恒定鏈經(jīng)修飾的雙特異性五價(jià)和六價(jià)Ig-M抗體的制作方法
【專利說(shuō)明】恒定鏈經(jīng)修飾的雙特異性五價(jià)和六價(jià)I g-M抗體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及具有五聚或六聚結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子。
[0002] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明設(shè)及具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子，其包含五個(gè)或六個(gè)雙 特異性結(jié)合單元。在本發(fā)明結(jié)合分子中，所述雙特異性結(jié)合單元各自結(jié)合兩個(gè)不同結(jié)合祀 標(biāo)或相同結(jié)合祀標(biāo)上的不同結(jié)合區(qū)（例如表位），并且所述五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元各 自具有相同結(jié)合特異性(結(jié)合至相同的兩個(gè)結(jié)合祀標(biāo)）。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及具 有五聚或六聚結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體，其包含五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元。
[0003] 在不同方面中，本發(fā)明包括包含五個(gè)或六個(gè)單特異性結(jié)合單元的結(jié)合分子，其中 (i)所述單特異性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)各自至 少包含綴合至結(jié)合祀標(biāo)的結(jié)合區(qū)的化3和化4域，（ii)至少兩個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié)合 至不同結(jié)合祀標(biāo)。本發(fā)明還包括包含五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元的結(jié)合分子，其中（i)所 述雙特異性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)各自至少包含 綴合至結(jié)合祀標(biāo)的結(jié)合區(qū)的化3和化4域，并且（i i)至少兩個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至 不同結(jié)合祀標(biāo)。在具體實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子是多特異性IgM抗體。
【背景技術(shù)】
[0004] 由于人源化抗體的出現(xiàn)，諸如民ituxan? (利妥昔單抗（r i tuximab))、Here巧tin? (曲妥珠單抗（trastuzumab))和AvasUn及（貝伐單抗(bevacizumab))的抗體的治療用途已 使醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)生巨大變化，包括腫瘤學(xué)、炎癥性病癥(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）的治療和許多 其他適應(yīng)癥。在美國(guó)，超過(guò)30種人類或人源化抗體已批準(zhǔn)用于臨床用途，并且超過(guò)600種新 抗體或抗體樣分子處于發(fā)展的不同階段。一些抗體對(duì)諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)或腫瘤 壞死因子(TNF)的可溶性祀標(biāo)分子具有括抗功能，它們的作用是疾病的病理性過(guò)程的一部 分?；蛘?，抗體可結(jié)合、阻斷和/或誘導(dǎo)諸如癌癥的某些疾病中病理性細(xì)胞的破壞。運(yùn)些治療 性抗體的主要功能是通過(guò)化b區(qū)的結(jié)合和經(jīng)由化域的效應(yīng)子功能的募集(運(yùn)也介導(dǎo)抗體的 長(zhǎng)循環(huán)半衰期）?？贵w相較于小分子藥物的主要優(yōu)點(diǎn)之一可在于它們的強(qiáng)烈的特異性?？贵w 可非常準(zhǔn)確地祀向選擇的蛋白抗原(諸如癌基因），排除非常相似的同源物，從而允許良性 的安全特性。因此，良好地表征抗體的特異性單一祀向功能。
[0005] 隨著領(lǐng)域的進(jìn)步，抗體功能已得到增強(qiáng)，其通過(guò)蛋白質(zhì)工程的創(chuàng)造性手段諸如提 供較高的親和力、較長(zhǎng)的半衰期和/或較好的組織分布，W及組合小分子和大分子技術(shù)來(lái)實(shí) 現(xiàn)對(duì)經(jīng)由毒性有效載荷遞送破壞細(xì)胞的提高的關(guān)注(例如抗體-藥物綴合物）。改良抗體功 能的另一種方法利用免疫球蛋白G(IgG)結(jié)構(gòu)的二價(jià)結(jié)合，從而允許一個(gè)IgG分子結(jié)合兩個(gè) 抗原。事實(shí)上，在某些應(yīng)用中存在不對(duì)稱抗體通過(guò)同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同祀標(biāo)抗原來(lái)發(fā)揮有用 功能的良好可能性。為了解決運(yùn)種需要，已產(chǎn)生多種構(gòu)建體W得到可結(jié)合兩個(gè)不同抗原的 單一分子，從而允許之前從未在自然界中見(jiàn)到的功能。運(yùn)種雙特異性方法的實(shí)例是結(jié)合分 別在T細(xì)胞和B細(xì)胞上的CD3和CD19受體的"布利莫單抗(blinatumumabr (MT103)。細(xì)胞毒性 T細(xì)胞對(duì)癌性B細(xì)胞的運(yùn)種束縛允許有效治療B細(xì)胞白血病。
