專利名稱：石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列，更具體涉及一種從石斑魚垂體的SMART cDNA文庫中篩選出的一個原腸期開始特異表達的胚胎發(fā)育調(diào)控因子1(Gastrula specific embryonic regulator 1，gerl)的序列、氨基酸序列、時空表達圖譜，本發(fā)明還涉及一種用途。
背景技術(shù)：
石斑魚(E.coioides)為海洋珊瑚礁魚類，屬鮨科(Serranidae)，石斑魚屬(Epinephelus)，是一種名貴的海水魚類，銷售市場穩(wěn)定、價格昂貴，同時石斑魚也是人工繁殖與育苗技術(shù)難度最大的海產(chǎn)魚類之一，至今養(yǎng)殖種苗的供應(yīng)仍依賴捕撈野生天然苗。近年來，日本、東南亞各國、我國臺灣、華南沿海都進行了大規(guī)模的人工養(yǎng)殖。隨著海洋魚類人工規(guī)?；B(yǎng)殖不斷發(fā)展，天然苗種已不能滿足養(yǎng)殖生產(chǎn)的需要，人工育苗成為其持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。盡管已進行了一些初步的繁殖生物學(xué)研究，但對人工育苗的理論基礎(chǔ)---生殖調(diào)控的研究才剛剛起步、基礎(chǔ)十分薄弱。據(jù)張其永等2000年統(tǒng)計，我國已成功繁殖培育出幼苗魚苗的石斑魚種類有赤點石斑魚、鮭點石斑魚、點帶石斑魚、石斑魚等。但實際上它們離能夠較穩(wěn)定地進行種苗批量生產(chǎn)的目標(biāo)尚有相當(dāng)?shù)牟罹唷?br> 石斑魚人工繁殖與育苗的難度主要來自以下幾個方面(1)石斑魚雌雄同體，雌性先熟，然后性轉(zhuǎn)化；(2)受精卵質(zhì)量差，孵化率低；(3)仔魚個體纖細，對開口餌料的要求嚴(yán)格；以及稚、幼魚的自相殘殺習(xí)性、病害等問題。胚胎發(fā)育不僅僅是一個復(fù)雜而有趣的生命現(xiàn)象，而且是一個高度精確、程序化的過程。在早期胚胎發(fā)育調(diào)控過渡期間出現(xiàn)了諸多的變化，其中最關(guān)鍵的無疑是合子型基因的表達。目前尚未克隆分離到調(diào)控石斑魚胚胎發(fā)育的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列，氨基酸序列和時空表達圖譜，篩選方法簡便。該基因為一具有跨膜區(qū)的分泌蛋白，在原腸期開始轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明還涉及一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列在石斑魚人工育苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列在飼料添加劑中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施本發(fā)明所述的gerl是從石斑魚垂體的SMART cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到的一個新基因，在隨機篩選并測序的90個克隆中，共檢測到該基因的2個克隆。其特征是基因gerl cDNA序列和基因gerl編碼蛋白的氨基酸序列(如下)。該基因的cDNA長514bp，有一個252bp(54-305)的開放閱讀框，編碼83個氨基酸，5′非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元；3′非編碼區(qū)長209bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中進行同源搜索，發(fā)現(xiàn)與其它基因無任何同源性，為一新基因。
通過Signal P程序?qū)ζ涞鞍状嬖谛盘栯牡目赡苄赃M行了分析，發(fā)現(xiàn)其N-端的22個氨基酸肽段極可能為信號肽，其信號肽酶的可能切割位點位于第22位和23位氨基酸之間，提示該蛋白為分泌型蛋白(圖1)；采用DAS軟件分析其跨膜結(jié)構(gòu)，顯示該蛋白在對應(yīng)信號肽位置存在跨膜區(qū)(圖2)。
