專利名稱：用于改善治療物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的脂質(zhì)體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及用于改善被捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的脂質(zhì)體組合物。更特定地，本發(fā)明涉及用于增加被脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)細胞毒性的組合物和方法。
背景技術(shù)：
一直認為脂質(zhì)體是向細胞內(nèi)傳遞治療物質(zhì)的可能載體。但是，迄今為止，成功地獲得脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞一直受到各種因素的限制。原因之一在于在將脂質(zhì)體全身給藥于血液后，脂質(zhì)體被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)迅速從循環(huán)中除去。另一個原因在于本來就難以將分子，特別是大分子或帶電分子傳遞到細胞的細胞質(zhì)和/或核中。
一種改善被脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的方法是通過在脂質(zhì)體雙層膜中包含聚乙二醇(PEG)衍生的脂質(zhì)而來延長脂質(zhì)體的血液循環(huán)持續(xù)時間(見例如US5,013,556)。通過延長脂質(zhì)體在血液中的保留時間可以改善被細胞吸收的機會。
另一種改善被脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的方法是在脂質(zhì)體上提供一種靶向部分或配體(Klibanov等人，J.LiposomeRes.，2(3)321(1992))。靶向部分與靶細胞上受體的結(jié)合改善了脂質(zhì)體及其所捕獲物質(zhì)細胞內(nèi)吸收的可能性。
在現(xiàn)有技術(shù)中還描述了脂質(zhì)體能與靶細胞融合(US5,891,468)。融合脂質(zhì)體一般包括一種從脂質(zhì)體的外表面延伸出來的用于滲透到靶細胞膜中的疏水片段。
已經(jīng)對作為將所捕獲物質(zhì)傳遞到細胞內(nèi)的方法的在微酸性條件下不穩(wěn)定的脂質(zhì)體(所謂的pH敏感的脂質(zhì)體)進行了描述(Slepushkin等人，J.Biol.Chem.，272(4)2382(1997)；Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，847851(1987)，Liu等人，Biochim.Biophys.Acta，981254(1989))。這些脂質(zhì)體主要由在確定的pH范圍內(nèi)形成脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)如二油?；字Ｒ掖及?DOPE)所組成。在該pH范圍之外，該脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定。在該類脂質(zhì)體通過胞吞作用進入細胞后，在核內(nèi)體內(nèi)的酸性pH使得該pH-敏感的脂質(zhì)體不穩(wěn)定并釋放出所捕獲的物質(zhì)。
同“常規(guī)的”、“非pH-敏感的脂質(zhì)體”一樣，因為pH-敏感的脂質(zhì)體具有短的循環(huán)持續(xù)時間，所以已經(jīng)報道了通過加入PEG-衍生化的脂質(zhì)來延長其血液循環(huán)時間(Slepushkin等人)。但是，PEG-衍生化脂質(zhì)的加入降低了該脂質(zhì)體的pH-敏感性，使其喪失了所需的脂質(zhì)體雙分子層的去穩(wěn)定和同時所需的所捕獲藥物迅速釋放到細胞內(nèi)的作用。
一種獲得具有長血液循環(huán)持續(xù)時間并同時保留脂質(zhì)體迅速去穩(wěn)定能力的pH-敏感脂質(zhì)體的方法是使用其中PEG是通過可化學(xué)裂解的鍵如二硫化物而被連接到脂質(zhì)上的PEG-衍生化的脂質(zhì)(Kirpotin等人，F(xiàn)EBS Letters，388115(1996))。但是，其希望該脫穩(wěn)定化發(fā)生于細胞內(nèi)以使得被脂質(zhì)體所捕獲的物質(zhì)在細胞內(nèi)可以達到高濃度水平。由Kirpotin等人(Id.)所描述的長循環(huán)的pH敏感脂質(zhì)體被設(shè)計成通過釋放PEG鏈而在細胞外脫穩(wěn)定化。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中仍然需要能與靶細胞特定結(jié)合并同時能迅速在細胞內(nèi)釋放出所捕獲物質(zhì)的脂質(zhì)體組合物。
本發(fā)明的概述
