專利名稱：：紅細(xì)胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽的制作方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求以下專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，2001-04-04提交的法國申請(qǐng)F(tuán)R0104603，題為《NouveauxpolynucléotidescomportantdespolymorphismesdetypeSNPfonctionnelsdanslaséquencenucléotidiquedugène(EPO)ainsiquedenouveauxpolypeptidescodésparcespolynucléotidesetleursutilisationsthérapeutiques》；2001-12-21提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/343163，題為ErythropoietinRelatedMoleculesandSingleNucleotidePolymorphisms；2002-01-04提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/345,440，題為ModifiedErythropoietinRelatedMoleculesandSingleNucleotidePolymorphisms；以及2002-02-21提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/358,598，題為NewPolynucleotidesandPolypeptidesoftheEPOGene。
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及來源于紅細(xì)胞生成素基因(EPO)核苷酸序列并包含新的SNP的新的多核苷酸、來源于天然紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)并包含由所述SNP所致突變的新的多肽、及其治療用途。相關(guān)技術(shù)紅細(xì)胞生成素基因，以下簡(jiǎn)稱EPO，描述于文獻(xiàn)JacobsK.等人(1985)″IsolationandcharacterizationofgenomicandcDNAclonesofhumanerythropoietin″；Nature313(6005)，806-810。該基因的核苷酸序列可得自GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)X02158。已知紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)作用于紅細(xì)胞生成造血祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟。決定其分化并成熟為紅細(xì)胞。還已知EPO作為自分泌因子作用于某些紅白血病細(xì)胞，并作為有絲分裂原和內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子(chemoattractant)。還已知EPO刺激活化和分化的B細(xì)胞，并增強(qiáng)B細(xì)胞免疫球蛋白生成和增殖。EPO的合成受連接腎和骨髓的反饋環(huán)路的復(fù)雜控制系統(tǒng)支配。其合成依賴于靜脈氧分壓，在低氧條件下升高。EPO的生成還受其它多種體液因子的影響，例如睪丸素、甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素和兒茶酚胺。相反，諸如IL-1、IL-6和TNF-α等幾種細(xì)胞因子降低EPO的合成。在細(xì)胞中EPO與其受體的結(jié)合可誘導(dǎo)-釋放膜磷脂，-合成二?；视?，-增加細(xì)胞內(nèi)鈣的水平，-提高細(xì)胞內(nèi)pH，以及-增加細(xì)胞內(nèi)磷脂酶A2和磷脂酶C，后者可誘導(dǎo)fos和myc癌基因。已知過量的EPO導(dǎo)致紅細(xì)胞增多。伴有血液粘度和心輸出量增加，并可能還導(dǎo)致心力衰竭和肺性高血壓癥。還觀察到血小板顯著減少。EPO過量的另一副作用是血栓形成。肺栓塞和腦栓塞，即血液轉(zhuǎn)運(yùn)的凝塊或外來化合物突然堵塞血管，也構(gòu)成與EPO消耗有關(guān)的嚴(yán)重副作用。然而，如果EPO的合成量過低，例如在嚴(yán)重腎功能不全的情況下，常觀察到貧血。因此，常將EPO給予血細(xì)胞比容低于0.3的嚴(yán)重腎功能不全的患者，特別是透析患者。使用EPO治療的最重要的并發(fā)癥是張力過高、尿素、鉀和磷酸鹽水平增多、血液粘度增加、生成血小板的祖細(xì)胞和循環(huán)血小板擴(kuò)增。EPO還用于活化紅細(xì)胞生成，能采集自體供體的血液。此外，對(duì)于例如由慢性感染、炎性過程、放射治療和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物治療誘導(dǎo)的非腎型貧血，建議也使用EPO。在某種程度上，EPO還是巨核細(xì)胞生成的刺激因子。EPO活性由IL-4協(xié)同。已經(jīng)證明EPO保護(hù)神經(jīng)元免受局部缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，因此似乎EPO可能通過降低自由基產(chǎn)生并降低氧化應(yīng)力效應(yīng)，而具有神經(jīng)保護(hù)能力。眾所周知，EPO基因與各種人類病癥(disorder)和/或疾病有關(guān)，例如各種癌癥，如惡性腫瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、腫瘤、白血病和肝、頸、頭和腎癌；心血管疾病，例如腦損傷；例如與免疫系統(tǒng)無關(guān)的代謝疾病，如肥胖癥；傳染病，特別是病毒性傳染，例如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS；肺炎；潰瘍性結(jié)腸炎；中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如阿爾茨海默氏病、精神分裂癥和抑郁癥；組織或器官移植排斥；創(chuàng)傷愈合；貧血；變態(tài)反應(yīng)；哮喘；多發(fā)性硬化；骨質(zhì)疏松癥；銀屑??；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；克羅恩氏病(Crohn’sdisease)；自身免疫疾病和病癥；生殖器或性疣；胃腸疾病；以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EPO基因的新的多肽和新的多核苷酸類似物，其能夠具有不同于天然野生型EPO蛋白質(zhì)的功能性。這些新的多肽和多核苷酸可以特別用于治療或預(yù)防前述病癥或疾病，并避免其所帶來的全部或部分害處。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的首要目的在于新的多核苷酸，因其包含一個(gè)或幾個(gè)SNP(單核苷酸多態(tài)性)而不同于參考的野生型EPO基因核苷酸序列。參考的野生型人EPO基因的核苷酸序列SEQIDNO.1由3398個(gè)核苷酸組成，包含核苷酸615(起始密碼子)-2763(終止密碼子)的2149個(gè)核苷酸的編碼序列。EPO基因由5個(gè)外顯子組成，其在核苷酸序列SEQIDNO.1中的位置如下外顯子1核苷酸397-627(包含位于615的起始密碼子)。外顯子2核苷酸1194-1339。外顯子3核苷酸1596-1682。外顯子4核苷酸2294-2473。外顯子5核苷酸2608-3327(包含位于2763的終止密碼子)。申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定了參考的野生型EPO基因核苷酸序列中的12個(gè)SNP。這12個(gè)SNP如下465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明意義上，上文確定的SNP位置的相應(yīng)編號(hào)是相對(duì)于核苷酸序列SEQIDNO.1的編號(hào)而言。字母a、t、c和g分別對(duì)應(yīng)于含氮堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤。第一個(gè)字母表示野生型核苷酸，而最后一個(gè)字母表示突變的核苷酸。因此，例如SNPg1644a表示參考的野生型EPO基因核苷酸序列SEQIDNO.1中的1644位核苷酸g(鳥嘌呤)突變?yōu)楹塑账醓(腺嘌呤)。SNP465-486(缺失)表示一種突變，其中參考的野生型EPO基因核苷酸序列SEQIDNO.1中465-486位的22個(gè)核苷酸已經(jīng)缺失。本申請(qǐng)人利用申請(qǐng)人于2000年12月6日提交的題為″Processforthedeterminationofoneorseveralfunctionalpolymorphism(s)inthenucleotidesequenceofapreselectedfunctionalcandidategeneanditsapplications″的專利申請(qǐng)F(tuán)R0022894中所述測(cè)定方法(在此引入以供參考)鑒定出了這些SNP。該專利申請(qǐng)中所述方法可以從隨機(jī)群體中的至少一個(gè)個(gè)體中鑒定一個(gè)(或幾個(gè))先前存在的SNP。在本發(fā)明范圍內(nèi)，在隨機(jī)選取的群體中的不同個(gè)體中分離EPO基因核苷酸序列片段(例如包含編碼序列)。在DHPLC分析(″變性高效液相層析″)之后，對(duì)某些具有異質(zhì)雙鏈性質(zhì)(即性質(zhì)不同于參考的野生型EPO基因序列)的樣品進(jìn)行這些片段的測(cè)序。這樣測(cè)序的片段然后與參考的野生型EPO基因片段的核苷酸序列作比較，并鑒定與本發(fā)明相符的SNP。因此，該SNP是天然的，其中每一個(gè)均存在于世界人群的某些個(gè)體中。參考的野生型EPO基因編碼對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQIDNO.2的193個(gè)氨基酸的未成熟蛋白質(zhì)，通過斷裂包括前27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽而轉(zhuǎn)變?yōu)?66個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。天然野生型EPO蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)包含稱為A、B、C和D的四個(gè)螺旋。與EPO受體復(fù)合的EPO晶體結(jié)構(gòu)表明，只有A、C、D三個(gè)螺旋與EPO結(jié)合其受體有關(guān)(Syed等人(1998).Efficiencyofsignalingthroughcytokinereceptorsdependscriticallyonreceptororientation.Nature395511-516)。此外，研究EPO活性部位的定點(diǎn)誘變證明，螺旋B中的氨基酸變化對(duì)EPO活性的影響有限(Eliott等人(1997).Mappingoftheactivesiteofrecombinanthumanerythropoietin.Blood.89493-502；Wen等人(1994).Erythropoietinstructure-functionrelationships.Identificationoffunctionallyimportantdomains.J.Biol.Chem.26922839-22846)。本發(fā)明的每一個(gè)編碼SNP，即g1644a、g2357a、c2621g，引起EPO基因核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列水平的改變。這些氨基酸序列的改變?nèi)缦戮幋aSNPg1644a引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQIDNO.2的EPO基因未成熟蛋白質(zhì)的70位氨基酸天冬氨酸(D)突變?yōu)樘扉T冬酰胺(N)，其位于成熟蛋白質(zhì)的43位。在本發(fā)明的說明書中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱為D43N或D70N。編碼SNPg2357a引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQIDNO.2的EPO基因未成熟蛋白質(zhì)的104位氨基酸甘氨酸(G)突變?yōu)榻z氨酸(S)，其位于成熟蛋白質(zhì)的77位。在本發(fā)明的說明書中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱為G77S或G104S。編碼SNPc2621g引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQIDNO.2的EPO基因未成熟蛋白質(zhì)的147位氨基酸絲氨酸(S)突變?yōu)榘腚装彼?C)，其位于成熟蛋白質(zhì)的120位。在本發(fā)明的說明書中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱為S120C或S147C。編碼SNPg1644a、g2357a和c2621g引起本發(fā)明的多肽較之野生型參考EPO基因核苷酸序列編碼的多肽，其空間構(gòu)象改變。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，通過計(jì)算機(jī)分子模建(modeling)，例如借助denovo(例如SEQFOLD/MSI)、同源性(例如MODELER/MSI)、最小化勢(shì)場(chǎng)(forcefield)(例如DISCOVER、DELPHI/MSI)和/或分子動(dòng)力學(xué)(例如CFF/MSI)模建工具，可以觀察到這些改變。下文實(shí)驗(yàn)部分給出了上述模型的實(shí)例。1/計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的D43N突變涉及位于EPO蛋白質(zhì)螺旋A和螺旋B之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)改變，以及在P129-I133氨基酸區(qū)域連接EPO蛋白質(zhì)螺旋C和D的長(zhǎng)環(huán)的結(jié)構(gòu)變化。這些殘基位于突變氨基酸N43之前。由于該突變位于接近與結(jié)合EPO受體有關(guān)的短螺旋F48-R53，可能影響EPO蛋白質(zhì)與其受體的相互作用。在所有的EPO直向同源物(orthologues)中，D43殘基高度保守。它可能與在EPO直向同源物中同樣保守的帶正電荷的殘基(K45、R131)形成鹽鍵。因此，該突變蛋白質(zhì)具有不同于野生型EPO基因編碼的天然野生型EPO蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象。計(jì)算機(jī)分子模建還預(yù)測(cè)，43位氨基酸天門冬酰胺的存在涉及天然野生型EPO蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重大改變。2/計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的G77S突變涉及螺旋B的C端完全伸展，其起因于與螺旋D中183位苯丙氨酸殘基的空間位阻以及螺旋A和螺旋B之間環(huán)上親水性(77位絲氨酸)和疏水性(35位亮氨酸)氨基酸之間不利的相互作用。G77殘基埋藏于野生型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。因此，該突變蛋白質(zhì)具有不同于野生型EPO基因編碼的天然野生型EPO蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象。計(jì)算機(jī)分子模建還預(yù)測(cè)，77位氨基酸絲氨酸的存在涉及天然野生型EPO結(jié)構(gòu)和功能的重大改變，特別是通過改變EPO與其受體的親合力。3/計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的S120C突變涉及位于螺旋C和螺旋D之間、特別是116位賴氨酸和125位丙氨酸之間的環(huán)的結(jié)構(gòu)改變。野生型EPO蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)S120和K116殘基之間的氫鍵在突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中斷裂。因此，該突變蛋白質(zhì)具有不同于野生型EPO基因編碼的天然野生型EPO蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象。計(jì)算機(jī)分子模建還預(yù)測(cè)，120位氨基酸半胱氨酸的存在涉及天然野生型EPO蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重大改變有關(guān)。本發(fā)明的其它SNP，即465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634a，并不涉及EPO基因核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列SEQIDNO.2水平的改變。SNPc1288t、t1607c、g2634a是沉默型，而SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1347t、g2228a、c2502t是非編碼型。本發(fā)明的多核苷酸可以按這種方式進(jìn)行基因分型，以便確定這些多核苷酸在群體中的等位頻率。下文實(shí)驗(yàn)部分給出了關(guān)于SNPg1644a和c2621g的兩個(gè)基因分型的實(shí)例。