運用RT-PCR技術(shù)考察了其在石斑魚肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、心、肌、垂體、下丘腦、端腦、小腦、中腦、延腦的mRNA水平，考察了其在處于卵子發(fā)生期、卵母細胞成熟期、變性期不同階段石斑魚個體的腦垂體、下丘腦及成熟卵巢和處于變性期的性腺的表達圖譜，考察了其在未受精卵、桑椹期、高囊胚期、原腸中期、胚體期、視泡期、心跳期、出膜前期、出膜后、魚苗1天的表達圖譜，結(jié)果表明該基因在肝、腎、垂體和下丘腦中大量轉(zhuǎn)錄，在脾和胰中有微量轉(zhuǎn)錄，在心、肌、端腦、小腦、中腦和延腦中沒有檢測到其mRNA的存在(圖3)；該基因僅在處于卵子發(fā)生期的垂體和下丘腦中有大量轉(zhuǎn)錄，而在卵母細胞成熟期和變性期的2種垂體和下丘腦，及其成熟卵巢和處于變性期間的性腺都未檢測到其mRNA的存在(圖4)。該基因從原腸中期開始轉(zhuǎn)錄，在視泡期表達達到飽和，直至魚苗1天都無差異(圖5)。
胚胎發(fā)育不僅僅是一個復(fù)雜而有趣的生命現(xiàn)象，而且是一個高度精確、程序化的過程。在早期胚胎發(fā)育調(diào)控過渡期間出現(xiàn)了諸多的變化，其中最關(guān)鍵的無疑是合子型基因的表達。gerl基因在原腸中期開始檢測到其轉(zhuǎn)錄本，一直持續(xù)到在卵子發(fā)生期的肝、腎、垂體和下丘腦中有大量轉(zhuǎn)錄，但在在卵母細胞成熟期和變性期的2種垂體和下丘腦，及其成熟卵巢和處于變性期間的性腺都未檢測到其mRNA的存在，這說明該基因在早期發(fā)育階段具有重要功能。通過制備該基因的原核表達蛋白和真核酵母表達蛋白，用于研究該基因在石斑魚的人工育苗中的作用。通過制備該基因的真核酵母表達蛋白，在飼料添加劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點是鑒于gerl基因是全新基因，目前人類對此基因的認(rèn)識和了解僅限于本發(fā)明人所作的科學(xué)工作研究。由于該基因為具有跨膜區(qū)的分泌型蛋白，在原腸中期開始檢測到其轉(zhuǎn)錄本，一直持續(xù)到在卵子發(fā)生期的肝、腎、垂體和下丘腦中有大量轉(zhuǎn)錄，但在在卵母細胞成熟期和變性期的2種垂體和下丘腦，及其成熟卵巢和處于變性期間的性腺都未檢測到其mRNA的存在，這說明該基因在早期發(fā)育階段具有重要功能。因此該基因的研究可用于通過制備該基因的蛋白，用于研究該基因在石斑魚的人工育苗中的作用。


圖1為Signal P程序分析顯示出的基因gerl的信號肽位置圖1表明通過Signal P程序?qū)ζ涞鞍状嬖谛盘栯牡目赡苄赃M行了分析，發(fā)現(xiàn)其N-端的22個氨基酸肽段極可能為信號肽，其信號肽酶的可能切割位點位于第22位和23位氨基酸之間，提示該蛋白為分泌型蛋白；圖2為DAS推測基因gerl的跨膜區(qū)圖2表明采用DAS軟件分析其跨膜結(jié)構(gòu)，顯示該蛋白在對應(yīng)信號肽位置存在跨膜區(qū)。
圖3為RT-PCR檢測基因gerl在石斑魚組織中的表達圖3表明該基因在肝、腎、垂體和下丘腦中大量轉(zhuǎn)錄，在脾和胰中有微量轉(zhuǎn)錄，在心、肌、端腦、小腦、中腦和延腦中沒有檢測到其mRNA的存在。
圖4為RT-PCR檢測基因gerl在處于卵子發(fā)生期(1)、卵母細胞成熟期(2)、變性期(3)不同階段石斑魚個體的腦垂體、下丘腦及成熟卵巢和處于變性期的性腺中的表達圖4表明該基因僅在處于卵子發(fā)生期的垂體和下丘腦中有大量轉(zhuǎn)錄，而在卵母細胞成熟期和變性期的2種垂體和下丘腦，及其成熟卵巢和處于變性期間的性腺都未檢測到其mRNA的存在。
圖5為RT-PCR檢測基因gerl在石斑魚胚胎發(fā)育過程中的表達圖5表明該基因從原腸中期開始轉(zhuǎn)錄，在視泡期表達達到飽和，直至魚苗1天都無差異。
具體實施例方式
1、RNA的提取和SMART cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建垂體總RNA用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取，步驟具體如下取約500克石斑魚1尾，麻醉放血，開顱取出下丘腦，加入175μl的抽提緩沖溶液，充分勻漿后，加入350μlRNA稀釋緩沖液，混勻后70℃封阻3分鐘，14000×g離心10min。轉(zhuǎn)移上清，加入200μl95％乙醇，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱，14000×g離心1min，加入600μl RNA洗滌液，14000×g離心1min。加入50μl DNA酶I 20-25℃消化15min后加200μl DNA酶終止溶液，14000×g離心1min。加入600μlSV RNA洗滌液，14000×g離心1min后，再次加入250μl RNA洗滌液，高速離心2min。用250μl無RNA酶水洗脫總RNA兩次。取0.5-5μl電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。其余總RNA于-70℃凍結(jié)實，真空凍干機超低溫凍干濃縮，溶解于20-30μll水中，取0.5μl電泳檢測mRNA濃度和質(zhì)量。
