專利名稱：抗體特異性分布的治療和診斷使用的制作方法
發(fā)明的背景免疫系統(tǒng)令人驚訝的復(fù)雜性是其最強(qiáng)力量。1012-1014種可能的抗體特異性、多種調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞間精密的相互作用、根據(jù)MHC抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的限制；所有這些使宿主能與傳染劑和其它視作外來(lái)的抗原有效反應(yīng)。但此多樣性有它的缺點(diǎn)。錯(cuò)誤發(fā)生應(yīng)答的目標(biāo)也許成為正常自身蛋白質(zhì)；炎癥反應(yīng)被錯(cuò)調(diào)節(jié)；正常應(yīng)答不需要地針對(duì)嫁接和移植細(xì)胞。在這些情況下，系統(tǒng)的復(fù)雜性使診斷和治療非常困難。
對(duì)于大部分自身免疫疾病、遺傳性過(guò)敏狀態(tài)和不需要的免疫應(yīng)答，存在有效的診斷血液測(cè)試或治療劑。例如，當(dāng)前的治療策略通常以廣泛系統(tǒng)免疫抑制為基礎(chǔ)。由于此治療不是抗原特異，結(jié)果是免疫功能的整體降低，導(dǎo)致對(duì)感染和疾病敏感。因此，臨床上非常需要抗原特異診斷和耐受治療，它們會(huì)特異地去除不需要的免疫應(yīng)答，但使免疫系統(tǒng)的其它部分完整。然而，為了提供抗原特異治療，需要確定反應(yīng)細(xì)胞的抗原特異性。
在自身免疫疾病中確定抗原靶的重要性一部分是涉及這些疾病的進(jìn)展。例如，神經(jīng)退化疾病如多發(fā)性硬化(MS)和實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎(EAE)可針對(duì)一種或更多髓鞘蛋白，例如髓鞘堿性蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白和多種其它髓鞘抗原。隨著疾病發(fā)展，對(duì)初始抗原的反應(yīng)消失，產(chǎn)生有序和可定義的新免疫反應(yīng)。隨著時(shí)間流逝，抗原-特異自身免疫應(yīng)答可擴(kuò)散至一種蛋白質(zhì)上不同的表位，稱為“分子內(nèi)表位擴(kuò)散”，或者擴(kuò)散至其它結(jié)構(gòu)蛋白的表位，稱為“分子間表位擴(kuò)散”。在由對(duì)一種表位免疫起始的EAE過(guò)程中，分子內(nèi)和分子間表位擴(kuò)散使自身免疫應(yīng)答發(fā)展到包括可檢測(cè)的T細(xì)胞對(duì)其它初始抗原上表位和其它髓鞘抗原的應(yīng)答(參見(jiàn)Steinman(1999)J.Exp.Med.1891021-1024)。
如Touhy等(1999)J.Exp.Med.1891033-1042所述，病人失去對(duì)在初次免疫應(yīng)答中識(shí)別的髓鞘表位的反應(yīng)，并發(fā)展出對(duì)其它髓鞘表位的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。隨著疾病進(jìn)入臨床發(fā)展并隨后慢性占主導(dǎo)的階段，在自身免疫中對(duì)初始自身抗原的免疫應(yīng)答可最終消失。然而，關(guān)鍵的免疫表位仍可在慢性疾病狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，這些提供了抗原特異治療的關(guān)鍵。
在可提供抗原特異治療前，需要一種更精確和高通量的診斷方法以及傳遞特異免疫抑制劑的方式。在強(qiáng)T細(xì)胞是自身免疫疾病組成的地方得到診斷特別困難，這是由于T細(xì)胞受體僅當(dāng)結(jié)合適當(dāng)主要組織相容性蛋白時(shí)識(shí)別抗原。
盡管精確鑒定T細(xì)胞關(guān)聯(lián)抗原仍具挑戰(zhàn)性(參見(jiàn)Altman等(1996)Science274(5284)94-6)，存在按血清型分類抗體特異性的技術(shù)。許多分析在本領(lǐng)域已知并使用以檢測(cè)有具體特異性的抗體，包括ELISA、RIA、競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性?shī)A心分析、固相免疫測(cè)定如在多孔載體上(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,486,452)等。例如，Atassi等(1996)美國(guó)專利號(hào)5,578,496用重疊肽通過(guò)固相放射免疫測(cè)定來(lái)確定自身抗體的優(yōu)良特異性，重疊肽獲得自靶抗原。類似的，Harley(1997)美國(guó)專利號(hào)5,637,454進(jìn)行了固相抗肽試驗(yàn)來(lái)確定SSA蛋白自身抗體的特異性。
針對(duì)抗原特異反應(yīng)的治療正在發(fā)展中。在一些情況中，肽以誘導(dǎo)對(duì)抗原耐受性的方式傳遞給宿主。例如，階段II臨床試驗(yàn)在進(jìn)行之中以治療有髓鞘堿性蛋白改變肽的MS。臨床試驗(yàn)的結(jié)果描述于Kappos等，(2000)Nature Medicine61176-1182；Bielekova等，(2000)Nat.Med61167-1175。作為改變肽配體的微生物肽描述于Ruiz等，(1999)J.Exp.Med1891275-1283。傳遞純化的自身免疫應(yīng)答靶向的髓鞘蛋白也證明了治療EAE的效果(Critchfield等，(1994)Science2631139-43)。編碼自身抗原的DNA序列也用于促進(jìn)抗原-特異免疫抑制。Ruiz等，(1999)J.Immunol，1623336-3341用編碼髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白主導(dǎo)表位的小基因接種，并證明對(duì)免于疾病的保護(hù)。Garren等(2001)用編碼4種抗原的小基因混合物接種，證明了保護(hù)和治療活性疾病的提高。
對(duì)準(zhǔn)確和迅速進(jìn)行自身抗原診斷的方法的需求還未滿足，這些自身抗原在臨床疾病狀態(tài)中由免疫細(xì)胞識(shí)別，并且將此知識(shí)轉(zhuǎn)化成具體治療形式的需求也未滿足。本發(fā)明針對(duì)此問(wèn)題。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的通過(guò)一種確定患免疫相關(guān)疾病的病人中抗體特異性分布的新方法達(dá)到，方法包括(a)制備包括至少兩種疾病相關(guān)抗原的抗原陣列，其中所述抗原進(jìn)一步包括一種或更多免疫表位；(b)使來(lái)自步驟(a)的抗原陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(c)鑒定微陣列內(nèi)結(jié)合來(lái)自步驟(b)病人樣品中抗體的疾病相關(guān)抗原；(d)比較結(jié)合步驟(c)中疾病相關(guān)抗原的抗體和(1)結(jié)合步驟(a)的微陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；(2)結(jié)合步驟(a)的微陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與疾病關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的目的也通過(guò)在有免疫-相關(guān)疾病的病人中確定抗體特異性分布的新方法完成，方法包括(a)制備包括一種或更多疾病相關(guān)表位的表位陣列；(b)使來(lái)自步驟(a)的表位陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(c)鑒定微陣列內(nèi)結(jié)合來(lái)自步驟(b)病人樣品中抗體的疾病相關(guān)表位；(d)比較結(jié)合步驟(c)中疾病相關(guān)表位的抗體和(1)結(jié)合步驟(a)的微陣列內(nèi)疾病相關(guān)表位的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；(2)結(jié)合步驟(a)的微陣列內(nèi)疾病相關(guān)表位的抗體，其中抗體不與疾病關(guān)聯(lián)。確定抗體特異性分布的新方法也根據(jù)具體情況而定，提供普通技術(shù)人員抗原分布或表位分布。此發(fā)明的方法和組合物用于診斷和設(shè)計(jì)和選擇免疫-相關(guān)疾病的具體治療。更具體的是與確定抗體特異性分布相關(guān)的方法和組合物可用于自身免疫疾病，包括免疫相關(guān)疾病如多發(fā)性硬化(MS)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、肌炎、硬皮病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、重癥肌無(wú)力(MG)、多軟骨炎和組織移植排斥。此外，確定抗體特異性分布的方法也用于過(guò)敏癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，高通量確定通過(guò)這些抗體的詳細(xì)結(jié)合分析由病人血清中存在的疾病相關(guān)抗體的光譜構(gòu)成。抗體特異性分布揭示個(gè)體對(duì)一種或更多抗原的復(fù)雜免疫應(yīng)答，抗原有一種或更多表位。
發(fā)明提供確定抗體特異性分布的方法用于鑒定很可能發(fā)展免疫相關(guān)疾病但還沒(méi)有明顯癥狀的病人。
發(fā)明也提供一種方法用于鑒定很可能發(fā)展更嚴(yán)重形式疾病的病人，能在病人抗體特異性分布的基礎(chǔ)上選擇更具進(jìn)攻性的治療。
發(fā)明也提供用于設(shè)計(jì)治療方案的方法，包括抗原-特異和非抗原-特異治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原-特異治療在抗體特異性分布的基礎(chǔ)上選擇。病人抗體特異性分布提供關(guān)于B細(xì)胞和T細(xì)胞調(diào)節(jié)應(yīng)答的信息。個(gè)人抗原特異治療的混合物可在病人特異性分布的基礎(chǔ)上制定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定患相同免疫疾病的病人間共同抗體特異性分布的統(tǒng)一，鑒定提供一般抗原-特異治療制劑以治療患此疾病的病人。
而在發(fā)明的另一方面，有確定抗體特異性分布的方法用于監(jiān)控接收免疫相關(guān)疾病治療的病人中的治療反應(yīng)。治療反應(yīng)在抗體特異性分布改變的基礎(chǔ)上評(píng)估，改變包括抗體靶標(biāo)的變化(即抗原或表位分布)、抗體滴度的變化、同種抗體的變化、和抗體識(shí)別大規(guī)模模式的變化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性分布可用于預(yù)測(cè)各病人不利的結(jié)果，從而能選擇另外的治療。
另一方面，抗體特異性分布能鑒定疾病相關(guān)的新抗原和疾病相關(guān)的新的表位。
附圖概述

圖1A到1D顯示的抗體特異性分布包括大鼠EAE中自身抗體反應(yīng)的髓鞘肽-特異性抗原陣列描述(抗原陣列分布)。抗原陣列通過(guò)點(diǎn)樣免疫顯性髓鞘肽表位并純化天然髓鞘堿性蛋白來(lái)產(chǎn)生(列于表1)。A-D描繪的掃描圖像來(lái)自正常對(duì)照大鼠(A)和3只Lewis大鼠，Lewis大鼠用在完全弗氏佐劑(B-D)中的不同髓鞘蛋白肽誘導(dǎo)發(fā)展EAE，接著用Cy-3標(biāo)記的抗-大鼠Ig二次抗體。結(jié)果通過(guò)ELISA確定。掃描圖像的定量計(jì)算機(jī)分析示于表1。報(bào)道的數(shù)字顯示SLE識(shí)別的抗原相對(duì)對(duì)照血清的熒光強(qiáng)度比率，對(duì)照血清調(diào)節(jié)背景血清使大于或小于1的比率(1＝?jīng)]有區(qū)別)代表有＞95％置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)顯性差異?？乖嚵杏辛Φ罔b定EAE中自身抗體的肽特異性。
圖2顯示的抗體特異性分布包括8種不同人類自身免疫疾病中自身抗體特異性的抗原陣列鑒定和描述(抗原陣列分布)。有序自身抗原陣列通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣4批192種不同推定自身抗原以建立一個(gè)1152-特征風(fēng)濕病自身抗原陣列。點(diǎn)樣的抗原包括36種重組或純化的蛋白質(zhì)，包括Ro52、La、組氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)、SR蛋白、組蛋白H2A(H2A)、Sm-B/B’、U1小核內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合體的70kDa和C成分(U1-70kDa、U1snRNP-C)、Sm-B/B’、hnRNP-B1、Sm/RNP復(fù)合體、拓?fù)洚悩?gòu)酶I(topo I)、著絲粒蛋白B(CENP B)、丙酮酸脫氫酶(PDH)；6種以核酸為基礎(chǔ)的推定抗原，包括一些形式的哺乳動(dòng)物雙鏈DNA(dsDNA)和合成單鏈DNA(ssDNA)；154種表達(dá)SnRNP蛋白、Sm蛋白、組蛋白H1、H2A、H3和H4的肽。此外，我們點(diǎn)樣人IgG和IgM特異的抗體(α-IgG和α-IgM)；流感A和肺炎球菌(Pneumovax)的疫苗；用Cy-3-和Cy-5預(yù)標(biāo)記抗體的混合物以作為標(biāo)記點(diǎn)來(lái)確定陣列方向(黃色特征)。自身抗原陣列培養(yǎng)用的稀釋病人血清樣品來(lái)自(a)沒(méi)有檢測(cè)到特異自身抗體反應(yīng)的健康人(正常)；(b)表現(xiàn)抗Ro52和La自身抗體反應(yīng)的斯耶格倫綜合征；(c)表現(xiàn)抗DNA、組蛋白H2A、U1-70kDa和SR蛋白反應(yīng)的SLE；(d)表現(xiàn)抗Jo-1和Ro52反應(yīng)的PM；(e)表現(xiàn)抗DNA、H2A、Ro52和U1-70kDa反應(yīng)的MCTD；(f)表現(xiàn)抗PDH反應(yīng)的PBC；(g)表現(xiàn)抗topo I反應(yīng)的sclero-D；(h)表現(xiàn)抗CENP B反應(yīng)的sclero-L；和(i)表現(xiàn)抗hnRNP-B1反應(yīng)的RA。用于探針的自身免疫疾病血清沿圖頂部表示，灰色盒子中所含的各列切下和粘貼抗原特征是來(lái)自單個(gè)陣列的典型抗原特征。陣列上由來(lái)自嚙齒動(dòng)物血清中自身抗體識(shí)別的髓鞘堿性蛋白肽作為典型負(fù)對(duì)照(MBP68-86)包括，嚙齒動(dòng)物有實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎。結(jié)合的抗體掃描前用Cy-3-綴合山羊-抗-人IgM/IgG檢測(cè)。
圖3顯示的抗體特異性分布包括來(lái)自人多發(fā)性硬化病人腦脊液中自身抗體反應(yīng)的抗原陣列描述(抗原陣列分布)。通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣推定髓鞘抗原(文中所述)來(lái)產(chǎn)生2400-點(diǎn)‘髓鞘蛋白(myelin proteome)’陣列，探針用腦脊液，接著用Cy-3-標(biāo)記的抗-人Ig二次抗體，用GenePix掃描儀掃描，用GenePix軟件分析圖像以確定結(jié)合各點(diǎn)的自身抗體的水平。這些陣列包含400種不同髓鞘蛋白和肽表位，包括MBP、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)、表達(dá)這些蛋白的重疊肽、和表達(dá)來(lái)自另外包括環(huán)核苷磷酸二酯酶(CNP酶)的髓鞘自身抗原顯性表位的肽、髓鞘-相聯(lián)糖蛋白(MAG)、和髓鞘-相聯(lián)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)。在對(duì)照病人中，盡管檢測(cè)到共同和普遍人病原體的特異抗體，病原體包括流感病毒和肺炎鏈球菌，沒(méi)有檢測(cè)到髓鞘蛋白的特異抗體。在MS病人1中，抗原陣列檢測(cè)完整髓鞘堿性蛋白(MBP)、完整髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)的特異自身抗體以及識(shí)別MOG肽35-55、MBP肽1-20和MBP肽68-86的自身抗體。相反，在MS病人2中，檢測(cè)到抗MOG蛋白和MOG肽25-42的自身抗體。在MS病人3中，鑒定了蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)肽139-151的特異抗體。