[0006] 但是，在雙特異性抗體的構(gòu)建、表達(dá)和產(chǎn)生中仍然存在相當(dāng)大的技術(shù)難度。盡管雙 特異性抗體由于它們同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同抗原的能力而被視為有前景的治療劑，但是它們的 實(shí)用性由于穩(wěn)定性和制造復(fù)雜性的問(wèn)題受到限制。
[0007] 各種形式的蛋白質(zhì)工程改造已用于匹配異源重鏈，加上重鏈和輕鏈的適當(dāng)成對(duì)匹 配，W有效得到雙特異性IgG。此外，各種雙特異性抗體型式，包括四價(jià)體瘤、化學(xué)異綴合物、 使用選擇的異二聚化域的重組構(gòu)建體和由兩種最小抗原結(jié)合位點(diǎn)組成的最小大小的重組 構(gòu)建體。
[000引但是，所有運(yùn)些努力都存在困難。
[0009] 因此，除了針對(duì)開(kāi)發(fā)雙特異性治療性抗體的努力，仍然存在對(duì)開(kāi)發(fā)可引起更有效 并靈活地產(chǎn)生雙特異性和多特異性抗體的更有效平臺(tái)的極大需要，從而使此類治療劑的發(fā) 現(xiàn)與臨床引入之間的時(shí)間線變短并且實(shí)現(xiàn)具有多種特異性和/或化合價(jià)的新類型抗體型式 的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明設(shè)及具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子，諸如像具有五個(gè)或六個(gè)雙特異性 結(jié)合單元的分離的IgM抗體，W及用于制備和使用所述結(jié)合分子的方法和方式。
[0011] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及一種具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子，其包含五個(gè) 或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元，其中所述雙特異性結(jié)合單元各自具有相同的兩種結(jié)合特異性并 且包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈至少包含與第一結(jié)合祀標(biāo)的第一結(jié)合區(qū)綴合的IgM重 鏈恒定區(qū)的化4域，所述第二鏈至少包含IgM重鏈恒定區(qū)的化4域和第二結(jié)合祀標(biāo)的第二結(jié) 合區(qū)，其中所述第一結(jié)合祀標(biāo)和所述第二結(jié)合祀標(biāo)不同，并且其中所述第一鏈和所述第二 鏈經(jīng)過(guò)組裝W由于它們個(gè)別IgM重鏈恒定區(qū)之間所產(chǎn)生的不對(duì)稱界面而產(chǎn)生雙特異性結(jié)合 單元。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性結(jié)合單元是相同的。
[0013] 在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子還包含IgM J鏈。
[0014] 在又另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0015] 在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子具有六聚環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0016] 在又另一實(shí)施方案中，在所述結(jié)合分子中，所述第一鏈和所述第二鏈還包含IgM重 鏈恒定區(qū)的化3域。
[0017] 在另一實(shí)施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈還包含IgM重鏈恒定區(qū)的化2域。
[0018] 在其他實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合祀標(biāo)和所述第二結(jié)合祀標(biāo)選自膚、多膚、糖蛋 白、核酸分子W及有機(jī)小分子和非有機(jī)小分子，包括但不限于可溶性多膚、細(xì)胞表面受體、 配體、分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶和酶底物。