按照以下文獻(xiàn)所述方法的生物活性實(shí)驗(yàn)，可以同樣測(cè)定本發(fā)明多肽的功能性。-Bittorf等人；″RapidactivationoftheMAPkinasepathwayinhematopoieticcellsbyerythropoietin，granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorandinterleukin-3″；CellSignal；1994；Mar；6(3)305-11.-Chretien等人；″Erythropoietin-inducederythroiddifferentiationofthehumanerythroleukemiacelllineTF-1correlateswithimpairedSTAT5activation″；EMBOJ.；1996Aug15；15(16)4174-81.-Porteu等人；″Functionalregionsofthemousethrombopoietinreceptorcytoplasmicdomainevidenceforacriticalregionwhichisinvolvedindifferentiationandcanbecomplementedbyerythropoietin″；Mol.Cell.Biol.；1996May；16(5)2473-82.-Pallard等人；″ThrombopoietinactivatesaSTAT5-likefactorinhematopoieticcells″；EMBOJ.；1995Jun15；14(12)2847-56.本發(fā)明目的還在于本發(fā)明的多核苷酸和多肽、以及由這些多核苷酸和多肽而獲得和/或鑒定的治療性分子的用途，特別是用于預(yù)防和治療某些人類病癥和/或疾病。該分子特別用于預(yù)防或治療貧血，特別是腎機(jī)能不全的透析患者，以及由慢性感染、炎性過程、放射治療、化學(xué)治療所致貧血，并用于預(yù)防腦損傷。該分子更特別用于增加自體血液生成，特別是參與不同自體血液采集程序的患者，以避免使用他人血液。附圖簡(jiǎn)述圖1A代表本發(fā)明包含SNPD70N的編碼蛋白質(zhì)和天然野生型紅細(xì)胞生成素的模建。圖1B代表突變型和野生型蛋白質(zhì)右側(cè)部分的模建。在圖1A和1B中，黑色條帶代表天然野生型紅細(xì)胞生成素的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表突變的紅細(xì)胞生成素(D70N)的結(jié)構(gòu)。圖2A代表本發(fā)明包含SNPG104S的編碼蛋白質(zhì)和天然野生型紅細(xì)胞生成素的模建。圖2B代表突變型和野生型蛋白質(zhì)下側(cè)部分的模建。在圖2A和2B中，黑色條帶代表天然野生型紅細(xì)胞生成素的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表突變的紅細(xì)胞生成素(G104S)的結(jié)構(gòu)。圖3A代表本發(fā)明包含SNPS147C的編碼蛋白質(zhì)和天然野生型紅細(xì)胞生成素的模建。圖3B代表突變型和野生型蛋白質(zhì)左上部分的模建。在圖3A和3B中，黑色條帶代表天然野生型紅細(xì)胞生成素的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表突變的紅細(xì)胞生成素(S147C)的結(jié)構(gòu)。圖4代表G104S突變的紅細(xì)胞生成素和野生型紅細(xì)胞生成素(包含于蛋白質(zhì)提取物中)對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人紅細(xì)胞生成素受體的32D小鼠細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的影響。圖4A和4B分別代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖5代表純化的G104S突變的紅細(xì)胞生成素和純化的野生型紅細(xì)胞生成素對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人紅細(xì)胞生成素受體的32D小鼠細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的影響。圖5A和5B分別代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6代表G104S突變的紅細(xì)胞生成素(白色三角形)或野生型紅細(xì)胞生成素(黑色方塊)刺激后的紅系集落形成。圖7代表G104S突變的紅細(xì)胞生成素(圓圈)和野生型紅細(xì)胞生成素(星形)對(duì)人EPO受體外部的結(jié)合能力。給出了利用兩個(gè)濃度紅細(xì)胞生成素得到的數(shù)據(jù)7.5nM(白色)、15nM(黑色)。發(fā)明詳述定義″參考的野生型基因核苷酸序列″可理解為人EPO基因的核苷酸序列SEQIDNO.1，其可得自GenBank登錄號(hào)X02158，并描述于JacobsK.等人；″IsolationandcharacterizationofgenomicandcDNAclonesofhumanerythropoietin″；Nature313(6005)，806-810(1985)?！逄烊灰吧图t細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)″可理解為由參考的野生型EPO基因的核苷酸序列編碼的成熟蛋白質(zhì)。天然野生型非成熟EPO蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于肽序列SEQIDNO.2。″多核苷酸″可理解為可以是被修飾的或未修飾的DNA或RNA的多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸。術(shù)語多核苷酸包括，例如單鏈或雙鏈DNA、由一個(gè)或幾個(gè)單鏈區(qū)以及一個(gè)或幾個(gè)雙鏈區(qū)的混合物組成的DNA、單鏈或雙鏈RNA以及由一個(gè)或幾個(gè)單鏈區(qū)以及一個(gè)或幾個(gè)雙鏈區(qū)的混合物組成的RNA。術(shù)語多核苷酸還可以包括包含一個(gè)或幾個(gè)三鏈區(qū)的RNA和/或DNA。多核苷酸同樣可理解為包含一個(gè)或幾個(gè)修飾的堿基的DNA和RNA，從而因穩(wěn)定性或其它原因而修飾骨架。修飾的堿基可理解為，例如諸如次黃苷等稀有堿基?！宥嚯摹蹇衫斫鉃榘ㄟ^正?；蛐揎椀碾逆I(例如，諸如在同型空間配位肽的情況下)彼此互聯(lián)的至少兩個(gè)氨基酸的肽、寡肽、寡聚體或蛋白質(zhì)。多肽可以由除遺傳密碼定義的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸組成。多肽同樣可以由利用天然過程(諸如翻譯后成熟過程)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)過程修飾的氨基酸組成。文獻(xiàn)中充分詳述了這些修飾。這些修飾可以出現(xiàn)在多肽的任何位置肽骨架、氨基酸鏈乃至羧基或氨基末端。多肽可以是泛素化之后的分支狀，或者有或無分支的環(huán)狀。這類修飾可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的天然或合成的翻譯后過程的結(jié)果。例如，多肽修飾可理解為包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)固定、血紅素的共價(jià)固定、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)固定、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)固定、磷脂酰肌醇的共價(jià)固定、共價(jià)或非共價(jià)交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；?、γ-羧基化、糖基化包括聚乙二醇化(pegylation)、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、十四?；⒀趸?、蛋白水解過程、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、seneloylation、硫酸酯化(sulfatation)、氨基酸加成，諸如精氨酸化或泛素化。文獻(xiàn)中充分詳述了這些修飾PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，NewYork，1993，POSTTRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，NewYork，1983，Seifter等人″Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactors″，Meth.Enzym0l.(1990)182626-646etRattan等人″ProteinSynthesisPost-translationalModificationsandAging″，AnnNYAcadSci(1992)66348-62。″超糖基化多肽″或″多肽的超糖基化類似物″可理解為其氨基酸序列已經(jīng)改變?yōu)榫哂兄辽倭硪粋€(gè)增加的糖基化位點(diǎn)的多肽，或者氨基酸序列相同、但其糖基化水平已經(jīng)提高的多肽。″分離的多核苷酸″或″分離的多肽″可理解為如前文定義的分離自人體、或通過技術(shù)方法產(chǎn)生的多核苷酸或多肽。″同一性″可理解為測(cè)定核苷酸或多肽序列的同一性。同一性是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語，文獻(xiàn)對(duì)其有詳細(xì)描述。參見COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY，Lesk，A.M.，Ed.，OxfordUniversityPress，NewYork，1998；BIOCOMPUTINGINFORMATICSANDGENOMEPROJECT，Smith，D.W.，Ed.，AcademicPress，NewYork，1993；COMPUTERANALYSISOFSEQUENCEDATA，PARTI，Griffin，A.M.和GriffinH.G.，Ed，HumanaPress，NewJersey，1994；etSEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987。文獻(xiàn)中同樣詳述了常用來確定兩個(gè)序列之間同一性和相似性的方法。參見GUIDETOHUGECOMPUTER，MartinJ.Bishop，Ed，AcademicPress，SanDiego，1994，以及CarilloH.和LiptonD.，SiamJAppliedMath(1988)481073。例如，與核苷酸序列SEQIDNO.1具有至少95％同一性的多核苷酸是與該序列相比，每100個(gè)核苷酸中包含至多5個(gè)突變點(diǎn)的多核苷酸。這些突變點(diǎn)可以是一個(gè)(或幾個(gè))核苷酸的一個(gè)(或幾個(gè))替換、添加和/或缺失。同樣，例如與氨基酸序列SEQIDNO.2具有至少95％同一性的多肽是與該序列相比，每100個(gè)氨基酸中包含至多5個(gè)突變點(diǎn)的多肽。這些突變點(diǎn)可以是一個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的一個(gè)(或幾個(gè))替換、添加和/或缺失。本發(fā)明的多核苷酸和多肽并不完全分別等同于核苷酸序列SEQIDNO.1或氨基酸序列SEQIDNO.2，應(yīng)當(dāng)理解這些序列包含至少一個(gè)本發(fā)明的SNP，而被認(rèn)為是這些序列的變體。本發(fā)明的多核苷酸通常與包含至少一個(gè)本發(fā)明的SNP的核苷酸序列SEQIDNO.1具有相同或幾乎相同的生物活性。同樣，本發(fā)明的多肽通常與包含至少一個(gè)本發(fā)明的編碼SNP的氨基酸序列SEQIDNO.2具有相同或幾乎相同的生物活性。例如，通過定點(diǎn)誘變或直接合成，可以獲得本發(fā)明的變體?！錝NP″可理解為核苷酸序列中堿基的任何天然變異。核苷酸序列的SNP可以是編碼、沉默或非編碼型。編碼SNP是包括在核苷酸序列的編碼序列內(nèi)一種多態(tài)性，其涉及該核苷酸序列所編碼氨基酸序列中的氨基酸改變。在這種情況下，術(shù)語SNP經(jīng)外延同樣適用于氨基酸序列中的突變。沉默SNP是包括在核苷酸序列的編碼序列內(nèi)一種多態(tài)性，其不涉及該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列中的氨基酸改變。非編碼SNP是包括在核苷酸序列的非編碼序列中的一種多態(tài)性。該多態(tài)性特別發(fā)現(xiàn)于內(nèi)含子、拼接區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子位點(diǎn)序列中?！骞δ苄許NP″可理解為如前文定義的、包括在核苷酸序列或氨基酸序列中的具有功能性的SNP。″功能性″可理解為多肽或多核苷酸的生物活性。本發(fā)明的多肽或多核苷酸的功能性可以是保留、增加、降低或抑制野生型參考基因的核苷酸序列編碼的多肽或后者核苷酸序列的生物活性。本發(fā)明的多肽或多核苷酸的功能性同樣可以是野生型參考基因的核苷酸序列編碼的多肽或后者核苷酸序列的生物活性的本質(zhì)改變。生物活性可以特別涉及本發(fā)明的多肽與受體有或沒有親合力。多核苷酸本發(fā)明的首要目的在于分離的多核苷酸，其包含a)與序列SEQIDNO.1或其編碼序列(核苷酸615-2763)具有至少80％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選95％的同一性以及更優(yōu)選至少99％同一性的核苷酸序列，應(yīng)當(dāng)理解該核苷酸序列包含至少一個(gè)以下編碼SNPg1644a、g2357a、c2621g，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明同樣涉及分離的多核苷酸，其包含a)核苷酸序列SEQIDNO.1或其編碼序列，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)以下編碼SNPg1644a、g2357a、c2621g，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選由序列SEQIDNO.1或其編碼序列組成，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)以下編碼SNPg1644a、g2357a、c2621g。根據(jù)本發(fā)明，先前定義的多核苷酸包含選自g1644a、g2357a和c2621g單一的編碼SNP。如先前定義的多核苷酸同樣可以包括至少一個(gè)以下非編碼和沉默SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634a。本發(fā)明的目的同樣在于分離的多核苷酸，其包含或由下列序列組成a)核苷酸序列SEQIDNO.1或必要時(shí)其編碼序列，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)以下非編碼或沉默SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634a，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，以下沉默SNPc1288t、t1607c、g2634a位于核苷酸序列SEQIDNO.1的編碼序列中。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其由部分的下列序列組成a)核苷酸序列SEQIDNO.1或必要時(shí)其編碼序列，應(yīng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)下列SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。該分離的多核苷酸由至少10個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明的目的還在于分離的多核苷酸，其編碼的多肽包含a)氨基酸序列SEQIDNO.2，或b)包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193位之間所含氨基酸的氨基酸序列，應(yīng)理解a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPD70N、G104S、S147C。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明意義上，定位D70N、G104S、S147CSNP的相應(yīng)編號(hào)是相對(duì)于氨基酸序列SEQIDNO.2的編號(hào)而言。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選目的，先前定義的多肽包含單個(gè)如上定義的編碼SNP。更優(yōu)選地，本發(fā)明的目的還在于編碼包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分的多肽、并具有SNPG104S的分離的多核苷酸。本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸由DNA或RNA分子組成。本發(fā)明的多核苷酸可以由標(biāo)準(zhǔn)DNA或RNA合成方法獲得。利用定點(diǎn)誘變從EPO基因的核苷酸序列開始，通過核苷酸序列SEQIDNO.1中每個(gè)SNP的突變核苷酸修飾野生型核苷酸，同樣可以獲得本發(fā)明的多核苷酸。例如，利用定點(diǎn)誘變從EPO基因的核苷酸序列開始，通過在核苷酸序列SEQIDNO.1中2357位用核苷a酸修飾核苷酸g，可以獲得本發(fā)明包含SNPg2357a的多核苷酸。可以這樣實(shí)施的定點(diǎn)誘變方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。