因此，本發(fā)明的目的是要提供一種能細胞內(nèi)傳遞被脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的脂質(zhì)體組合物。
本發(fā)明的另一個目的是要提供一種脂質(zhì)體組合物和用其治療各種病癥的方法，特別是治療血液惡性腫瘤的方法。
因此，本發(fā)明一方面包括一種用于細胞內(nèi)傳遞治療物質(zhì)的脂質(zhì)體組合物。該組合物由脂質(zhì)體所組成，所說的脂質(zhì)體由如下物質(zhì)所形成(i)一種pH-敏感的脂質(zhì)；(ii)1-20摩爾百分比的用一種親水性聚合物衍生化的脂質(zhì)，該聚合物通過一種鍵而被連接到該脂質(zhì)上，該鍵對于存在或誘導(dǎo)的生理學(xué)條件有響應(yīng)從而可有效釋放該親水性聚合物鏈；(iii)一種靶向配體；和(iv)被捕獲的治療物質(zhì)。該組合物可有效結(jié)合到靶細胞上并可有效釋放所捕獲的物質(zhì)，從而使得當(dāng)與由缺乏可釋放鍵和/或靶向配體的相似脂質(zhì)體所傳遞的細胞內(nèi)藥物濃度相比時，藥物的細胞內(nèi)濃度至少增加兩倍。
在一個實施方案中，該pH-敏感的脂質(zhì)是二油?；字Ｒ掖及?DOPE)。在另一個實施方案中，該脂質(zhì)體進一步包含一種穩(wěn)定組分，如半琥珀酸膽甾醇酯(CHEMS)。
在一個實施方案中，該聚合物衍生化的脂質(zhì)是用聚乙二醇衍生化的磷脂酰乙醇胺。該靶向配體可以是抗體或抗體片段，并且對于某些病癥的治療而言，優(yōu)選是得自抗-CD19、抗-DC20、抗-CD22的抗體或片段。
在一個實施方案中，將親水性聚合物連接到脂質(zhì)上的可釋放鍵包含一種二硫化物鍵。在一個優(yōu)選的實施方案中，該二硫化物鍵是二硫代芐基鍵的一部分。
在另一方面，本發(fā)明包括一種用于增加被脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)細胞毒性的方法。該方法包括提供具有如上所述組分的脂質(zhì)體，并將該脂質(zhì)體進行給藥以完成(i)可釋放鍵的裂解，從而釋放出該親水性的聚合物鏈；(ii)配體與靶細胞的結(jié)合，其中所說的結(jié)合發(fā)生在該裂解之前或之后；和(iii)脂質(zhì)體被靶細胞的內(nèi)在化。相對于由缺乏可釋放鍵和/或靶向配體的相似脂質(zhì)體所傳遞的細胞內(nèi)藥物濃度而言，該類給藥可有效獲得該物質(zhì)至少高兩倍的細胞內(nèi)細胞毒性。
在一個實施方案中，在將該組合物進行給藥后可釋放鍵的裂解是通過一種或多種內(nèi)源性物質(zhì)來完成的，其中所說的內(nèi)源性物質(zhì)如在血液或細胞中天然存在的組分。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種通過提供如上所述的脂質(zhì)體并將該脂質(zhì)體進行給藥而來增加治療物質(zhì)在細胞核內(nèi)的積聚的方法，通過提供如上所述的脂質(zhì)體并將該脂質(zhì)體進行給藥從而完成(i)可釋放鍵的裂解，從而釋放出該親水性聚合物鏈的一部分或全部；(ii)配體與靶細胞的結(jié)合，其中所說的結(jié)合發(fā)生在該裂解之前或之后；和(iii)脂質(zhì)體被靶細胞的內(nèi)在化。當(dāng)與由缺乏可釋放鍵和/或靶向配體的相似脂質(zhì)體所傳遞的細胞內(nèi)物質(zhì)濃度進行比較時，該類給藥可有效獲得該物質(zhì)至少高兩倍的細胞核內(nèi)物質(zhì)積聚。
當(dāng)結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明如下的詳細說明時，將可以更充分地理解本發(fā)明的這些和其它目的以及特征。
附圖簡要說明


圖1A表示了本發(fā)明的一個實施方案，其中二硫代芐基(DTB)連接著一個甲氧基-聚乙二醇(mPEG)部分和包含胺的配體。
圖1B表示了圖1A中的化合物硫解后的產(chǎn)物。
圖2說明了mPEG-DTB-胺-脂質(zhì)合成的合成反應(yīng)流程圖，其中胺-脂質(zhì)是脂質(zhì)二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)。
圖3說明了對-二硫代芐基尿烷(DBT)-連接的mPEG-DSPE共軛物的硫解機理。
圖4A-4B說明了作為時間(小時)函數(shù)的被捕獲的熒光染料的泄漏，其是在37℃下在存在或不存在二硫蘇糖醇(DTT)的情況下，用相對于用Triton X-100(100％釋放)進行處理的預(yù)培養(yǎng)樣品的樣品熒光增加百分比來進行測定的，所說樣品得自在pH為7.4或5.5的緩沖劑中的被各種PEG-DSPE共軛物(可裂解或不可裂解的)所穩(wěn)定的二油?；字Ｒ掖及?DOPE)脂質(zhì)體；該結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.(在許多情況中誤差棒小于標(biāo)志)；在(A)中，●，DOPE，沒有PEG-DSPE，pH7.4；○，DOPE，沒有PEG-DSPE，pH5.5；▲，DOPE/mPEG-DSPE，pH7.4；△，DOPE/mPEG-DSPE，pH5.5，在(B)中，■，DOPE/mPEG-S-S-DSPE，pH7.4；，DOPE/mPEG-S-S-DSPE，pH5.5；□，DOPE/mPEG-S-S-DSPE+DTT，pH7.4；□，DOPE/mPEG-S-S-DSPE+DTT，pH5.5。