[0019] 在又另一實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合祀標(biāo)和所述第二結(jié)合祀標(biāo)是相同可溶性祀標(biāo) 上的兩個(gè)位點(diǎn)、相同細(xì)胞表面受體祀標(biāo)上的兩個(gè)位點(diǎn)、兩個(gè)不同可溶性祀標(biāo)、兩個(gè)細(xì)胞表面 受體祀標(biāo)、一個(gè)可溶性祀標(biāo)和一個(gè)細(xì)胞表面受體祀標(biāo)、一個(gè)可溶性祀標(biāo)或細(xì)胞表面受體祀 標(biāo)和一個(gè)長(zhǎng)停留時(shí)間祀標(biāo)、一個(gè)可溶性祀標(biāo)和一個(gè)基質(zhì)蛋白祀標(biāo)或底物祀標(biāo)、一個(gè)可溶性 祀標(biāo)或受體祀標(biāo)和一個(gè)分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白祀標(biāo)，或兩個(gè)不同細(xì)胞類型。
[0020] 將結(jié)合區(qū)綴合至分子的其余部分可采取融合。因此，例如，第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合 區(qū)可分別融合至第一 IgM重鏈恒定區(qū)和第二IgM重鏈恒定區(qū)的N末端。
[0021] 在具體實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合區(qū)和所述第二結(jié)合區(qū)是抗體的可變區(qū)。
[0022] 在另一實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合祀標(biāo)和所述第二結(jié)合祀標(biāo)是兩個(gè)不同抗原。
[0023] 在又另一實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合祀標(biāo)和所述第二結(jié)合祀標(biāo)是相同抗原上的不 同表位。
[0024] 在另外實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合區(qū)和所述第二結(jié)合區(qū)可W是結(jié)合至兩個(gè)結(jié)合祀 標(biāo)或相同結(jié)合祀標(biāo)上的不同表位的兩個(gè)不同抗體重鏈可變區(qū)。
[0025] 在本發(fā)明結(jié)合分子中，抗體重鏈可變區(qū)可來(lái)自IgG、IgA、I巧和/或IgM抗體，優(yōu)選來(lái) 自IgM抗體。優(yōu)選地，本文結(jié)合分子是雙特異性IgM分子，所述分子可(但不需要)還包含與兩 個(gè)不同IgM重鏈可變區(qū)中的一個(gè)締合的至少一個(gè)IgM輕鏈可變區(qū)序列。
[0026] 在具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明結(jié)合分子中，在結(jié)合單元的兩條鏈的IgM重鏈恒定區(qū) 之間，至少一些不對(duì)稱界面由鹽橋產(chǎn)生，所述鹽橋由所述結(jié)合單元的兩條鏈的化2、化3和/ 或化4域中的至少一個(gè)中帶相反電荷的氨基酸殘基之間的成對(duì)開(kāi)關(guān)形成。
[0027] 因此，鹽橋可在結(jié)合單元的兩條鏈的化2-化2、化4-化4和化2-化3-化4域中的至少 一個(gè)之間形成。
[002引在一個(gè)實(shí)施方案中，成對(duì)開(kāi)關(guān)選自由W下組成的組:E一K、K一E; R一E、E一R; D一K、 K一D;和R一D、D一R。
[0029] 在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子可包含化4-化4域中的至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基 酸殘基開(kāi)關(guān)，其中開(kāi)關(guān)可例如選自由W下組成的組：R328E，DwE339R，K; R34化，DwS330R，K;1。7化，D^^E3S5R，K.; R427E，D<-->E339民，K;和]-'354E，D<-->I397R.1C。
[0030] 在另一實(shí)施方案中，化2-化2域之間的至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基酸開(kāi)關(guān)并且可 例如選自由E167R，!<^K177E，D和K16化、D一EI70民，K組成的組。
[0031] 在又另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基酸殘基開(kāi)關(guān)在化2-化3-化4域 中，并且可例如選自由W下組成的組：DO化，Rw投1姐玉;K150E,D一E385K，民;和 技1縣0玉wD3鄉(xiāng)民氏。
[0032] 在另一實(shí)施方案中，在本發(fā)明結(jié)合分子中，在結(jié)合單元的兩條鏈的IgM重鏈恒定區(qū) 之間，至少一些不對(duì)稱界面通過(guò)鈕-孔化nobs-into-holes)連接產(chǎn)生，所述鈕-孔連接可例 如通過(guò)選自由W下組成的組的突變產(chǎn)生:鈕:T350一Y，F(xiàn)，W;和冊(cè)95一Y，F(xiàn);和孔:L352一G，A， ￥，1，]?，5，1';冊(cè)95一4，￥，1，1^，]\1，尸，￥;尸393一胖，￥;1397一4，￥，5，1';1350一5,4，￥;和1348一5。
[0033] 在特定實(shí)施方案中，在本發(fā)明結(jié)合分子中，輕鏈可變區(qū)序列（若存在)通過(guò)在輕鏈 與重鏈之間產(chǎn)生不對(duì)稱界面來(lái)偶聯(lián)至它們的匹配重鏈可變區(qū)。
[0034] 在其他實(shí)施方案中，不對(duì)稱界面通過(guò)CrossMab技術(shù)、鈕-孔偶聯(lián)和/或鹽橋偶聯(lián)來(lái) 產(chǎn)生。
