專(zhuān)利名稱：表達(dá)人輪狀病毒vp7的重組腺病毒及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒，特別是表達(dá)嬰兒輪狀病毒VP7的重組腺病毒，屬醫(yī)藥基因工程領(lǐng)域。
本發(fā)明還涉及該重組腺病毒的制備方法和用途。
對(duì)于輪狀病毒疫苗的研究，目前美國(guó)雖然研制了四價(jià)重配疫苗，但是保護(hù)效果并不理想，對(duì)普通腹瀉保護(hù)率為60～70％，生產(chǎn)成本高，發(fā)展中國(guó)家難以負(fù)擔(dān)，并且長(zhǎng)期使用存在與野生病毒重配，產(chǎn)生新病毒的可能，更為重要的是，這種疫苗1998年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用后，1999年因發(fā)現(xiàn)可引起小兒腸套疊，而被停止銷(xiāo)售，因此輪狀病毒疫苗的問(wèn)題還沒(méi)有解決。
運(yùn)用基因工程方法制備輪狀病毒基因工程疫苗，以往采用的是復(fù)制型腺病毒載體，保留了E1區(qū)，刪除了E3區(qū)，認(rèn)為只有載體病毒大量復(fù)制才能誘導(dǎo)良好的免疫效果，但腺病毒復(fù)制雖無(wú)致癌性，仍有可能導(dǎo)致一些疾病，如小兒肺炎等，表達(dá)的基因是動(dòng)物，如猴、豬的輪狀病毒的VP7基因，且為了加強(qiáng)免疫效果人為加入了外源基因片段，如經(jīng)過(guò)改造的猴輪狀病毒SA11的VP7基因(DoroninKK，Mol Gen Mikrobiol Viru-sol，1995，435-39，Xu ZZ et al，J Gen Virol，1995，761971-80，BothGW，Virol，1993，193940-50)。但是動(dòng)物病毒基因與人類(lèi)有較大差異，其誘導(dǎo)的免疫難以用于人體的感染保護(hù)。
本發(fā)明還提供了重組腺病毒的制備方法和用途。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒，包括左、右側(cè)的末端倒置重復(fù)序列LITR、RITR，外源基因表達(dá)盒，其特征在于它是非復(fù)制型重組腺病毒，其基因組缺失了E1區(qū)(ΔE1)和E3區(qū)(ΔE3)，在E1區(qū)缺失位置插入了人輪狀病毒VP7基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒的基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子，基因轉(zhuǎn)錄的加尾信號(hào)為SV-40病毒的多聚腺苷化的加尾信號(hào)(PA)，其結(jié)構(gòu)為如

圖1所示。
表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒的制備方法，其特征在于它按下述步驟進(jìn)行a)首先從醫(yī)院兒科門(mén)診收集輪狀病毒感染的嬰幼兒腹瀉大便標(biāo)本，按常規(guī)方法提取人輪狀病毒基因組RNA，經(jīng)過(guò)純化，用RT-PCR擴(kuò)增出人輪狀病毒VP7基因全長(zhǎng)1062bp cDNA，插入克隆載體pGEM-7zf，得到重組質(zhì)粒pGEM-7zf-VP7；b)用Sma I和Xho I雙酶切pGEM-7zf-VP7，回收VP7全長(zhǎng)基因片段與用EcoR V和Sal I雙酶切的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV進(jìn)行定向連接，獲得插入有VP7基因的穿梭質(zhì)粒pShuttleVP7；c)將Pme I消化的穿梭質(zhì)粒pShuttleVP7與缺失了E1區(qū)(ΔE1)和E3區(qū)(ΔE3)的腺病毒的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，用電轉(zhuǎn)法共轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒的DNA，經(jīng)Pac I酶切后，再用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，得到重組腺病毒Ad-VP7。
所述的穿梭質(zhì)粒包括5型病毒基因組左側(cè)末端1-480bp，3534-5790bp序列及右側(cè)末端34931-35935bp序列。
骨架質(zhì)粒，含有除E1區(qū)(1-3533bp)和E3區(qū)(28130-30820bp)以外的5型腺病毒基因組全部序列。
表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒的用途，其特征在于它可用于預(yù)防減少輪狀病毒引起的嬰幼兒急性腹瀉。