圖5A-5B說明了作為時間(小時)函數(shù)的被捕獲的熒光染料的泄漏，其是在37℃下，在存在或不存在二硫蘇糖醇(DTT)的情況下，用相對于Triton X-100(100％釋放)進行處理的預(yù)培養(yǎng)樣品的樣品熒光增加百分比來進行測定的，所說樣品得自在pH為7.4或5.5的緩沖劑中的被5mol％mPEG-DSPE或5mol％mPEG-S-S-DSPE共軛物(可裂解或不可裂解的)所穩(wěn)定的DOPE/CHEMS脂質(zhì)體；該結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.(在許多情況中誤差棒小于標(biāo)志)；在(A)中，●，僅為DOPE/CHEMS，pH7.4；○，僅為DOPE/CHEMS，pH5.5；▲，DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，pH7.4；△，DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，pH5.5；在(B)中，■，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE，pH7.4；，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE，pH5.5；□，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE+DTT，pH7.4；□，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE+DTT，pH5.5。
圖6A-6B說明了作為時間(小時)函數(shù)的被捕獲的熒光染料的泄漏，其得自在37℃下在pH被調(diào)至5.5的無細胞提取物中進行培養(yǎng)的未被穩(wěn)定或被脂質(zhì)混合物中不同比例的mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE脂質(zhì)體(A)或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體(B)；泄漏是用相對于用TritonX-100(100％釋放)進行處理的預(yù)培養(yǎng)樣品的樣品熒光增加百分比來進行測定的；結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.；在(A)中，●，僅有DOPE；▲，DOPE/mPEG-S-S-DSPE(1∶0.03)；■，DOPE/mPEG-S-S-DSPE(1∶0.05)；在(B)中，○，DOPE/CHEMS(6∶4)；△，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE(6∶4∶0.18)；□，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE(6∶4∶0.3)。
圖7A-7B說明了在37℃下在人血漿(pH7.4)中進行培養(yǎng)后，作為時間(小時)函數(shù)的被包含作為靶向部分的抗-CD19和mPEG-DSPE或mPEG-S-S-DSPE的DOPE或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體所捕獲的阿霉素的泄漏；所釋放的DXR是根據(jù)用相對于用Triton X-100進行了處理的預(yù)培養(yǎng)樣品的樣品熒光增加百分比來進行測定的；該結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.；(A)●，抗-CD19靶向的、負載有DXR的DOPE/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(1∶0.04∶0.01)；▲，抗-CD19-靶向的、負載有DXR的DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.2∶0.1)；(B)■，抗-CD19-靶向的、負載有DXR的DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(1∶0.04∶0.01)；，抗-CD19-靶向的、負載有DXR的DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.2∶0.1)。