特別提到的是文獻(xiàn)TAKunkel，1985″Proc.Natl.Acad.Sci.USA″82488。分離的多核苷酸同樣可以包括，例如編碼前(pre-)、原(pro-)或前原(pre-pro-)蛋白質(zhì)氨基酸序列或諸如六組氨酸肽等標(biāo)志氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸同樣可以連接編碼其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的核苷酸序列，以獲得融合蛋白質(zhì)或其它純化產(chǎn)物。本發(fā)明的多核苷酸同樣可以包括諸如5’和/或3’非編碼序列的核苷酸序列，例如轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄序列、翻譯或非翻譯序列、拼接信號(hào)序列、多腺苷酸化序列、核糖體結(jié)合序列乃至穩(wěn)定mRNA的序列。與核苷酸或多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列可定義為可以在嚴(yán)格條件下與該核苷酸序列雜交的核苷酸序列?！鍑?yán)格雜交條件″一般但不一定理解為允許具有至少80％、優(yōu)選大于或等于90％、更優(yōu)選大于或等于95％、最優(yōu)選大于或等于97％的同一性的核苷酸序列雜交的化學(xué)條件。可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得嚴(yán)格條件，例如將多核苷酸在包含50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH＝7.6)、5xDenhardt液、10％硫酸葡聚糖和20μg變性鮭精DNA的溶液中，于42℃溫育，然后于0.1xSSC、65℃洗滌濾膜。在本發(fā)明范圍內(nèi)，如果該嚴(yán)格條件允許具有100％同一性的核苷酸序列雜交，則認(rèn)為該核苷酸序列與a)中所述核苷酸序列嚴(yán)格互補(bǔ)。在本發(fā)明的涵義中可以理解，與一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列包含至少一個(gè)本發(fā)明的反義SNP。因此，舉例來說，如果該核苷酸序列包含SNPg1644a，則其互補(bǔ)核苷酸序列在相當(dāng)于1644的位置包含核苷酸t(yī)。包含SNP的多核苷酸的鑒定、雜交和/或擴(kuò)增本發(fā)明的目的還在于全部或部分的先前定義的多核苷酸的用途，以鑒定、雜交和/或擴(kuò)增由核苷酸序列SEQIDNO.1或必要時(shí)其編碼序列(核苷酸615-2763)組成的全部或部分多核苷酸，這些序列中每個(gè)均包含至少一個(gè)下列SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。基因分型并測(cè)定SNP頻率本發(fā)明的目的同樣在于本發(fā)明的全部或部分多核苷酸的用途，用于與EPO基因的核苷酸序列具有90-100％同一性、并包含至少一個(gè)下列SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a的核苷酸序列的基因分型。根據(jù)本發(fā)明，可以對(duì)個(gè)體或個(gè)體群進(jìn)行基因分型。在本發(fā)明的涵義中，基因分型可定義為用于測(cè)定個(gè)體或個(gè)體群基因型的方法?；蛐陀纱嬖谟谝粋€(gè)或多個(gè)特定座位的等位基因構(gòu)成?！鍌€(gè)體群″可理解為以隨機(jī)或非隨機(jī)方式選擇的一群確定的個(gè)體。這些個(gè)體可以是人類、動(dòng)物、微生物或植物。該個(gè)體群一般包含至少10個(gè)成員，優(yōu)選100-300個(gè)成員。可以根據(jù)種族或表現(xiàn)型選擇個(gè)體，特別是受以下病癥和/或疾病影響的個(gè)體癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。所述癌癥和腫瘤包括包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤(carcinoidtumor)以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病(Crohn’sdisease)以及潰瘍性結(jié)腸炎。所述心血管疾病可能包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。所述代謝疾病可能包括此類非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。所述疾病和病癥可能還包括創(chuàng)傷愈合和骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明的化合物可能優(yōu)選用于制備意在增加自體血液生成、特別是參與不同自體血液采集程序的患者的的自體血液生成的治療性化合物，以避免使用他人血液。優(yōu)選對(duì)個(gè)體群進(jìn)行本發(fā)明功能性SNP的基因分型?，F(xiàn)有許多技術(shù)可以用來進(jìn)行SNP基因分型(特別參見KwokPharmacogenomics，2000，卷1，95-100頁?！錒igh-throughputgenotypingassayapproaches″)。這些技術(shù)基于以下四原理之一等位基因特異性寡核苷酸雜交、任選在脫氧核苷酸存在下通過雙脫氧核苷酸的寡核苷酸延伸、等位基因特異性寡核苷酸的連接或等位基因特異性寡核苷酸的斷裂。其中每個(gè)技術(shù)都可與諸如直接或偏振熒光測(cè)定、或質(zhì)譜分析等檢測(cè)系統(tǒng)相連。利用熱ddNTP(由不同熒光團(tuán)標(biāo)記的兩種不同的ddNTP)和冷ddNTP(兩種不同的非標(biāo)記的ddNTP)的微型測(cè)序，結(jié)合偏振熒光掃描儀，可以特別進(jìn)行基因分型。利用讀取偏振熒光的微型測(cè)序方法(FP-TDI技術(shù)或熒光偏振模板-直接染料-終止物參入)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。它可以對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增每一個(gè)體DNA后獲得的產(chǎn)物進(jìn)行。選擇包括含所研究SNP的多核苷酸基因區(qū)域的PCR產(chǎn)物。在PCR熱循環(huán)儀的最后步驟之后，將平板置于偏振熒光掃描儀，利用熒光團(tuán)特異性激發(fā)和發(fā)射濾片讀取標(biāo)記堿基。在圖表上報(bào)告標(biāo)記堿基的強(qiáng)度值。就本發(fā)明SNP的PCR擴(kuò)增而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易根據(jù)本發(fā)明SNP的定位，選擇分別的有義和反義引物。例如，用來PCR擴(kuò)增包含SNPg2228a、g2357a、c2502t、c2621g和/或g2634a的序列片段的有義和反義核苷酸序列分別為SEQIDNO.3有義引物(A)TTGCATACCTTCTGTTTGCTSEQIDNO.4反義引物(B)CACAAGCAATGTTGGTGAG上述核苷酸序列可以擴(kuò)增核苷酸序列SEQIDNO.1中2192-2817位核苷酸的626個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。然后對(duì)個(gè)體群中由包含SNP的基因編碼的每個(gè)等位基因的頻率(等位頻率)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定其影響的重要性及其在不同亞群、特別是必要時(shí)在構(gòu)成該個(gè)體群的不同種群中的分布。分析基因分型數(shù)據(jù)，估計(jì)在所研究群體中觀察到的不同等位基因的分布頻率?？山柚谲浖?，例如SAS-suite(SAS)或SPLUS(MathSoft)，計(jì)算等位頻率。利用軟件ARLEQUIN和SAS-suite，可以比較本發(fā)明SNP在個(gè)體群中不同種群的等位分布。本發(fā)明還涉及本發(fā)明多核苷酸在研究一個(gè)個(gè)體EPO核苷酸序列的一個(gè)變異中的用途。本發(fā)明的SNP作為遺傳標(biāo)志鑒于SNP修飾基因功能性序列(例如啟動(dòng)子、拼接位點(diǎn)、編碼區(qū))很可能與疾病易感性或抗性直接有關(guān)，所有SNP(不論功能性與否)均可能提供用于鑒定與疾病狀態(tài)有關(guān)的一種或幾種基因的重要標(biāo)志，從而可能與該疾病狀態(tài)間接相關(guān)。(參見Cargill等人(1999).NatureGenetics22231-238；Riley等人(2000).Pharmacogenomics139-47；RobertsL.(2000).Science2871898-1899)。因此，本發(fā)明還涉及數(shù)據(jù)庫，其包含EPO基因多核苷酸中至少一個(gè)下列SNP的465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。應(yīng)當(dāng)理解，該SNP按核苷酸序列SEQIDNO.1編號(hào)?？煞治鲈摂?shù)據(jù)庫，確定以下兩者之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(i)EPO基因多核苷酸中的至少一個(gè)下列SNP465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a，以及(ii)疾病或疾病抗性。本發(fā)明還涉及EPO基因多核苷酸中至少一個(gè)下列SNP的用途465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a，用于開發(fā)疾病或疾病抗性的診斷/預(yù)后試劑盒。諸如上文定義的本發(fā)明SNP可直接或間接與疾病或疾病抗性有關(guān)。優(yōu)選地，這些疾病可能是上文定義的疾病。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明目的還在于包含至少一種本發(fā)明多核苷酸的重組載體?？梢允褂枚喾N表達(dá)系統(tǒng)，例如染色體、附加體、衍生病毒。更特別而言，所用重組載體可來自于細(xì)菌質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、諸如桿狀病毒等病毒、諸如SV40等乳頭狀瘤病毒、痘苗病毒、腺病毒、?？怂苟徊《?foxpoxviruse)、假狂犬病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些重組載體同樣可以是粘?；蚴删Ｑ苌??？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，將核苷酸序列插入重組表達(dá)載體，例如MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，Sambrook等人，第二版，Co1dSpringHarborLaboratoryPress，Co1dSpringHarbor，N.Y.(1989)中所述的方法。該重組載體可以包括控制多核苷酸表達(dá)調(diào)節(jié)的核苷酸序列、以及可表達(dá)和轉(zhuǎn)錄本發(fā)明多核苷酸、翻譯本發(fā)明多肽的核苷酸序列，根據(jù)所用宿主細(xì)胞選擇這些序列。因此，例如可以將合適的分泌信號(hào)引入重組載體，以便將本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì)間隙、膜或細(xì)胞外環(huán)境。本發(fā)明目的還在于包含本發(fā)明重組載體的宿主細(xì)胞。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY，Davis等人，1986和MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL(同上)中所述諸如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染等方法，可以將重組載體引入宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是例如細(xì)菌細(xì)胞諸如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌細(xì)胞(Bacillussubtilis)，真菌細(xì)胞諸如酵母細(xì)胞和曲霉菌屬、鏈霉菌屬細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞諸如果蠅S2(DrosophiliaS2)和SpodopteraSf9細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞諸如CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK293細(xì)胞，以及所治療受試者的人類細(xì)胞乃至植物細(xì)胞。例如可用來表達(dá)本發(fā)明多肽或作為藥物組合物中活性產(chǎn)物的宿主細(xì)胞參見下文。多肽本發(fā)明目的還在于分離的多肽，其包含與以下序列具有至少80％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、更加優(yōu)選至少99％同一性的氨基酸序列a)氨基酸序列SEQIDNO.2，或b)包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193位之間所含氨基酸的氨基酸序列，應(yīng)理解a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPD70N、G104S、S147C。本發(fā)明的多肽同樣可以包含a)氨基酸序列SEQIDNO.2，或b)包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193位之間所含氨基酸的氨基酸序列，應(yīng)理解a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPD70N、G104S、S147C。本發(fā)明的多肽可以更特別由下列序列組成a)氨基酸序列SEQIDNO.2，或b)包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193位之間所含氨基酸的氨基酸序列，應(yīng)理解a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPD70N、G104S、S147C。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含選自D70N、G104S和S147C中的單個(gè)編碼SNP。更優(yōu)選地，本發(fā)明多肽包含氨基酸序列SEQIDNO.2的氨基酸28-193、并具有SNPG104S。本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的超糖基化類似物，以便改進(jìn)其治療特性。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列SEQIDNO.2的氨基酸28-193、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列SEQIDNO.2的氨基酸28-193、并具有SNPG104S的多肽的聚乙二醇化類似物。實(shí)際上，本領(lǐng)域已知，寡糖成分可以顯著影響有關(guān)治療性糖蛋白效力的特性，包括物理穩(wěn)定性、蛋白酶攻擊抗性、與免疫系統(tǒng)的相互作用、藥代動(dòng)力學(xué)和特定生物活性(例如參見Dube等人J.Biol.Chem.263，17516(1988)；Delorme等人Biochemistry31，9871-9876(1992))。而野生型人尿源性EPO和重組野生型人EPO包含三個(gè)N-連接和一個(gè)O-連接寡糖鏈，共包含糖蛋白總分子量約40％，有可能增加蛋白質(zhì)上糖鏈的數(shù)目?？稍黾拥鞍踪|(zhì)上糖鏈數(shù)目的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，包括如下-利用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生氨基酸殘基替換或添加引入可供糖基化的新位點(diǎn)(例如參見EP0640619以及公開號(hào)為20020037841的美國專利申請(qǐng)09/853731)。-使用如WO9954342申請(qǐng)所示含有編碼目的蛋白質(zhì)的核酸以及至少一種編碼修飾糖蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸的宿主細(xì)胞，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改造。本發(fā)明的目的同樣在于制備上述多肽的方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前面定義的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分離該多肽。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如利用諸如鹽、特別是硫酸銨、乙醇、丙酮或三氯乙酸等離液劑沉淀；酸提?。浑x子交換層析；磷酸纖維素層析；疏水作用層析；親合層析；羥磷灰石層析或排阻層析，可以從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化多肽。″培養(yǎng)基″可理解為從中分離或純化本發(fā)明多肽的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以由細(xì)胞外培養(yǎng)基和/或細(xì)胞裂解物組成。如果該多肽的構(gòu)象在分離或純化期間改變，同樣可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法恢復(fù)該多肽的活性構(gòu)象?？贵w本發(fā)明的目的還在于獲得免疫特異性抗體的方法?！