專利名稱：大蹼鈴蟾鈴蟾肽及其制備方法和其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾(Bombina maxima)鈴蟾肽及其制備方法和其基因，屬生物醫(yī)學領(lǐng)域。
鈴蟾肽(bombesin)是一類神經(jīng)內(nèi)分泌多肽，具有廣泛而復雜的生物學效應(yīng)，主要包括3方面的生理功能神經(jīng)遞質(zhì)，促激素和有絲分裂原。其最顯著的生理功能是作用于大腦孤束核而引起食欲減退。目前在國際上已經(jīng)被用于研究和開發(fā)減肥藥物。
很多兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而被廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。大蹼鈴蟾主要分布于我國的云南、四川省，是我國的特色資源動物之一，也是特色的民族民間藥物。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點。據(jù)文獻報道，國外學者已從東方鈴蟾(Bombina orientalis)中分離出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到的降壓肽類物質(zhì)bufokinin和ranakinin有舒張血管和降血壓的作用，已在治療心血管疾病方面顯示出誘人的應(yīng)用前景；最近，一種兩棲類核酸酶對HIV的選擇性抑制作用更引起了人們對兩棲類活性物質(zhì)的注意。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發(fā)前景。
發(fā)明人將本發(fā)明的大蹼鈴蟾鈴蟾肽全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽，與從歐洲鈴蟾(Bombina bombina)皮膚中得到的鈴蟾肽有8個氨基酸的差異，發(fā)明人將本發(fā)明的鈴蟾肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種用于開發(fā)減肥藥物的大蹼鈴蟾鈴蟾肽及其制備方法和其基因。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案大蹼鈴蟾鈴蟾肽，為我們從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾(Bombina maxima)皮膚分泌物中分離得到鈴蟾肽，它由16個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量1887，等電點10.6，多肽氨基酸全序列一級結(jié)構(gòu)為焦谷氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-色氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-酰胺化甲硫氨酸(pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH2)。
大蹼鈴蟾鈴蟾肽的制備方法，是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)，冷凍干燥后，分子篩凝膠過濾分離，收取所得峰V再經(jīng)高效液相色譜(HPLC)反相C18柱分離純化，取第二步HPLC反相C18柱層析分離出的峰(箭頭所示)即可。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，N-端氨基酸用焦谷氨酸酶處理后再用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
大蹼鈴蟾鈴蟾肽用于藥物制備的應(yīng)用。
大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因的克隆包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，在歐洲鈴蟾鈴蟾肽信號肽核苷酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計引物，利用PCR方法篩選鈴蟾肽基因。根據(jù)信號肽序列所設(shè)計的擴增引物LR126，其長度為22個核苷酸，其序列為5’ATGTCTGCGATTCCTCTGAACA3’，PCR另一擴增引物為位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定?；驕y序結(jié)果表明編碼大蹼鈴蟾鈴蟾肽的基因由522個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為CTCAGACTCTCACAGCTCTGCGGTACTCACAGCTTTAGACATGTCTGCAATTCCTCTGAACAGGATCCTGCCTCTAGGGTTCCTATTTTGCCTGCTTCTTTCCTCCTTCATTTCTCTGTCCAGCTGCATGGAGTTCGTTGAAGATGCCAACAATCAGGGCAGAATCAGCCTGCAGAAGAAGCCACCCCGGCCACCCCAGTGGGCAGTGGGTCACTTCATGGGTAAGAAGAGCCTGCAAGACATGGACTTTGAAGAGATGGGAAGTTTTGCTAAACGTAGCGTTGAGAAGATTAGAGCTGCTCTCCTGCAAGAGCAGCAAGGAGCAGGATCAGAAAGAGAGCTGCGGCATGCACAGTTGGTAGCAAGGGAGATCTTGGCGCAGTATCTGGAGAATATGCAGAATTAGCAAAGAAATGTTTCCTCCTGTACATACAGAAATATAAATAAATATATTTGTGCCTGAGATATGGGACTTATTTTACACATTCCAAAAGTTTATTGTTTACAAAAAAAAAAAAAAAA其中編碼成熟大蹼鈴蟾鈴蟾肽為第173-220位核苷酸，其氨基酸序列為pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH2(pE為焦谷氨酸)大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因作為基因工程制備鈴蟾肽的應(yīng)用。下面結(jié)合附圖用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。


圖1為本發(fā)明大蹼鈴蟾鈴蟾肽的Sephadex G-50凝膠過濾層析圖。
圖2為本發(fā)明大蹼鈴蟾鈴蟾肽的HPLC反相C18柱層析圖。
圖3為本發(fā)明大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因核苷酸序列。
圖4為本發(fā)明成熟大蹼鈴蟾鈴蟾肽氨基酸序列。
實施例一1，制備大蹼鈴蟾鈴蟾肽活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，將大蹼鈴蟾置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥、低溫保存。
第一步SephadexG-50凝膠過濾按上述方法獲得原材料大蹼鈴蟾分泌物凍干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液，上樣品于經(jīng)0.1MNa2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液平衡的SephadexG-50凝膠過濾柱(1000mm長，26mm直徑)，經(jīng)0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液洗脫，收集峰V。
第二步，反相高壓液相層析(RP-HPLC)SephadexG-50凝膠過濾得到的峰V以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰(箭頭標記)即大蹼鈴蟾鈴蟾肽。
2，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment massspectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油間硝基芐醇二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Ky。
3，純化的大蹼鈴蟾鈴蟾肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點，N-端氨基酸用焦谷氨酸酶處理后再用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過上述方法制備的大蹼鈴蟾鈴蟾肽，為我們從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的鈴蟾肽，它是由16個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量1887，等電點10.6，多肽氨基酸全序列一級結(jié)構(gòu)為焦谷氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-色氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-酰胺化甲硫氨酸(pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH2)。
大蹼鈴蟾鈴蟾肽用于藥物制備的應(yīng)用。
實施例二1，大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因克隆1)，大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBC0BRL公司產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘，加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀，上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為大蹼鈴蟾皮膚總RNA。