圖4A到4C顯示的抗體特異性分布包括小鼠中自身抗體反應(yīng)多樣性和類似性的抗原陣列描述(抗原陣列分布)，小鼠有實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎(EAE)。通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣推定髓鞘抗原來(lái)產(chǎn)生2400-點(diǎn)‘髓鞘蛋白組’陣列，探針用EAE小鼠血清，接著用Cy-3-標(biāo)記的抗-小鼠Ig二次抗體，用GenePix掃描儀掃描，用GenePix軟件分析圖像以確定結(jié)合各點(diǎn)的自身抗體的水平。A-C表示的陣列掃描圖像的探針?biāo)醚鍋?lái)自對(duì)照小鼠(A)和2只SJL小鼠，SJL小鼠用PLPp139-151誘導(dǎo)EAE后87天疾病復(fù)發(fā)(B&C)。2只EAE小鼠中抗誘導(dǎo)肽PLPp139-151的自身抗體反應(yīng)相對(duì)對(duì)照顯著強(qiáng)烈，小鼠-2中觀察到抗鄰近分子內(nèi)表位PLPp89-106的自身抗體反應(yīng)但小鼠-1或?qū)φ諞](méi)有觀察到，EAE小鼠中都觀察到抗分子間蛋白和表位的自身抗體反應(yīng)但對(duì)照沒(méi)有，分子間蛋白和表位包括MOG蛋白、MOGp66-78、CNP酶p343-373、和MBPp1-20。結(jié)果用ELISA確認(rèn)且代表另外小鼠中觀察到的自身抗體反應(yīng)。因此，用PLP肽139-151誘導(dǎo)的SJL小鼠經(jīng)歷它們自身免疫反應(yīng)擴(kuò)展至鄰近PLP上的肽表位以及3種另外髓鞘蛋白上的肽表位，3種髓鞘蛋白上包括MBP、MOG和CNP酶。這些結(jié)果證明自身抗體反應(yīng)靶向具體自身抗原的陣列鑒定?？乖?特異DNA耐受性疫苗(Tolerizing vaccine)編碼更大數(shù)量自身抗體反應(yīng)的抗原陣列-鑒定靶，此疫苗防止和治療EAE的效率比編碼單個(gè)自身抗體靶或非靶向髓鞘抗原的疫苗更高。
圖5A和5B顯示的抗體特異性分布包括有膠原-誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的小鼠中自身抗體反應(yīng)的抗原陣列描述(抗原陣列分布)。抗原陣列用機(jī)器毛細(xì)管陣列儀產(chǎn)生以點(diǎn)樣RA中推定滑液肽和蛋白自身抗原到聚-L-賴氨酸-覆蓋顯微鏡載物片上的有序陣列中。點(diǎn)樣抗原包括膠原種類I、II和III、CIIp257-270、Ro52、La、組氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)、U1小核內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合體的70kDa和C成分(U1-70kDa、U1snRNP-C)、hnRNP-B1、和GP-39的重疊肽。我們點(diǎn)樣用Cy-3預(yù)標(biāo)記的抗體作為‘標(biāo)記特征’來(lái)確定陣列方向(綠色特征的絕大部分)。陣列培養(yǎng)用(a)正常DBA/1LacJ血清或(b)從DBA/1LacJ小鼠中在疾病開(kāi)始(29天)時(shí)獲得的血清，小鼠用CFA中的雞CII誘導(dǎo)發(fā)展CIA。結(jié)合的抗體用Cy-3-綴合驢-抗-小鼠IgM/IgG檢測(cè)。CII和CIIp257-270特異抗體僅在CIA血清樣品中檢測(cè)到。
圖6提供的串列分析證明DNA耐受性治療編碼來(lái)自抗原陣列鑒定的EAE中自身抗原的多表位，此治療降低臨床疾病活性并減少自身免疫反應(yīng)的擴(kuò)展。各小鼠列于X軸上，肽和蛋白抗原示于Y軸上的‘髓鞘蛋白組’陣列。綠色表示缺少活性，紅色表示自身抗體活性。以抗原陣列類似性為基礎(chǔ)的串列分析算法組小鼠確定它們自身抗體反應(yīng)的特異性。此圖像表示全部串列的小部分。正常小鼠(NMS)串列和綠色占優(yōu)勢(shì)表明缺少自身抗體對(duì)所列抗原的反應(yīng)。慢性復(fù)發(fā)EAE的SJL小鼠用對(duì)照載體或緩沖(B和C)串列處理并有顯著自身抗體反應(yīng)，相對(duì)多種髓鞘抗原用紅色表示。在這些小鼠中觀察到的自身抗體反應(yīng)的擴(kuò)展與它們更嚴(yán)重的疾病過(guò)程相關(guān)，87天時(shí)間段平均有2.4-3.5次復(fù)發(fā)。癱瘓(復(fù)發(fā))臨床惡化的平均數(shù)字示于圖頂部，通過(guò)表示相關(guān)小鼠組的柱上的數(shù)字表示。相反，小鼠用髓鞘蛋白混合物DNA耐受性疫苗串列處理(含大量抗原陣列鑒定的自身免疫反應(yīng)靶，顯示處理EAE[表4]中的最大效率)且如綠色相對(duì)其它組增加所示，它們自身免疫反應(yīng)的擴(kuò)展顯著減少。自身免疫反應(yīng)擴(kuò)展的減少與它們嚴(yán)重程度較低的臨床過(guò)程相關(guān)，87天時(shí)間段平均有1.5次復(fù)發(fā)。
實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明在一個(gè)實(shí)施方案中，高通量確定由病人血清中存在的疾病相關(guān)抗體構(gòu)成，這是通過(guò)這些抗體的詳細(xì)結(jié)合分析。抗體特異性分布揭示了個(gè)人對(duì)自身抗原、過(guò)敏源、移植抗原等的多種表位的免疫應(yīng)答。這種抗體或抗原特異性分布用于發(fā)展診斷和治療個(gè)人免疫相關(guān)疾病，包括自身免疫疾病、過(guò)敏和移植排斥。通過(guò)追蹤表位擴(kuò)展、抗原特異性和定量結(jié)合數(shù)據(jù)，可確定疾病的階段和進(jìn)展。
發(fā)現(xiàn)自身抗體反應(yīng)的特異性可與自身反應(yīng)的T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)。在一些人自身免疫疾病中，自身免疫T和B細(xì)胞應(yīng)答識(shí)別相同的免疫顯性表位。在那些情況中B和T細(xì)胞應(yīng)答在自身免疫疾病中的優(yōu)良特異性不一致，鑒定人體自身反應(yīng)的特異自身蛋白的能力足夠以研究自身免疫應(yīng)答的特異性和進(jìn)化并選擇適當(dāng)抗原-特異治療。關(guān)于各病人中自身抗體反應(yīng)特異性的知識(shí)可促進(jìn)早期診斷，作為預(yù)測(cè)指示，并有助于指導(dǎo)適當(dāng)抗原-特異耐受性治療的發(fā)展和選擇。
對(duì)于一些自身免疫疾病包括自身免疫性糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重癥肌無(wú)力、和格雷夫斯病，檢測(cè)抗體對(duì)一種或兩種自身-蛋白的反應(yīng)有診斷功效。也證明一些抗體反應(yīng)有預(yù)測(cè)功效。例如，直接抗DNA的自身抗體在一些SLE模式中是致病的，一般與腎參與相聯(lián)，且它們的滴度常常與疾病活性相關(guān)。在多肌炎中，Jo-1自身抗體經(jīng)常預(yù)測(cè)幾個(gè)月到幾年的臨床疾病，預(yù)測(cè)肺間隙疾病的發(fā)展和不良預(yù)報(bào)。
人自身免疫疾病在它的臨床表現(xiàn)上非常不同。例如，SLE病人臨床疾病的譜各病人間不同。一些病人疾病主要涉及他們的皮膚和關(guān)節(jié)表現(xiàn)，另一些的疾病引起滑液積聚在心臟和肺(漿膜炎)，另外的疾病主要影響腎和腦。在多肌炎中，一些病人患的復(fù)發(fā)-緩解病(relaping-remitting disease)有一個(gè)沒(méi)有殘疾的良性過(guò)程，另一些開(kāi)始患的復(fù)發(fā)-緩和病發(fā)展成引起癱瘓和殘疾的慢性發(fā)展疾病，還有一些組從開(kāi)始就發(fā)生了慢性發(fā)展疾病?？赡芨鞣N這些疾病的臨床形式代表疾病的不同類型，其中自身免疫反應(yīng)直接抗不同抗原并對(duì)具體治療有不同應(yīng)答。
在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)來(lái)自病人樣品的抗體結(jié)合包括陣列的抗原來(lái)確定抗體特異性分布，在陣列中肽相應(yīng)于抗原可能的表位。少量樣品足夠篩選大量的不同肽。陣列可包括蛋白復(fù)合體、完整蛋白質(zhì)和/或蛋白片段的單獨(dú)的點(diǎn)，其中片斷可以是包括完整蛋白的重疊肽或蛋白的部分表達(dá)，蛋白可包含已知的免疫顯性肽。陣列也可包括其它分子的點(diǎn)，分子包含單鏈DNA、雙鏈DNA、寡核苷酸、RNA、脂質(zhì)、碳水化合物或其它分子。在自身免疫疾病的情況中，抗體特異性分布提供了監(jiān)控和/或預(yù)測(cè)抗體對(duì)抗原-特異疫苗或治療的反應(yīng)的方法，疫苗或治療可以DNA為基礎(chǔ)、以肽為基礎(chǔ)、以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)或以其它分子為基礎(chǔ)。抗體反應(yīng)分布可指示是否傳送給病人有效的治療。
從抗體特異性分布中獲得的信息用于監(jiān)控治療、修飾治療方法、并進(jìn)一步最優(yōu)化治療劑的選擇。用這種方法，治療和/或診斷方法可根據(jù)治療過(guò)程中不同時(shí)間獲得的具體數(shù)據(jù)個(gè)人化和相應(yīng)改變，從而提供適合個(gè)人的方法。此外，病人樣品可在治療過(guò)程中任何時(shí)間獲得用于分析。
提供分析樣品的哺乳動(dòng)物種包括犬科；貓科；馬；牛；綿羊等和靈長(zhǎng)類，具體是人。動(dòng)物模型具體是小型哺乳動(dòng)物，如鼠科、兔類等，可用于實(shí)驗(yàn)性研究。感興趣的動(dòng)物模型包括那些用于自身免疫、移植排斥等的模型。
抗體、自身抗體和T細(xì)胞受體免疫系統(tǒng)的抗原特異性通過(guò)已知為抗體(免疫球蛋白)和T細(xì)胞受體的蛋白組來(lái)提供。各個(gè)以許多種類、亞類和同種產(chǎn)生，它們?cè)诒绢I(lǐng)域中熟知并包括于此定義中用于本發(fā)明的目的。在一些體細(xì)胞突變的情況中，通過(guò)遺傳重組過(guò)程，不同蛋白序列很大一部分產(chǎn)生于這些蛋白的可變區(qū)域。這些可變區(qū)域的非共價(jià)結(jié)合相互作用使免疫系統(tǒng)能結(jié)合抗原，抗原是如多糖、多肽、多核苷等的分子。因此抗體或T細(xì)胞受體的“特異性”指可變區(qū)域高親和性結(jié)合抗原的能力。
抗體結(jié)合位置通常用多個(gè)非共價(jià)相互作用來(lái)獲得高親和性結(jié)合。當(dāng)抗原的一些接觸殘基非常接近結(jié)合袋時(shí)，也可需要抗原分子其它部分維持允許結(jié)合的構(gòu)型?？乖豢贵w結(jié)合的部分稱為表位。如本文所用，表位是抗原足夠高親和性結(jié)合的部分。當(dāng)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)，一般線性表位至少約7個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，且不超過(guò)約15到22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。然而，抗體也可識(shí)別由抗原上非-鄰近殘基形成的構(gòu)型決定簇，因此表位可需要存在更大抗原片斷用于結(jié)合，如蛋白或核蛋白復(fù)合體區(qū)域、蛋白結(jié)構(gòu)域或幾乎所有蛋白序列。在其它例子中如半抗原，表位可以是很小的分子如地高辛、地高辛配基等。也建立自身抗體以結(jié)合系統(tǒng)性紅斑狼瘡和其它自身免疫疾病中的蛋白、脂質(zhì)、核酸復(fù)合體、或核蛋白質(zhì)復(fù)合體。此外，自身抗體可直接抗翻譯后修飾自身蛋白。本文所用自身蛋白是生物體產(chǎn)生的基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)。翻譯后修飾的例子包括磷酸化和瓜氨酸-修飾的氨基酸以及糖基化中的不同，檢測(cè)到抗這些翻譯后修飾的自身抗體。
認(rèn)為是“特異”的抗體結(jié)合親和性水平部分通過(guò)抗體種類確定，如IgM種類的抗原特異抗體比例如IgG種類的抗體親和性低。如本文所用，為了認(rèn)為抗體相互反應(yīng)是“特異”的，對(duì)感興趣表位的親和性至少約為10-7M，通常約10-8到-9M，可直至10-11或更高。本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的術(shù)語(yǔ)“特異性”是指這種高親和性結(jié)合，但不意味抗體也不能結(jié)合其它分子?？砂l(fā)現(xiàn)不同表位的交叉反應(yīng)是由于如抗原序列或結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，或由于抗體結(jié)合袋本身的結(jié)構(gòu)。表現(xiàn)這種交叉反應(yīng)的抗體仍被認(rèn)為對(duì)本發(fā)明的目的特異。
T細(xì)胞受體比抗體識(shí)別更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，且需要主要組織相容性蛋白結(jié)合袋和抗原肽存在。T細(xì)胞受體的結(jié)合親和性比抗體低，通常至少約10-4M，更常見(jiàn)的至少約10-5M。
自身反應(yīng)抗體或自身抗體、和T細(xì)胞受體是高親和性結(jié)合宿主中存在分子的抗原受體，通常分子正常存在于宿主中，如在一些癌癥中的自身免疫疾病或腫瘤抗原。來(lái)自移植或外來(lái)組織的抗原一般不認(rèn)為是自身抗原。初始免疫原可以是自身抗原，或可以是與自身抗原交叉反應(yīng)的分子。
所示方法部分以自身抗體特異性與自身反應(yīng)輔助T細(xì)胞應(yīng)答特異性間的相互關(guān)系為基礎(chǔ)。在一些人自身免疫中，自身免疫T和B細(xì)胞應(yīng)答識(shí)別相同的免疫顯性表位。免疫顯性髓鞘堿性蛋白(MBP)表位由MS中自身反應(yīng)T和B細(xì)胞識(shí)別。即使在那些B和T細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)良特異性不一致的情況中，鑒定特異自身蛋白的能力足夠以指導(dǎo)選擇抗原-特異耐受性治療，個(gè)人自身反應(yīng)抗特異自身蛋白。
陣列陣列是可尋址元件的集合。這種元件可空間尋找，如包含在微量滴定板中或打印在平面上的陣列，其中各元件以不同X和Y軸表示。另外，元件可在標(biāo)記、珠、微?；蛭锢硇再|(zhì)的基礎(chǔ)上尋找。微陣列可根據(jù)普通技術(shù)人員已知的方法制備(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,807,522；Robinson等(2002)Nature Medicine 8295-301；Robinson等(2002)46885-93)。本文所用陣列是指任何有多種可尋址元件的生物分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，可尋址元件是表位。微陣列是陣列的小型化形式。如本文所用，元件指可由抗體結(jié)合的任何抗原。本文所用抗原指任何可特異結(jié)合抗體的分子。分子可以是但不限于蛋白質(zhì)、多肽、肽、RNA、DNA、脂質(zhì)、糖基化分子、碳水化合物、磷酸化修飾的多肽、和有瓜氨酸修飾、aptamers、氧化分子、其它分子的多肽、以及其它分子。