蹇贵w″可理解為包括單克隆、多克隆、嵌合、單鏈、人源化抗體以及Fab片段，包括Fab或免疫球蛋白表達(dá)文庫產(chǎn)物。利用本發(fā)明的多肽免疫動(dòng)物，可以獲得免疫特異性抗體。本發(fā)明還涉及前面定義的本發(fā)明多肽的免疫特異性抗體。本發(fā)明的多肽、其片段之一、類似物、其變體之一或表達(dá)該多肽的細(xì)胞，也可以用來產(chǎn)生免疫特異性抗體。術(shù)語″免疫特異性″是指該抗體對(duì)于本發(fā)明的多肽比對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)已知的其它多肽具有更好的親合力。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，將本發(fā)明的多肽、其片段之一、類似物或表位片段、或表達(dá)該多核苷酸的細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物、優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物，可以獲得免疫特異性抗體。為制備單克隆抗體，可以從細(xì)胞系開始，使用抗體制備的典型方法，例如雜交瘤(trioma)技術(shù)(Kohler等人，Nature(1975)256495-497)，三源雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，ImmunologyToday(1983)472)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY，77-96頁，AlanR.Liss，1985)。同樣可以使用單鏈抗體制備技術(shù)，例如美國專利4,946,778所述。諸如小鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物同樣可以用來制備人源化抗體。與本發(fā)明多肽相互作用的試劑(agent)本發(fā)明的目的同樣在于鑒定活化或抑制本發(fā)明多肽的試劑的方法，其包含a)制備包含本發(fā)明的含有至少一個(gè)編碼SNP的多核苷酸的重組載體，b)制備包含a)中重組載體的宿主細(xì)胞，c)將b)中宿主細(xì)胞接觸待測(cè)試劑，以及d)確定待測(cè)試劑產(chǎn)生的活化或抑制作用。本發(fā)明的多肽還可以用于篩選與其相互作用的化合物的方法。這些化合物可以是本發(fā)明多肽固有活性的活化劑(激動(dòng)劑)或抑制劑(拮抗劑)。這些化合物同樣可以是本發(fā)明多肽的配基或底物。參見Coligan等人，CurrentProtocolsinImmunology1(2)，Chapter5(1991)。一般而言，為實(shí)施上述方法，最理想的是制備表達(dá)本發(fā)明多肽的合適的宿主細(xì)胞。此類細(xì)胞可以是，例如哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲(例如果蠅)或細(xì)菌(例如大腸桿菌)的細(xì)胞。將這些細(xì)胞或這些細(xì)胞的膜提取物置于待測(cè)化合物的存在下。然后觀察該待測(cè)化合物與本發(fā)明多肽的結(jié)合力以及對(duì)功能性反應(yīng)的抑制或活化作用?？梢允褂弥苯踊蜷g接標(biāo)記的待測(cè)試劑進(jìn)行上述方法的步驟d)。還可以包括一個(gè)使用標(biāo)記或非標(biāo)記的試劑以及標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)劑的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。同樣可以利用根據(jù)待檢信號(hào)而適當(dāng)選擇的檢測(cè)方法，確定待檢試劑是否對(duì)表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞產(chǎn)生活化或抑制信號(hào)。例如，上述活化或抑制劑可以是多核苷酸、在某些情況下是寡核苷酸或多肽，例如蛋白質(zhì)或抗體。本發(fā)明的目的還在于鑒定受本發(fā)明多肽活化或抑制的試劑的方法，其包含a)制備包含本發(fā)明的含有至少一個(gè)SNP的多核苷酸的重組載體，b)制備包含a)中重組載體的宿主細(xì)胞，c)將b)中宿主細(xì)胞置于待測(cè)試劑的存在下，以及d)確定該多肽對(duì)待測(cè)試劑產(chǎn)生的活化或抑制作用。受本發(fā)明多肽活化或抑制的試劑是在該多肽存在下，分別對(duì)活化或抑制反應(yīng)的試劑。受本發(fā)明多肽直接或間接活化或抑制的試劑可以由多肽例如膜或核受體、激酶并更優(yōu)選酪氨酸激酶、轉(zhuǎn)錄因子或多核苷酸組成。疾病檢測(cè)本發(fā)明目的還在于分析受試者中本發(fā)明多核苷酸和/或本發(fā)明多肽的生物學(xué)特性的方法，其包含以下至少一項(xiàng)a)確定受試者基因組中存在或缺少本發(fā)明的多核苷酸；b)確定受試者中本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)水平；c)確定受試者中存在或缺少本發(fā)明的多肽；d)確定受試者中本發(fā)明多肽的濃度；和/或e)確定受試者中本發(fā)明多肽的功能性?？煞治鍪茉囌呋蚴茉囌邩悠分羞@些生物學(xué)特性。這些生物學(xué)特性可遺傳診斷和/或確定受試者是否患有與存在本發(fā)明多核苷酸和/或本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病、不適或病癥，或具有患有疾病、不適或病癥的危險(xiǎn)，或反之具有對(duì)疾病、不適或病癥形成的部分抗性。這些疾病可以是病癥和/或人類疾病，例如癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。所述心血管疾病可能包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。所述疾病和病癥可能還包括創(chuàng)傷愈合和骨質(zhì)疏松癥。該方法還可遺傳診斷受試者中與存在本發(fā)明SNP編碼的突變的等位基因有關(guān)的疾病或疾病抗性。優(yōu)選在步驟a)中檢測(cè)包含前面定義的至少一個(gè)編碼SNP的多核苷酸的存在與否?？梢詮乃芯康氖茉囌叩纳飿悠?例如細(xì)胞、血液、尿、唾液)、或其活檢或尸檢樣品開始，進(jìn)行該多核苷酸的檢測(cè)。例如，可使用基因組DNA直接或于PCR擴(kuò)增后進(jìn)行檢測(cè)。同樣可按類似方式使用RNA或cDNA。然后有可能將本發(fā)明多核苷酸的核苷酸序列與受試者基因組中檢測(cè)到的核苷酸序列作比較。可以通過測(cè)序、DNA雜交方法、DNA片段在有或無變性劑的電泳凝膠中的遷移率差異、或解鏈溫度差異，進(jìn)行核苷酸序列的比較。參見Myers等人，Science(1985)2301242。利用核酸酶保護(hù)試驗(yàn)(例如RNase和S1核酸酶)或化學(xué)裂解劑，同樣可以揭示核苷酸序列精確位點(diǎn)的上述結(jié)構(gòu)改變。參見Cotton等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401。同樣可以利用包含本發(fā)明多核苷酸片段的寡核苷酸探針進(jìn)行篩選。許多為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法可用于確定本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)，并鑒定該多核苷酸的遺傳變異性(參見Chee等人，Science(1996)，Vol274，610-613頁)。在步驟b)中，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如PCR、RT-PCR、RNase保護(hù)、Northern印跡及其它雜交方法，定量該多核苷酸編碼的RNA(及編碼多肽)的水平，可測(cè)定該多核苷酸的表達(dá)水平。在步驟c)和d)中，利用公知的方法，例如放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)、Western印跡和ELISA試驗(yàn)，可以測(cè)定本發(fā)明多肽在受試者或受試者樣品中的存在與否及其濃度。步驟d)之后，測(cè)定的本發(fā)明多肽的濃度可與通常在受試者中發(fā)現(xiàn)的天然野生型EPO蛋白質(zhì)的濃度相比。本領(lǐng)域技術(shù)人員借助于現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)或諸如前述常規(guī)試驗(yàn)或測(cè)定，可以確定對(duì)以上所致疾病、不適或病癥表現(xiàn)出敏感性或反之抗性的高低閾值。在步驟e)中，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如上述體外試驗(yàn)，或使用表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞，可以測(cè)定本發(fā)明多肽的功能性。治療性化合物及疾病治療本發(fā)明的目的還在于包含本發(fā)明多肽和/或包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物作為活性劑的治療性化合物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽和/或包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物的用途，用于制備意在預(yù)防或治療不同的人類病癥和/或疾病的治療性化合物。這些疾病可以是病癥和/或人類疾病，例如癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，傳染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。所述心血管疾病可能包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。所述疾病和病癥可能還包括創(chuàng)傷愈合和骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明的化合物可能優(yōu)選用于制備意在增加自體血液生成、特別是參與不同自體血液采集程序的患者的自體血液生成的治療性化合物，以避免使用他人血液。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽和/或包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物還可以用于制備治療性化合物，用于-預(yù)防或治療貧血，特別是腎機(jī)能不全的透析患者，以及由慢性感染、炎性過程、放射治療、化學(xué)治療所致貧血，和/或-增加自體血液生成，特別是參與不同自體血液采集程序的患者中的自體血液生成，以避免使用他人血液，和/或-預(yù)防腦損傷。可以獲得本發(fā)明多肽的某些化合物以及通過或由該多肽獲得或鑒定的化合物同樣可以作為治療性化合物，用于治療人體。正因?yàn)槿绱?，本發(fā)明的目的還在于治療性化合物，其包含含有至少一個(gè)前面定義的SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體作為活性劑。本發(fā)明還涉及包含至少一個(gè)前面定義的SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體的用途，用于制備意在預(yù)防或治療不同的人類病癥和/或疾病的治療性化合物，例如癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，傳染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。所述心血管疾病可能包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。所述疾病和病癥可能還包括創(chuàng)傷愈合和骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明的化合物可能優(yōu)選用于制備意在增加自體血液生成、特別是參與不同自體血液采集程序的患者的自體血液生成的治療性化合物，以避免使用他人血液。本發(fā)明優(yōu)選涉及包含至少一個(gè)前面定義的SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體的用途，用于制備治療性化合物，用于-預(yù)防或治療貧血，特別是腎機(jī)能不全的透析患者的貧血，以及由慢性感染、炎性過程、放射治療、化學(xué)治療所致貧血，和/或-增加自體血液生成，特別是參與不同自體血液采集程序的患者的自體血液生成，以避免使用他人血液，和/或-預(yù)防腦損傷。用作活性劑的本發(fā)明多肽和其它化合物的劑量取決于所選擇的化合物、治療適應(yīng)癥、給藥方式、制劑性質(zhì)、受試者性質(zhì)及醫(yī)生的判斷。用作活性劑時(shí)，一般按1-300單位/千克受試者的劑量給予本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的目的還在于藥物組合物，其包含至少一種上述化合物，例如本發(fā)明的多肽；包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物；包含至少一種前面定義的SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體作為活性劑，以及藥物可接受的賦形劑。這些藥物組合物中該活性劑有利地以生理有效劑量存在。這些藥物組合物可以是例如固體或液體，并以目前用于人類醫(yī)學(xué)的藥物形式存在，例如簡(jiǎn)單或包衣片劑、軟膠囊(gelcaps)、顆粒劑、焦糖劑、栓劑、優(yōu)選可注射制劑和可注射用粉末?？梢园凑粘Ｓ梅椒ㄖ苽溥@些藥物形式?；钚詣┛梢該饺胪ǔＳ糜谒幬锝M合物的賦形劑，例如滑石粉、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、葡萄糖、甘油、乙醇、硬脂酸鎂、可可脂、含水或無水載體、動(dòng)物或植物來源的脂質(zhì)、石蠟衍生物、乙二醇、各種濕潤(rùn)劑、分散劑或乳化劑、防腐劑。本發(fā)明的活性劑可以單獨(dú)使用或與其它化合物例如治療性化合物，諸如白細(xì)胞介素或干擾素等其它細(xì)胞因子聯(lián)用。根據(jù)給藥方式，調(diào)整該藥物組合物的不同劑型?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同給藥途徑，給予該藥物組合物。本發(fā)明的目的同樣在于診斷性組合物，其包含至少一種上述化合物(例如本發(fā)明的多肽、本發(fā)明多核苷酸的全部或部分、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體)作為活性劑、以及合適的藥物可接受的賦形劑。該診斷性組合物可包含，例如一般用于診斷性組合物的合適的賦形劑，諸如緩沖液和防腐劑。本發(fā)明的目的同樣在于下列物質(zhì)的用途a)治療有效量的本發(fā)明多肽，和/或b)本發(fā)明的多核苷酸，和/或c)前面定義的來自所需治療受試者的宿主細(xì)胞，制備意在增加本發(fā)明多肽在受試者中表達(dá)或活性的治療性化合物。因此，為治療需要增加本發(fā)明多肽表達(dá)或活性的受試者，可能有幾種方法。有可能給予受試者治療有效量的本發(fā)明多肽；包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物；和/或諸如前面定義的活化劑和/或被活化劑，可能聯(lián)用，藥物可接受的賦形劑。同樣有可能通過給予受試者本發(fā)明的多核苷酸，以增加本發(fā)明多肽的內(nèi)源性生成。例如，可以將該多核苷酸插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。利用包含編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體感染細(xì)胞，以使轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生包含目的基因的感染性病毒顆粒，可以從該細(xì)胞中分離上述載體。參見HumanMolecularGenetics，Strachan和Read，第20章，GeneTherapyandotherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches，BIOSScientificsPublishersLtd(1996)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用如上定義的包含至少一個(gè)編碼SNP的多核苷酸。同樣有可能給予受試者屬于自身的宿主細(xì)胞(自體細(xì)胞)，預(yù)先取出這些宿主細(xì)胞，并如前所述進(jìn)行修飾，使其表達(dá)本發(fā)明多肽。本發(fā)明同樣涉及下列物質(zhì)的用途a)治療有效量的前面定義的免疫特異性抗體，和/或b)可抑制本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的多核苷酸，和/或c)如前定義的來自欲治療的受試者的宿主細(xì)胞，以便制備意在降低受試者中本發(fā)明多肽的表達(dá)或活性的治療性化合物。因此，可給予受試者治療有效量的如前定義的抑制劑和/或抗體，可能聯(lián)用，藥物可接受的賦形劑。同樣也可通過給予受試者可抑制本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的本發(fā)明的互補(bǔ)多核苷酸，降低本發(fā)明多肽的內(nèi)源性生成。優(yōu)選使用如上定義的包含至少一個(gè)編碼SNP的互補(bǔ)多核苷酸。本發(fā)明還涉及紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)和/或超糖基化類似物在制備治療性化合物中的用途，用于預(yù)防或治療EPO變體所致病癥或疾病的患者，其與所述患者基因組中存在與核苷酸序列SEQIDNO.1具有至少95％同一性(優(yōu)選97％同一性、更優(yōu)選99％同一性、特別優(yōu)選100％同一性)的核苷酸序列有關(guān)，只要該核苷酸序列包含下列SNP之一465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。