SMART cDNA的合成用SMART cDNA library construction Kit(Clontech)試劑盒，具體操作如下合成所用的3個引物序列為(1)CDS引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3′；(2)SmartII寡核苷酸(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′；(3)PCR引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3′。
取垂體總RNA50ng，按文庫構(gòu)建方法合成第一鏈cDNA加入CDS引物和SmartII寡核苷酸各1μl，72℃保溫2min后，冰上速冷2min；然后在終體積為10μL的反應(yīng)體系中，加入5×第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)2μl、DTT(20mmol/L)1μl、dNTP(10mmol/L)1μl和PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃保溫1h合成第一鏈cDNA。取2μl第一鏈cDNA加入dNTP 2μl、PCR引物4μl、和2μl 50×Advantage 2 cDNA Polymerase Mix，于100μl反應(yīng)體系中進行如下PCR循環(huán)95℃預(yù)變性1min后，以95℃ 5s、65℃ 5s、68℃ 6min反應(yīng)13個循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL電泳檢測。此PCR產(chǎn)物用于構(gòu)建質(zhì)粒文庫。合成的SMART cDNA連接入pEGM-T載體中(Promega)，并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中。
2、質(zhì)粒文庫的隨機篩選及測序鋪平板(內(nèi)含100μg/mL氨芐青霉素以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌斑于預(yù)先分裝有100μlAmp-LB的小管中，37℃培養(yǎng)2h以上。取1μl菌液作模板，以M13+和M13-為引物(M13+CAGGAAACAGCTATGAC；M13-GTAAACGACGGCCAGT)，PCR鑒定插入片段大小。將插入片段大于500bp的克隆進行測序(上海，生工)。在隨機篩選并測序的90個克隆中，共檢測到該基因的2個克隆(編號分別為3-25和3-102)。該基因的核苷酸序列及由此推斷出的氨基酸序列結(jié)果見圖1。該基因cDNA長514bp，有一個252bp(54-305)的開放閱讀框，編碼83個氨基酸。5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元；3’非編碼區(qū)長209bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中進行同源搜索，發(fā)現(xiàn)與其它基因無任何同源性，為一新基因(圖1)。