尋址對(duì)于本文所述元件，尋址指能鑒定元件的定位、位置、標(biāo)記、可裂開(kāi)的標(biāo)記和記號(hào)、標(biāo)識(shí)物、光譜性質(zhì)、電泳性質(zhì)或其它物理性質(zhì)。尋址也認(rèn)為是編碼的一個(gè)例子是空間尋址，其中分子的位置固定，此位置與標(biāo)識(shí)相關(guān)。此空間陣列種類一般是合成或點(diǎn)樣到平面上，產(chǎn)生例如微陣列，其中大量不同分子濃密地覆蓋在小區(qū)域中，如包括至少約400種不同序列每cm2，可以是1000序列每cm2或多達(dá)5000序列每cm2或更多。密集程度較低的陣列如可在ELISA或RIA板中發(fā)現(xiàn)的，其中板中各孔包含不同抗原，這種陣列可包括從約96種序列每板至約100種序列每cm2直至微陣列的密度。其它空間陣列使用光學(xué)纖維，其中不同抗原結(jié)合纖維，纖維可形成束用于結(jié)合和分析。生產(chǎn)和使用多肽空間陣列的方法在本領(lǐng)域中已知。最近的文章包括Joos等(2000)Electrophoresis21(13)2641-50描述了含一系列稀釋抗原的以微陣列為基礎(chǔ)的免疫分析；Roda等(2000)Biotechniques28(3)492-6描述了通過(guò)改變商業(yè)墨水-噴射打印機(jī)獲得的系統(tǒng)并用于在纖維素紙上產(chǎn)生含蛋白點(diǎn)的一和二維陣列；Ge(2000)Nucleic Acids Res28(2)e3描述了定量檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA、蛋白質(zhì)-配體相互作用的通用蛋白質(zhì)陣列系統(tǒng)。也參見(jiàn)Mendoza等(1999)“高通量以微陣列為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)”Biotechniques27778-780；和Lueking等(1999)“用于基因表達(dá)和抗體篩選的蛋白質(zhì)微陣列”Anal.Biochem.270103-111。
除了此種空間編碼陣列，另一種是使用“標(biāo)記”分子，其中靶抗原或表位粘附于提供抗原或表位序列編碼信息的可檢測(cè)標(biāo)注或標(biāo)記。在一些情況中，這些標(biāo)記可從元件上分開(kāi)并隨后檢測(cè)以鑒定元件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一批抗原或表位可合成或附于一批編碼珠，各個(gè)珠與不同抗原或表位相連且珠本身以可鑒定所附抗原或表位的形式編碼。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析臨床樣品的多路微球設(shè)置的使用描述于國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?7/24028；和Fulton等(1997)Chlinical Chemistry.431749-1756)。也可能使用其它可尋址顆?；驑?biāo)記(Robinson等(2002)ArthritisRheumatism.46885-93綜述)。
在此種“標(biāo)記陣列”中，抗原結(jié)合珠或微球，可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合。例如，有熒光編碼的微球在本領(lǐng)域中描述，其中熒光顏色和水平分辨具體微球。因此抗原共價(jià)粘附“顏色編碼”的物體。標(biāo)記的抗體可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，且微球上的標(biāo)碼用于鑒別結(jié)合抗原。
抗原陣列陣列的一個(gè)實(shí)施方案是抗原陣列。本文所用的抗原陣列指空間分離的能結(jié)合抗體的不同分子實(shí)體，抗體以可鑒定包含在病人樣品中抗體的方式排列。換句話說(shuō)，一批靶抗原有不同序列、三位形狀或分子結(jié)構(gòu)，其中編碼各靶抗原用于鑒別。陣列可包括一種或更多蛋白質(zhì)、多肽、肽、RNA、DNA、脂質(zhì)、糖基化分子、磷酸化修飾的多肽、和有瓜氨酸修飾、aptamers、其它分子的多肽、以及其它分子，其中不同種類的分子可組合在陣列中。
抗原抗原包括的分子如核酸、脂質(zhì)、核蛋白復(fù)合體、蛋白復(fù)合體、蛋白質(zhì)、多肽、肽和這些分子天然發(fā)生的修飾，可產(chǎn)生抗它們的包括T和B淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答。對(duì)各個(gè)抗原，存在一組表現(xiàn)此抗原免疫決定簇的表位?？乖ㄈ魏慰捎伤谢虿糠挚贵w或T細(xì)胞受體識(shí)別的分子。如本文所用，包括自身免疫疾病、過(guò)敏或組織移植排斥相聯(lián)的抗原。關(guān)于自身免疫疾病，本文的抗原通常指自身抗原。關(guān)于過(guò)敏疾病，本文的抗原通常指過(guò)敏原?？乖庖弑砦?。
表位表位是由B淋巴細(xì)胞識(shí)別的部分抗原，具體是B細(xì)胞分泌并在細(xì)胞表面表達(dá)的抗體。表位也可由T淋巴細(xì)胞上的特異受體識(shí)別。單個(gè)抗原通常包含多種表位，盡管有抗原包含單個(gè)表位的例子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自完整蛋白抗原的肽片斷用于表現(xiàn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體靶向的各表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)翻譯后修飾的分子部分、碳水化合物、脂質(zhì)和其它分子可用于表現(xiàn)各表位。表位表達(dá)的的形狀由免疫B和T細(xì)胞識(shí)別，也可被非抗原獲得肽和其它分子表達(dá)，這些分子有與天然抗原中存在的相同表位形狀。有表位形狀的元件例子是aptamer。Aptamer是提供可模仿免疫表位形狀的分子。用aptamer集合可產(chǎn)生表位形狀庫(kù)。
為了發(fā)明的目的，自身抗原和來(lái)自自身抗原的表位的陣列可用于確定病人抗體特異性分布用于鑒定或確定1.可能發(fā)展疾病的病人；2.可能發(fā)展或多或少嚴(yán)重疾病的病人；3.可能對(duì)具體治療有反應(yīng)的病人，或有與具體治療相關(guān)的反作用的病人；4.病人-特異治療；和5.具體治療干涉是成功、不成功還是有害。自身抗原陣列包括多種已知與疾病關(guān)聯(lián)、懷疑與具體疾病或潛在自身抗原庫(kù)相聯(lián)的自身抗原。在一個(gè)例子中，自身抗原陣列可包括對(duì)具體疾病最優(yōu)化的自身抗原，而在另一個(gè)例子中可包括未知抗原庫(kù)以鑒定患病病人中抗體反應(yīng)的靶。由自身抗原組組成的自身抗原陣列可用于篩選目的，其中組反映與具體疾病關(guān)聯(lián)的不同表位。感興趣的表位組包括對(duì)感興趣的具體疾病最優(yōu)化的組，可包括一種或更多完整蛋白、肽和這些蛋白序列中的重疊肽、表現(xiàn)顯性表位的肽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)多肽定義為任何蛋白和肽。當(dāng)使用短肽時(shí)，優(yōu)選肽至少約7個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，可至少約15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并多達(dá)22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。肽可重疊7-10個(gè)氨基酸，并可包括感興趣蛋白質(zhì)的全序列。肽也可模仿天然肽形狀，例如環(huán)肽、核酸aptamer、或可以是另一種分子、藥物或模仿由抗體或T細(xì)胞受體分子識(shí)別的3維形狀的有機(jī)分子。
免疫表位免疫表位是任何肽、多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或其它由抗體或T細(xì)胞受體分子識(shí)別的分子部分。
自身抗原是生物體產(chǎn)生的任何可成為免疫應(yīng)答靶的分子。一方面，這種分子是生物體基因組內(nèi)編碼的肽、多肽、和蛋白質(zhì)。另一方面，這種分子是這些肽、多肽、和蛋白質(zhì)翻譯后產(chǎn)生的修飾，如分裂、磷酸化、deimination精氨酸成瓜氨酸、和其它通過(guò)生理和非生理細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)生的修飾。而另外一方面，這種分子包括生物體產(chǎn)生的碳水化合物、脂質(zhì)和其它分子。本文所用的自身抗原的例子包括內(nèi)源蛋白質(zhì)或其引起致病免疫應(yīng)答的片斷。具體感興趣的是誘導(dǎo)T細(xì)胞調(diào)節(jié)致病應(yīng)答的自身抗原。特征是T細(xì)胞參與的自身免疫疾病包括多發(fā)性硬化、實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病等。
為了發(fā)明的目的，自身抗原或自身抗原表位的組可用于篩選目的，其中組反映與具體疾病相連的不同表位。感興趣的表位組包括對(duì)感興趣的具體疾病最優(yōu)化的組，可包括一種或更多完整蛋白、肽和這些蛋白序列中的重疊肽、表現(xiàn)顯性表位的肽。如本本文所用，術(shù)語(yǔ)多肽定義為任何蛋白和肽。當(dāng)使用短肽時(shí)，優(yōu)選肽至少約7個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，可至少約15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并多達(dá)22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。肽可重疊7-10個(gè)氨基酸，并可包括感興趣蛋白質(zhì)的全序列。
抗原陣列包含的抗原組表達(dá)由自身免疫疾病或組織移植排斥中異常免疫應(yīng)答靶向的自身蛋白、這些自身蛋白的修飾、存在于組織中的其它分子。
通常一組或一列抗原包括一種或更多不同抗原分子，即蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、多核苷分子，常常包括兩種或更多不同抗原，更常見(jiàn)的是三種或更多抗原，并可包括多達(dá)五到十種不同抗原或更多。各抗原可由一種或更多不同表位表現(xiàn)，通常三種或更多表位，更常見(jiàn)的是五種或更多，并可包括多達(dá)十到二十種不同表位。
用于具體疾病的陣列例子是用于脫髓鞘疾病的抗原組或陣列，如多發(fā)性硬化和EAE，且可包括的抗原和/或表位來(lái)自蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)；髓鞘堿性蛋白(MBP)；髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)；環(huán)核苷磷酸二酯酶(CNP酶)；髓鞘-相聯(lián)糖蛋白(MAG)；和髓鞘-相聯(lián)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)；α-B-晶體蛋白(一種熱激蛋白)；病毒和細(xì)菌模仿肽如流感、皰疹病毒、乙肝病毒等；OSP(少突細(xì)胞特異蛋白)；瓜氨酸-修飾MBP(MBP的C8異構(gòu)體，其中6個(gè)精氨酸de-imminated成瓜氨酸)等。整合膜蛋白PLP是髓鞘質(zhì)的顯性自身抗原。PLP抗原性的決定簇在一些小鼠品系中鑒定，包括殘基139-151、103-116、215-232、43-64和178-191。至少報(bào)道了26種MBP表位(Meinl等(1993)J.Clin.Invest.922633-2643)。值得注意的是殘基1-11、59-76和87-99。在一些小鼠品系中鑒定的免疫顯性MOG表位包括殘基1-22、35-55、64-96。
組或陣列可特異于疾病如多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、SLE等，特異于一類疾病如移植相關(guān)疾病、過(guò)敏疾病等，或可以是用于多種疾病的有廣泛基礎(chǔ)的抗原組。
疾病相關(guān)抗原。疾病相關(guān)抗原是已知與免疫相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)、或目前不知相聯(lián)但最終顯示相聯(lián)的抗原。自身免疫疾病相關(guān)抗原的例子如下所述。用于脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化和EAE的抗原組或陣列可包括的抗原和/或表位來(lái)自蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)；髓鞘堿性蛋白(MBP)；髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)；環(huán)核苷磷酸二酯酶(CNP酶)；髓鞘-相聯(lián)糖蛋白(MAG)；和髓鞘-相聯(lián)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)；α-B-晶體蛋白(一種熱激蛋白)；病毒和細(xì)菌模仿肽如流感、皰疹病毒、乙肝病毒等；OSP(少突細(xì)胞特異蛋白)；瓜氨酸-修飾MBP(MBP的C8異構(gòu)體，其中6個(gè)精氨酸de-imminated成瓜氨酸)等。整合膜蛋白PLP是髓鞘質(zhì)的顯性自身抗原。PLP抗原性的決定簇在一些小鼠品系中鑒定，包括殘基139-151、103-116、215-232、43-64和178-191。至少報(bào)道了26種MBP表位(Meinl等(1993)J.Clin.Invest.922633-2643)。值得注意的是殘基1-11、59-76和87-99。在一些小鼠品系中鑒定的免疫顯性MOG表位包括殘基1-22、35-55、64-96。
用于胰島素依賴性糖尿病的抗原組或陣列可包括的抗原和表位來(lái)自IA-2；IA-2β；GAD；胰島素；胰島素原；HSP；glima 38；ICA69；和p52。
用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組或陣列可包括的抗原來(lái)自II類膠原、hnRNP；A2/RA33；Sa；filaggrin；角蛋白；瓜氨酸；包括gp39的軟骨蛋白；膠原類型I、III、IV、V、IX、XI；HSP-65/60；IgM；RNA聚合酶；心磷脂；醛縮酶A；瓜氨酸-修飾filaggrin和纖維蛋白等。識(shí)別含修飾精氨酸殘基(deiminated形成瓜氨酸)的filaggrin肽的自身抗體在大部分RA病人血清中鑒定。自身反應(yīng)T和B細(xì)胞應(yīng)答在一些病人中都直接抗相同的免疫顯性II類膠原(CII)肽257-270。
用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的抗原組或陣列可包括DNA；磷脂；核抗原；Ro；La；U1核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；鈣網(wǎng)蛋白；Grp78；Scl-70；組蛋白；Sm蛋白；和染色質(zhì)等。
用于眼色素層炎的抗原組或陣列可包括S-抗原、和光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)等。
用于重癥肌無(wú)力的抗原組或陣列可包括有乙酰膽堿受體的表位。用于格雷夫斯病的表位可包括Na+/l-同向轉(zhuǎn)運(yùn)；促甲狀腺素受體；Tg；和TPO。Sjogren綜合癥組可包括SSA(Ro)；SSB(La)；和胞影蛋白。用于尋常性天皰瘡的組可包括橋粒芯蛋白-3。用于肌炎的組可包括tRNA合成酶(如蘇氨酰、組氨酰、丙氨酰、異亮氨酰、和甘氨酰)；Ku；PM/Scl；SSA；U1 sn-核糖核酸蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku；和SRP。用于硬皮病的組可包括Scl-70；著絲粒蛋白；U1核糖核酸蛋白；和纖維蛋白。用于原發(fā)性膽汁性肝硬化的組可包括丙酮酸脫氫酶E2和α-酮戊二酸脫氫酶成分。用于惡性貧血的組可包括內(nèi)因子；和胃H/K ATP酶的糖蛋白β亞基。