所述治療性化合物優(yōu)選用于預(yù)防或治療選自下列之一的疾病癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤在內(nèi)的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤在內(nèi)的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，傳染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。所述心血管疾病可能包括腦損傷和貧血，其包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。所述疾病和病癥可能還包括創(chuàng)傷愈合和骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明的化合物可能優(yōu)選用于制備意在增加自體血液生成、特別是參與不同自體血液采集程序的患者的自體血液生成的治療性化合物，以避免使用他人血液。包含SNPG104S的EPO多肽的類似(mimetic)化合物本發(fā)明還涉及具有與下列多肽基本類似、或更高的生物活性的新化合物a)氨基酸序列SEQIDNO.2，或b)包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193位之間所含氨基酸的氨基酸序列；只要a)和b)中所述氨基酸序列包含G104SSNP。例如通過測(cè)定對(duì)來自過表達(dá)EPO受體的小鼠32D細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性、紅系集落形成或與EPO受體的結(jié)合能力，可評(píng)價(jià)所述的生物活性。如實(shí)驗(yàn)部分所述，G104S突變的EPO對(duì)過表達(dá)EPO受體的小鼠32D細(xì)胞系的細(xì)胞增殖作用比野生型EPO增強(qiáng)2-5倍。如實(shí)驗(yàn)部分所述，G104S突變的EPO刺激紅系集落形成的能力高于野生型EPO。如實(shí)驗(yàn)部分所述，G104S突變的EPO與EPO受體的結(jié)合能力高于天然野生型EPO。如前定義的本發(fā)明的新化合物可具有與G104S突變的EPO基本相似的生物活性，即高于天然野生型EPO。所述化合物可能還具有甚至高于G104S突變的EPO的生物活性。本發(fā)明化合物可能具有至少一種與EPO作用于EPO受體有關(guān)的功能，并且其活性基本類似于包含G104SSNP的氨基酸序列SEQIDNO.2的多肽。根據(jù)通過在EPO受體產(chǎn)生變化而誘導(dǎo)的活性基本類似于包含G104SSNP的氨基酸序列SEQIDNO.2的多肽誘導(dǎo)的對(duì)該EPO受體的作用，所述化合物可能還具有至少一種與EPO作用于EPO受體有關(guān)的功能。所述化合物可能是生物化學(xué)化合物，例如多肽或肽，或有機(jī)化學(xué)化合物，例如合成的肽類似物。本發(fā)明還提供了新化合物，其對(duì)來自過表達(dá)EPO受體的小鼠32D細(xì)胞系的細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性比野生型EPO高2-5倍。本發(fā)明還提供了其刺激紅系集落形成能力高于野生型EPO的新化合物。本發(fā)明還提供了其對(duì)EPO受體的結(jié)合能力高于野生型EPO的新化合物。本發(fā)明還涉及包含G104SSNP的本發(fā)明多肽在鑒定如上所述化合物中的用途。本發(fā)明還涉及鑒定本發(fā)明化合物的方法，其包含以下步驟a)確定生物活性，例如對(duì)過表達(dá)人EPO受體的32D細(xì)胞系細(xì)胞增殖的刺激作用、對(duì)紅系集落形成的刺激作用、和/或與EPO受體的結(jié)合能力；b)比較i)步驟a)測(cè)定的待測(cè)化合物的活性，與ii)氨基酸序列SEQIDNO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQIDNO.2中28-193位氨基酸的氨基酸序列的多肽的活性；只要該氨基酸序列包含G104SSNP；以及c)根據(jù)步驟b)中進(jìn)行的比較，確定該待測(cè)化合物是否具有與氨基酸序列SEQIDNO.2或包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193位氨基酸的氨基酸序列的多肽基本類似或更高的活性；只要所述氨基酸序列包含G104SSNP。優(yōu)選地待測(cè)化合物可能先前鑒定自合成肽組合文庫、高通量篩選、或通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)，以具有與氨基酸序列SEQIDNO.2的多肽、或與包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193位氨基酸的氨基酸序列的多肽相同的三維結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)效應(yīng)，只要該氨基酸序列包含G104SSNP。鑒定和設(shè)計(jì)化合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，關(guān)于這些方法的文獻(xiàn)可能有-SilvermanR.B.(1992).″OrganicChemistryofDrugDesignandDrugAction″.AcademicPress，1stedition(January15，1992).-AndersonS和ChiplinJ.(2002).″Structuralgenomics；shapingthefutureofdrugdesign？DrugDiscov.Today.7(2)105-107.-SelickHE，BeresfordAP，TarbitMH.(2002).″TheemergingimportanceofpredictiveADMEsimulationindrugdiscovery″.DrugDiscov.Today.7(2)109-116.-BurbidgeR，TrotterM，BuxtonB，HoldenS.(2001).″Drugdesignbymachinelearningsupportvectormachinesforpharmaceuticaldataanalysis″.Comput.Chem.26(1)5-14.-KauvarL.M.(1996).″Peptidemimeticdrugsacommentonprogressandprospects″14(6)709.本發(fā)明的化合物可用于制備治療性化合物，用于預(yù)防或治療選自下列的疾病癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，傳染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。所述心血管疾病可能包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。所述疾病和異?？赡苓€包括創(chuàng)傷愈合和骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明的化合物可能優(yōu)選用于制備意在增加自體血液生成、特別是參與不同自體血液采集程序的患者的自體血液生成的治療性化合物，以避免使用他人血液。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1包含SNPg1644a、g2357a或c2621g的核苷酸序列的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)以及野生型參考基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的模建。第一步，從可獲得的PDB數(shù)據(jù)庫(編碼lEER)開始，并利用軟件Modeler(MSISanDiego，CA)，構(gòu)建紅細(xì)胞生成素的三維結(jié)構(gòu)。然后修飾該成熟的多肽片段，以便復(fù)制突變D70N、G104S或S147C。利用程序AMBER和DISCOVER(MSIMolecularSimulationsInc.)，對(duì)該突變片段進(jìn)行1000次分子最小化步驟。然后利用相同程序和相同勢(shì)場(chǎng)(forcefield)，進(jìn)行兩次分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算運(yùn)行。在每種情況下，在300°K計(jì)算50，000個(gè)步驟，結(jié)束于300個(gè)平衡步驟。模建結(jié)果如圖1、2和3所示。實(shí)施例2個(gè)體群中SNPg1644a和c2621g的基因分型。SNP的基因分型是根據(jù)微型測(cè)序原理，其中通過讀取偏振熒光進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。該技術(shù)由熒光微型測(cè)序(FP-TDI技術(shù)或熒光偏振模板直接染料終止物參入)組成。對(duì)群體中每一個(gè)體基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行微型測(cè)序。選擇PCR產(chǎn)物，使其包括含待基因分型的SNP的基因區(qū)域。去除PCR引物和未摻入的dNTPs之后，進(jìn)行微型測(cè)序。微型測(cè)序包含利用聚合酶和熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，延伸位于SNP位點(diǎn)緊上游的寡核苷酸引物。通過讀取偏振熒光，直接分析該延伸過程產(chǎn)生的產(chǎn)物。所有這些步驟及讀取，均在同一PCR平板上進(jìn)行。因此，基因分型需要5個(gè)步驟1)PCR擴(kuò)增2)利用酶促消化純化PCR產(chǎn)物3)寡核苷酸引物延伸4)讀取5)解讀步驟1)PCR擴(kuò)增。從來自不同種族起源的268位個(gè)體的基因組DNA開始，進(jìn)行EPO基因核苷酸序列的PCR擴(kuò)增。美國CoriellInstitute提供了這些基因組DNA。該268位個(gè)體分布如下<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="771">系統(tǒng)發(fā)生的群體特定種族的群體總計(jì)％非裔美國人美洲印第安人加勒比人歐洲高加索人墨西哥人東北亞人非歐洲高加索人東南亞人南美人非裔美國人50100.0小計(jì)5018.7南美安迪斯人1066.7西南美國印地安人533.3小計(jì)155.6加勒比人10100.0小計(jì)103.7北美高加索人7979.8伊比利亞人1010.1意大利人1010.1小計(jì)9936.9墨西哥人10100.0小計(jì)103.7中國人1050.0日本人1050.0小計(jì)207.5希臘人821.6印度-巴基斯坦人924.3中東人2054.1小計(jì)3713.8太平洋島民741.2南亞人1058.8小計(jì)176.3南美人10100.0小計(jì)103.7總計(jì)268100</table></tables>*系統(tǒng)發(fā)生的群體來自Cavalli-Sforza，P.Menozzi和A.Piazza.1994.″TheHistoryandGeographyofHumanGenes.″PrincetonPrincetonUniversityPress.80頁。來自其中每一個(gè)體的基因組DNA形成一個(gè)樣品。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)核苷酸序列SEQIDNO.1輕易設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了g1644a的基因分型利用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SEQIDNO.5有義引物TTCAGGGACCCTTGACTCSEQIDNO.6反義引物GATCATTCTCCCTTTCATCC上述核苷酸序列可以擴(kuò)增核苷酸序列SEQIDNO.1中1557-1764位核苷酸的208個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。為了c2621g的基因分型利用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SEQIDNO.7有義引物TTGCATACCTTCTGTTTGCTSEQIDNO.8反義引物CACAAGCAATGTTGGTGAG上述核苷酸序列可以擴(kuò)增核苷酸序列SEQIDNO.1中2192-2817位核苷酸的626個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。對(duì)于每個(gè)需要基因分型的SNP，均以PCR產(chǎn)物作為微型測(cè)序的模板。每個(gè)樣品PCR反應(yīng)的總體積為5μl。該反應(yīng)體積由下表所示試劑組成<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="804">供應(yīng)商參考反應(yīng)物初濃度體積/管(μl)終濃度LifeTechnology附送w/Taq緩沖液(X)100.51LifeTechnology附送w/TaqMgSO4(mM)500.22APBiotech27-2035-03dNTPs(mM)100.10.2函索有義引物(μM)100.10.2函索反義引物(μM)100.10.2LifeTechnology11304-029Taqplatinum5U/μl0.020.1U/rxnH2OQsp5μl1.98DNA(樣品)2.5ng/μl25ng/rxn總體積5μl</table></tables>這些試劑分布于ABGene提供的具有384孔的黑色PCR平板中(refTF-0384-k)。將該平板密封、離心，然后置于用于384孔平板的熱循環(huán)儀(MJResearch的Tetrad)，進(jìn)行下列溫育PCR循環(huán)94℃1分鐘，繼之以3個(gè)步驟的36個(gè)循環(huán)(94℃15秒、56℃30秒、68℃1分鐘)。步驟2)利用酶促消化純化PCR產(chǎn)物然后利用兩種酶蝦堿性磷酸酶(SAP)和核酸外切酶I(ExoI)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。第一種酶使PCR擴(kuò)增期間未摻入的dNTP去磷酸化，第二種酶去除遺留的單鏈DNA，特別是PCR期間未使用的引物。在PCR平板的每個(gè)孔中，每種樣品加入5μl反應(yīng)混合物，進(jìn)行消化。該反應(yīng)混合物由以下試劑組成<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="765">供應(yīng)商參考反應(yīng)物初濃度體積/管(μl)終濃度APBiotechE70092XSAP1U/μl0.50.5/rxnAPBiotech070073ZExoI10U/μl0.11/rxnAPBiotech提供w/SAP緩沖液SAP(X)100.51，H2OQsp5μl3.9PCR產(chǎn)物5μl總體積10μl</table></tables>加樣后，將平板密封、離心，然后置于用于384孔平板的熱循環(huán)儀(MJResearch的Tetrad)，進(jìn)行下列溫育SAP-EXO消化37℃45分鐘、80℃15分鐘。步驟3)寡核苷酸引物延伸然后每個(gè)制備的樣品加入5μl如下表所示反應(yīng)混合物，對(duì)消化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行延伸或微型測(cè)序<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="789">供應(yīng)商參考反應(yīng)物初濃度體積/管(μl)終濃度Ownpreparation延伸緩沖液1(X)511LifeTechnologies函索微型測(cè)序引物(μM)A或B100.51APBiotech27-2051(61，71，81)-01ddNTPs2(μM)2個(gè)未標(biāo)記各2.50.25各0.125NENNel472/5如Nel492/5ddNTPs2(μM)2個(gè)標(biāo)記Tamra和R110各2.50.25各0.125APBiotechE79000Z熱測(cè)序酶3.2U/μl0.1250.4U/反應(yīng)H2OQsp5μl3.125消化的PCR產(chǎn)物10總體積15</table></tables>15X延伸緩沖液由250mMTris-HClpH9、250mMKCl、25mMNaCl、10mMMgCl2和40％甘油組成。2對(duì)于ddNTP，根據(jù)研究的多態(tài)性使用4種堿基的混合物。只有構(gòu)成功能性SNP的2種目的堿基(g1644a反義讀取的C/T、或c2621g的C/G)標(biāo)記Tamra或R110。對(duì)于g1644a的基因分型，ddNTP混合物由以下組成-2.5μM未標(biāo)記ddGTP，-2.5μM未標(biāo)記ddATP，-2.5μMddTTP(1.875μM未標(biāo)記ddTTP以及0.625μMTamra標(biāo)記的ddTTP)，-2.5μMddCTP(1.875μM未標(biāo)記ddCTP以及0.625μMR110標(biāo)記的ddCTP)。對(duì)于c2621g的基因分型，該ddNTP混合物由以下組成-2.5μM未標(biāo)記ddATP，-2.5μM未標(biāo)記ddTTP，-2.5μMddGTP(1.875μM未標(biāo)記ddGTP以及0.625μMTamra標(biāo)記的ddGTP)，-2.5μMddCTP(1.875μM未標(biāo)記ddCTP以及0.625μMR110標(biāo)記的ddCTP)。對(duì)應(yīng)于位于本發(fā)明SNP位點(diǎn)上游的核苷酸序列，確定基因分型所需的兩個(gè)微型測(cè)序引物的序列。包含該SNP的PCR產(chǎn)物是雙鏈DNA產(chǎn)物，因此可以對(duì)有義鏈或反義鏈進(jìn)行基因分型。所選引物由LifeTechnologiesInc制備。