表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒的用途，其特征在于可與醫(yī)學(xué)上許可的賦型劑制成滴鼻劑、噴霧劑、注射劑或口服劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案采用基因工程方法制備的重組腺病毒制成疫苗，它針對(duì)了輪狀病毒的生物學(xué)與免疫學(xué)特點(diǎn)，即輪狀病毒經(jīng)過(guò)腸道感染且繁殖局限在腸道，因此腸道局部粘膜免疫起主要保護(hù)作用，而腺病毒具有粘膜感染的特點(diǎn)，制備重組腺病毒顯然有利于刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫，從而保護(hù)機(jī)體免受通過(guò)呼吸、消化道、泌尿生殖及其它粘膜途徑入侵的病原體的危害。
本發(fā)明的重組腺病毒Ad-VP7分類(lèi)命名為重組腺病毒，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，地址是中國(guó).北京.中關(guān)村.郵編100080，保藏日為2001年3月8日，保藏號(hào)CGMCC No.0544。
由于采取上述技術(shù)方案，使本發(fā)明技術(shù)與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果a)采用非復(fù)制型腺病毒載體對(duì)人輪狀病毒VP7基因進(jìn)行表達(dá)，能防止腺病毒復(fù)制對(duì)特殊人群如嬰兒造成的毒副作用，如腺病毒復(fù)制有可能造成感染者的病毒性肺炎等疾病的發(fā)生，或者在嬰兒等免疫力低下的人群中易造成腺病毒感染的廣泛擴(kuò)散，因此保證了安全性和可靠性又不影響免疫效果；b)所表達(dá)的基因是人輪狀病毒的VP7基因，激發(fā)了良好的免疫效果，誘發(fā)的免疫更適于保護(hù)人體；c)該重組腺病毒可感染腸道及呼吸道，有效地激發(fā)體液免疫和粘膜免疫，在血清中能產(chǎn)生高滴度的中和抗體，在粘膜組織中誘導(dǎo)輪狀病毒特異性的分泌型IgA(SIgA)，可有效預(yù)防或減少輪狀病毒的入侵，同時(shí)用同型腺病毒載體加強(qiáng)免疫得到了理想的免疫增強(qiáng)效果，表明了它具有良好的免疫刺激作用，顯示非復(fù)制型載體更安全，可成為良好的輪狀病毒疫苗載體，可用于預(yù)防或減少輪狀病毒引起的嬰幼兒急性腹瀉；
d)該病毒生物活性高，易保存，細(xì)胞培養(yǎng)的重組腺病毒即為疫苗本身，制備方法簡(jiǎn)單，成本低，劑型多，適用嬰幼兒使用。
(4)VP7基因的克隆與序列分析用低熔點(diǎn)瓊脂糖法回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用EcoR I酶切，回收VP7基因片段，插入載體pGEM-7zf中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基上挑取白斑，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切鑒定，選出正確的克隆測(cè)定其核苷酸序列，經(jīng)3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果一致，最后得到陽(yáng)性克隆pGEM-7zf-VP7。
2、表達(dá)輪狀病毒VP7的重組腺病毒的構(gòu)建(1)插入VP7基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建用Sma I和Xho I雙酶切pGEM-7zf-VP7，回收VP7基因片段與用EcoRV和Sal I雙酶切的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV進(jìn)行定向連接，穿梭質(zhì)粒包括5型腺病毒基因組左側(cè)末端1-480bp，3534-5790bp序列及右側(cè)末端34931-35935bp序列。獲得插入有VP7基因的穿梭質(zhì)粒pShuttleVP7，分別用EcoR I、BamH I及Pac I酶切鑒定。
(2)利用大腸桿菌的同源重組機(jī)制獲得重組腺病毒DNA(2-1)制備適宜于電轉(zhuǎn)化的E.coli BJ5183細(xì)胞，-80℃下保存?zhèn)溆?，用限制性?nèi)切酶Pme I酶切穿梭質(zhì)粒pShuttleVP7，使其線性化。用電轉(zhuǎn)化法將線性化的穿梭質(zhì)粒與腺病毒的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183，骨架質(zhì)粒含有除E1區(qū)(1-3533bp)和E3區(qū)(28130-30820bp)以外的5型腺病毒基因組全部序列，將轉(zhuǎn)化物在含卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)。
(2-2)挑選10～20個(gè)較小菌落，用堿法提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選出分子量增大的質(zhì)粒用Pac I進(jìn)行酶切分析。
(2-3)取經(jīng)鑒定為正確的重組質(zhì)粒，再用CaCl2法轉(zhuǎn)化到E.coli DH10B中，挑取菌落、提取質(zhì)粒，用Pac I再次酶切鑒定。
(2-4)取經(jīng)酶切鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，用Pac I酶切質(zhì)粒，經(jīng)電洗脫法回收及純化獲得重組腺病毒的DNA，用無(wú)菌H2O懸浮。
(3)重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，得到重組腺病毒(3-1)在T-25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)使其豐度為50％-70％。
(3-2)取上述用20μl無(wú)菌H2O重懸的重組腺病毒DNA(約4μg)及20μl Lipofectamine分別與100μl的M溶液(無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM溶液)混合，室溫放置30min，混合兩種液體，室溫繼續(xù)作用15min。
(3-3)移去293細(xì)胞的生長(zhǎng)液(含10％胎牛血清的DMEM)，用4mlM液洗細(xì)胞一次。補(bǔ)加800μl M液至Lipofectamine-DNA的混合物中，接種293細(xì)胞，置37℃CO2孵箱，孵育3～5h。
(3-4)補(bǔ)加4ml生長(zhǎng)液，置37℃ CO2孵箱，孵育過(guò)夜。次日，換生長(zhǎng)液，逐日用顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的病變狀況。
(3-5)在轉(zhuǎn)染后7～10天，用無(wú)菌細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，離心，棄上清，用HBSS重懸沉淀的細(xì)胞，反復(fù)凍融四次，離心，上清液貯存于-20℃保存。此為第一代種子病毒，將其命名為Ad-VP7，其基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示，置-80℃保存。
3、重組腺病毒的鑒定取第一代種子液30％的上清液，感染T-25方瓶中培養(yǎng)的293細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變。待細(xì)胞出現(xiàn)病變后(感染后3～4天)，收獲上清液作為第二代種子液留作以下實(shí)驗(yàn)。取細(xì)胞反復(fù)凍融，一部分提取病毒基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，另一部分細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，證實(shí)VP7基因在腺病毒基因組中的整合和表達(dá)。
(1)PCR法擴(kuò)增重組腺病毒中VP7的特異性基因片段利用PCR技術(shù)檢測(cè)重組腺病毒中是否插入了VP7基因，擴(kuò)增VP7基因的PCR引物序列同前。
94℃預(yù)變性3min后開(kāi)始PCR循環(huán)，條件為94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴(kuò)增到一條約1kb的條帶，與目的片段1062bp大小基本一致，圖3所示，證明VP7基因已經(jīng)整合到腺病毒基因組中。
(2)Western blot分析重組病毒中目的基因VP7的表達(dá)情況制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白電泳，將重組腺病毒感染的293細(xì)胞總蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，室溫封閉過(guò)夜。加1∶500用封閉液(TBS，5％脫脂奶)稀釋的山羊抗牛輪狀病毒多抗(美國(guó)ChemiconInternationl公司產(chǎn)品，與人輪狀病毒有90％以上的反應(yīng)性)，室溫孵育2h，TBST(TBS，0.05％Tween20)洗滌6次。加1∶2000用TBS及5％脫脂奶稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的馬抗山羊IgG，室溫1h，TBST洗滌6次。加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，暗室內(nèi)X光片感光約1min，經(jīng)適當(dāng)?shù)娘@影和定影后，在重組腺病毒泳道，約34KD位置處，出現(xiàn)一特異性條帶，見(jiàn)于輪狀病毒陽(yáng)性對(duì)照，未見(jiàn)于5型腺病毒空載體陰性對(duì)照，如圖4所示，證明VP7基因在重組腺病毒中有表達(dá)。