自身抗體自身抗體是任何識(shí)別或結(jié)合自身抗原或自身表位的抗體。自身抗原或自身表位包括多肽、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、多糖和這些基因組內(nèi)編碼或生物體產(chǎn)生的自身抗原的修飾。
過(guò)敏原是在易得病的人中引起增強(qiáng)的Th2-型T細(xì)胞應(yīng)答和IgE B細(xì)胞應(yīng)答的免疫原性化合物，包括過(guò)敏原相聯(lián)哮喘。感興趣的過(guò)敏原包括食物中發(fā)現(xiàn)的過(guò)敏原，如草莓、花生、牛奶蛋白、蛋白等。其它感興趣的過(guò)敏原包括多種空氣傳播抗原，如青草花粉、動(dòng)物頭垢、家螨糞便等。分子克隆的過(guò)敏原包括Dermatophagoidespteryonyssinus(一種嗜皮螨)(Der P1)；來(lái)自黑麥春季花粉的Lol pl-V；一些昆蟲(chóng)毒液，包括來(lái)自跳躍螞蟻Myrmecia pilosula的毒液；產(chǎn)蜜蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒磷脂酶A2(PLA2和抗原5S；來(lái)自小黃蜂Vespula maculifrons和白面大黃蜂Dolichovespula maculata的磷脂酶；大量花粉蛋白，包括樺樹(shù)花粉、豚草花粉、Parol(Parietaria officinalis的主要過(guò)敏原)和交叉反應(yīng)過(guò)敏原Parjl(來(lái)自Parietaria judaica)，和其它空氣花粉包括油橄欖(Olea europaea)、艾屬、禾本科等。其它感興趣的過(guò)敏原是那些引起過(guò)敏性皮炎的過(guò)敏原，過(guò)敏性皮炎由吸血節(jié)肢動(dòng)物導(dǎo)致，如雙翅目包括蚊子(瘧蚊屬、伊蚊屬、Culiseta屬、庫(kù)蚊屬)；蒼蠅(白蛉屬、Culicoides屬)具體是黑蠅、鹿蠅和咀嚼蚊(biting midges)；扁虱(Dermacenter屬、Ornithodoros屬)；跳蚤如order Siphonaptera，包括Xenopsylla、Pulex和Ctenocephalides felis felis。具體過(guò)敏原可以是多糖、脂肪酸部分、蛋白質(zhì)等。
特異性分析的方法免疫相關(guān)疾病包括1.自身免疫疾病，其中免疫應(yīng)答異常地攻擊自身抗原，自身免疫疾病的例子包括但不限于多發(fā)性硬化(MS)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、I型自身免疫糖尿病(IDDM)、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；2.過(guò)敏性疾病，其中免疫系統(tǒng)異常地攻擊分子如花粉、粉塵螨(dust mite)抗原、蜂毒、花生油和其它食物等；和3.組織移植排斥，其中免疫系統(tǒng)異常地攻擊嫁接或移植組織中表達(dá)或包含的抗原，組織如血液、骨髓細(xì)胞、或包括心臟、肺、腎和肝臟的固體器官。樣品獲得自臨床癥狀指示免疫相關(guān)疾病或更高可能性發(fā)展這種疾病的病人，這種可能性是以家族歷史或遺傳試驗(yàn)為基礎(chǔ)。
人類病人取樣的形式包括跟蹤疾病進(jìn)展的過(guò)程、在類似疾病階段比較不同病人，如早期開(kāi)始、急性階段、恢復(fù)階段等；追蹤病人對(duì)治療的應(yīng)答過(guò)程，包括藥物治療、疫苗等?？蓞R編和分析來(lái)自動(dòng)物的數(shù)據(jù)以提供詳述疾病過(guò)程的數(shù)據(jù)庫(kù)、參與疾病的抗原等，動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔、猴等?？蓮闹惺占∪丝贵w的生物樣品包括血液和衍生物，如血清、血漿、血漿部分等。其它樣品來(lái)源是體液如滑液、淋巴、腦脊液、支氣管吸氣，并可進(jìn)一步包括唾液、牛腦、尿等?？贵w和T細(xì)胞受體也都可獲得自適當(dāng)淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞收集自血液、組織如脾、胸腺、淋巴結(jié)、胎兒肝臟、自身免疫損傷位置上的組織如胰腺、關(guān)節(jié)、腎、腦脊液等。淋巴細(xì)胞可完整分析，或可制備溶解產(chǎn)物用于分析。病人樣品包含抗體，且抗原陣列用于表現(xiàn)這些抗體分布。
在一個(gè)典型分析中，含抗體的病人樣品與抗原陣列物理接觸，接觸在允許高親和性結(jié)合的條件下但最小化非特異相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，病人樣品加到陣列上或含可尋址元件的空間中。沖洗陣列到?jīng)]有非結(jié)合物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)合抗體的存在，并與同源抗原相聯(lián)。
在陣列內(nèi)鑒定疾病相關(guān)抗原的方式使用本領(lǐng)域已知的檢測(cè)方法，抗原結(jié)合病人樣品中的抗體。那些鑒定方法可包括直接或間接預(yù)標(biāo)記樣品；加入結(jié)合抗體或間接標(biāo)記的第二階段抗體，如標(biāo)記的山羊抗人-血清、大鼠抗-小鼠等。其它鑒定方法包括分析可尋址元件如珠、微粒、標(biāo)記、可分裂標(biāo)記和其它陣列內(nèi)元件具有或賦予的物理性質(zhì)?？纱嬖趩蝹€(gè)表位的不同濃度以促進(jìn)結(jié)合抗體的定量。
有用的標(biāo)記包括熒光染料如Cy2，Cy3，Cy5、熒光素異硫氰酸(FITC)、若丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2’，7’-二甲氧-2’，4，’7，’4，’7，’-六氯熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或N，N，N’，N’，-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA))。間接標(biāo)記包括半抗原如地高辛和地高辛配基、生物素等，其中第二階段結(jié)合伴侶如抗生物素蛋白、抗-地高辛抗體等可用酶標(biāo)記，如山葵過(guò)氧化物酶、熒光染料、放射性標(biāo)記等。優(yōu)選的是當(dāng)包括對(duì)照樣品時(shí)，用于標(biāo)記對(duì)照序列的熒光報(bào)道基因在激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)出熒光信號(hào)，與用于標(biāo)記測(cè)試序列的熒光報(bào)道基因發(fā)出的信號(hào)有可檢測(cè)的不同。
檢測(cè)也可用不要求標(biāo)記的方法進(jìn)行。例子包括檢測(cè)結(jié)合的自身抗原的電荷或質(zhì)量變化，檢測(cè)用的方法或裝置如單電子晶體管、應(yīng)用于碳小管或小管網(wǎng)的蛋白質(zhì)、表面胞質(zhì)基因共振、原子力顯微鏡、和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。
一般如在本領(lǐng)域已知，分析包括多種負(fù)和正對(duì)照。這些可包括有已知自身抗體的“針刺狀”樣品的正對(duì)照、患已知疾病的病人等。負(fù)對(duì)照包括來(lái)自正常病人、動(dòng)物血清等的樣品。
含樣品的抗體與抗原陣列的結(jié)合根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法獲得。結(jié)合條件和洗優(yōu)先在僅允許高親和性結(jié)合伴侶保留的條件下進(jìn)行。
兩種顏色標(biāo)記不同抗體可用于結(jié)合相同或不同陣列，這是為了分析病人樣品中相較對(duì)照樣品的結(jié)合水平。對(duì)任何具體陣列元件，從一種顏色和另一種的比例可確定在兩個(gè)樣品中有具體特異性抗體的相對(duì)豐度。此外，比較兩種樣品的結(jié)合提供分析的內(nèi)部對(duì)照。競(jìng)爭(zhēng)性分析在本領(lǐng)域熟知，其中有已知特異性的競(jìng)爭(zhēng)抗體或含分子的表位可包括在結(jié)合反應(yīng)中。
可掃描陣列以檢測(cè)抗體結(jié)合，如用描述于Shalon等，Genome Res.6639(1996)的掃描激光顯微鏡。用適當(dāng)激發(fā)線路對(duì)各使用的熒光團(tuán)進(jìn)行分別掃描。隨后結(jié)合掃描產(chǎn)生的數(shù)字圖象用于后續(xù)分析。對(duì)任何具體陣列元件，來(lái)自一種樣品的信號(hào)比例與來(lái)自另一種樣品的熒光信號(hào)相比并確定相對(duì)豐度。
使用多種方法確定病人樣品的抗體特異性分布。開(kāi)始確定單個(gè)病人的抗體特異性分布，抗體特異性分布如本文所用是指抗原或表位被來(lái)自病人樣品的抗體結(jié)合。比較獲得自病人樣品的結(jié)合模式和獲得自對(duì)照或參考的結(jié)合模式，樣品通過(guò)使用合適的推論方法(deduction protocol)、Al系統(tǒng)、統(tǒng)計(jì)比較、識(shí)別模式算法等來(lái)完成。當(dāng)數(shù)據(jù)矩陣各點(diǎn)與來(lái)自具體陣列或抗原或表位讀數(shù)相應(yīng)時(shí)，通常產(chǎn)生數(shù)據(jù)矩陣。來(lái)自參考模式的信息可用于分析方法以確定抗原或表位擴(kuò)展、相對(duì)豐度、隨著時(shí)間的變化、產(chǎn)生同種抗體的變化、和其它相關(guān)變化。
抗原或表位讀數(shù)可以是測(cè)量相關(guān)的平均數(shù)、均值、中值或方差或其它統(tǒng)計(jì)或數(shù)學(xué)-所得值?？乖虮砦蛔x數(shù)信息可進(jìn)一步通過(guò)與相應(yīng)參考或?qū)φ漳Ｊ街苯颖容^來(lái)改進(jìn)。結(jié)合模式可在一些點(diǎn)上評(píng)估以確定數(shù)據(jù)矩陣中任何點(diǎn)上是否有統(tǒng)計(jì)上的顯著變化；表位結(jié)合的變化是增加或減少；變化是否特異于一種或更多生理狀態(tài)等。在相同條件下獲得的各表位的絕對(duì)值表現(xiàn)活生物系統(tǒng)中固有的差異并也反映各抗體差異以及個(gè)體間固有的差異。
鑒定參考模式的分類規(guī)則從幾批訓(xùn)練數(shù)據(jù)(即數(shù)據(jù)矩陣)中建立，數(shù)據(jù)獲得自多種重復(fù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)分類規(guī)則正確鑒定重復(fù)參考模式并成功分辨不同參考模式時(shí)，分類規(guī)則被選擇。分類規(guī)則-學(xué)習(xí)算法可包括決策樹(shù)方法、統(tǒng)計(jì)方法、原始 貝葉斯算法等。
為有效鑒定和分類新試驗(yàn)?zāi)Ｊ?，知識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)肯定有足夠復(fù)雜性。這可通過(guò)一些產(chǎn)生分類模式充分覆蓋的方法和足夠有力區(qū)分它們的數(shù)學(xué)/統(tǒng)計(jì)方法來(lái)完成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得自血清和其它病理組織樣品分析的信息用于改進(jìn)和建立抗體特異性分布的數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，鑒定特異結(jié)合部分可用于跟蹤疾病和發(fā)展治療。
病人抗體特異性分布如本文所用，抗體特異性分布指抗原或表位的抗原或表位陣列-確定光譜，抗原或表位由來(lái)自病人樣品的抗體識(shí)別。
一旦鑒定具體樣品特異性的亞型，數(shù)據(jù)用于發(fā)展新的診斷劑并選擇對(duì)個(gè)人最適當(dāng)?shù)闹委?。通過(guò)在個(gè)人基礎(chǔ)上分析自身抗體特異性，確定存在于疾病狀態(tài)中的特異表位靶。接著可選擇一種或更多對(duì)單個(gè)病人和疾病有最佳特異性的治療劑。
分析和治療的條件風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是影響8％世界人口的慢性自身免疫炎癥關(guān)節(jié)膜炎。當(dāng)前RA的治療使用非特異性抑制或調(diào)節(jié)免疫功能的治療劑。這種治療包括最近發(fā)展的TNFα拮抗物，不能根本上治愈，且疾病活性在治療中止后迅速回復(fù)。臨床上非常需要不引起全身免疫抑制或調(diào)節(jié)的從根本上治愈的治療。
退化關(guān)節(jié)疾病可以是與血清反應(yīng)陰性椎關(guān)節(jié)病一起的炎癥，如僵硬脊椎炎和反應(yīng)關(guān)節(jié)炎；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；痛風(fēng)；和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。退化關(guān)節(jié)疾病共同的特征是關(guān)節(jié)軟骨被侵蝕，最終暴露骨頭表面。軟骨破壞開(kāi)始于蛋白多糖降解，由酶如基質(zhì)溶素和膠原酶調(diào)節(jié)，導(dǎo)致抵抗壓力的能力損失。接著粘合分子如CD44(SwissprotP22511)、ICAM-1(Swissprot P05362)以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖連蛋白和腱生蛋白表達(dá)變化。最后纖維膠原被金屬蛋白酶攻擊，當(dāng)失去膠原微骨架時(shí)再生修復(fù)是不可能的。
在發(fā)炎關(guān)節(jié)炎過(guò)程中滑膜中有顯著的免疫活性。早期階段治療是需要的，后期階段中疾病的不利癥狀可至少由治療緩解。關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性的臨床指標(biāo)包括疼痛、膨脹、疲勞和早晨僵硬，并可通過(guò)Pannus標(biāo)準(zhǔn)定量監(jiān)控。動(dòng)物模型中的疾病進(jìn)展可通過(guò)測(cè)量受影響關(guān)節(jié)炎癥來(lái)追蹤。治療發(fā)炎關(guān)節(jié)炎可結(jié)合試驗(yàn)者治療和傳統(tǒng)NSAID治療。一般，試驗(yàn)者治療不結(jié)合這種疾病修飾藥物如環(huán)孢霉素A、氨甲蝶呤等。
能分泌IFN-γ的髓鞘質(zhì)-自身反應(yīng)T細(xì)胞的定量增加與MS和EAE發(fā)病相聯(lián)，說(shuō)明MS病人外周血液中的自身免疫誘導(dǎo)物/輔助T淋巴細(xì)胞可起始和/或調(diào)節(jié)MS病人中脫髓鞘過(guò)程。明顯的疾病與肌肉虛弱、腹壁反射損失、表觀缺陷和感覺(jué)異常相聯(lián)。在感覺(jué)異常階段中有白細(xì)胞滲透入腦脊液、炎癥和脫髓鞘。家族歷史和存在HLA單模標(biāo)本DRB1*1501、DQA1*0102、DQB1*0602指示對(duì)疾病的敏感?？杀O(jiān)控疾病進(jìn)展的標(biāo)記是腦脊液中抗體的存在、腦電圖儀所示視皮層和腦干的“誘發(fā)潛能”、和MRl或計(jì)算機(jī)化X線斷層攝影術(shù)發(fā)現(xiàn)存在的脊髓缺陷。疾病早期階段中的治療減慢或抑制進(jìn)一步神經(jīng)功能的損失。
人IDDM是導(dǎo)致胰島素-分泌β細(xì)胞破壞和明顯的高血糖癥的細(xì)胞調(diào)節(jié)自身免疫疾病。T淋巴細(xì)胞侵入胰島并特異地破壞胰島素-產(chǎn)生β細(xì)胞。缺乏β細(xì)胞導(dǎo)致沒(méi)有能力調(diào)節(jié)血液中葡萄糖水平。當(dāng)血液中葡萄糖水平上升到具體水平之上，通常約250mg/dl，發(fā)生明顯的糖尿病。在人中，糖尿病開(kāi)始前有一段長(zhǎng)時(shí)間的癥狀出現(xiàn)前階段。在此階段中胰腺β細(xì)胞功能逐步損失。在通過(guò)家族歷史和遺傳分析診斷為易得病的人中，可監(jiān)控疾病進(jìn)展。最重要的遺傳效果用主要組織相容性基因座(IDDM1)的基因了解，盡管其它基因座包括胰島素基因區(qū)域(IDDM2)也顯示與疾病相關(guān)(參見(jiàn)Davies等，同上和Kennedy等，(1995)Nature Genetics9293-298)。