圖8A-8C說明在體外，在用被捕獲在脂質(zhì)體中的阿霉素進行處理后，隨著時間的進行，阿霉素在Namalwa細胞中的核積聚；結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.；在(A)中，●游離阿霉素；■，包含阿霉素的HSPC/CHOL/mPEG-DSPE(2∶1∶0.1)脂質(zhì)體；▲，抗-CD19靶向的包含阿霉素的HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(2∶1∶0.08∶0.02)脂質(zhì)體；在(B)中，●，抗-CD19-靶向的包含阿霉素的DOPE/mPEGDSPE/Mal-PEG-DSPE(1∶0.04∶0.01)脂質(zhì)體；▲，抗-CD19靶向的包含阿霉素的DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.24∶0.06)脂質(zhì)體；○，包含阿霉素的DOPE/mPEG-DSPE(1∶0.05)；○，DXR-DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE(6∶4∶0.3)脂質(zhì)體；在(C)中，，抗-CD19靶向的包含阿霉素的DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.12∶0.06)脂質(zhì)體；■，抗-CD19靶向的包含阿霉素的DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(1∶0.02∶0.01)脂質(zhì)體；□，非靶向的包含阿霉素的DOPE/mPEG-S-S-DSPE(1∶0.03)脂質(zhì)體；□，非靶向的包含阿霉素的DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE(6∶4∶0.18)脂質(zhì)體。
圖9A-9D說明了DOPE或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體在BALB/c小鼠中的藥動學(xué)，其是通過測定被各種脂質(zhì)體制劑所包封的[126I]TI的吸收來獲得的(0.5μmol PL/小鼠)；結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.；在(A)中◇，DOPE；■，DOPE/mPEG-DSPE，1.0∶0.03；▲，DOPE/mPEG-DSPE，1.0∶0.05；●DOPE/mPEG-DSPE，1.0∶0.1；在(B)中◇，DOPE/CHEMS；□，DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，6∶4∶0.18；△，DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，6∶4∶0.3；○，DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，6∶4∶0.6；在(C)■中，DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，1.0∶0.02∶0.01；▲，DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，1.0∶0.04∶0.01；●，DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，1.0∶0.09∶0.01；(D)□，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，6∶4∶0.012∶0.06；△，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，6∶4∶0.024∶0.06；○，DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，6∶4∶0.054∶0.06。
本發(fā)明的詳細描述
本發(fā)明提供了脂質(zhì)體組合物和用其進行被脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的方法。該脂質(zhì)體在遇到靶部位低生理學(xué)pH環(huán)境時能迅速釋放所捕獲的物質(zhì)，其中所說靶部位的低生理學(xué)pH環(huán)境如細胞或細胞內(nèi)細胞器的內(nèi)部區(qū)域。在下面對該脂質(zhì)體組合物進行了描述并表明了該脂質(zhì)體內(nèi)含物的細胞內(nèi)傳遞。
I.定義和縮寫
“誘導(dǎo)的生理學(xué)情況”指的是一種給藥于用這里所述的脂質(zhì)體進行治療的個體的外源性物質(zhì)或情況，如熱、光、化學(xué)物質(zhì)、或生物學(xué)物質(zhì)，其中所說的物質(zhì)或情況可有效地造成不穩(wěn)定鍵的裂解。
“存在的生理學(xué)情況”指的是一種可有效地使得不穩(wěn)定鍵裂解的內(nèi)源性物質(zhì)或情況，如化學(xué)物質(zhì)、生物學(xué)物質(zhì)、pH水平或溫度。
短語“有效地釋放親水性聚合物鏈”指的是該聚合物鏈的全部或至少一部分被釋放。
“pH-敏感的”脂質(zhì)指的是其形成和/或維持形成脂質(zhì)雙分子層的能力至少部分取決于周圍環(huán)境pH值的脂質(zhì)。