[0035] 本發(fā)明結(jié)合分子可包含共同輕鏈和/或可綴合至毒素或化療劑。優(yōu)選地，綴合是通 過(guò)融合，但通過(guò)化學(xué)連接子的綴合也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0036] 本文結(jié)合分子可W是具有五聚或六聚結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體，所述抗體可W是嵌合 的或人源化的。
[0037] 在不同方面中，本發(fā)明設(shè)及一種組合物，其包含至少約70%、或至少80%、或至少 90%或至少95%、至少98%、或至少99%如上文中定義的結(jié)合分子。
[0038] 在具體實(shí)施方案中，組合物是藥物組合物。
[0039] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及一種具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的多特異性結(jié)合分子，其包含五個(gè) 或六個(gè)單特異性結(jié)合單元，其中（i )所述單特異性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)， 其各自至少包含綴合至結(jié)合祀標(biāo)的結(jié)合區(qū)的化3和化4域，（ii)至少兩個(gè)所述單特異性結(jié)合 單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)，并且（iii)外部不對(duì)稱界面在結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)的鄰近單特 異性結(jié)合單元的重鏈恒定區(qū)之間產(chǎn)生。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少=個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)。
[0041] 在另一實(shí)施方案中，至少四個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)。
[0042] 在又另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且所有五個(gè)單特異性結(jié)合單元 結(jié)合至不同祀標(biāo)。
[0043] 在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子具有六聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且至少五個(gè)所述單特異性結(jié)合單 元結(jié)合至不同祀標(biāo)。
[0044] 在又另一實(shí)施方案中，所有六個(gè)單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同祀標(biāo)。
[0045] 在另一方面中，本發(fā)明設(shè)及一種具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的多特異性結(jié)合分子，其 包含五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元，其中（i)所述雙特異性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈 恒定區(qū)，其各自至少包含綴合至結(jié)合祀標(biāo)的結(jié)合區(qū)的化3和化4域，（ii)至少兩個(gè)雙特異性 結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)，（i i i)內(nèi)部不對(duì)稱界面在各雙特異性結(jié)合單元的兩個(gè)IgM重 鏈恒定區(qū)之間產(chǎn)生，并且（iv)外部不對(duì)稱界面在結(jié)合至不同祀標(biāo)的鄰近雙特異性結(jié)合單元 的重鏈恒定區(qū)之間產(chǎn)生。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少=個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)。
[0047] 在另一實(shí)施方案中，至少四個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)。
[0048] 在又另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且所有五個(gè)雙特異性結(jié)合單元 結(jié)合至不同祀標(biāo)。
[0049] 在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子具有六聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且至少五個(gè)所述雙特異性結(jié)合單 元結(jié)合至不同祀標(biāo)。
[0050] 在又另一實(shí)施方案中，所有六個(gè)雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同祀標(biāo)。
[0051] 在不同實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子還包含IgM J鏈。