在癥狀出現(xiàn)前階段可評(píng)估的標(biāo)記是胰腺中胰島炎的存在、島細(xì)胞抗體的水平和頻率、島細(xì)胞表面抗體、II型MHC分子在胰腺β細(xì)胞上的異常表達(dá)、血液中的葡萄糖濃度、和胰島素的血漿濃度。胰腺中T淋巴細(xì)胞、島細(xì)胞抗體和血液葡萄糖數(shù)量的增加指示疾病，胰島素濃度下降也如此。明顯的糖尿病開(kāi)始后，有剩余β細(xì)胞功能的病人也可從試驗(yàn)者實(shí)驗(yàn)中受益以防止功能進(jìn)一步損失，病人的剩余β細(xì)胞功能通過(guò)胰島素C-肽的血漿持續(xù)性證明。
過(guò)敏或遺傳性過(guò)敏癥是對(duì)IgE為基礎(chǔ)的敏感性傾向增加，導(dǎo)致產(chǎn)生特異IgE抗體給免疫原，具體是普通的環(huán)境過(guò)敏原如昆蟲(chóng)毒液、房屋粉塵小蟲(chóng)、花粉、模子或動(dòng)物頭垢。過(guò)敏反應(yīng)是抗原特異的。對(duì)抗原的免疫應(yīng)答進(jìn)一步以Th2-型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-10的過(guò)量產(chǎn)生和應(yīng)答T細(xì)胞為特征。遺傳誘病的人暴露于低濃度過(guò)敏原后發(fā)生過(guò)敏；香煙煙霧和病毒感染可協(xié)助過(guò)敏過(guò)程。
患遺傳性過(guò)敏癥的病人組包括有哮喘相聯(lián)過(guò)敏的人。約40％人群患遺傳性過(guò)敏癥，此組約半數(shù)發(fā)展臨床疾病，范圍從普通鼻炎到威脅生命的哮喘。過(guò)敏后，連續(xù)暴露于過(guò)敏原導(dǎo)致哮喘流行顯著增加。患哮喘的90％孩子和80％成人是遺傳性過(guò)敏。一旦發(fā)生過(guò)敏，再暴露于過(guò)敏原對(duì)哮喘惡化是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素。有效處理過(guò)敏哮喘包括藥物治療和避免過(guò)敏原。哮喘相聯(lián)過(guò)敏的具體生理效果包括空中炎癥、嗜曙紅細(xì)胞過(guò)多和產(chǎn)生粘液、產(chǎn)生抗原特異IgE和IL-4。
除了影響人群的過(guò)敏，非人的哺乳動(dòng)物也已知忍受過(guò)敏情況。跳蚤，Ctenocephalides felis felis和其它，現(xiàn)在認(rèn)為是引起哺乳動(dòng)物生理疾病的主要原因。這些昆蟲(chóng)是攻擊狗、貓和人的外寄生蟲(chóng)。一些種類(即狗和貓)和這些種中的個(gè)體比其它的對(duì)蚤咬更敏感，導(dǎo)致稱為跳蚤過(guò)敏皮炎(FAD)或蚤咬超敏性的臨床疾病。FAD的特點(diǎn)是強(qiáng)烈的搔癢癥(癢)不僅在蚤咬位置而且以不同的、全身性的分布。過(guò)敏反應(yīng)是對(duì)口分泌物中多種蛋白物質(zhì)的全身反應(yīng)，當(dāng)跳蚤咬時(shí)將這些蛋白物質(zhì)注射到皮內(nèi)。慢性FAD導(dǎo)致疤痕和永久的光禿點(diǎn)并常與皮脂溢相聯(lián)，使狗有會(huì)遍及家里的骯臟氣味。跳蚤過(guò)敏也被認(rèn)為引起稱為丘疹風(fēng)疹的人普通皮炎。
抗原特異治療方法如上所述，由病人樣品中存在的抗體識(shí)別的抗原或表位可用于發(fā)展和選擇抗原或表位特異治療，治療包括施用抗原或表位特異治療劑，其中試劑通過(guò)結(jié)合病人抗體到陣列上可尋址元件來(lái)定義。病人抗體特異性分布可用于發(fā)展、選擇和監(jiān)控對(duì)抗原或表位特異治療方法的應(yīng)答，治療方法包括(1)口頭施用特異-抗原，稱為‘口頭耐受’(Annu Rev Immunol.12809-37)；(2)施用天然肽(Science 2581491-4；J Neurol Sci.15231-8)；(3)施用改變的肽配體(Nature 379343-5)；(4)施用完整蛋白質(zhì)(Science2631139)；施用融合蛋白或肽；施用其它分子如DNA或包括花粉、粉塵小蟲(chóng)、貓唾液抗原的過(guò)敏原(J.Rheumatology28257-65)；施用編碼靶向自身蛋白或過(guò)敏原的多核苷序列(J.Immunol 1623336-41；Curr.Dir.Autoimmun.2203-16)。對(duì)于所有這些治療，用于免疫抑制目的的施用抗原(或以DNA編碼)可包括所有或部分抗體鑒別的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用一個(gè)或更多這樣鑒別的表位，常常兩個(gè)或更多，更常見(jiàn)的是三個(gè)或更多，并可包括多達(dá)十個(gè)或更多不同表位?？墒┯酶鱾€(gè)肽或編碼肽的DNA。另外，可施用完整蛋白質(zhì)或編碼所有或幾乎所有抗原蛋白的DNA。因此可施用一個(gè)或更多，常常兩個(gè)或更多，并可多達(dá)三個(gè)或更多不同表位。本文所用抗原特異治療是指由本發(fā)明新方法確定的在抗原特異性分布基礎(chǔ)上的治療方案。
在發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，上述以知識(shí)為基礎(chǔ)的方法用于鑒定疾病模式，其中可描繪具體病人樣品成疾病進(jìn)展模式。在這些情況中，抑制性表位可不僅包括現(xiàn)在抗體識(shí)別的表位，而且可預(yù)期疾病進(jìn)展和用藥可能在疾病后期與疾病關(guān)聯(lián)的肽，從而防止在許多自身免疫中觀察到的表位擴(kuò)展。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療包括通過(guò)用藥注入宿主組織的DNA表達(dá)盒來(lái)誘導(dǎo)抗原-特異、抑制性T細(xì)胞應(yīng)答，例如肌肉或皮膚，如PCT應(yīng)用US00/0623中所述例子。 載體包括編碼至少部分自身抗原、移植抗原等的DNA序列。對(duì)此疫苗反應(yīng)，引起抑制性應(yīng)答?？乖?特異T細(xì)胞擴(kuò)增被抑制且Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生減少。
防止涉及靶抗原的自身免疫疾病通過(guò)在明顯疾病發(fā)展前施用疫苗來(lái)完成。具體感興趣的是治療正發(fā)生的疾病，其中接種抑制性疫苗使病人臨床癥狀穩(wěn)定或改進(jìn)。這種治療需要在受影響組織功能完全喪失前進(jìn)行。
編碼所有、幾乎所有或部分抗原、編碼至少一個(gè)完整表位的DNA表達(dá)盒被引入受體的組織，DNA表達(dá)盒通常作為載體的一部分?；蚧蛐』蛟诮M織中表達(dá)，編碼的多肽作為免疫原或抗原。可假設(shè)由“非專業(yè)”細(xì)胞表達(dá)的抗原序列刺激抑制性T細(xì)胞應(yīng)答，這種表達(dá)缺少共刺激分子如CD80和CD86。
DNA表達(dá)盒包括大部分或所有編碼抗原片段的序列。編碼序列可截去5’或3’末端并可以是完整多肽序列片斷。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，序列編碼已知呈遞給致病T細(xì)胞的肽片斷，例如由宿主II型MHC分子呈遞的肽。這種肽在文獻(xiàn)中描述，通常有約8到約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，序列編碼完整抗原蛋白或幾乎所有抗原蛋白。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，序列編碼自身蛋白，其中如果注入會(huì)有害或降低耐受效力的部分自身蛋白被去除。
疫苗可用一個(gè)表位或表位序列混合物制成。在一些情況中包括多種序列是需要的，其中各個(gè)編碼一個(gè)不同表位。例如，參見(jiàn)Leadbetter等(1998)J.Immunol.161504-512。包括多種不同表位編碼序列的制劑可用于誘導(dǎo)更有力和/或持久的抑制性應(yīng)答。通過(guò)特異靶向多種自身反應(yīng)T細(xì)胞人群，這種制劑可減緩或防止自身抗原抗性的發(fā)展。
除了自身抗原的特異表位和多肽，免疫應(yīng)答可通過(guò)包含如Krieg等(1998)Trends Microbiol.623-27描述的CpG序列和King等(1998)Nat.Med.41281-1286的輔助序列來(lái)增強(qiáng)。當(dāng)注入動(dòng)物時(shí)，DNA基序像未甲基化CpG二核苷酸的生物效果可調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答，CpG二核苷酸具體是堿基含量(CpG-S基序)。
抗原序列插入適當(dāng)表達(dá)盒中。表達(dá)構(gòu)建以常規(guī)方式制備。盒有用于在受體細(xì)胞中表達(dá)序列的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列。盒一般是載體的一部分，在引入受體前載體包含合適復(fù)制起點(diǎn)和編碼可選擇標(biāo)記的基因，這些基因也許是載體生長(zhǎng)、擴(kuò)增和操作所需的。適當(dāng)載體包括質(zhì)粒、YACs、BACs、噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等。方便的表達(dá)載體是質(zhì)粒。在引入受體前，盒可通過(guò)分裂、擴(kuò)增等本領(lǐng)域已知方式從載體序列分離。對(duì)于注射，DNA可以是超螺旋或線性，超螺旋優(yōu)選。盒可在宿主細(xì)胞中維持較長(zhǎng)的時(shí)間或可以是瞬時(shí)，一般是瞬時(shí)。穩(wěn)定維持通過(guò)包含提供整合和/或維持的序列來(lái)獲得，如反轉(zhuǎn)錄病毒、EBV載體等。
表達(dá)盒一般使用外源轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，即除了在正常發(fā)生染色體中與T細(xì)胞受體相聯(lián)啟動(dòng)子外的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中有功能，具體是盒靶向的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子可通過(guò)體外重組方法或作為適當(dāng)宿主細(xì)胞序列同源整合的結(jié)果來(lái)引入。啟動(dòng)子可操作地連接于抗原編碼序列以產(chǎn)生可翻譯mRNA轉(zhuǎn)錄本。表達(dá)載體方便地具有位于啟動(dòng)子附近的限制性酶切位點(diǎn)以促進(jìn)抗原序列的插入。
制備的表達(dá)盒包括可以是組成型或可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、編碼抗原序列的基因、和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。表達(dá)盒可引入多種載體中。感興趣的啟動(dòng)子可以是可誘導(dǎo)的或組成型，通常是組成型，并提供受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可僅在受體細(xì)胞類型中活化，或在許多不同細(xì)胞類型中廣泛活化。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中已知，包括β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、人細(xì)胞巨化病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs等。啟動(dòng)子可與或不與增強(qiáng)子相聯(lián)，其中增強(qiáng)子可與具體啟動(dòng)子天然相聯(lián)或與一個(gè)不同啟動(dòng)子相聯(lián)。
終止區(qū)域提供3’給編碼區(qū)域，其中終止區(qū)域可與可變區(qū)域天然相聯(lián)或獲得自不同來(lái)源?？墒褂枚喾N終止區(qū)域而沒(méi)有不利地影響表達(dá)。
可在自身抗原序列末端插入少量核苷，通常不超過(guò)20個(gè)，更常見(jiàn)的是不超過(guò)15個(gè)。核苷缺失或插入通常是構(gòu)建需要的結(jié)果，提供方便的限制性酶切位點(diǎn)、加入處理信號(hào)、加入統(tǒng)一的Kozak序列、使操作容易、提高表達(dá)水平等。此外，可為了類似原因用不同的氨基酸替換一個(gè)或更多氨基酸，通常在區(qū)域中不替換超過(guò)約5個(gè)氨基酸。
DNA載體懸浮于生理可接受緩沖液，一般是水溶液如正常鹽水、磷酸緩沖鹽水、水等。穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和乳化劑、鹽和皮膚穿透增強(qiáng)子可作為佐劑，鹽用于改變滲透壓或緩沖液以保證合適pH值。DNA通常以至少約1ng/ml和不超過(guò)約10mg/ml的濃度存在，常約從100μg到1mg/ml。
DNA耐受性治療可分成兩個(gè)或更多劑量，至少約1μg，更常見(jiàn)的是至少約100μg，優(yōu)選的是至少約1mg每劑量，用藥從約4天到一周。在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，個(gè)人試驗(yàn)一系列疫苗以產(chǎn)生充分、廣泛的免疫應(yīng)答。根據(jù)此方法，至少兩次和優(yōu)選的四次注射在一段時(shí)間中給予。注射間的時(shí)間段可包括注射間分開(kāi)從24小時(shí)到兩周或更長(zhǎng)，分開(kāi)一周優(yōu)選。另外，至少兩至四次單獨(dú)注射同時(shí)在身體不同部分給予。
DNA治療劑皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、口頭注入肌肉或其它組織或者直接注入脊髓或滑液。具體感興趣的是進(jìn)入骨骼肌的注射。遺傳治療劑可直接用藥待免疫的個(gè)人或活體外給于取出的個(gè)人細(xì)胞，這些細(xì)胞是在用藥后再輸入的。通過(guò)任一途徑，引入遺傳物質(zhì)到個(gè)人身體中存在的細(xì)胞。另外，遺傳治療劑可通過(guò)多種方式引入從個(gè)人中取出的細(xì)胞。這種方式包括例如轉(zhuǎn)染、電穿孔和微粒轟擊。遺傳構(gòu)建為細(xì)胞吸收后，它們?cè)僖浦踩肴酥小Ａ硗庥斜疚乃z傳構(gòu)建的非-免疫原性細(xì)胞可取自一個(gè)人并移植入另一個(gè)人。
布比卡因或有類似功能的化合物可在使用疫苗前或同時(shí)用藥。布比卡因是馬比佛卡因同源物并與利多卡因相關(guān)。它提供對(duì)鈉挑戰(zhàn)敏感的肌肉組織電壓并影響細(xì)胞中的離子濃度。除了布比卡因、馬比佛卡因、利多卡因和其它類似作用化合物，其它預(yù)期細(xì)胞刺激試劑包括外源凝集素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和淋巴因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、gCSF、gMCSF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和IL-4。
另外或除了DNA耐受性，特異肽、修飾肽或蛋白質(zhì)可治療用藥以誘導(dǎo)治療自身免疫的抗原-特異耐受?？蓚鬟f自身免疫應(yīng)答靶向的天然肽以誘導(dǎo)抗原-特異耐受(Science 2581491-4)。天然肽在靜脈內(nèi)傳遞以誘導(dǎo)免疫耐受(J NeurolSci.15231-8)。
傳遞改變自天然肽的肽也在本領(lǐng)域已知。有關(guān)鍵殘基選擇性變化的天然肽修飾(修飾肽配體或“APL”)可誘導(dǎo)無(wú)感應(yīng)性或改變抗原-特異自身反應(yīng)T細(xì)胞的感應(yīng)性。