對(duì)于SNPg1644a，測(cè)試的微型測(cè)序引物如下SEQIDNO.9有義引物(A)tgcagcttgaatgagaatatcactgtcccaSEQIDNO.10反義引物(B)cctcttccaggcatagaaattaactttggtgt首先利用48個(gè)樣品驗(yàn)證SNPg1644a的微型測(cè)序，然后對(duì)由268位個(gè)體和11個(gè)陰性對(duì)照組成的一組個(gè)體群進(jìn)行基因分型。測(cè)試了幾種微型測(cè)序條件，g1644a的基因分型維持下列最適條件反義引物+ddCTP-R110+ddTTP-Tamra對(duì)于SNPc2621g，測(cè)試的微型測(cè)序引物如下SEQIDNO.11有義引物(A)ttggcagaaggaagccatctSEQIDNO.12反義引物(B)ctgaggccgcatctggaggg首先利用48個(gè)樣品驗(yàn)證SNPc2621g的微型測(cè)序，然后對(duì)由268位個(gè)體和10個(gè)陰性對(duì)照組成的一組個(gè)體群進(jìn)行基因分型。測(cè)試了幾種微型測(cè)序條件，c2621g的基因分型維持下列最適條件有義引物+ddCTP-R110+ddGTP-Tamra加樣后，將平板密封、離心，然后置于用于384孔平板的熱循環(huán)儀(MJResearch的Tetrad)，進(jìn)行下列溫育延伸循環(huán)93℃1分鐘、繼之以由2個(gè)步驟組成的35個(gè)循環(huán)(93℃10秒、55℃30秒)。在熱循環(huán)儀最后步驟之后，將平板直接置于LJLBiosystemsInc的AnalystHT型偏振熒光閱讀儀。利用CriterionHost軟件，通過兩種方法讀取平板。第一種方法可利用該熒光團(tuán)特異性的發(fā)射和激發(fā)濾片(激發(fā)550-10nm、發(fā)射580-10nm)讀取Tamra標(biāo)記的堿基，第二種方法可利用該熒光團(tuán)特異性的發(fā)射和激發(fā)濾片(激發(fā)490-10nm、發(fā)射520-10nm)讀取R110標(biāo)記的堿基。兩種情況均使用二色性的雙反射鏡(dichroicdoublemirror)(R110/Tamra)，其它的閱讀參數(shù)為Z-高度1.5mm衰減器關(guān)斷積分時(shí)間100,000微妙原始數(shù)據(jù)單位計(jì)數(shù)/秒偏振轉(zhuǎn)換按孔平板穩(wěn)定時(shí)間0毫秒PMT設(shè)置精確讀取(+)、靈敏度2動(dòng)態(tài)起偏鏡發(fā)射靜態(tài)起偏鏡S從而獲得包含Tamra濾片和R110濾片的mP(毫偏振度)計(jì)算值的文件結(jié)果。利用平行面(//)和垂直面(⊥)所得強(qiáng)度值，按照下列公式，計(jì)算這些mP值mP＝1000(//-g⊥)/(//+g⊥).在該運(yùn)算中，值⊥利用因子g權(quán)重。這是必須由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的機(jī)器參數(shù)。步驟4)和5)解讀并確定基因型。利用MicrosoftInc.Excel軟件、和/或LJLBiosystemsInc開發(fā)的AlleleCaller軟件，圖解報(bào)告mP值。橫坐標(biāo)表示Tamra標(biāo)記堿基的mP值，縱座標(biāo)表示R110標(biāo)記堿基的mP值。強(qiáng)mP值表示摻入了該熒光團(tuán)標(biāo)記的堿基，反之，弱mP值表明該堿基未摻入。獲得了多達(dá)三個(gè)同源組的具有不同基因型的核苷酸序列。一旦對(duì)不同組進(jìn)行了鑒定，便可以使用AlleleCaller軟件，以表格形式直接獲取所確定的每一個(gè)體的基因型。SNPg1644a和c2621g的微型測(cè)序結(jié)果。基因分型過程完成以后，針對(duì)此處所研究的兩個(gè)功能性SNP，使用上述圖形確定個(gè)體群中個(gè)體的基因型。對(duì)于SNPg1644a，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子GG、或雜合子GA、或純合子AA。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型AA。同樣，對(duì)于SNPc2621g，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子CC、或雜合子CG、或純合子GG。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型GG。針對(duì)這兩個(gè)功能性SNP，陰性對(duì)照、個(gè)體群中所測(cè)基因型分布以及計(jì)算不同等位基因的頻率的結(jié)果如下表所示<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="768">個(gè)體數(shù)對(duì)照數(shù)成功率測(cè)試基因分型測(cè)試基因分型g1644a268267111199.6c2621g268250101093.5</table></tables><tablesid="table6"num="006"><tablewidth="770">系統(tǒng)發(fā)生的群體總計(jì)g1644a(D70N)f(95%CI)GG％GA％AA％總計(jì)非裔美國人美洲印第安人加勒比人歐洲高加索人墨西哥人非歐洲高加索人東北亞人南美人東南亞人5015109910372010170.5(0，1.5)5010015100101009799.011.0101003710020100101001710050151098l037201017總計(jì)2680.2(0，0.6)26699.610.4267</table></tables><tablesid="table7"num="007"><tablewidth="810">系統(tǒng)發(fā)生的群體總計(jì)c2621g(S147C)f(95％CI)CC％CG％GG％總計(jì)非裔美國人美洲印第安人加勒比人歐洲高加索人墨西哥人非歐洲高加索人東北亞人南美人東南亞人5015109910372010170.5(0，1.6)5010015100101009198.911.1810032100191008100161005015109283219816總計(jì)2680.2(0，0.6)24999.610.4250</table></tables>在上表中-N代表個(gè)體數(shù)目。-％代表特定亞群中個(gè)體的百分比。-等位基因頻率代表特定亞群中突變等位基因的百分比。-95％IC代表最小和最大的95％置信區(qū)間。按群體考查這些結(jié)果可以看出，就SNPg1644a而言，唯一的雜合子個(gè)體GA來自該個(gè)體群中歐洲高加索人亞群。同樣，按群體考查這些結(jié)果可以看出，就SNPc2621g而言，唯一的雜合子個(gè)體CG來自該個(gè)體群中歐洲高加索人亞群。實(shí)施例3研究G104S突變的紅細(xì)胞生成素相比天然野生型紅細(xì)胞生成素的生物功能第一步包括制備突變和野生型EPO蛋白質(zhì)a)在攜帶遺傳霉素抗性基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/His-Topo中克隆天然野生型紅細(xì)胞生成素和突變的紅細(xì)胞生成素(g2357a)與SwissProt發(fā)布的紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)序列相比，來自Genestorm克隆(H-XO2158M-Invitrogen)的多聚組氨酸標(biāo)簽的EPOcDNA帶有K143E(G427AG)突變(下標(biāo)數(shù)字表示該核苷酸在cDNA序列中的定位)。因此，我們首先使用ExsitePCR試劑盒(Stratagene)和下列引物恢復(fù)了天然野生型的E143(A427AG)序列SEQIDNO.13有義引物CCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTSEQIDNO.14反義引物(5’端磷酸化)GCTCCCAGAGCCCGAAGCAG同時(shí)，使用ExsitePCR試劑盒(Stratagenecorp.)和下列引物獲得G104S(G310GC＝＞AGC)突變的紅細(xì)胞生成素SEQIDNO.15有義引物CGGAGCCAAGCCCTGTTGGTCASEQIDNO.16反義引物(5’端磷酸化)CAGGACAGCTTCCGACAGCA為去除多聚組氨酸尾并分離對(duì)應(yīng)于完整EPO蛋白質(zhì)(即天然信號(hào)肽和成熟蛋白質(zhì))的核苷酸序列，不論突變或野生型形式，使用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SEQIDNO.17有義引物ATGGGGGTGCACGAATGTCCSEQIDNO.18反義引物TCATCTGTCCCCTGTCCTGC將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/GS/HisTopo(TOPOTM-cloning；InvitrogenCorp.)，位于CMV啟動(dòng)子控制之下。該載體可使蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞系中組成型表達(dá)。在核對(duì)編碼重組蛋白質(zhì)的載體區(qū)核苷酸序列之后，使用Superfect(QIAgen)將不同的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。b)選擇過表達(dá)天然野生型或突變EPO的克隆利用各種EPO構(gòu)建體轉(zhuǎn)染兩天之后，將CHO細(xì)胞置于包含800μg/ml遺傳霉素(Invitrogen)的培養(yǎng)基中。通過在該培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)2周，選擇過表達(dá)EPO的穩(wěn)定細(xì)胞。然后利用有限稀釋法克隆細(xì)胞。利用EPOELISA(R&DSystems)篩選來自野生型或突變EPO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的30個(gè)克隆的EPO蛋白質(zhì)表達(dá)。挑選幾個(gè)表達(dá)EPO的克隆，凍存。其中，將野生型或突變EPO產(chǎn)量最高的克隆用于大量生產(chǎn)EPO。c)EPO蛋白質(zhì)的純化在CHO培養(yǎng)物中表達(dá)EPO之后，將培養(yǎng)基1500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，回收上清液。然后使用Labscale(Millipore膜5Kda)對(duì)3升緩沖液Tris50mM、NaCl25mMpH9透析，將上清液濃縮10倍，利用陰離子交換柱(Pharmacia，HiprepQ)純化。使用200mMNaCl洗脫蛋白質(zhì)之后，利用緩沖液NaH2PO450mM、NaCl25mM、pH7將蛋白質(zhì)脫鹽，用HeparineHP(Pharmacia)純化。然后利用150mMNaCl進(jìn)行蛋白質(zhì)洗脫。最后，通過SDS-PAGE凝膠定性分析EPO蛋白質(zhì)，然后利用光密度法(Biorad光密度計(jì)GS800)定量。第二步包括制備過表達(dá)EPO受體的32D小鼠細(xì)胞。d)在攜帶zeocyn抗性基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/GS/HisTopo中克隆天然EPO受體為進(jìn)一步在V5表位和多聚組氨酸尾的框架內(nèi)插入該cDNA，利用下列引物PCR擴(kuò)增來自Genestorm克隆(H-M60459M-Invitrogen)的天然人EPO受體cDNA的完整序列SEQIDNO.19有義引物ATGGACCACCTCGGGGCGTCSEQIDNO.20反義引物AGAGCAAGCCACATAGCTGGGGG將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/GS/HisTopo(TOPOTM-cloning；InvitrogenCorp.)，位于CMV啟動(dòng)子控制之下。該載體可使蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞系中組成型表達(dá)。在這種情況下，該EPO受體帶有外加的包含多聚組氨酸尾和V5表位的C末端序列。核實(shí)編碼該重組受體的載體區(qū)域的核苷酸序列之后，將該構(gòu)建體電穿孔轉(zhuǎn)入小鼠32D細(xì)胞系(ATCC)e)選擇過表達(dá)EPO受體的穩(wěn)定細(xì)胞。為選擇過表達(dá)人EPO受體的穩(wěn)定細(xì)胞，由編碼EPO受體的構(gòu)建體電穿孔轉(zhuǎn)入的32D細(xì)胞系在200μg/mLZeocin(Invitrogen)存在下培養(yǎng)5周，然后評(píng)價(jià)其在商品化人EPO(R&DSystems)存在下的增殖能力。最后，利用兩個(gè)不同試驗(yàn)測(cè)定突變EPO和野生型EPO的生物效應(yīng)評(píng)價(jià)不同EPO蛋白質(zhì)誘導(dǎo)過表達(dá)EPO受體的小鼠32細(xì)胞增殖的能力，以及測(cè)定突變EPO和野生型EPO與EPO受體的直接結(jié)合。f)評(píng)價(jià)野生型和突變G104SEPO誘導(dǎo)過表達(dá)EPO受體的小鼠32D細(xì)胞增殖的能力。評(píng)價(jià)野生型EPO和G104S突變的EPO誘導(dǎo)過表達(dá)EPO受體的小鼠32D細(xì)胞(32D-EPOR細(xì)胞)的細(xì)胞增殖能力。首先測(cè)試前面步驟產(chǎn)生的包含不同EPO蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物，其次測(cè)試前述獲得的純化的EPO蛋白質(zhì)。原理在于，將32D-EPOR細(xì)胞按2×104細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板包含10％胎牛血清的200μl最終培養(yǎng)基中。將32D-EPOR細(xì)胞與系列稀釋的野生型或者突變EPO(對(duì)于蛋白質(zhì)提取物為0.024-140ng/ml，對(duì)于純化的EPO則為0.76×10-3-400ng/ml)于37℃培養(yǎng)5天，然后培養(yǎng)物中加入U(xiǎn)ptiblue(Uptima)。對(duì)于蛋白質(zhì)提取物再溫育24小時(shí)，對(duì)于純化的EPO則再溫育4小時(shí)，然后測(cè)定590nm處發(fā)射的熒光(激發(fā)560nm)，定量細(xì)胞增殖速率。天然野生型和突變EPO的增殖活性基于EC50值的測(cè)定，即細(xì)胞增殖達(dá)到50％所對(duì)應(yīng)的EPO濃度(ng/ml)。首先，利用包含EPO的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖4A和圖4B所示。在圖4中，對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)濃度，數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次測(cè)定的平均值，標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation)代表3次重復(fù)之間的差異。由曲線獲得的EC值如下-第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中野生型EPO為24.22ng/ml，G104S突變的EPO為4.68ng/ml-第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中野生型EPO為5.24ng/ml，G104S突變的EPO為3.7ng/ml因此，圖4A和4B以及EC50值表明，G104S突變的EPO對(duì)過表達(dá)人EPO受體的32D細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的刺激作用比天然野生型EPO高2-5倍。其次，利用純化的EPO蛋白質(zhì)進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)。一式三份進(jìn)行的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別如圖5A和圖5B所示。在圖5中，對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)濃度，數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次測(cè)定的平均值，標(biāo)準(zhǔn)差代表3次重復(fù)之間的差異。由曲線獲得的EC50值如下-第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中野生型EPO為2.38ng/ml，G104S突變的EPO為0.58ng/ml-第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中野生型EPO為2.57ng/ml，G104S突變的EPO為1.12ng/ml。因此，圖5A和5B以及EC50值表明，純化的G104S突變的EPO對(duì)過表達(dá)人EPO受體的32D細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的刺激作用比純化的天然野生型EPO高2-5倍，證實(shí)了由蛋白質(zhì)提取物所得結(jié)果。g)G104S突變的紅細(xì)胞生成素刺激紅系集落形成評(píng)價(jià)G104S突變的紅細(xì)胞生成素刺激紅系集落形成的能力，并與野生型紅細(xì)胞生成素相比較。為此，收集健康個(gè)體的人骨髓細(xì)胞，并利用聚蔗糖梯度分離。將有核細(xì)胞(2.5×105細(xì)胞)鋪于半固體甲基纖維素中。然后將0.25-10ng/ml的突變或野生型紅細(xì)胞生成素加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)10天后計(jì)數(shù)紅系集落。