2)，大蹼鈴蟾皮膚mRNA的純化采用美國PROMEGA公司的mRNA分離純化試劑盒。取大蹼鈴蟾皮膚總RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的大蹼鈴蟾皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異戊醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3)，大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫構(gòu)建采用美國GIBC0BRL公司SuperScriptTM質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，但方法操作有改進。cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)，于1.5ml試管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4μl 5X第一鏈合成緩沖液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶，于37℃保溫1小時后放入冰浴。cDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二鏈合成緩沖液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大腸桿菌DNA連接酶，4μl大腸桿菌DNA多聚酶I，1μl大腸桿菌RNA酶，反應(yīng)總體積150μl，混勻后于16℃保溫2小時；加入2μlT4 DNA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140μl上層溶液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，加入70μl 7.5M乙酸銨，0.5ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的連接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA連接酶緩沖液，10μl SalI adapter，5μl T4 DNA連接酶，反應(yīng)總體積50μl，于16℃保溫16小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3緩沖液，4μl Not I酶，反應(yīng)體積50μl，于37℃保溫2小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于100μlTEN緩沖液中。將cDNA樣品過DNA分級分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組份合并，體積為200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸銨，0.6ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN緩沖液中。合成的cDNA連接到pSPORT 1質(zhì)粒，取10μl溶解于TEN緩沖液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA連接酶緩沖液，1μl pSPORT 1質(zhì)粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA連接酶，反應(yīng)體積20μl，室溫3小時，可準備轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞的制備，挑取單個HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于，50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時，待菌液540nm OD值為0.4時，4℃，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2懸浮，再2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀以適量0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)備用。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物5μl加入100μl感受態(tài)細胞冰浴60分鐘，42℃熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.9ml，37℃培養(yǎng)1小時，取200μl涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37℃培養(yǎng)16小時，每個LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA含4×104個單獨克隆。
4)，大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因克隆篩選利用PCR篩選法篩選大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因，所用正向引物LR126，根據(jù)編碼歐洲鈴蟾鈴蟾肽信號肽的核苷酸序列所設(shè)計，長度為22個核苷酸，其序列為5’ATGTCTGCGATTCCTCTGAACA3’；和位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物， 其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反應(yīng)在如下條件下進行94℃1分鐘，45℃1分鐘和72℃1分鐘，30個循環(huán)。首先滴定構(gòu)建的細菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當?shù)募毦鷿舛?大約5000個細菌/毫升，和30個細菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板(Costar)上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細菌培養(yǎng)液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。
5)，大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因序列測定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems373A全自動核昔酸序列測定儀，測序引物為SP6和T7啟動子，SP6啟動子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7啟動子序列5’TAATACGACTCACTATAGGGA3’?；驕y序結(jié)果自5’端至3’端(見圖3)。圖3所示大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因核苷酸的序列表為序列長度，522個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源大蹼鈴蟾皮膚，序列特征1編碼成熟鈴蟾肽為第173-220位核苷酸，其氨基酸序列見圖4，大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因作為基因工程制備鈴蟾肽的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1，大蹼鈴蟾鈴蟾肽，其特征是從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的由16個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量1887，等電點10.6，多肽氨基酸全序列一級結(jié)構(gòu)為焦谷氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-色氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-酰胺化甲硫氨酸。
2，大蹼鈴蟾鈴蟾肽的制備方法，其特征是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經(jīng)凝膠過濾、高壓液相反相柱層析分離純化后即得到。
3，大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由522個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為CTCAGACTCTCACAGCTCTGCGGTACTCACAGCTTTAGACATGTCTGCAATTCCTCTGAACAGGATCCTGCCTCTAGGGTTCCTATTTTGCCTGCTTCTTTCCTCCTTCATTTCTCTGTCCAGCTGCATGGAGTTCGTTGAAGATGCCAACAATCAGGGCAGAATCAGCCTGCAGAAGAAGCCACCCCGGCCACCCCAGTGGGCAGTGGGTCACTTCATGGGTAAGAAGAGCCTGCAAGACATGGACTTTGAAGAGATGGGAAGTTTTGCTAAACGTAGCGTTGAGAAGATTAGAGCTGCTCTCCTGCAAGAGCAGCAAGGAGCAGGATCAGAAAGAGAGCTGCGGCATGCACAGTTGGTAGCAAGGGAGATCTTGGCGCAGTATCTGGAGAATATGCAGAATTAGCAAAGAAATGTTTCCTCCTGTACATACAGAAATATAAATAAATATATTTGTGCCTGAGATATGGGACTTATTTTACACATTCCAAAAGTTTATTGTTTACAAAAAAAAAAAAAAAA
4，根據(jù)權(quán)利要求3所述的大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟大蹼鈴蟾鈴蟾肽為第173-220位核苷酸，其氨基酸序列為pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH全文摘要
本發(fā)明涉及大蹼鈴蟾鈴蟾肽及其制備方法和其基因，屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域。其鈴蟾肽為從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾(Bombina maxima)皮膚分泌物中分離得到的由16個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量1887，等電點10.6，多肽氨基酸全序列一級結(jié)構(gòu)為pEKKPPRPPQWAVGHFM－NH
文檔編號C07K1/14GK1390851SQ0110852
公開日2003年1月15日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者張云, 賴仞, 劉衡, 李文輝 申請人:中國科學院昆明動物研究所