“肽類似物”至少七個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且包含至少一種類似物和天然抗原肽間的氨基酸序列不同。來(lái)自天然肽的L-氨基酸可改變成任何其它20種L-氨基酸中一種，這20種L-氨基酸普遍發(fā)現(xiàn)于蛋白質(zhì)、任何一種相應(yīng)D-氨基酸、稀有氨基酸如4-羥脯氨酸和羥賴氨酸、或非-蛋白質(zhì)氨基酸如β-丙氨酸和高絲氨酸。也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是通過(guò)化學(xué)方法修飾的氨基酸，化學(xué)方法如甲基化(如α-甲基纈氨酸)、通過(guò)烷基胺如乙胺、乙醇胺和乙二胺來(lái)酰胺化C-末端氨基酸、?；蚣谆被醾?cè)鏈功能(如酰化賴氨酸ε氨基)、deimination精氨酸成瓜氨酸、異天冬氨酸化(isoaspartylation)、或磷酸化絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組氨酸殘基。
修飾肽配體如何有效的作用機(jī)制可包括不完全動(dòng)員T細(xì)胞受體(TCR)。有一些APL可誘導(dǎo)的可能功能改變，這些包括簡(jiǎn)單拮抗物，其中APL可競(jìng)爭(zhēng)MHC結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上的天然肽且不允許完全T細(xì)胞活化。這意味著沒(méi)有信號(hào)由APL通過(guò)T細(xì)胞受體傳輸。能量，其中APL誘導(dǎo)T細(xì)胞中完全無(wú)感應(yīng)性狀態(tài)從而T細(xì)胞不應(yīng)答天然肽。表型轉(zhuǎn)換，其中APL可誘導(dǎo)T細(xì)胞中功能轉(zhuǎn)換從而減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或增加非發(fā)炎細(xì)胞因子如IL-4或IL-10的產(chǎn)生。
肽和肽類似物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)合成，包括由自動(dòng)化過(guò)程合成。一般，肽類似物通過(guò)固相肽合成方法制備，固相肽合成方法包括偶聯(lián)各受保護(hù)氨基酸殘基于樹(shù)脂支持體，4-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂優(yōu)選，用二環(huán)己基碳二亞胺活化以產(chǎn)生有C-末端酰胺的肽。另外，氯甲基樹(shù)脂(Merrifield樹(shù)脂)可用于產(chǎn)生C-末端有自由羧酸的肽。附上最后的殘基后，受保護(hù)肽-樹(shù)脂用氟化氫處理以從樹(shù)脂分開(kāi)肽以及脫保護(hù)側(cè)鏈功能基團(tuán)。粗產(chǎn)物可用凝膠過(guò)濾、HPLC、分配層析或離子交換層析進(jìn)一步純化。
候選肽類似物可篩選它們治療疾病的能力，篩選是通過(guò)測(cè)量競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MHC的分析和測(cè)量T細(xì)胞增殖的分析。那些抑制天然肽結(jié)合且不刺激自身反應(yīng)T細(xì)胞增殖的類似物是有用的治療劑。進(jìn)一步試驗(yàn)候選肽類似物刺激或抑制T細(xì)胞增殖的性質(zhì)，試驗(yàn)是通過(guò)測(cè)量類似物以直接方式引起T細(xì)胞增殖的能力或測(cè)量肽類似物抑制天然肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的能力。
肽作為一種或不同表位混合物施用，通過(guò)一種途徑例如靜脈內(nèi)或皮下提供免疫應(yīng)答的抑制。APL和天然肽都以0.5-100mg/劑量的劑量在雙周到一個(gè)月的基礎(chǔ)上IV和皮下輸遞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可傳遞自身免疫應(yīng)答靶向的完整蛋白抗原以恢復(fù)免疫耐受來(lái)治療自身免疫(Science 2631139)。
過(guò)敏原免疫治療或消除過(guò)敏是定期腸胃外用藥作為抗原的過(guò)敏提取物，通常以增加的劑量規(guī)模直到作為維持治療保持的劑量。免疫治療的指示由上述抗體特異性診斷確定。過(guò)敏原免疫治療通過(guò)提供定期注射過(guò)敏原到過(guò)敏試驗(yàn)者來(lái)進(jìn)行，目的是減少癥狀和過(guò)敏反應(yīng)跡象或防止未來(lái)抗如昆蟲(chóng)毒液、青霉素等抗原的過(guò)敏性反應(yīng)。通常開(kāi)始用低劑量，在幾周時(shí)間中逐步增加劑量。
免疫治療特異于注入的抗原。它導(dǎo)致下列免疫變化T細(xì)胞應(yīng)答隨著細(xì)胞因子產(chǎn)生的相應(yīng)變化從Th-2型應(yīng)答轉(zhuǎn)換成Th-1型應(yīng)答、降低的過(guò)敏原-特異IgE產(chǎn)生、增加的過(guò)敏原-特異IgG產(chǎn)生、減少的發(fā)炎細(xì)胞、減少的炎癥介質(zhì)和減少的組胺-釋放因子。這些變化導(dǎo)致靶器官中過(guò)敏原反應(yīng)降低。
待注入過(guò)敏原的量可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)獲得且取決于受體大小，通常至少約100ng過(guò)敏原/千克體重且不超過(guò)約1mg過(guò)敏原/千克體重。劑量經(jīng)常在注射過(guò)程中增加多達(dá)約十到一百萬(wàn)倍。注射時(shí)間表隨著各病人變化。例如，Allpyral制備每1-2周施用。應(yīng)再?gòu)?qiáng)調(diào)的是免疫治療時(shí)間表個(gè)人化且不推薦固定的時(shí)間表。過(guò)敏原注射很少“永久”但常在病人沒(méi)有發(fā)生過(guò)敏癥狀后停止，當(dāng)使用維持時(shí)間表時(shí)不要求18-24個(gè)月連續(xù)藥物治療。病人治療平均持續(xù)時(shí)間是3到5年但在一些臨床情況中可更長(zhǎng)。如果癥狀在間斷免疫治療之后6到12個(gè)月觀察段后復(fù)發(fā)，批準(zhǔn)再評(píng)估。
過(guò)敏原免疫治療對(duì)下列指示是適當(dāng)?shù)膰?yán)重、季節(jié)性(持續(xù)2年或更長(zhǎng))或終年、IgE-依賴鼻過(guò)敏結(jié)膜炎，其中最佳過(guò)敏原避免和藥物治療在控制癥狀中不充分有效。IgE-調(diào)節(jié)過(guò)敏哮喘；具體是在其中暴露于過(guò)敏原和哮喘跡象及癥狀間有清楚的暫時(shí)聯(lián)系，和那些連續(xù)幾年在兩個(gè)或更多過(guò)敏季節(jié)中發(fā)生癥狀的。房屋粉塵小蟲(chóng)或豚草花粉引起的IgE-調(diào)節(jié)哮喘可用過(guò)敏原免疫治療處理。IgE-調(diào)節(jié)過(guò)敏性反應(yīng)針對(duì)昆蟲(chóng)刺。用來(lái)自小黃蜂、大黃蜂、白面大黃蜂、黃蜂和蜜蜂以及fire螞蟻整體提取物的免疫治療有有效的。
組織移植排斥組織移植的免疫排斥由移植受體中直接抗移植器官的免疫應(yīng)答來(lái)調(diào)節(jié)，組織移植包括肺、心臟、肝臟、腎、胰腺和其它器官和組織。當(dāng)與移植受體氨基酸序列相比時(shí)，異源移植的器官包含氨基酸序列有變化的蛋白質(zhì)。因?yàn)橐浦财鞴俚陌被嵝蛄胁煌谝浦彩荏w的，它們常在受體中引起抗移植器官的免疫應(yīng)答?？挂浦财鞴俚呐懦馐墙M織移植的主要復(fù)雜因素和限制，并可引起受體中抗移植器官的失敗。由排斥產(chǎn)生的慢性炎癥導(dǎo)致移植器官中功能異常。移植受體目前用多種免疫抑制劑處理以防止和抑制排斥。這些試劑包括糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素A、Cellcept、FK-506、和OKT3。
要理解的是此發(fā)明不限于所述具體方法、操作、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)佟⒑驮噭?，因?yàn)檫@些可變化。也要理解的是本文所用術(shù)語(yǔ)僅為了描述具體實(shí)施方案的目的，不想限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍僅由所附權(quán)力要求書(shū)限制。
如本文所用，除非另有明確說(shuō)明，單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指示物。除非另有明確說(shuō)明，所有本文所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般理解的相同含義。
提出下列實(shí)施例是為了提供本領(lǐng)域普通技術(shù)人員關(guān)于如何制造和使用此主題發(fā)明的完整揭示和描述，并不想限制認(rèn)為是發(fā)明的范圍。努力確保所用數(shù)字(如量、溫度、濃度等)的精確性但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，部分是重量部分、分子量是平均分子量、溫度是攝氏度；壓力是或接近大氣壓。
本說(shuō)明書(shū)中所有引用的出版物和專利申請(qǐng)納入本文參考文獻(xiàn)，各單獨(dú)出版和專利申請(qǐng)?zhí)囟ɑ騿为?dú)指示納入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1大鼠和小鼠EAE中自身抗體反應(yīng)特異性的抗原陣列描述為確定EAE動(dòng)物血清中自身抗體特異性分布，進(jìn)行測(cè)試血清抗體結(jié)合蛋白質(zhì)微陣列的試驗(yàn)。
如表1所列，抗原陣列通過(guò)點(diǎn)樣免疫顯性髓鞘肽表位產(chǎn)生并純化天然髓鞘堿性蛋白。圖1A-D是用來(lái)自正常對(duì)照大鼠(A)和3只Lewis大鼠作探針陣列的掃描圖像，Lewis大鼠被誘導(dǎo)在完全弗氏佐劑中發(fā)展有不同髓鞘蛋白肽的EAE，接著用Cy-3標(biāo)記的抗大鼠Ig二級(jí)抗體。
掃描圖像的定量計(jì)算機(jī)分析示于表1。所報(bào)道的數(shù)字代表來(lái)自EAE動(dòng)物血清識(shí)別的抗原相對(duì)對(duì)照血清的熒光強(qiáng)度，對(duì)照血清調(diào)節(jié)背景水平使大于或小于1(1＝?jīng)]有區(qū)別)的比例代表有＞95％置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)差異。結(jié)果用ELISA確認(rèn)。這些結(jié)果證明抗原陣列有力地鑒定EAE自身抗體反應(yīng)的肽-特異性。
表1.lewis大鼠中EAE自身抗體反應(yīng)特異性的抗原陣列描述
實(shí)施例2自身免疫風(fēng)濕性疾病中病人抗體特異性分布的確定自身抗原陣列鑒別8種不同人類自身免疫風(fēng)濕性疾病的自身抗體分布特征。超過(guò)50種特征高度表現(xiàn)的自身免疫血清樣品的自身抗原陣列分析的代表性例子被提出(圖2)。
有序自身抗原陣列通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣4批192種不同推定自身抗原以建立一個(gè)1152-特征風(fēng)濕病自身抗原陣列。點(diǎn)樣的抗原包括36種重組或純化的蛋白質(zhì)，包括Ro52、La、組氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)、SR蛋白、組蛋白H2A(H2A)、Sm-B/B’、U1小核內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合體的70kDa和C成分(U1-70kDa、U1snRNP-C)、Sm-B/B’、hnRNP-B1、Sm/RNP復(fù)合體、拓?fù)洚悩?gòu)酶I(topo I)、著絲粒蛋白B(CENP B)、丙酮酸脫氫酶(PDH)；6種以核酸為基礎(chǔ)的推定抗原，包括一些形式的哺乳動(dòng)物雙鏈DNA(dsDNA)和合成單鏈DNA(ssDNA)；154種表達(dá)SnRNP蛋白、Sm蛋白、組蛋白H1、H2A、H3和H4的肽。此外，我們點(diǎn)樣人IgG和IgM特異的抗體(α-IgG和α-IgM)；流感A和肺炎球菌(Pneumovax)的疫苗；用Cy-3-和Cy-5預(yù)標(biāo)記抗體的混合物以作為標(biāo)記點(diǎn)來(lái)確定陣列方向(黃色特征)。自身抗原陣列培養(yǎng)用的稀釋病人血清樣品來(lái)自(a)沒(méi)有檢測(cè)到特異自身抗體反應(yīng)的健康人(正常)；(b)表現(xiàn)抗Ro52和La自身抗體反應(yīng)的斯耶格倫綜合征；(c)表現(xiàn)抗DNA、組蛋白H2A、U1-70kDa和SR蛋白反應(yīng)的SLE；(d)表現(xiàn)抗Jo-1和Ro52反應(yīng)的PM；(e)表現(xiàn)抗DNA、組蛋白H2A、Ro52和U1-70kDa反應(yīng)的MCTD；(f)表現(xiàn)抗PDH反應(yīng)的PBC；(g)表現(xiàn)抗topo I反應(yīng)的sclero-D；(h)表現(xiàn)抗CENP B反應(yīng)的sclero-L；和(i)表現(xiàn)抗hnRNP-B1反應(yīng)的RA。用于探針的自身免疫疾病血清沿圖頂部表示，灰色盒子中所含的各列切下和粘貼抗原特征是來(lái)自單個(gè)陣列的典型抗原特征。陣列上由來(lái)自嚙齒動(dòng)物血清中自身抗體識(shí)別的髓鞘堿性蛋白肽作為典型負(fù)對(duì)照(MBP 68-86)包括，嚙齒動(dòng)物有實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎。結(jié)合的抗體掃描前用Cy-3-綴合山羊-抗-人IgM/IgG檢測(cè)。
如出版物所示，高度特征表現(xiàn)的血清樣品獲得自患斯耶格倫綜合征、SLE、PM、混合性結(jié)締組織病(MCTD)、PBC、擴(kuò)散和限制性硬皮病(sclero-D和sclero-L)、和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的病人，血清樣品鑒別不同和診斷自身抗體特異性模式。例如，檢測(cè)到直接抗DNA和組蛋白的SLE-特異自身抗體(圖2c)。DNA-特異自身抗體在一些模式中是病原，且它們的滴度常與疾病活性相關(guān)。Jo-1自身抗體(圖2d)常預(yù)測(cè)幾個(gè)月到幾年的臨床PM，并預(yù)測(cè)肺間隙疾病的發(fā)展和不良預(yù)報(bào)。來(lái)自擴(kuò)散或限制性硬皮病病人的自身抗體分別獨(dú)特靶向topo I和CENP B(圖2g和h)。CENP B自身抗體與低概率肺間隙和腎病相聯(lián)，而拓?fù)洚悩?gòu)酶自身抗體與肺纖維化風(fēng)險(xiǎn)提高和存活降低相關(guān)。當(dāng)來(lái)自10個(gè)健康人的血清作為探針時(shí)，沒(méi)有觀察到自身抗原反應(yīng)，盡管可重復(fù)檢測(cè)到肺炎球菌和流感的抗體(圖2a)。這些陣列分布與前述常規(guī)試驗(yàn)的結(jié)果精確相關(guān)。
這些結(jié)果證明抗原陣列檢測(cè)特異于蛋白質(zhì)、肽、核酸、翻譯后修飾抗原、和蛋白復(fù)合體的自身抗體。這種信息可用于診斷、預(yù)測(cè)、監(jiān)控對(duì)治療的反應(yīng)，并發(fā)展和選擇抗原-特異治療。
實(shí)施例3確定來(lái)自人多發(fā)件硬化病人腦脊液的自身抗體特異性分布含髓鞘蛋白和肽的抗原陣列用于表現(xiàn)來(lái)自多發(fā)性硬化病人腦脊液樣品中自身抗體的特異性(圖3)。圖3中的陣列證明檢測(cè)到的腦脊液自身抗體特異于完整髓鞘堿性蛋白(MBP)、MBP肽1-20(相應(yīng)于MBP氨基酸1-20)、MBP肽68-86、完整髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)、MOG肽35-55、和蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)肽139-151。如實(shí)施例2，這種信息可用于診斷、發(fā)展、監(jiān)控和選擇特異治療。