[0052] 在各種實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子可具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0053] 不管本發(fā)明多特異性結(jié)合分子的結(jié)合特異性的數(shù)目和性質(zhì)，W下特定實(shí)施方案適 用：
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在至少一個(gè)結(jié)合單元中，IgM重鏈恒定區(qū)還包含化2域。在又另 一實(shí)施方案中，在所有結(jié)合單元中，IgM重鏈恒定區(qū)還包含化2域。在各種實(shí)施方案中，本發(fā) 明多特異性結(jié)合分子可結(jié)合至選自W下的結(jié)合祀標(biāo):膚、多膚、糖蛋白、核酸分子W及有機(jī) 小分子和無(wú)機(jī)小分子。
[0055] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子結(jié)合至選自W下的結(jié)合祀標(biāo):可溶 性多膚、細(xì)胞表面受體、配體、分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶和酶底物。
[0056] 在另外實(shí)施方案中，結(jié)合至不同祀標(biāo)的本發(fā)明多特異性結(jié)合分子選自由結(jié)合至W 下的結(jié)合單元組成的組:相同可溶性祀標(biāo)上的位點(diǎn)；相同細(xì)胞表面受體祀標(biāo)上的位點(diǎn)；不同 可溶性祀標(biāo);不同細(xì)胞表面受體祀標(biāo);可溶性祀標(biāo)和細(xì)胞表面受體祀標(biāo);可溶性祀標(biāo)或細(xì)胞 表面受體祀標(biāo)和長(zhǎng)停留時(shí)間祀標(biāo);可溶性祀標(biāo)和基質(zhì)蛋白祀標(biāo)或底物祀標(biāo);可溶性祀標(biāo)或 受體祀標(biāo)和分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白祀標(biāo)，和不同細(xì)胞類型。
[0057] 在具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明結(jié)合分子內(nèi)的結(jié)合單元中，IgM重鏈恒定區(qū)與結(jié)合祀 標(biāo)的結(jié)合區(qū)之間的綴合是通過(guò)融合。因此，例如，結(jié)合區(qū)可融合至IgM重鏈恒定區(qū)的N末端。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)結(jié)合區(qū)是抗體的可變區(qū)。
[0059] 在另一實(shí)施方案中，所有結(jié)合區(qū)是抗體重鏈可變區(qū)。
[0060] 在又另一實(shí)施方案中，至少兩個(gè)結(jié)合祀標(biāo)是不同抗原。
[0061] 在又另一實(shí)施方案中，至少兩個(gè)結(jié)合祀標(biāo)是相同抗原上的不同表位。
[0062] 在所有方面和實(shí)施方案中，抗體重鏈可變區(qū)可來(lái)自IgG、IgA、I姐或IgM抗體，優(yōu)選 來(lái)自IgM抗體。
[0063] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子是多特異性IgM抗體。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性IgM抗體還包含與至少一個(gè)結(jié)合單元中的IgM 重鏈可變區(qū)締合的至少一個(gè)IgM輕鏈可變區(qū)序列。
[0065] 在另一實(shí)施方案中，多特異性IgM抗體還包含與IgM重鏈可變區(qū)中的每一個(gè)締合的 IgM輕鏈可變區(qū)序列。
[0066] 在所有方面和實(shí)施方案中，外部不對(duì)稱界面通過(guò)化3域內(nèi)的變化產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施 方案中，變化由鹽橋產(chǎn)生，所述鹽橋由化3域中帶相反電荷的氨基酸殘基之間的成對(duì)開(kāi)關(guān)形 成。
[0067] 在各種實(shí)施方案中，提供外部不對(duì)稱界面的鹽橋由化3-化3域中至少一個(gè)帶成對(duì) 電荷的氨基酸殘基開(kāi)關(guān)形成，所述氨基酸殘基開(kāi)關(guān)可例如是鄰近y鏈中的1C238 D293或 K268 <-? D294.
[0068] 在所有方面和實(shí)施方案中，在本發(fā)明多特異性結(jié)合分子(例如多特異性IgM抗體） 中，內(nèi)部不對(duì)稱界面由鹽橋產(chǎn)生，所述鹽橋由化2、化3和/或化4域中的至少一個(gè)中帶相反電 荷的氨基酸殘基之間的成對(duì)開(kāi)關(guān)形成。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，鹽橋在所述結(jié)合單元的兩條鏈的化2-化2、化4-化4和化2-化 3-化4域中的至少一個(gè)之間形成。
[0070] 在另一實(shí)施方案中，成對(duì)開(kāi)關(guān)選自由W下組成的組:E一K、K一E; R一E、E一R; D一K、 K一D;和R一D、D一R。
[0071] 在另一實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子，例如多特異性IgM抗體，包含化4-化4域中 至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基酸殘基開(kāi)關(guān)，所述開(kāi)關(guān)可例如選自由W下組成的組： R32化，DwE339R乂； RM化，[>-*S330民，K; K巧化，DwE385R,K;及427E，D一E339R，K;和 T354E,Dwl397R,K，
[0072] 在又另一實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子，例如多特異性IgM抗體，包含化2-化2域 之間至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基酸開(kāi)關(guān)，所述開(kāi)關(guān)可例如選自由E167氏區(qū)一財(cái)77E，D和 區(qū)1貓E，r)4；E巧腿糸組成的組。
[0073] 在另一實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子，例如多特異性IgM抗體，包含化2-化3-化4 域中至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基酸殘基開(kāi)關(guān)，所述開(kāi)關(guān)可例如選自由W下組成的組： D1211<，民<一1<3 i 5D，E ; K150E，D一E;;85K，R;和 K185D，E一D360K，R。
[0074] 在所有方面和實(shí)施方案中，IgM重鏈恒定區(qū)之間的至少一些外部不對(duì)稱界面和/或 內(nèi)部不對(duì)稱界面可通過(guò)鈕-孔連接產(chǎn)生。例如，至少一個(gè)鈕-孔連接由選自由W下組成的組 的突變產(chǎn)生:鈕:T350一Y，F(xiàn)，W;和冊(cè)95一 Y，F(xiàn);和孔:L352一 G，A，V，I，M，S，T;H395^A，V，I，L, M，F(xiàn)，Y;F393一W，Y;I397一A，V，S，T;T350一S，A，V;和T348一S。
[0075] 在包含輕鏈可變區(qū)序列的多特異性IgM抗體中，此類輕鏈可變區(qū)序列可通過(guò)在輕 鏈與重鏈之間產(chǎn)生不對(duì)稱界面來(lái)偶聯(lián)至它們的匹配重鏈可變區(qū)。在各種實(shí)施方案中，不對(duì) 稱界面可通過(guò)CrossMab技術(shù)、鈕-孔偶聯(lián)和/或鹽橋偶聯(lián)來(lái)產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，多特異 性結(jié)合分子的結(jié)合單元包含共同輕鏈。
[0076] 在所有方面和實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子可綴合至毒素或化療劑，其中綴合 可例如通過(guò)融合和/或通過(guò)化學(xué)連接子。
[0077] 本發(fā)明多特異性IgM抗體可W是嵌合的或人源化的。
[0078] 在另一方面中，本發(fā)明設(shè)及一種組合物，其包含至少約70%、或至少約80%、或至 少約90%、或至少約95%、或至少約98%、或至少約99%本文的多特異性結(jié)合分子。所述組 合物可例如是包含至少一種藥學(xué)上可接受的成分的藥物組合物。
【附圖說(shuō)明】
[0079] 圖1說(shuō)明包含J鏈的IgM五聚體的結(jié)構(gòu)，其中鏈A和B在天然IgM中是相同的。
[0080] 圖2A說(shuō)明具有兩種結(jié)合特異性的五元IgM分子，其中指定為A和B的重(ii)鏈?zhǔn)遣煌?的。
[0081] 圖2B說(shuō)明包含五個(gè)或六個(gè)單特異性結(jié)合單元的多特異性IgM抗體，其中（i)單特異 性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)各自至少包含綴合至結(jié) 合祀標(biāo)的結(jié)合區(qū)的化4域，（i i)至少兩個(gè)單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)。
[0082] 圖2C說(shuō)明包含五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元的多特異性IgM抗體，其中（i)雙特異 性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)各自至少包含綴合至結(jié) 合祀標(biāo)的結(jié)合區(qū)的化4域，并且（ii)至少兩個(gè)雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié)合祀標(biāo)。
[0083] 圖3為如Czajkowsky D.M，化曰〇 Z,PNAS 2009; 106:14960-14965中公開(kāi)的IgM分子 的A重鏈和B重鏈的結(jié)構(gòu)模型。
[0084] 圖4A示出人類IgGU I巧和IgM的分別CGUCEl和CMl恒定域的比對(duì)。
[0085] 圖4B示出人類I巧和I gM的分別CE2和CM2恒定域的比對(duì)。
[0086] 圖4C示出人類IgGU I巧和IgM的分別CG2、CE3和CM3恒定域的比對(duì)。
[0087] 圖4D示出人類IgG、I巧和IgM的分別CG3、CE4和CM4恒定域的比對(duì)。
[008引在圖4A至4D中：
[0089] 人類I巧序列來(lái)自GenBank J00222.1;殘基編號(hào)來(lái)自PDB 2WQR;螺旋化)和折疊（S) 分配來(lái)自PDB