3、組織和胚胎總RNA的提取和RT-PCR反應(yīng)提取了石斑魚的各種組織(包括肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、心、肌、垂體、下丘腦、端腦、小腦、中腦、延腦)的RNA，提取了處于卵子發(fā)生期、卵母細胞成熟期變性期不同階段石斑魚個體的腦垂體、下丘腦及成熟卵巢和處于變性期的性腺的RNA，以及提取了石斑魚胚胎發(fā)育各個時期(包括未受精卵、桑椹期、高囊胚期、原腸中期、胚體期、視泡期、心跳期、出膜前期、出膜后、魚苗1天)的總RNA?？俁NA的提取用SV total RNA isolation system(Promega)提取。具體步驟見操作手冊。各取0.2μg的總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)和寡聚(dT)8-12反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。取第一鏈cDNA稀釋10倍后1μl作模板用該基因的特異引物(3-25-FGAATTCATATGCTGGCTTTGGTCGCATACAC和3-46-RGCTCGAGTTAGTTGTTGAGGTCTTGAA)進行PCR。反應(yīng)體系的總體積為20μl，內(nèi)含1μl模板DNA，0.2μM引物，0.5單位Taq酶，0.1μM dNTP和1×Taq酶反應(yīng)緩沖液。PCR反應(yīng)在Perkin-Elmer DNA GeneAmp PCR System 9600擴增儀上進行，反應(yīng)程序為在94℃預(yù)變性4分鐘后，進行28個擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性40秒，62℃復(fù)性50秒，72℃延伸50秒。最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離。用鯽魚的α-tubulin基因(上游引物5’-GTGCACTGGTCTTCA GGGGTT-3’，下游引物5’-GGGAAGTGGATGCGTGGGTAT-3’)作為對照。
α-tubulin引物做PCR，確證各個組織和各個胚胎發(fā)育時期逆轉(zhuǎn)錄的效率都符合要求而且cDNA的量都相差不多。而該基因的表達圖譜顯示該基因在肝、腎、垂體和下丘腦中大量轉(zhuǎn)錄，在脾和胰中有微量轉(zhuǎn)錄，在心、肌、端腦、小腦、中腦和延腦中沒有檢測到其mRNA的存在(圖4)；該基因僅在處于卵子發(fā)生期的垂體和下丘腦中有大量轉(zhuǎn)錄，而在卵母細胞成熟期和變性期的2種垂體和下丘腦，及其成熟卵巢和處于變性期間的性腺都未檢測到其mRNA的存在(圖5)。該基因從原腸中期開始轉(zhuǎn)錄，在視泡期表達達到飽和，直至魚苗1天都無差異(圖6)。
4、gerl基因融合蛋白的制備以基因開放閱讀框的核苷酸序列與pET-15b載體制備成表達質(zhì)粒，挑單克隆培養(yǎng)至對數(shù)期，加入終濃度為1mmoL的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達3-6h。表達的蛋白N端融合了長20個氨基酸的組氨酸t(yī)ag，可用金屬離子親和層析純化。
5、gerl基因編碼蛋白特異性多克隆抗體將3mL純化蛋白(約100-300μg)與3mL弗氏完全佐劑充分混勻乳化，在家兔的背部皮下多點注射，每點注射約0.2mL。第一次注射2-3周后加強免疫3次，各次劑量為第一次注射的四分之一，每次間隔10天，后3次以弗氏不完全佐劑乳化樣品。在第4次注射后10天自心臟抽取血液。將兔血于37℃放置1h后再在4℃放置過夜，4,000×g離心10min，吸取上層的多抗血清，分裝后于-80℃凍存。
6、gerl基因在酵母中的表達以基因開放閱讀框的核苷酸序列與pGAPZA和pGAPZαB表達載體制備成表達質(zhì)粒，構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入克隆菌株DH5α中，將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BspHI消化，濃縮線性化的DNA片段后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，在Zeocin抗性平板上篩選重組子，3mlYPD(100μg/ml)Zeocin)培養(yǎng)，48h分別取菌體和上清于12.5％的聚丙烯按凝膠電泳。篩選出有特異蛋白表達的克隆。
序列表基因gerl cDNA序列如下GACACTCGATTGTTTTCCTCCTCTGAGACGGACAGCAGAGAGCCACAGCCAAGATGAGACTGTACCTTGCAATTGCCGTGCTGATGCTGGCTTTGGTCGCATACACAGAGGCCCAGGAGGAGACCTTCGAGCAGAAGTTCGCCAAGTTTACCGAGCAGGTGACTCAGGTGGGCCAGAACCTGGGTGAAAGGCTCAAGACCGGCTTTGATGATATCCAAACCAGCGACTTTGCAACCAATTCAAAGGCCCGTCTCAATGAGTTTTTTGAGTGGATGAAGACAAAAGTTCAAGACCTCAACAACTAAACAAGTCCCAGTCTCCAGCCTACAACCTGCCGTCTGACCGCCGACCTCTTCACACAAGTCATCGCTCTGCTCACCACGCAAAATGGTTGTGTTGCCTCTCTGTCAGTGTTTTTTGTAGATTAATTTAAGTGTAATCTTTTGGGGCGAAACAATGTGAAAAAGTGCAATAAAGACATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA基因gerl編碼蛋白的氨基酸序列為MRLYLAIAVLMLALVAYTEAQEETFEQKFAKFTEQVTQVGQNLGERLKTGFDDIQTSDFATNSKARLNEFFEWMKTKVQDLNN
權(quán)利要求
1.一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列，其特征在于基因gerl cDNA序列和基因gerl編碼蛋白的氨基酸序列，該基因cDNA長514bp的開放閱讀框，編碼83氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元，3’非編碼區(qū)長209bp，有多聚腺苷酸加尾信號AAUAAA和多聚腺苷酸尾巴。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列，其特征在于基因gerl cDNA序列GACACTCGATTGTTTTCCTCCTCTGAGACGGACAGCAGAGAGCCACAGCCAAGATGAGACTGTACCTTGCAATTGCCGTGCTGATGCTGGCTTTGGTCGCATACACAGAGGCCCAGGAGGAGACCTTCGAGCAGAAGTTCGCCAAGTTTACCGAGCAGGTGACTCAGGTGGGCCAGAACCTGGGTGAAAGGCTCAAGACCGGCTTTGATGATATCCAAACCAGCGACTTTGCAACCAATTCAAAGGCCCGTCTCAATGAGTTTTTTGAGTGGATGAAGACAAAAGTTCAAGACCTCAACAACTAAACAAGTCCCAGTCTCCAGCCTACAACCTGCCGTCTGACCGCCGACCTCTTCACACAAGTCATCGCTCTGCTCACCACGCAAAATGGTTGTGTTGCCTCTCTGTCAGTGTTTTTTGTAGATTAATTTAAGTGTAATCTTTTGGGGCGAAACAATGTGAAAAAGTGCAATAAAGACATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列，其特征在于基因gerl編碼蛋白的氨基酸序列MRLYLAIAVLMLALVAYTEAQEETFEQKFAKFTEQVTQVGQNLGERLKTGFDDIQTSDFATNSKARLNEFFEWMKTKVQDLNN
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列在石斑魚人工育苗中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列在飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種石斑魚垂體中一個胚胎發(fā)育調(diào)控因子的基因序列及其用途，該基因cDNA長514bp，有一個252bp的開放閱讀框，編碼83個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元，3’非編碼區(qū)長209bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴。該基因在早期發(fā)育階段具有重要功能，該基因在石斑魚的人工育苗中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/7088GK1401655SQ02138829
公開日2003年3月12日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者周莉, 桂建芳 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所