通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣這些推定髓鞘抗原來(lái)產(chǎn)生2400-點(diǎn)‘髓鞘蛋白組’陣列，探針用腦脊液，接著用Cy-3-標(biāo)記的抗-人Ig二次抗體，用GenePix掃描儀掃描，用GenePix軟件分析圖像以確定結(jié)合各點(diǎn)的自身抗體的水平。這些陣列包含400種不同髓鞘蛋白和肽表位，包括MBP、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)、表達(dá)這些蛋白的重疊肽、和表達(dá)來(lái)自另外包括環(huán)核苷磷酸二酯酶(CNP酶)的髓鞘自身抗原顯性表位的肽、髓鞘-相聯(lián)糖蛋白(MAG)、和髓鞘-相聯(lián)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)。
在對(duì)照病人中，盡管檢測(cè)到共同和普遍人病原體的特異抗體，病原體包括流感病毒和肺炎鏈球菌，沒(méi)有檢測(cè)到髓鞘蛋白和肽的特異抗體。在MS病人1中，抗原陣列檢測(cè)到完整髓鞘堿性蛋白(MBP)、完整髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)的特異自身抗體以及識(shí)別MOG肽35-55、MBP肽1-20和MBP肽68-86的自身抗體。相反，在MS病人2中，檢測(cè)到抗MOG蛋白和MOG肽25-42的自身抗體。在MS病人3中，鑒定了蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)肽139-151的特異抗體。
實(shí)施例4使用病人抗體特異性分布來(lái)指導(dǎo)選擇治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗原特異治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膠原-誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型中自身抗體反應(yīng)的抗原陣列分析。圖5顯示含約450種不同滑液關(guān)節(jié)蛋白和肽的RA/CIA陣列圖像，蛋白和肽包括II型膠原(CII)、膠原種類I、III、IV、V、IX和XI、GP-39、免疫球蛋白、Sa、鈣蛋白酶抑制蛋白、RA33、醛縮酶A、熱激蛋白-60和-65、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、分子伴侶BiP、瓜氨酸-修飾纖維蛋白和filaggrin肽和蛋白。
圖5使用來(lái)自滑液關(guān)節(jié)的抗原和表位陣列顯示抗體特異性分布以確定CIA中自身抗體反應(yīng)的特異性。通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣推定滑液關(guān)節(jié)抗原來(lái)產(chǎn)生2000-點(diǎn)‘滑液蛋白組’陣列，探針用CIA小鼠血清，接著用Cy-3-標(biāo)記的抗-小鼠Ig二次抗體，用GenePix掃描儀掃描，用GenePix軟件分析圖像以確定結(jié)合各點(diǎn)的自身抗體的水平。A-B顯示用來(lái)自對(duì)照DBA/1LacJ小鼠(A)和有CIA的DBA/1LacJ小鼠(B)血清作為探針的陣列掃描圖像。觀察到抗II型膠原和免疫顯性II型膠原肽257-270的自身抗體反應(yīng)。結(jié)果用ELISA確定且代表另外小鼠中觀察到的自身抗體反應(yīng)。為了診斷和治療目的，確定自身抗體反應(yīng)特異性也可用常規(guī)方法完成，常規(guī)方法包括放射性免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、以熒光為基礎(chǔ)的自身抗體試驗(yàn)和/或蛋白質(zhì)印跡分析。
用編碼抗原陣列的抗原-特異DNA耐受性處理治療CIA鑒定了CIA中自身抗體反應(yīng)的靶。DNA耐受治療在表位特異性分布的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)，此特異性分布根據(jù)發(fā)明在圖5中確定。用DNA耐受防止或治療CIA，DNA耐受編碼II型膠原(CII)、CIIp257-270的表位，這些表位用圖5所示范抗原陣列鑒定為自身抗體反應(yīng)的靶。此外，編碼完整II型膠原的耐受DNA也用圖5所示抗原陣列鑒定為CIA中自身免疫反應(yīng)的靶，它也有效防止和治療CIA。表5列出代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
表5.耐受DNA治療組 CIA概率凈CIA值pTarget+(僅DNA載體、對(duì)照) 0.53 22ptarget+IL-4(DNA載體+IL-4、對(duì)照)0.432小基因(編碼CIIp257-270的DNA)0.13 4小基因+IL-4 0 4CII(編碼完整CII的DNA) 0.13 8CII+IL-40.06 4在用完全弗氏佐劑中乳化的CII誘導(dǎo)CIA前，編碼II型膠原(CII)的DNA肌肉內(nèi)用藥于DBA/1LacJ小鼠，以每周一次100μg劑量各DNA質(zhì)粒為基礎(chǔ)共兩次。用不完全弗氏佐劑中的CII的動(dòng)物在第20天上升。每天用公開(kāi)示分系統(tǒng)獲得各小鼠關(guān)節(jié)炎的分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例5使用抗體特異性分布指導(dǎo)治療多發(fā)性硬化的抗原特異治療的發(fā)展和選擇多發(fā)性硬化、EAE動(dòng)物模型中自身抗體反應(yīng)的抗原陣列分析。圖4顯示含約400種不同髓鞘蛋白和肽表位的2400-點(diǎn)MS/EAE陣列，髓鞘蛋白和肽表位包括MBP、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)、表達(dá)這些蛋白的重疊肽、和表達(dá)來(lái)自另外包括環(huán)核苷磷酸二酯酶(CNP酶)的髓鞘自身抗原顯性表位的肽、髓鞘-相聯(lián)糖蛋白(MAG)、和髓鞘-相聯(lián)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)。
圖4示范使用此含髓鞘抗原和表位的陣列以研究EAE中自身抗體反應(yīng)的特異性。通過(guò)用機(jī)器微陣列儀點(diǎn)樣推定髓鞘抗原來(lái)產(chǎn)生2400-點(diǎn)‘髓鞘蛋白組’陣列，探針用EAE小鼠血清，接著用Cy-3-標(biāo)記的抗-小鼠Ig二次抗體，用GenePix掃描儀掃描，用GenePix軟件分析圖像以確定結(jié)合各點(diǎn)的自身抗體的水平。A-C瑣示陣列掃描圖像的探針?biāo)醚鍋?lái)自對(duì)照小鼠(A)和2只SJL小鼠，SJL小鼠用PLPp139-151誘導(dǎo)EAE后87天疾病復(fù)發(fā)(B&C)。2只EAE小鼠中抗誘導(dǎo)肽PLPp139-151的自身抗體反應(yīng)相對(duì)對(duì)照顯著強(qiáng)烈，小鼠-2中觀察到抗鄰近分子內(nèi)表位PLPp89-106的自身抗體反應(yīng)但小鼠-1或?qū)φ諞](méi)有觀察到，EAE小鼠中都觀察到抗分子間蛋白和表位的自身抗體反應(yīng)但對(duì)照沒(méi)有，分子間蛋白和表位包括MOG蛋白、MOGp66-78、CNP酶p343-373、和MBPp1-20。結(jié)果用ELISA確認(rèn)且代表另外小鼠中觀察到的自身抗體反應(yīng)。
SJL小鼠用完全弗氏佐劑(CFA)中的PLPp139-151誘導(dǎo)EAE發(fā)展，誘導(dǎo)的SJL小鼠經(jīng)歷它們自身免疫反應(yīng)在分子內(nèi)和分子間擴(kuò)展至鄰近PLP上的肽表位以及3種另外髓鞘蛋白上的肽表位，3種髓鞘蛋白上包括MBP、MOG和CNP酶(圖4B和C)。在有EAE的SJL小鼠中，臨床復(fù)發(fā)較少的小鼠自身抗體反應(yīng)擴(kuò)散顯著較少(圖5)。發(fā)現(xiàn)自身抗體的表位擴(kuò)散增加與復(fù)發(fā)和更嚴(yán)重疾病關(guān)聯(lián)，自身抗體應(yīng)答另外的髓鞘抗原，此發(fā)現(xiàn)提供證據(jù)表明使用抗原陣列的自身抗體特異性分布可用于預(yù)測(cè)各動(dòng)物中的臨床結(jié)果。并行的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)分析鑒定并證實(shí)抗原陣列確定的自身抗體反應(yīng)特異性。以前沒(méi)有描述自身抗體反應(yīng)擴(kuò)散和它與EAE中更嚴(yán)重疾病的相互關(guān)系、T細(xì)胞調(diào)節(jié)疾病且它們證明了確定自身抗體特異性分布的診斷和預(yù)測(cè)效用。
抗原-特異DNA耐受治療劑作為抗原-特異治療的例子。慢性復(fù)發(fā)EAE可通過(guò)引入編碼PLP表位的DNA質(zhì)粒小基因來(lái)防止和治療(J.Immunol1623336-41；Curr.Dir.Autoimmun.2203-16；表2)。編碼一些完整髓鞘蛋白的DNA疫苗在治療EAE上更有效(表2和3)。傳遞與IL-4結(jié)合的DNA疫苗進(jìn)一步提高保護(hù)效果，DNA疫苗編碼所有髓鞘抗原(表3)。
表2.治療慢性復(fù)發(fā)EAE的抗原-特異DNA耐受治療劑，它編碼用抗體特異性分布鑒定的抗原DNA n 平均復(fù)發(fā)比率與混合物相比的p值載體 172.94 0.0064僅載體163.875 ＜0.0001混合物161.5631施用混合物治療的小鼠每星期一次肌肉內(nèi)治療，治療以50μg四種主要髓鞘質(zhì)粒MBP、MOG、MAG、和PLP的劑量?；旌衔镉删幋a這四種髓鞘抗原的DNA組成。治療在從EAE最初急性發(fā)生中恢復(fù)后立即開(kāi)始。當(dāng)小鼠在第87天犧牲后，收集血清并在髓鞘蛋白陣列上使用。每天為各小鼠打分且列出各組小鼠87天中臨床癱瘓惡化(復(fù)發(fā))的平均數(shù)字。p值用斯氏兩端不成對(duì)t檢驗(yàn)(Student’s two-tailedunpaired t test)來(lái)計(jì)算。
表3.治療慢性復(fù)發(fā)EAE的抗原-特異DNA耐受性治療劑，它編碼用抗體特異性分布鑒定的抗原，包含編碼IL-4的DNA質(zhì)粒以加強(qiáng)此效果DNAn 平均復(fù)發(fā)比率與混合物/IL-4相比的p值載體 202.450.0018IL4142.930.0003PLP139-151/IL-4171.940.0158混合物 181.440.1714混合物/IL-4170.9411施用混合物的小鼠每星期一次肌肉內(nèi)治療，治療以25μg四種主要髓鞘質(zhì)粒MBP、MOG、MAG、和PLP的劑量。混合物由編碼這四種髓鞘抗原的DNA組成。所有其它DNA以50μg質(zhì)粒每只動(dòng)物的劑量一周一次。治療在從EAE最初急性發(fā)生中恢復(fù)后立即開(kāi)始。每天為各小鼠打分且列出各組小鼠81天中臨床癱瘓惡化(復(fù)發(fā))的平均數(shù)字。p值用斯氏兩端不成對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算。
用對(duì)所選抗原-特異DNA耐受性治療應(yīng)答的自身抗體特異性來(lái)更有效治療EAE。我們用編碼多種髓鞘抗原的DNA質(zhì)粒治療SJL小鼠中的慢性復(fù)發(fā)EAE，髓鞘抗原通過(guò)抗原陣列確定的抗體特異性分布鑒定。表4顯示來(lái)自多種使用抗原-特異DNA耐受性治療劑實(shí)驗(yàn)的累積結(jié)果，治療劑用于(1)防止EAE誘導(dǎo)，(2)治療建立的EAE。表4證明編碼更大數(shù)量蛋白陣列鑒定自身抗原的抗原-特異DNA質(zhì)粒相較僅編碼一種靶向自身抗原(或編碼非靶向髓鞘蛋白)的質(zhì)粒在治療EAE中有更高效率，自身抗原由自身免疫過(guò)程靶向。在抗原陣列確定的抗原特異性分布基礎(chǔ)上選擇和發(fā)展的抗原-特異治療使用導(dǎo)致更有效的治療。
表4用抗原-特異DNA耐受性治療劑防止和治療EAE的累積結(jié)果
實(shí)施例6使用抗體特異性分布來(lái)監(jiān)控對(duì)治療的反應(yīng)用DNA質(zhì)粒保護(hù)動(dòng)物抗EAE或治療EAE的分析在蛋白質(zhì)陣列分析上證明自身抗體反應(yīng)的表位擴(kuò)散減少(圖6)。各小鼠列于X軸，肽和蛋白抗原示于Y軸上的‘髓鞘蛋白組’陣列。綠色表示缺少活性，紅色表示自身抗體活性。以抗原陣列類似性為基礎(chǔ)的串列分析算法組小鼠確定它們自身抗體反應(yīng)的特異性。此圖像表示全部串列的一小部分。正常小鼠(NMS)串列和綠色占優(yōu)勢(shì)表明缺少自身抗體對(duì)所列抗原的反應(yīng)。慢性復(fù)發(fā)EAE的SJL小鼠用對(duì)照載體或緩沖(B和C)串列處理并有顯著自身抗體反應(yīng)，相對(duì)多種髓鞘抗原用紅色表示。在這些小鼠中觀察到的自身抗體反應(yīng)的擴(kuò)展與它們更嚴(yán)重的疾病過(guò)程相關(guān)，87天時(shí)間段平均有2.4-3.5次復(fù)發(fā)。癱瘓(復(fù)發(fā))臨床惡化的平均數(shù)字示于圖頂部，通過(guò)表示相關(guān)小鼠組的柱上的數(shù)字表示。相反，小鼠用髓鞘蛋白混合物DNA耐受性治療劑(含大量抗原陣列鑒定的自身免疫反應(yīng)靶，顯示處理EAE[表4]中的最大效率)串列處理且如綠色相對(duì)其它組增加所示，它們自身免疫反應(yīng)的擴(kuò)展顯著減少。自身免疫反應(yīng)擴(kuò)展的減少與它們嚴(yán)重程度較低的臨床過(guò)程相關(guān)，87天時(shí)間段平均有1.5次復(fù)發(fā)。
圖6顯示來(lái)自EAE小鼠抗原陣列的串列分析，EAE小鼠用抗原-特異DNA耐受性治療劑處理。編碼4種髓鞘抗原的髓鞘蛋白混合物DNA耐受性有力地減少B細(xì)胞表位擴(kuò)散，髓鞘抗原通過(guò)自身抗體反應(yīng)靶向的抗原陣列鑒定(圖6)。這與它顯著降低由復(fù)發(fā)速度測(cè)量的疾病活性相關(guān)(表2和3，圖6)。因此以抗原陣列為基礎(chǔ)的自身抗體分布除了在指導(dǎo)選擇抗原-特異治療中有用，也可用于監(jiān)控對(duì)抗原特異治療的反應(yīng)。盡管沒(méi)有顯示，結(jié)合陣列上各抗原特征的同種抗體分析可更詳細(xì)地分析且預(yù)測(cè)治療反應(yīng)。例如，在人自身免疫疾病中治療效果可通過(guò)抗原陣列鑒定同種抗體亞型的轉(zhuǎn)換來(lái)指示，同種抗體亞型在自身免疫疾病中從與組織損傷相連的Th1同種亞型IgG1和IgG3到與抗組織損傷保護(hù)相連的Th2同種亞型IgG2和IgG4。使用自身抗體反應(yīng)的特異性選擇來(lái)抗原-特異治療通過(guò)抑制自身免疫反應(yīng)的擴(kuò)散在根本上治療自身免疫過(guò)程，且這與疾病活性降低相關(guān)。
實(shí)施例7以病人抗體特異性分布為基礎(chǔ)的用于組織移植的治療組織移植的一個(gè)主要限制是受體免疫系統(tǒng)對(duì)移植組織的排斥。組織移植包含移植血液和血液-獲得細(xì)胞以及移植固體器官，固體器官包括心臟、肺、腎、肝臟和其它器官。免疫排斥由識(shí)別組織移植蛋白中等位基因變異的受體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。組織移植排斥由受體在組織移植中抗MHC I和II類蛋白和抗其它組織相容性和與另外抗原的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，另外抗原在組織移植中與受體相比有等位基因變異。當(dāng)移植受體的免疫系統(tǒng)對(duì)移植物反應(yīng)時(shí)，它產(chǎn)生結(jié)合移植物內(nèi)抗原的抗體。
在Balb/c(H-2d)和Balb/k(H-2k)小鼠間使用組織移植，含抗原的抗原陣列和表達(dá)H-2dI和II類MHC分子的表位用于確定抗體分布。使用標(biāo)準(zhǔn)操作，心臟從H-2d小鼠移植入H-2k小鼠中的異位腹部位置(異位移植能通過(guò)簡(jiǎn)單觸診緊密監(jiān)控移植的心臟)。來(lái)自受體小鼠的血清用所述抗原陣列分析以鑒定抗供體MHC分子的抗體反應(yīng)?？贵w分布的鑒定能鑒別排斥移植心臟的受體動(dòng)物?？贵w分布也能評(píng)估排斥的嚴(yán)重性用于預(yù)測(cè)，并指導(dǎo)非-特異治療的選擇?？贵w特異性分布也可用于發(fā)展和選擇抗原-特異治療來(lái)處理組織移植排斥以防止移植組織的死亡。在此例子中，移植存活通過(guò)觸診移植的心臟來(lái)監(jiān)控。