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，下表匯集了其平均結(jié)果，并如圖6所示。<tablesid="table8"num="008"><tablewidth="766">集落數(shù)EPO(ng/mL)野生型EPOG104SEPO0.251702300.550568515408102.5620860567085510715950</table></tables>這些數(shù)據(jù)清楚表明，G104S突變的紅細(xì)胞生成素刺激紅系集落形成。更具體而言，G104S突變的紅細(xì)胞生成素刺激紅系集落形成比野生型紅細(xì)胞生成素高30-50％。h)EPO和EPO受體之間的相互作用利用表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SurfacePlasmonResonance)技術(shù)(Biacore，SPR)測(cè)定EPO及其受體(EPO-R)之間的相互作用。為比較G104S突變的EPO和野生型EPO的親合力，利用固定化于檢測(cè)器芯片表面的EPO-R靶配體，然后在芯片上流過不同濃度包含待測(cè)EPO蛋白質(zhì)的分析物，定量測(cè)定EPO與EPO-R細(xì)胞外部分結(jié)合的相互作用。將芯片的羧甲基化葡聚糖層設(shè)計(jì)為與鎳結(jié)合，以便通過多聚組氨酸尾的金屬螯合作用而介導(dǎo)配體捕獲。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)于成熟人受體(氨基酸25-247)細(xì)胞外部分的EPO受體，后接C末端V5表位和多聚組氨酸尾(KGFSFNWGGKPIPNPLLGLDSTGVDHHHHHH-C-ter)。利用下列特定寡核苷酸，將相應(yīng)的cDNA片段插入巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)載體pPICZalphahis-topo(Invitrogen)中SEQIDNO.21有義引物GCGCCCCCGCCTAACCTCSEQIDNO.22反義引物GTCGCTAGGCGTCAGCAGCGA將包含編碼天然野生型EPO或G104SEPO的克隆的兩個(gè)50mlBMGY培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、1％甘油、100mM磷酸鉀、0.4mg/L生物素pH6.8)的飽和前培養(yǎng)物(saturatedpre-cultures)在30℃、200轉(zhuǎn)/分(rpm)振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度達(dá)到波長(zhǎng)600nm下所測(cè)光密度5.0時(shí)，用于按1/5接種到200mlBMMY培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、0.5％甲醇、100磷酸鉀、0.4mg/L生物素pH6.8)。然后利用終濃度0.5％的甲醇，在30℃、培養(yǎng)瓶于200轉(zhuǎn)/分振蕩下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)2-5天。利用labscale裝置(截留5000Da)超濾濃縮包含約10mg/mLEPO-R的上清液，并通過對(duì)磷酸鈉50mM、Tris(Cl)10mM(pH8.0)、NaCl150mM、咪唑10mM的透析交換緩沖液。然后利用預(yù)裝硫酸鎳的Hi-Trap(AmershamPharmacia)捕獲多聚組氨酸EPO-R。利用凝膠過濾柱(緩沖液Tris(Cl)pH9、NaCl50mM)將包含蛋白質(zhì)的組分脫鹽，然后利用陰離子交換層析純化為約95％。利用SDS-PAGE凝膠估計(jì)純度和濃度。然后流過20μl/分鐘的500μM硫酸鎳，活化檢測(cè)器芯片NTA。然后利用流速為10μl/分鐘、濃度為50nM的HBS-P緩沖液(10mMHEPES、NaCl150mM、0.005％P20EDTA50μM)，在表面上捕獲EPO-R。濃度為0.45-15nM的野生型EPO和G104S突變的EPO然后流過檢測(cè)器芯片。每次濃縮試驗(yàn)后利用HBS-P、EDTA0.35M再生。自動(dòng)方法可以評(píng)價(jià)上述范圍內(nèi)6個(gè)濃度的野生型EPO和G104S突變的EPO的結(jié)合相互作用。圖7顯示兩個(gè)濃度(7.5和15nM)的G104S突變EPO和野生型EPO的結(jié)合測(cè)定結(jié)果。這些結(jié)果表明，G104S突變的EPO與其受體結(jié)合比野生型EPO更快，證實(shí)了在細(xì)胞水平觀察到的作用(參見3f和3g所述實(shí)施例)。從而證明，G104S突變的EPO對(duì)過表達(dá)EPO受體的小鼠32D細(xì)胞的增殖的強(qiáng)烈正效應(yīng)至少部分和G104S突變的EPO與其受體的較高親合力有關(guān)。影響不成熟EPO蛋白質(zhì)序列104位氨基酸的突變對(duì)EPO效應(yīng)的作用非常出人意外。實(shí)際上，與EPO受體復(fù)合的EPO晶體結(jié)構(gòu)表明，只有EPO(從四個(gè)螺旋A、B、C和D當(dāng)中)的A、C和D三個(gè)螺旋與結(jié)合EPO受體有關(guān)(Syed等人Efficiencyofsignalingthroughcytokinereceptorsdependscriticallyonreceptororientation.Nature395511-516(1998))。此外，分析EPO結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的定點(diǎn)誘變證明，位于77位殘基附近的螺旋B的氨基酸的改變對(duì)EPO活性基本沒有影響(Eliott等人Mappingoftheactivesiteofrecombinanthumanerythropoietin.Blood.89493-502(1997)；Wen等人Erythropoietinstructure-functionrelationships.Identificationoffunctionallyimportantdomains.J.Biol.Chem.26922839-22846(1994))。上述有關(guān)EPO結(jié)構(gòu)/功能的新信息還可以用于鑒定、設(shè)計(jì)和開發(fā)模擬EPO對(duì)其人類受體活性的新EPO樣實(shí)體(化學(xué)的或肽的)。序列表<110>Escary，Jean-Louis<120>紅細(xì)胞生成素基因的新多核苷酸和多肽<130>021349/0037<150>FR0104603<151>2001-04-04<150>US60/343163<151>2001-12-21<150>US60/345,440<151>2002-01-04<150>US60/358,598<151>2002-02-21<160>22<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3398<212>DNA<213>人類(Homosapiens)<400>1agcttctgggcttccagacccagctactttgcggaactcagcaacccaggcatctctgag60tctccgcccaagaccgggatgccccccaggaggtgtccgggagcccagcctttcccagat120agcagctccgccagtcccaagggtgcgcaaccggctgcactcccctcccgcgacccaggg180cccgggagcagcccccatgacccacacgcacgtctgcagcagccccgtcagccccggagc240ctcaacccaggcgtcctgcccctgctctgaccccgggtggcccctacccctggcgacccc300tcacgcacacagcctctcccccacccccacccgcgcacgcacacatgcagataacagccc360cgacccccggccagagccgcagagtccctgggccaccccggccgctcgctgcgctgcgcc420gcaccgcgctgtcctcccggagccggaccggggccaccgcgcccgctctgctccgacacc480gcgccccctggacagccgccctctcctccaggcccgtggggctggccctgcaccgccgag540cttcccgggatgagggcccccggtgtggtcacccggcgccccaggtcgctgagggacccc600ggccaggcgcggagatgggggtgcacggtgagtactcgcgggctgggcgctcccgcccgc660ccgggtccctgtttgagcggggatttagcgccccggctattggccaggaggtggctgggt720tcaaggaccggcgacttgtcaaggaccccggaagggggaggggggtggggcagcctccac780gtgccagcggggacttgggggagtccttggggatggcaaaaacctgacctgtgaagggga840cacagtttgggggttgaggggaagaaggtttggggggttctgctgtgccagtggagagga900agctgataagctgataacctgggcgctggagccaccacttatctgccagaggggaagcct960ctgtcacaccaggattgaagtttggccggagaagtggatgctggtagcctgggggtgggg1020tgtgcacacggcagcaggattgaatgaaggccagggaggcagcacctgagtgcttgcatg1080gttggggacaggaaggacgagctggggcagagacgtggggatgaaggaagctgtccttcc1140acagccacccttctccctccccgcctgactctcagcctggctatctgttctagaatgtcc1200tgcctggctgtggcttctcctgtccctgctgtcgctccctctgggcctcccagtcctggg1260cgccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctgcagaggtacctcttggaggccaa1320ggaggccgagaatatcacggtgagaccccttccccagcacattccacagaactcacgctc1380agggcttcagggaactcctcccagatccaggaacctggcacttggtttggggtggagttg1440ggaagctagacactgcccccctacataagaataagtctggtggccccaaaccatacctgg1500aaactaggcaaggagcaaagccagcagatcctacgcctgtggccagggccagagccttca1560gggacccttgactccccgggctgtgtgcatttcagacgggctgtgctgaacactgcagct1620tgaatgagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatgg1680aggtgagttcctttttttttttttttcctttcttttggagaatctcatttgcgagcctga1740ttttggatgaaagggagaatgatcgagggaaaggtaaaatggagcagcagagatgaggct1800gcctgggcgcagaggctcacgtctataatcccaggctgagatggccgagatgggagaatt1860gcttgagccctggagtttcagaccaacctaggcagcatagtgagatcccccatctctaca1920aacatttaaaaaaattagtcaggtgaagtggtgcatggtggtagtcccagatatttggaa1980ggctgaggcgggaggatcgcttgagcccaggaatttgaggctgcagtgagctgtgatcac2040accactgcactccagcctcagtgacagagtgaggccctgtctcaaaaaagaaaagaaaaa2100agaaaaataatgagggctgtatggaatacgttcattattcattcactcactcactcactc2160attcattcattcattcattcaacaagtcttattgcataccttctgtttgctcagcttggt2220gcttggggctgctgaggggcaggagggagagggtgacatccctcagctgactcccagagt2280ccactccctgtaggtcgggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtc2340ggaagctgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccct2400gcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggc2460tctgggagcccaggtgagtaggagcggacacttctgcttgccctttctgtaagaagggga2520gaagggtcttgctaaggagtacaggaactgtccgtattccttccctttctgtggcactgc2580agcgacctcctgttttctccttggcagaaggaagccatctcccctccagatgcggcctca2640gctgctccactccgaacaatcactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactcc2700aatttcctccggggaaagctgaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacaga2760tgaccaggtgtgtccacctgggcatatccaccacctccctcaccaacattgcttgtgcca2820caccctcccccgccactcctgaaccccgtcgaggggctctcagctcagcgccagcctgtc2880ccatggacactccagtgccaccaatgacatctcaggggccagaggaactgtccagagagc2940aactctgagatctaaggatgtcacagggccaacttgagggcccagagcaggaagcattca3000gagagcagctttaaactcagggacagacccatgctgggaagacgcctgagctcactcggc3060accctgcaaaattgatgccaggacacgctttggaggcgatttacctgttttcgcacctac3120catcagggacaggatgacctggagaacttaggtggcaagctgtgacttctccaggtctca3180cgggcatgggcactcccttggtggcaagagcccccttgacaccggggtggtgggaaccat3240gaagacaggatgggggctggcctctggctctcatggggtccaacttttgtgtattcttca3300acctcattgacaagaactgaaaccaccaatatgactcttggcttttctgttttctgggaa3360cctccaaatcccctggctctgtcccactcctggcagca3398<210>2<211>193<212>PRT<213>人類<400>2MetGlyValHisGluCysProAlaTrpLeuTrpLeuLeuLeuSerLeu151015LeuSerLeuProLeuGlyLeuProValLeuGlyAlaProProArgLeu202530IleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysGlu354045AlaGluAsnIleThrThrGlyCysAlaGluHisCysSerLeuAsnGlu505560AsnIleThrValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArg65707580MetGluValGlyGlnGlnAlaValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeu859095LeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeuLeuValAsnSerSer100105110GlnProTrpGluProLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSerGly115120125LeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGlu130135140AlaIleSerProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIle145150155160ThrAlaAspThrPheArgLysLeuPheArgValTyrSerAsnPheLeu165170175ArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAlaCysArgThrGlyAsp180185190Arg<210>3<211>20<212>DNA<213>人類<400>3ttgcataccttctgtttgct20<210>4<211>19<212>DNA<213>人類<400>4cacaagcaatgttggtgag19<210>5<211>18<212>DNA<213>人類<400>5ttcagggacccttgactc18<210>6<211>20<212>DNA<213>人類<400>6gatcattctccctttcatcc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人類<400>7ttgcataccttctgtttgct20<210>8<211>19<212>DNA<213>人類<400>8cacaagcaatgttggtgag19<210>9<211>30<212>DNA<213>人類<400>9tgcagcttgaatgagaatatcactgtccca30<210>10<211>32<212>DNA<213>人類<400>10cctcttccaggcatagaaattaactttggtgt32<210>11<211>20<212>DNA<213>人類<400>11ttggcagaaggaagccatct20<210>12<211>20<212>DNA<213>人類<400>12ctgaggccgcatctggaggg20<210>13<211>22<212>DNA<213>人類<400>13ccagaaggaagccatctcccct22<210>14<211>20<212>DNA<213>人類<400>14gctcccagagcccgaagcag20<210>15<211>22<212>DNA<213>人類<400>15cggagccaagccctgttggtca22<210>16<211>20<212>DNA<213>人類<400>16caggacagcttccgacagca20<210>17<211>20<212>DNA<213>人類<400>17atgggggtgcacgaatgtcc20<210>18<211>20<212>DNA<213>人類<400>18tcatctgtcccctgtcctgc20<210>19<211>20<212>DNA<213>人類<400>19atggaccacctcggggcgtc20<210>20<211>23<212>DNA<213>人類<400>20agagcaagccacatagctggggg23<210>21<211>18<212>DNA<213>人類<400>21gcgcccccgcctaacctc18<210>22<211>18<212>DNA<213>人類<400>22gcgcccccgcctaacctc18權(quán)利要求1.包含以下全部或部分的分離的多核苷酸a)核苷酸序列SEQIDNO.1，只要該核苷酸序列包含至少一個(gè)選自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a的SNP；或者b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO.1的615-2763位核苷酸，只要該序列包含至少一個(gè)選自g1644a、g2357a和c2621g的編碼SNP。3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由至少10個(gè)核苷酸組成。4.分離的多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有選自至少一個(gè)D70N、G104S和S147C的編碼SNP的多肽。5.分離的多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分的多肽，該多肽具有SNPG104S。6.鑒定或擴(kuò)增與核苷酸序列SEQIDNO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含該多核苷酸在合適的雜交條件下與權(quán)利要求1的多核苷酸雜交。7.基因分型與核苷酸序列SEQIDNO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含以下步驟擴(kuò)增受試者或受試者群體基因組DNA的目的區(qū)域，并確定位于核苷酸序列SEQIDNO.1至少一個(gè)下列位置的等位基因465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。8.權(quán)利要求7的方法，其中基因分型通過微型測(cè)序進(jìn)行。9.包含權(quán)利要求1的多核苷酸的重組載體。10.包含權(quán)利要求9的重組載體的宿主細(xì)胞。11.分離多肽的方法，其包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分離該多肽。12.由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸編碼的多肽。13.分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP。14.權(quán)利要求12的多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP。15.權(quán)利要求12的多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S。16.包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物。17.獲得免疫特異性抗體的方法，其包含利用權(quán)利要求12的多肽免疫動(dòng)物，并從該動(dòng)物中收集所述抗體。18.權(quán)利要求17的方法所產(chǎn)生的免疫特異性抗體。19.在一種或多種待測(cè)化合物中鑒定活化或抑制分離多肽活性的試劑的方法，所述的分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP，該方法包含a)提供包含權(quán)利要求9的重組載體的宿主細(xì)胞；b)使該宿主細(xì)胞接觸待測(cè)化合物，c)確定對(duì)該多肽活性的活化或抑制作用，從而鑒定所述的活化或抑制劑。20.在一種或多種待測(cè)化合物中鑒定其活性受分離多肽增強(qiáng)或抑制的試劑的方法，該分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP，該方法包含a)提供包含權(quán)利要求9的重組載體的宿主細(xì)胞；b)使該宿主細(xì)胞接觸待測(cè)化合物，c)確定對(duì)所述試劑活性的增強(qiáng)或抑制作用，從而鑒定所述的被增強(qiáng)或抑制的試劑。21.分析受試者生物學(xué)特征的方法，其包含進(jìn)行至少一個(gè)以下步驟a)確定受試者基因組中存在或缺少權(quán)利要求1的多核苷酸；b)確定受試者中權(quán)利要求1的多核苷酸的表達(dá)水平；c)確定受試者中存在或缺少由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸所編碼的多肽；d)確定受試者中由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸所編碼多肽的濃度；或e)確定受試者中由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸所編碼多肽的功能性。22.包含選自以下的一種或多種化合物的治療劑-包含核苷酸序列SEQIDNO.1的全部或部分的分離的多核苷酸，只要該核苷酸序列包含至少一個(gè)選自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；-包含所述多核苷酸的重組載體；-包含所述重組載體的宿主細(xì)胞；-分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP；-包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物；以及-所述多肽的特異性抗體。23.用于預(yù)防或治療個(gè)體疾病的方法，所述疾病選自癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管病、代謝病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及化學(xué)治療相關(guān)疾病，該方法包含給予所述個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求22的治療劑，和藥物可接受的賦形劑。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述癌癥和腫瘤包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述代謝疾病包含非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。26.權(quán)利要求23的方法，其中所述傳染病包含病毒性傳染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包含阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥以及抑郁癥。28.權(quán)利要求23的方法，其中所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病包含組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。29.權(quán)利要求23的方法，其中所述心血管疾病包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。30.預(yù)防或治療個(gè)體選自創(chuàng)傷愈合和/或骨質(zhì)疏松癥的疾病的方法，包含給予該個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求22的治療劑和藥物可接受的賦形劑。31.提高自體血液產(chǎn)生、特別是參與不同的自體血液采集程序的患者自體血液產(chǎn)生的方法，其包含給予該個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求22的治療劑，和藥物可接受的賦形劑。32.提高或降低受試者中權(quán)利要求12的多肽活性的方法，其包含給予治療有效量的一種或多種包含核苷酸序列SEQIDNO.1的全部或部分的分離的多核苷酸或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，只要該核苷酸序列包含至少一個(gè)選自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP；包含該多核苷酸的重組載體；包含該重組載體的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞可能得自需要治療的受試者；包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP的分離的多肽；包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物；該多肽的特異性抗體，和藥物可接受的賦形劑。33.預(yù)防或治療個(gè)體與該個(gè)體基因組中存在權(quán)利要求1的多核苷酸有關(guān)的病癥或疾病的方法，其包含給予治療有效量的一種或多種包含核苷酸序列SEQIDNO.1的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP的分離的多核苷酸，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；包含所述多核苷酸之一的重組載體；包含該重組載體的宿主細(xì)胞；包含氨基酸序列SEQIDNO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自D70N、G104S和S147C的編碼SNP的分離的多肽；包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化類似物；所述多肽之一的特異性抗體，和藥物可接受的賦形劑。34.確定至少一個(gè)選自EPO基因465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP與疾病或疾病抗性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性的方法，該方法包含以下步驟a)對(duì)一組個(gè)體進(jìn)行基因分型；b)確定所述疾病或疾病抗性在該組個(gè)體中的分布；c)將基因型數(shù)據(jù)與所述疾病或疾病抗性的分布作比較；以及d)對(duì)上述比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。35.診斷或確定疾病預(yù)后或疾病抗性的方法，其包含檢測(cè)選自EPO基因465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的至少一個(gè)SNP。36.在一種或多種待測(cè)化合物中鑒定具有與G104S突變的EPO基因產(chǎn)物的活性基本類似或更高的生物活性的化合物的方法，該方法包含以下步驟a)確定該化合物的生物活性，例如對(duì)過表達(dá)人EPO受體的32D細(xì)胞系細(xì)胞增殖的刺激作用、對(duì)紅系集落形成的刺激作用、和/或與人EPO受體的結(jié)合能力；b)將由步驟a)確定的該化合物活性與G104S突變的EPO基因產(chǎn)物活性作比較。c)根據(jù)步驟b)進(jìn)行的比較確定該化合物是否具有與G104S突變的EPO基因產(chǎn)物相比基本類似或更高的活性。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述待測(cè)化合物鑒定自合成肽組合文庫、高通量篩選、或通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)，以具有與SEQIDNO.2的多肽、或與包含氨基酸序列SEQIDNO.2的28-193位氨基酸的氨基酸序列相同的三維結(jié)構(gòu)，只要該氨基酸序列包含G104SSNP。38.通過權(quán)利要求36的方法鑒定的化合物。39.用于預(yù)防或治療個(gè)體疾病的方法，所述疾病選自癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管病、代謝病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及化學(xué)治療相關(guān)疾病，其包含給予個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求38的藥劑和藥物可接受的賦形劑。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥和腫瘤包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。41.權(quán)利要求39的方法，其中所述代謝疾病包含非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。42.權(quán)利要求39的方法，其中所述傳染病包含病毒性傳染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。43.權(quán)利要求39的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包含阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥以及抑郁癥。44.權(quán)利要求39的方法，其中所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病包含組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。45.權(quán)利要求39的方法，其中所述心血管疾病包括腦損傷和貧血，其中包括腎機(jī)能不全的透析患者的貧血以及慢性感染、炎性過程、放射治療和化學(xué)治療所致貧血。46.預(yù)防或治療個(gè)體創(chuàng)傷愈合和/或骨質(zhì)疏松癥疾病的方法，包含給予該個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求38的藥劑和藥物可接受的賦形劑。47.提高自體血液產(chǎn)生、特別是參與不同的自體血液采集程序的患者的自體血液產(chǎn)生的方法，其包含給予該個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求38的藥劑和藥物可接受的賦形劑。48.以具有與野生型人紅細(xì)胞生成素至少相同的細(xì)胞增殖功能特征、并能夠結(jié)合紅細(xì)胞生成素受體的螺旋A、B、C和D為特征的分子，其螺旋B的氨基酸序列具有至少一個(gè)改變，以致與紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合的親合力高于野生型人紅細(xì)胞生成素。49.提高具有野生型紅細(xì)胞生成素螺旋B的相應(yīng)部分、并能夠結(jié)合紅細(xì)胞生成素受體的紅細(xì)胞生成素樣分子的細(xì)胞增殖功能性的方法，其包含修飾該紅細(xì)胞生成素樣分子對(duì)應(yīng)于野生型紅細(xì)胞生成素螺旋B部分的氨基酸序列。50.治療性化合物，包含權(quán)利要求48的分子以及藥物可接受載體。51.治療方法，包含給予患者治療有效量的權(quán)利要求50的化合物。52.提高具有螺旋A、B、C和D的野生型人紅細(xì)胞生成素分子的功能性的方法，其包含修飾該分子或編碼該分子的基因，從而改變螺旋B的氨基酸序列，以提高該分子與紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合的親合力。53.權(quán)利要求52的方法，其中改變了對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.2中甘氨酸104的氨基酸。54.權(quán)利要求53的方法，其中將對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.2中甘氨酸104的氨基酸替換為絲氨酸。55.通過權(quán)利要求52的方法產(chǎn)生的化合物。56.通過權(quán)利要求53的方法產(chǎn)生的化合物。57.通過權(quán)利要求54的方法產(chǎn)生的化合物。58.通過權(quán)利要求49的方法產(chǎn)生的化合物，其中改變了對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.2中甘氨酸104的氨基酸。59.利用權(quán)利要求49的方法產(chǎn)生的化合物，其中將對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.2中甘氨酸104的氨基酸替換為絲氨酸。全文摘要本發(fā)明涉及來源于EPO基因核苷酸序列并包含新的SNP的新的多核苷酸、來源于天然EPO蛋白質(zhì)并包含由本發(fā)明的SNP所致至少一個(gè)突變的新的多肽、及其治療用途。文檔編號(hào)A61P35/00GK1849400SQ02808942公開日2006年10月18日申請(qǐng)日期2002年3月29日優(yōu)先權(quán)日2001年4月4日發(fā)明者J－L·伊斯卡利申請(qǐng)人:吉恩奧迪塞公司