專利名稱：一種用于骨組織轉(zhuǎn)化生長因子載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)骨移植技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種用于骨組織轉(zhuǎn)化生因子載體的制備方法。
目前應(yīng)用的骨形成蛋白等載體有兩種物理形態(tài)1.膠體載體，如膠原、纖維蛋白凝塊(FC)、聚吡咯烷酮等；2.固態(tài)載體，常見如羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙烯二醇(polyethyleneglycol，PEG)、聚乙醇酸(polygiycolic acid，PGA)及它們的共聚物；燒結(jié)骨、同種異體脫鈣骨或脫礦骨基質(zhì)、凍干骨、脫蛋白骨、重組合異種骨和珊瑚骨等；3.另外是由兩種形態(tài)載體混合應(yīng)用。
膠體載體與骨形成蛋白等的復(fù)合方式為直接將骨形成蛋白等與載體混勻；固態(tài)載體與骨形成蛋白等的復(fù)合方式為將載體浸于含骨形成蛋白等的溶液中，通過負(fù)壓抽吸使骨形成蛋白等到載體中；混合性載體與骨形成蛋白的復(fù)合方式則是先將骨形成蛋白等與膠體載體混合，再將此液通過負(fù)壓抽吸而吸附到固態(tài)載體中。
這幾種承載方式有幾點(diǎn)不利一、骨形成蛋白等分布不均，載體外部含骨形成蛋白等多而內(nèi)部少。導(dǎo)致骨形成蛋白等的釋放不平衡，早期釋放多，被組織蛋白酶過快降解，而后期釋放少，達(dá)不到骨誘導(dǎo)的有效濃度。二、由于骨形成蛋白等的分布不均導(dǎo)致成骨主要在載體的表面，內(nèi)部成骨少，從而成骨不完全和緩慢。三、設(shè)備條件要求高、生產(chǎn)過程復(fù)雜。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案是；一種用于骨組織轉(zhuǎn)化生因子載體的制備方法，其特點(diǎn)是將各類固體載體加工成中空的圓柱體，骨形成蛋白等和膠體樣載體按特定比例充分混勻后，置入固體載體中孔中，干燥成型。
具體步驟為1.將異體骨制成直徑6-10mm，長度3-6mm，中空，內(nèi)徑2-4mm的圓柱體。
2.將制備好的圓柱體用甲醇/氯仿(1∶1)超聲洗滌6h，0.6當(dāng)量鹽酸，15分鐘脫鈣，3％雙氧水6h脫蛋白，制備去抗原骨。
3.將膠原與明膠以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例分別混合加入適量蒸餾水，渦旋震蕩器震蕩24h充分混勻，調(diào)節(jié)PH值7.0，凍干，制備膠原明膠混合物。
4.去抗原異體骨與膠原明膠復(fù)合物分別用環(huán)氧乙烷消毒備用。
5.無菌操作下，將定量膠原明膠復(fù)合物與骨形成蛋白混合，加少量無菌蒸餾水混勻成膠狀，置于去抗原骨中孔中，干燥。
當(dāng)此種復(fù)合物植入體內(nèi)后，因?yàn)橛型鈱庸腆w載體的阻擋，體液中的生物酶不能立刻接觸到骨形成蛋白，從而有效的保存了骨形成蛋白；隨著體液滲入到中孔，骨形成蛋白逐漸由中心緩慢向載體周圍釋放，在固體載體內(nèi)形成從中孔到外周由高到低的骨形成蛋白梯度濃度，進(jìn)而使成骨過程由中心向周圍進(jìn)行。
本實(shí)施例以異體骨(固體載體)，膠原和明膠(膠體載體)與骨形成蛋白的復(fù)合工藝為例具體的說明中心釋放載體與骨形成蛋白復(fù)合的加工程序。
具體步驟為1.將異體骨制成直徑8mm，長度5mm，中空，內(nèi)徑3mm的圓柱體。
2.將制備好的圓柱體用甲醇/氯仿(1∶1)超聲洗滌6h，0.6當(dāng)量鹽酸，15分鐘脫鈣，3％雙氧水6h脫蛋白，制備去抗原骨。
3.將膠原與明膠以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例分別混合加入適量蒸餾水，渦旋震蕩器震蕩24h充分混勻，調(diào)節(jié)PH值7.0，凍干，制備膠原明膠混合物。
4.去抗原異體骨與膠原明膠復(fù)合物分別用環(huán)氧乙烷消毒備用。
5.無菌操作下，將定量膠原明膠復(fù)合物與骨形成蛋白混合，加少量無菌蒸餾水混勻成膠狀，置于去抗原骨中孔中，干燥。
以上步驟參見附

圖1，圖中1為空隙性固體載體；2為含有藥物的膠體纖維復(fù)合物。
本方法在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)中空骨釋放骨形成蛋白較實(shí)心骨慢，說明本發(fā)明設(shè)計的中空結(jié)構(gòu)有利于骨形成蛋白的保留。
在動物實(shí)驗(yàn)中，將制備好的骨形成蛋白/膠原明膠復(fù)合物/異體骨復(fù)合物，將異體骨無中空結(jié)構(gòu)其他含同樣成分的復(fù)合物作為對照以異體骨(固體載體)，膠原和明膠(膠體載體)與骨形成蛋白各5個，一起植入兔脊柱兩側(cè)，分別于2、4周處死，2周4個樣本，4周6個樣本。結(jié)果2周時實(shí)心結(jié)構(gòu)釋放骨形成蛋白較空心快，ALP活性高，但是到4周時，空心結(jié)構(gòu)仍緩慢釋放骨形成蛋白，ALP的活性高于實(shí)心結(jié)構(gòu)，ALP的活性下降比較平緩，說明骨形成蛋白的釋放是緩慢而持續(xù)的。不象實(shí)心結(jié)構(gòu)釋放骨形成蛋白，早期太過，而后期則欠缺。
HE切片檢查2周時可見實(shí)心結(jié)構(gòu)植入物中無細(xì)胞長入，而空心結(jié)構(gòu)植入物內(nèi)有少量軟骨、骨細(xì)胞生長。
權(quán)利要求
1.一種用于骨組織轉(zhuǎn)化生因子載體的制備方法，其特征是將各類固體載體加工成中空的圓柱體，骨形成蛋白等和膠體樣載體按特定比例充分混勻后，置入固體載體中孔中，干燥成型。具體步驟為(1)將異體骨制成直徑6-10mm，長度3-6mm，中空，內(nèi)徑2-4mm的圓柱體。(2)將制備好的圓柱體用甲醇/氯仿(1∶1)超聲洗滌6h，0.6當(dāng)量鹽，15分鐘脫鈣，3％雙氧水6h脫蛋白，制備去抗原骨。(3)將膠原與明膠以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例分別混合加入蒸餾水，渦旋震蕩器震蕩24h充分混勻，調(diào)節(jié)PH值7.0，凍干，制備膠原明膠混合物。(4)去抗原異體骨與膠原明膠復(fù)合物分別用環(huán)氧乙烷消毒備用。(5)無菌操作下，將定量膠原明膠復(fù)合物與骨形成蛋白混合，加少量無菌蒸餾水混勻成膠狀，置于去抗原骨中孔中，干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在與于所述各類載體包括羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙烯二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙醇酸(polygiycolic acid，PGA)及它們的共聚物；燒結(jié)骨、同種異體脫鈣骨或脫礦骨基質(zhì)、凍干骨、脫蛋白骨、重組合異種骨和珊瑚骨等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于骨組織轉(zhuǎn)化生長因子載體的制備方法，將各類固體載體加工成中空的圓柱體，骨形成蛋白等和膠體樣載體按特定比例充分混勻后，置入固體載體中孔中，干燥成型。該方法的特點(diǎn)在于1.骨形成蛋白等從載體中心向周圍釋放，成骨由中心開始，避免了骨形成蛋白等大量釋放到組織中而被降解，在載體及周邊形成一個持續(xù)的骨形成蛋白等濃度梯度有利于成骨。載體內(nèi)外成骨完全，進(jìn)而有利于載體的降解。2.設(shè)備要求簡單，簡便易行。
文檔編號A61L27/00GK1463755SQ0212096
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者孫磊, 田偉, 尹大慶, 王戈平, 黃嘯原, 陳磊, 高新生, 杰永生, 陶劍峰, 禇黎, 劉竟成 申請人:北京市創(chuàng)傷骨科研究所