實(shí)施例8以抗體特異性分布為基礎(chǔ)的用于過(guò)敏性病的治療過(guò)敏性病由直接抗外源過(guò)敏原的異常免疫應(yīng)答來(lái)調(diào)節(jié)，病人暴露于外源過(guò)敏中。例子包括的過(guò)敏反應(yīng)針對(duì)花粉、房屋粉塵小蟲(chóng)抗原、蜂毒、花生油和其它存在于環(huán)境中的分子。在過(guò)敏反應(yīng)中病人產(chǎn)生直接抗入侵過(guò)敏原的抗體。產(chǎn)生含過(guò)敏原的陣列、表達(dá)過(guò)敏原的免疫表位并用于確定病人直接抗過(guò)敏原的抗體特異性分布。病人抗體特異性可進(jìn)一步用于發(fā)展和選擇使用適當(dāng)過(guò)敏原以耐受病人。耐受病人包括以關(guān)閉病人異常過(guò)敏免疫反應(yīng)的方式施用入侵過(guò)敏原，過(guò)敏免疫反應(yīng)直接抗入侵過(guò)敏原。病人抗體特異性分布也可用于監(jiān)控病人對(duì)過(guò)敏原耐受治療的反應(yīng)，以改變抗-過(guò)敏原抗體反應(yīng)、過(guò)敏原抗體滴度和/或使用抗-過(guò)敏原抗體同種亞型為基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種確定免疫相關(guān)疾病病人中抗體特異性分布的方法，其特征在于，所述方法包括(a)制備包括至少兩種疾病相關(guān)抗原原件的抗原陣列，其中各抗原元件進(jìn)一步包括至少一種免疫表位；(b)使來(lái)自步驟(a)的抗原陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(c)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合抗體的疾病相關(guān)抗原，抗體在來(lái)自步驟(b)的病人樣品中；(d)將步驟(c)中與疾病相關(guān)抗原結(jié)合的抗體和(1)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；以及(2)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與疾病關(guān)聯(lián)，進(jìn)行比較。條件是所述疾病不是胰島素依賴的糖尿病。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫相關(guān)疾病是自身免疫疾病。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫相關(guān)疾病是過(guò)敏。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫相關(guān)疾病是移植排斥。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病人沒(méi)有發(fā)展臨床癥狀。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病人有臨床癥狀。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病是多發(fā)性硬化。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、DNA、RNA、脂質(zhì)、糖基化分子、磷酸化修飾的多肽、瓜氨酸修飾的多肽、多糖或其它分子。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原陣列是微陣列。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原陣列有可尋址元件。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原陣列是低密度陣列。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原陣列是高密度陣列。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病人樣品是血液樣品。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病人樣品是腦脊液樣品。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病人樣品是滑液樣品。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病人樣品取自自身免疫疾病損傷。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括通過(guò)施用含一種或更多抗原的治療劑來(lái)治療病人的步驟，抗原被包括抗體特異性組的抗體結(jié)合。
19.一種確定免疫相關(guān)疾病病人中抗體特異性分布的方法，其特征在于，所述方法包括(a)制備包括至少一種表位元件的表位陣列；(b)使來(lái)自步驟(a)的表位陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(c)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合來(lái)自步驟(b)病人樣品中抗體的疾病相關(guān)表位；(d)將步驟(c)中與疾病相關(guān)抗原結(jié)合的抗體和(1)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；以及(2)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與疾病關(guān)聯(lián)，進(jìn)行比較。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述陣列是微陣列。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫相關(guān)疾病是自身免疫疾病。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫相關(guān)疾病是過(guò)敏。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫相關(guān)疾病是移植排斥。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述病人沒(méi)有發(fā)展臨床癥狀。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述病人有臨床癥狀。
26.一種治療自身免疫疾病的方法，其特征在于，所述方法包括(a)確定病人抗原特異性分布，包括以下步驟(1)制備包括至少兩種疾病相關(guān)抗原的抗原陣列，其中各抗原元件進(jìn)一步包括至少一種免疫表位；(2)使來(lái)自步驟(1)的抗原陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(3)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合來(lái)自步驟(2)病人樣品中抗體的疾病相關(guān)抗原；(4)將步驟(3)中與疾病相關(guān)抗原結(jié)合的抗體和(i)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；以及(ii)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與疾病關(guān)聯(lián)，進(jìn)行比較。(b)在步驟(a)的抗原特異性分布基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)病人特異治療方案，包括步驟(1)確定病人樣品中被抗體結(jié)合的抗原；和(2)給病人施用一種或更多抗原。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，施用給病人的抗原選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、DNA、RNA、脂質(zhì)、糖基化分子、磷酸化修飾的多肽、瓜氨酸修飾的多肽、多糖或其它分子。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，施用給病人的抗原是編碼所述抗原的核酸。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。
30.一種治療自身免疫疾病的方法，其特征在于，所述方法包括(a)確定病人抗原特表位異性分布，包括以下步驟(1)制備表位陣列；(2)使來(lái)自步驟(1)的表位陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(3)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合來(lái)自步驟(2)病人樣品中抗體的疾病相關(guān)表位；(4)將步驟(3)中與疾病相關(guān)抗原結(jié)合的抗體和(i)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；以及(ii)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與疾病關(guān)聯(lián)，進(jìn)行比較。(b)在步驟(a)的表位特異性分布基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)病人特異治療方案，包括步驟(1)確定病人樣品中由抗體結(jié)合的表位；和(2)施用一種或更多表位給病人。
31.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，施用給病人的表位選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、DNA、RNA、脂質(zhì)、糖基化分子、磷酸化修飾的多肽、瓜氨酸修飾的多肽、多糖或其它分子。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，施用給病人的表位是以編碼所述抗原的核酸形式。
33.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。
34.一種確定胰島素依賴性糖尿病(IDDM，自身免疫糖尿病)病人中抗體特異性分布的方法，其特征在于，所述方法包括(a)制備包括至少四種IDDM-相關(guān)抗原的抗原陣列，其中各抗原元件進(jìn)一步包括至少一種免疫表位；(b)使來(lái)自步驟(a)的IDDM抗原陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(c)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合抗體的IDDM-相關(guān)抗原，抗體在來(lái)自步驟(b)的病人樣品中；(d)比較結(jié)合步驟(c)中疾病相關(guān)抗原的抗體和(1)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)IDDM相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與疾病關(guān)聯(lián)；(2)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與IDDM相聯(lián)。
35.一種確定胰島素-依賴性糖尿病(IDDM，自身免疫糖尿病)病人中抗體特異性分布的方法，其特征在于，所述方法包括(a)制備包括至少四種IDDM-相關(guān)表位的表位陣列；(b)使來(lái)自步驟(a)的表位陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(c)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合抗體的IDDM-相關(guān)表位，抗體在來(lái)自步驟(b)的病人樣品中；(d)比較結(jié)合步驟(c)中IDDM-相關(guān)表位的抗體和(1)結(jié)合步驟(a)的陣列內(nèi)疾病相關(guān)表位的抗體，其中抗體不與IDDM相聯(lián)。
36.一種治療胰島素-依賴性糖尿病(IDDM，自身免疫糖尿病)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)確定病人抗原特異性分布，包括以下步驟(1)制備包括至少四種IDDM-相關(guān)抗原的抗原陣列，其中各抗原元件進(jìn)一步包括至少一種免疫表位；(2)使來(lái)自步驟(1)的抗原陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(3)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合抗體的IDDM相關(guān)抗原，抗體在來(lái)自步驟(2)的病人樣品中；(4)比較結(jié)合步驟(3)中IDDM-相關(guān)抗原的抗體和(i)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)IDDM相關(guān)抗原的抗體，其中已知抗體與IDDM相聯(lián)；(ii)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)IDDM相關(guān)抗原的抗體，其中抗體不與IDDM相聯(lián)。(b)在步驟(a)的抗原特異性分布基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)病人特異治療方案，包括步驟(1)確定病人樣品中由抗體結(jié)合的抗原；和(2)施用一種或更多抗原給病人。
37.一種治療胰島素-依賴性糖尿病(IDDM，自身免疫糖尿病)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)確定病人表位特異性分布，包括以下步驟(1)制備包括至少四種IDDM-相關(guān)表位的表位陣列；(2)使來(lái)自步驟(1)的表位陣列物理接觸含有抗體的病人樣品；(3)鑒定陣列內(nèi)結(jié)合抗體的IDDM相關(guān)表位，抗體在來(lái)自步驟(2)的病人樣品中；(4)比較結(jié)合步驟(3)中IDDM-相關(guān)表位的抗體和(i)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)IDDM相關(guān)表位的抗體，其中已知抗體與IDDM相聯(lián)；(ii)結(jié)合步驟(1)的陣列內(nèi)IDDM相關(guān)表位的抗體，其中抗體不與IDDM相聯(lián)。(b)在步驟(a)的表位特異性分布基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)病人特異治療方案，包括步驟(1)確定病人樣品中由抗體結(jié)合的表位；和(2)施用一種或更多表位給病人。
全文摘要
本發(fā)明提供了確定個(gè)人中抗體特異性分布的方法。此特異性分布揭示了個(gè)人對(duì)自身抗原、過(guò)敏原、移植抗原等的多抗原和/或表位的免疫應(yīng)答?？贵w特異性分布通過(guò)結(jié)合病人樣品到陣列上來(lái)確定，病人樣品包括抗體。陣列克包含抗原和表位。發(fā)明也提供了確定抗原和/或表位特異性分布的方式和方法，特異性分布可用于診斷和治療一般和個(gè)人免疫相關(guān)疾病，包括自身免疫疾病、過(guò)敏和移植排斥。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1602425SQ02810069
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月10日
發(fā)明者W·H·魯濱遜, D·L·希施貝格, L·斯坦曼, P·J·魯伊斯, P·J·烏茨, H·加倫 申請(qǐng)人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì)