專利名稱：一種人復(fù)合型α干擾素蛋白N末端tag結(jié)構(gòu)的制作方法
干擾素為分子量約20kD的蛋白多肽，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的功能，可用于臨床治療病毒性疾病、癌癥等。人干擾素分為α、β和γ型，分別由白細胞、成纖維細胞和淋巴細胞產(chǎn)生而命名。人α干擾素由165-166個氨基酸組成，分子量在19kD左右，主要亞型有α2a，α1b和α2b?，F(xiàn)有的α干擾素制品比活性較低，在1×108IU/mg左右，存在著大劑量時副作用較大的缺點。復(fù)合型α干擾素(concensus interferon)根據(jù)13個已知的人α干擾素亞型的氨基酸序列中氨基酸同源性高的原則組合而成(見附錄)，商品名為Irfergem，已批準用于治療慢性丙型病毒性肝炎，比活性在1.0×109單位左右。
通過對人α干擾素的結(jié)構(gòu)研究表明，人α干擾素含有十分保守的4個Cys，形成2對二硫鍵(Cys1-Cys99和Cys29-Cys139)(Wetzel R.Nature.1981，289606-607)，2對二硫鍵對于干擾素的活性極其重要，其中Cys29-Cys139對于抗病毒活性比較重要，而Cys1-Cys99參與抗病毒的活性，并對其穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用，而且還有抗細胞增殖的作用(Harvard M，et al.Biochemistry.1984，232500-2507；Davis JM，et al.Int J Pept Protein Res.1987，29685-691)。
由于2對二硫鍵對于人α干擾素的重要性，所以它們的形成和穩(wěn)定性關(guān)系到干擾素的活性，由于其中的一對二硫鍵Cys1-Cys99中的一個Cys位于人α干擾素N末端的第1位，受環(huán)境影響比較大，不易形成二硫鍵，并且形成的二硫鍵容易受溶液中酸、堿、氧化劑和還原劑的影響，從而影響到其活性和穩(wěn)定性。從這個角度出發(fā)，本發(fā)明在人復(fù)合型α干擾素的N末端加了一個氨基酸組成的tag(拉鏈)結(jié)構(gòu)，從而保護了蛋白N末端的第一位的Cys，使其更容易與98位的Cys形成二硫鍵，并有利于二硫鍵的穩(wěn)定。結(jié)果改造后的人復(fù)合型α干擾素活性得到了提高，穩(wěn)定性也得到了增強。
人復(fù)合型α干擾素的tag結(jié)構(gòu)是由氨基酸組成的肽，長度可以從2個到50個氨基酸，其在保護人α干擾素第1位Cys形成二硫鍵的同時，不能影響到其三維空間結(jié)構(gòu)或造成人α干擾素N末端第1位Cys的空間位阻，而干擾素的三級結(jié)構(gòu)表明，N末端是無規(guī)卷曲區(qū)域并暴露在分子表面(J Interferon Cytokine Res.1996，161-6)，所以加入tag結(jié)構(gòu)并不會影響干擾素分子的三維空間結(jié)構(gòu)，另外，本發(fā)明中的tag與人復(fù)合型α干擾素N末端第1位Cys相鄰的氨基酸和相鄰第2位的氨基酸選用小分子氨基酸，即Gly，Ala或Ser，優(yōu)選Gly，排除了相鄰氨基酸側(cè)鏈對N末端第1位Cys造成空間位阻的可能性。實例一 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-人復(fù)合型α干擾素(tag-IFN1)的制備和活性分析1.基因的獲得根據(jù)tag-IFN1的氨基酸序列選擇大腸桿菌偏愛密碼子，清除不利于表達的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計和密碼子的簡并性，設(shè)計以下DNA序列GGATCCGGTAGTGGTTGTGACCTGCCGCAGACTCATTCCCTGGGTAACCGTCGCGCTCTGATCCTGCTGGCACAAATGCGTCGTATCAGCCCGTTTTCTTGTCTGAAGGATCGTCACGACTTTGGCTTTCCGCAAGAAGAATTCGATGGCAACCAGTTCCAGAAAGCACAGGCTATCAGCGTACTGCATGAAATGATCCAGCAAACCTTCAACCTGTTCTCCACTAAAGATAGCTCTGCTGCATGGGACGAAAGCCTGCTGGAGAAATTCTACACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCATGCGTAATTCAGGAAGTAGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGATGAACGTCGATTCTATCCTGGCAGTTAAAAAGTACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACTGAAAAAAAGTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTAGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCCTTCTCTCTGTCTACTAACCTGCAAGAGCGTCTGCGTCGTAAGGAAIAGTAAGCTT根據(jù)上述設(shè)計DNA序列，分別合成9段寡聚DNA單鏈片段，每2段之間依次重疊，重疊長度為18個堿基，再合成與上面序列5’和3’端互補的2個引物，進行PCR，得到600bp大小的全基因序列，其中含有BamHI和HindIII兩個插入的酶切位點。經(jīng)回收純化后由BamHI和HindIII雙酶切，構(gòu)建PUC18載體的BamHI和HindIII之間，含tag-IFN1外源基因的重組質(zhì)粒命名為PUC-IFN，經(jīng)自動測序證實其DNA序列的正確性后用于表達載體的構(gòu)建。2.融合表達重組載體的構(gòu)建分泌型融合表達載體是PMAL-P2，啟動子為Ptac，tag-IFN1的N末端與其載體中融合蛋白部分的C末端融合相連，其中含有蛋白酶TEV的特異識別位點GluAsn Leu Tyr Phe Gln Gly。TEV的酶切位點在Gln和Gly之間。
設(shè)計含限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI的linker序列，見附

圖1，插入PUC18的SacI和BamHI之間，構(gòu)建成PUC-LK。將PUC-IFN的tag-IFN1用BamHI和HindIII雙酶切后，插入PUC-LK的BamHI和HindIII之間構(gòu)建成PUC-LK-IFN。經(jīng)測序證實其DNA序列后可用于表達載體的構(gòu)建。
PMAL-IFN的構(gòu)建方法見附圖2，是將PMAL-P2用SacI和HindIII雙酶切后，回收大片段，將PUC-LK-IFN用SacI和HindIII雙酶切后，回收約630bp的小片段。用T4連接酶連接回收后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選重組子。經(jīng)酶切鑒定和序列分析確證后的克隆命名為PMAL-IFN。3.重組tag-IFN1的融合表達將含tag-IFN1基因的重組表達載體PMAL-IFN轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，單菌落在含100ug/ml Amp的LB培養(yǎng)基中37℃搖瓶過夜，按1∶30接種后培養(yǎng)2-3小時，加入0.3mM IPTG后誘導(dǎo)4小時。菌體用2×電泳上樣緩沖破菌后，10％SDS-PAGE電泳后染色，顯示在68KD處有一明顯的融合蛋白表達帶，表達量占菌體蛋白的15-20％。4.重組tag-IFN1的純化2升實例3中的搖瓶發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體后，用滲透壓法破菌，得到的上清液經(jīng)淀粉親和層析(Amylose Agrose)純化融合蛋白至純度大于95％，加入TEV蛋白酶進行酶切后，再用凝膠過濾層析(Sephacryl S-100)純化得到高純度his-IFN80毫克，總收率約為42％。
得到的tag-IFN1經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定為一條帶，分子量在20.0kD，與理論值19.7kD一致。高效液相色譜分析(HPLC)為一個峰，純度大于98％。5.重組tag-IFN1的抗病毒活性測定重組tag-IFN1抗病毒比活性的測定應(yīng)用Wish細胞病變法，攻擊病毒為VSV(雞胚培養(yǎng)的濾泡口腔炎病毒)。按標準方法計算其抗病毒比活性。參照品為復(fù)合型α干擾素Infergen。結(jié)果見下表。
以上為三次測定結(jié)果的平均值。實例二.Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ser-人復(fù)合型α干擾素(tag-IFN2)的制備和活性分析制備和活性測定的方法參照實例一，活性測定結(jié)果見下表。
以上為三次測定結(jié)果的平均值。實例三.Gly-Ser-人復(fù)合型α干擾素(tag-IFN3)的制備和活性分析制備和活性測定的方法參照實例一，活性測定結(jié)果見下表。
以上為三次測定結(jié)果的平均值。實例四.Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-人復(fù)合型α干擾素(tag-IFN4)的制備和活性分析制備和活性測定的方法參照實例一，活性測定結(jié)果見下表。
以上為三次測定結(jié)果的平均值。附錄.人復(fù)合型α干擾素(Infergen)的氨基酸序列(共166個氨基酸)1 cdlpqthslg nrralillaq mrrispfscl kdrhdfgfpq eefdgnqfqk aqaisvlhem61 iqqtfnlfst kdssaawdes llekfytely qqlndleacv iqevgveetp lmnvdsilav121 rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe rlrrke
權(quán)利要求
1.一種由氨基酸組成的肽段與人復(fù)合型α干擾素的蛋白質(zhì)N末端相連而形成的tag結(jié)構(gòu)。其通式為Xn-B-C-人復(fù)合型α干擾素，其中X、B、C均為氨基酸，n為氨基酸的個數(shù)。
2.權(quán)利要求1中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的肽段長度為2-50個氨基酸，即n＝0-48。
3.權(quán)利要求2中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的肽段長度優(yōu)選4-6個氨基酸，即n＝2-4。
4.權(quán)利要求3中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的肽段長度最優(yōu)為5個氨基酸，即n＝3。
5.權(quán)利要求1中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的特征是其中與人復(fù)合型α干擾素N末端第1位氨基酸相鄰的氨基酸，即氨基酸B，為Gly，Ala或Ser。
6.權(quán)利要求5中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的特征是其中與人復(fù)合型α干擾素N末端第1位氨基酸相鄰的氨基酸，即氨基酸B，優(yōu)選為Gly。
7.權(quán)利要求1中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的特征是其中與人復(fù)合型α干擾素N末端第1位氨基酸相鄰的第2位氨基酸，即氨基酸C，為Gly，Ala或Ser。
8.權(quán)利要求7中，由氨基酸組成的tag結(jié)構(gòu)的特征是其中與人復(fù)合型α干擾素N末端第1位氨基酸相鄰的第2位氨基酸，即氨基酸C，優(yōu)選Gly。
9.權(quán)利要求1中，所說的人復(fù)合型α干擾素包括與復(fù)合型α干擾素Infergen氨基酸序列的同源性大于等于90％的干擾素。
10.權(quán)利要求1中，所說的帶有tag結(jié)構(gòu)的人復(fù)合型α干擾素可以用基因工程重組方法或化學(xué)合成的方法獲得。
11.權(quán)利要求10中，所說的基因工程重組方法所使用的表達系統(tǒng)包括大腸桿菌，酵母，真核細胞和轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)。
12.權(quán)利要求1中，所說的帶有tag結(jié)構(gòu)的人復(fù)合型α干擾素可用于治療和預(yù)防癌癥和病毒性疾病。
全文摘要
本發(fā)明為一種由氨基酸組成的肽段與人復(fù)合型α干擾素蛋白N末端的相連而形成的tag結(jié)構(gòu)，其特點是該結(jié)構(gòu)中與人復(fù)合型α干擾素N末端第1位氨基酸相鄰的氨基酸和相鄰的第2位氨基酸，為小分子氨基酸，即Gly，Ala或Ser，優(yōu)選Gly，該結(jié)構(gòu)可以較好地穩(wěn)定α干擾素的結(jié)構(gòu)，提高其比活性。
文檔編號A61P31/12GK1475505SQ02126098
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月13日
發(fā)明者劉斯香 申請人:北京英萊特生物技術(shù)開發(fā)有限公司