4、重組腺病毒的制備與檢定將重組腺病毒的第二代種子病毒感染293細(xì)胞，大量擴(kuò)增病毒。感染細(xì)胞72h后，收獲細(xì)胞和上清，離心收集細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，離心，去除細(xì)胞碎片。上清經(jīng)PEG8000包埋濃縮后，進(jìn)行CsCl2梯度離心(CsCl2梯度依次為1.25g/ml，1.35g/ml和1.5g/ml)，10℃，25000rpm，2h，吸取目的帶(1.25g/ml和1.35g/ml墊層之間)，再進(jìn)行第二次超速離心，墊層為1.35g/ml CsCl2，35000rpm，離心3h，吸取目的帶，將收集的病毒對(duì)50倍體積含10％甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，換液2次，用孔徑0.22um的濾膜濾菌后分裝，-80℃凍存。
用293細(xì)胞對(duì)病毒的滴度進(jìn)行滴定，采用微量細(xì)胞病變法，在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，病毒自103開(kāi)始進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?012為止，每一稀釋度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，最后測(cè)得病毒滴度為3.5×1010pfu/ml。用無(wú)菌注射用水稀釋成2×1010pfu/ml，-80℃凍存。使用時(shí)用無(wú)菌注射用水稀釋成2×108pfu/ml。
對(duì)所得病毒進(jìn)行如下檢定無(wú)菌試驗(yàn)為陰性，電鏡檢查無(wú)細(xì)菌、支原體、真菌和其他微生物的污染。病毒可穩(wěn)定傳代20代以上而無(wú)滴度的下降及復(fù)制性病毒的污染或再生。
5、重組腺病毒的免疫效果觀察6～8周齡雌性的BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分為四組，每組10只小鼠。接種前，通過(guò)小鼠尾部采取基礎(chǔ)血檢測(cè)輪狀病毒抗體為陰性。接種時(shí)，實(shí)驗(yàn)組分別經(jīng)鼻腔和胃腸道途徑接種重組腺病毒。鼻腔接種時(shí)，先用乙醚麻醉小鼠，然后將100μl重組腺病毒(2×108pfu/ml)滴入小鼠鼻腔；胃腸道接種時(shí)，直接用注射器將200μl 1×108pfu/ml的重組腺病毒，注入小鼠胃內(nèi)。四周后，再次經(jīng)尾部采血，并用與初次免疫時(shí)等量的病毒加強(qiáng)免疫一次。5天后，經(jīng)小鼠眼球采血，并分別制備肺灌洗液以及肺、腸組織勻漿液，對(duì)照組僅接種等量的生理鹽水，其它處理完全相同。
(1)重組腺病毒免疫小鼠可誘發(fā)高滴度血清抗體通過(guò)灌胃和滴鼻兩種不同途徑免疫后小鼠的血清抗體進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)初次免疫后，兩組小鼠均有應(yīng)答，但血清抗體的滴度及陽(yáng)轉(zhuǎn)率不同。灌胃組血清抗體的滴度為1∶1000，陽(yáng)轉(zhuǎn)率為80％；滴鼻組血清抗體的滴度為1∶1000～1∶10000，陽(yáng)轉(zhuǎn)率為90％。再次免疫后，灌胃組小鼠血清抗體的滴度未見(jiàn)增加，有1只小鼠的血清抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率為90％；滴鼻組小鼠血清抗體的滴度上升為1∶100000～1∶1000000，增加了100倍，顯示出明顯的加強(qiáng)效果，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100％，如圖5所示。
(2)重組病毒可誘導(dǎo)粘膜免疫由于輪狀病毒為腸道傳染，因此腸道粘膜免疫對(duì)于預(yù)防病毒感染具有重要意義。為了解獲得的重組腺病毒是否能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的針對(duì)輪狀病毒的粘膜免疫應(yīng)答，對(duì)腸粘膜組織勻漿中的輪狀病毒特異性SIgA進(jìn)行了檢測(cè)。腸勻漿液中，滴鼻組SIgA的陽(yáng)性率為70％，滴度為1∶10～1∶50；灌胃組SIgA的陽(yáng)性率為60％，滴度為1∶10～1∶20，表明重組腺病毒可有效誘導(dǎo)針對(duì)輪狀病毒的黏膜免疫，見(jiàn)表1。
表1 兩種不同途徑免疫后腸勻漿液SIgA抗體滴度比較小鼠號(hào)免疫途徑123 45678910灌胃--1010 20 20 20 20 --滴鼻50 50 2050 10 -50 10 --(3)重組病毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的血清抗體具有輪狀病毒中和活性取已于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上長(zhǎng)成單層的MA104細(xì)胞，進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)，試驗(yàn)表明，初次免疫后，兩組小鼠血清中和抗體的效價(jià)均為1∶128，加強(qiáng)免疫后，滴鼻組小鼠血清中和抗體效價(jià)上升為1∶512，灌胃組沒(méi)有變化，見(jiàn)表2。結(jié)果表明重組腺病毒誘導(dǎo)的血清抗體對(duì)輪狀病毒感染有中和作用。
表2血清中和抗體的效價(jià)血清免疫途徑 初次免疫 加強(qiáng)免疫灌 胃 128 128滴 鼻 128 512本發(fā)明所述的輪狀病毒有多個(gè)血清型可感染人，按VP7分型最主要的是G1型，占80％以上，本發(fā)明選用的輪狀病毒VP7基因?yàn)镚1型，因其具有代表性。按前述方法也可以制備表達(dá)G2、G3、G4、G9等可感染人的血清型的輪狀病毒VP7的重組腺病毒。
權(quán)利要求
1.表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒，包括左、右側(cè)的末端倒置重復(fù)序列LITR、RITR，外源基因表達(dá)盒，其特征在于它是非復(fù)制型重組腺病毒，其基因組缺失了E1區(qū)(ΔE1)和E3區(qū)(ΔE3)，在E1區(qū)缺失位置插入了人輪狀病毒VP7基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒的基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子，基因轉(zhuǎn)錄的加尾信號(hào)為SV-40病毒的多聚腺苷化的加尾信號(hào)(PA)。
2.如權(quán)利要求1所述表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒的制備方法，其特征在于它按下述步驟進(jìn)行a)首先從醫(yī)院兒科門(mén)診收集輪狀病毒感染的嬰幼兒腹瀉大便標(biāo)本，按常規(guī)方法提取人輪狀病毒基因組RNA，經(jīng)過(guò)純化，用RT-PCR擴(kuò)增出人輪狀病毒VP7基因全長(zhǎng)1062bp cDNA，插入克隆載體pGEM-7zf，得到重組質(zhì)粒pGEM-7zf-VP7；b)用Sma I和Xho I雙酶切pGEM-7zf-VP7，回收VP7全長(zhǎng)基因片段，與用EcoR V和Sal I雙酶切的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV進(jìn)行定向連接，獲得插入有VP7基因的穿梭質(zhì)粒pShuttleVP7；c)將Pme I消化的穿梭質(zhì)粒pShuttleVP7與缺失了E1區(qū)(ΔE1)和E3區(qū)(ΔE3)的腺病毒的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，用電轉(zhuǎn)法共轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒的DNA，經(jīng)Pac I酶切后，再用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，得到重組腺病毒Ad-VP7。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的穿梭質(zhì)粒包括5型腺病毒基因組左側(cè)末端1-480bp、3534-5790bp序列及右側(cè)末端34931-35935bp序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于骨架質(zhì)粒，含有除E1區(qū)(1-3533bp)和E3區(qū)(28130-30820bp)以外的5型腺病毒基因組全部序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒的用途，其特征在于它可用于預(yù)防減少輪狀病毒引起的嬰幼兒急性腹瀉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒的用途，其特征在于可與醫(yī)學(xué)上許可的賦型劑制成滴鼻劑、噴霧劑、注射劑或口服劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)人輪狀病毒VP7的重組腺病毒及其制備方法和用途,其特征在于它是非復(fù)制型的重組腺病毒,其基因組缺失了E1區(qū)(ΔE1)和E3區(qū)(ΔE3),在E1區(qū)缺失位置插入了人輪狀病毒VP7基因表達(dá)盒,該重組腺病毒可感染腸道及呼吸道,誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫和中和抗體,安全、可靠,可用于預(yù)防減少輪狀病毒感染引起的嬰幼兒急性腹瀉。
文檔編號(hào)A61K39/235GK1381563SQ0210412
公開(kāi)日2002年11月27日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月14日
發(fā)明者王健偉, 何金生, 洪濤, 徐倏燊 申請(qǐng)人:王健偉, 何金生, 洪濤, 徐倏燊