UK)中，然后保持于-70℃。用低溫下(-20℃)的切片機從動脈區(qū)域開始制備冰凍切片(每個9μm)，用油紅O將6個冰凍切片染色，并用Harris蘇木精對染。然后通過計算機輔助形態(tài)測定法對這些染色切片進行定量分析，并計算每組動物損害大小的平均值。這樣，根據(jù)對照組損害的發(fā)作，計算對樣品組損害的抑制活性。
(其中對照組指高膽固醇飲食組)(1)藿香組對動脈粥樣硬化損害抑制活性的試驗結果如表6所示，與對照組相比，8周試驗中藿香組的攝入量和體重沒有任何變化。
表6
另外，如表7所示，藿香提取物對動脈粥樣硬化損害抑制作用的結果顯示，與對照組相比，用包括0.1％和1％藿香提取物的飲食飼養(yǎng)的組中，損害的大小分別下降了23％和46.6％。
表7
而且，當對心臟的動脈橫切面染色時，與對照組相比，1％藿香提取物組中炎癥所致?lián)p害(壞死組織)的大小顯著下降(附圖2)。另外，當僅對損害的巨噬細胞染色時，與對照組相比，1％藿香提取物組中巨噬細胞的聚集顯著下降(附圖3)。
因此，動脈粥樣硬化損害進展至巨噬細胞等免疫細胞在內(nèi)皮細胞下的聚集和炎癥顯示，藿香提取物顯著地降低了炎癥所致?lián)p害的發(fā)展。
(2)椴素組對動脈粥樣硬化損害抑制活性的試驗結果如表8所示，椴素對動脈粥樣硬化損害抑制作用的結果顯示，與對照組相比，用包括1％椴素的飲食飼養(yǎng)的組中，損害的大小下降了41.9％。
表8
如表8所示，1％洛伐他汀組中對動脈粥樣硬化損害的抑制活性高于1％椴素組，但是本發(fā)明的椴素是安全的，沒有任何副作用，而洛伐他汀對肝臟具有毒性作用。另外，可以肯定的是本發(fā)明的椴素組比對照組更有效。
而且，心臟的動脈橫切面染色的結果顯示，與對照組相比，1％椴素組中炎性反應所致?lián)p害(壞死組織)的大小顯著下降(附圖4)。因此，在動脈粥樣硬化損害進展至巨噬細胞等免疫細胞在內(nèi)皮細胞下的聚集和炎癥的過程中，證實椴素顯著地減輕了動脈粥樣硬化損害的發(fā)展。
實施例7片劑的制備在將10g藿香提取物(包括1g椴素)、70g乳糖、15g結晶纖維素和5g硬脂酸鎂壓碎和混合后，通過直接壓片法制備片劑。每片總量為100mg，活性成分藿香提取物的量為10mg(1mg椴素)。
實施例8散劑的制備通過將10g藿香提取物(包括1g椴素)、50g玉米淀粉和40g羧基纖維素壓碎和混合，制備散劑。并通過將100mg散劑放入硬度VI的膠囊中而制備膠囊。
實施例9毒性試驗從很早以前開始，藿香提取物和通過分離-提純獲得的椴素是無毒的原料和天然藥物，用作食品和藥物。將在二甲亞砜中溶解并在水中稀釋的1g/kg成分給予每只鼠(10只/組)，7天后未發(fā)現(xiàn)任何鼠死亡。
實施例10包括藿香提取物的飲用組分將李子提取物(李子固體提取物(固體量69°Bx)，制造商韓國Hadong National Agricultural Cooperative Federation)、中國榅桲、大獨活、干姜、五味子、肉桂(漢城Kyongdong市場)、葡萄汁(固體量65°Bx，制造商Comax international Corp.)和梨汁(制造商Hanmi aromatics chemistry)制備為包含藿香提取物的飲用組分。
首先，加入天然藥物重量10倍的水，然后在100℃將中國榅桲、大獨活、干姜、五味子和肉桂等天然藥物水熱提取30分鐘。將這些保持在4℃24小時，在將它們離心10分鐘后，應用上層溶液的天然藥物提取物。
將所用的李子提取物的李子固體提取物(69°Bx)稀釋至10°Bx，所用的葡萄汁(65°Bx)和梨汁(69°Bx)不稀釋。
對于包含藿香提取物的飲用組分，將0.1％藿香提取物、0.2％李子提取物、0.3％干姜提取物、0.3％中國榅桲提取物、0.01％肉桂提取物、5.0％梨汁和17％超級果糖(superfructose)在水中稀釋以調(diào)整為100ml，在95℃進行射線照射和處理15秒，制備為飲料商品。
上面所述是制備包含藿香提取物的飲料商品的方法，也可制備相同用途的包含椴素的飲用商品，其中椴素替代藿香提取物。
如上所述，本發(fā)明的藿香提取物和通過分離-提純獲得的椴素可抑制各種炎癥因子的活化、產(chǎn)生和表達，在動物中具有抗炎活性，而且對動脈粥樣硬化損害的產(chǎn)生具有顯著的抑制活性，因此，它們可用作預防或治療炎性疾病、與炎性反應相關的動脈粥樣硬化和由動脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥物或食品添加劑。
權利要求
1.一種藥物組合物，它含有藿香提取物作為活性成分。
2.按照權利要求1的藥物組合物，其中所說的提取物含有正己烷、氯仿或正丁醇分餾的溶劑餾分。
3.按照權利要求1的藥物組合物，其中所說的提取物含有椴素作為活性成分。
4.按照權利要求1或3的藥物組合物，其中所說的組合物對炎癥反應中的一種因子-補體系統(tǒng)具有抑制活性。
5.按照權利要求1或3的藥物組合物，其中所說的組合物可抑制細胞間粘附分子-1的表達。
6.按照權利要求1或3的藥物組合物，其中所說的組合物可抑制一氧化氮的產(chǎn)生。
7.按照權利要求1或3的藥物組合物，其中所說的組合物具有抗炎活性及抗動脈粥樣硬化活性。
8.食品添加劑組合物，它包括藿香提取物或通過分離-提純獲得的椴素作為活性成分，并具有抗炎活性及抗動脈粥樣硬化活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含藿香和通過分離－提純獲得的椴素(tilianin)的組合物，它用于抗炎和抗動脈粥樣硬化，而且更特別的是，本發(fā)明涉及藿香提取物以及通過分離－提純從其中獲得的椴素，它們不僅可有效地預防和治療炎癥疾病，而且可有效地預防和治療與炎性反應相關的動脈粥樣硬化和由動脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病，這是因為它們可良好地抑制炎性反應中的一種因子－補體系統(tǒng)的活性，細胞間粘附分子－1(ICAM－1)和血管細胞粘附分子－1(VCAM－1)的表達，以及一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。它們還可顯著地減輕炎性反應所致動脈粥樣硬化的發(fā)展。
文檔編號A61P9/10GK1518454SQ01823069
公開日2004年8月4日 申請日期2001年12月20日 優(yōu)先權日2001年2月27日
發(fā)明者李炯圭, 吳世洋, 安境燮, 崔順子, 金正姬, 吳九澤, 弘廷宙, 樸成圭, 南窮佑 申請人:韓國生命工學研究院