DOPE指的是二油?；字Ｒ掖及?。
DSPE指的是二硬脂?；字Ｒ掖及?。
mPEG-DSPE指的是與DSPE共價偶合的甲氧基聚(乙二醇)。
mPEG-S-S-DSPE指的是N-[2-ω-甲氧基聚(乙二醇)-α-氨基羰基乙基-二硫代丙?；鵠-DSPE。
Mal-PEG-DSPE指的是與共價偶合于DSPE的馬來酰亞胺-結(jié)尾的聚乙二醇。
CHEMS指的是半琥珀酸膽甾醇酯。
CFE指的是無細胞提取物。
mAb指的是單科隆抗體。
DXR指的是阿霉素。
HPTS指的是8-羥基芘三磺酸三鈉。
HSCP指的是氫化大豆磷脂酰膽堿。
TI指的是tyraminylinulin。
DPX指的是對-二甲苯-二-吡啶鎓溴化物。
II.脂質(zhì)體組合物
用于本發(fā)明方法的脂質(zhì)體包括pH-敏感的脂質(zhì)和用親水性聚合物衍生化的脂質(zhì)，其中所說聚合物和脂質(zhì)通過一種可裂解的鍵結(jié)合到一起。該脂質(zhì)體還包括一種配體或可將該脂質(zhì)體有效靶向于特定細胞的部分。被捕獲在該脂質(zhì)體中的是一種用于進行細胞內(nèi)傳遞的治療物質(zhì)。現(xiàn)在將對這些組分中的各種組分進行描述。
pH-敏感的脂質(zhì)組分該脂質(zhì)體包括pH-敏感的脂質(zhì)，即在不存在穩(wěn)定化組分的情況下僅在特定的pH范圍內(nèi)就可形成雙分子層載體的脂質(zhì)。這些脂質(zhì)一般是具有疏水性和極性頭基團部分的兩親性脂質(zhì)，并且當(dāng)排列成雙分子層時，其取向為疏水部分與該雙層膜內(nèi)部的疏水區(qū)域相接觸，極性頭基團部分的取向為朝向于該膜外部的極性表面。該pH敏感的兩親性脂質(zhì)優(yōu)選地具有雙烴鏈，一般是長度為約8-22個碳原子的?；?，并且具有各種不飽和度。
一種優(yōu)選的pH敏感的脂質(zhì)是二油?；字Ｒ掖及?DOPE)——一種具有二?；湹牧字Ｔ谏韺W(xué)pH值和離子強度下，DOPE存在于一種能形成雙分子層的顛倒的六角形相(H)？)中。DOPE的雙分子層脂質(zhì)體可以在高于該氨基pKa的pH值(即大約pH約為8.5)下來進行制備(Allen T.M.等人，Biochemistry，232976(1990))。但是，在其中酸為負電荷的pH值時，DOPE可以在存在具有電荷相對的親水性部分的兩親物的條件下在雙分子層情況中被穩(wěn)定(Litzinger，L.H.Biochim.Biophys.Acta，1131201(1992)；Kirpotin等人，F(xiàn)EBS Letters，388115(1996))。在兩親物的pKa下，兩親物的質(zhì)子化通過促進回復(fù)成六角形相(Hit)而加速了DOPE囊的脫穩(wěn)定化(Lai，M.Z.等人，Biochemistry，241654(1985)；Ellens，H.等人，Biochemistry，231532(1984))。因此，可以通過選擇穩(wěn)定化的兩親物來控制脂質(zhì)體將在其下釋放其內(nèi)含物的pH。
在本發(fā)明的一個實施方案中，DOPE在雙分子層情況中被龐大的半琥珀酸膽甾醇酯(CHEMS)所穩(wěn)定。CHEMS在7.4的pH下為凈負電荷，并且在中性pH下穩(wěn)定了雙分子層狀態(tài)中的DOPE。在約6.0以及更低的pH值下，CHEMS質(zhì)子化，其將導(dǎo)致DOPE囊的脫穩(wěn)定化。
在雙分子層狀態(tài)，在5.5-7.4的pH范圍內(nèi)，DOPE還可以通過包含小摩爾百分比具有龐大的親水性部分的兩親性脂質(zhì)來被穩(wěn)定化，其中所說的兩親性脂質(zhì)例如將在下面進行描述的PEG-脂質(zhì)衍生物。
聚合物衍生化的脂質(zhì)組分該脂質(zhì)體還包括用親水性聚合物進行了衍生化的脂質(zhì)。該聚合物衍生化的脂質(zhì)可用來穩(wěn)定該pH敏感的脂質(zhì)以有助于該雙分子層和脂質(zhì)體的形成并可以在該脂質(zhì)體表面形成一種聚合物鏈的包衣以延長該脂質(zhì)體的血液循環(huán)持續(xù)時間。即，該親水性的聚合物包衣提供了膠體穩(wěn)定性并可保護該脂質(zhì)體不被單核吞噬細胞系統(tǒng)所攝取，從而使得該脂質(zhì)體具有較長的血液循環(huán)持續(xù)時間以在生物體中進行分布。該聚合物鏈通過一種可裂解的可釋放的鍵被連接到該脂質(zhì)上，并且正如將要進行描述的那樣，為了恢復(fù)該脂質(zhì)體的pH敏感性，該聚合物鏈可將被釋放。
優(yōu)選地，該可進行衍生化的脂質(zhì)是一種成囊的非pH敏感性的兩親性脂質(zhì)，其在水中可自發(fā)地形成一種雙分子層的囊。這種類型的成囊脂質(zhì)優(yōu)選地是具有雙烴鏈的脂質(zhì)，其中所說的雙烴鏈一般為酰基鏈和一種頂頭的基團，其中所說的頂頭的基團可以是極性或非極性基團。有許多合成和天然存在的成囊的兩親性脂質(zhì)，非限制性地包括磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、以及鞘磷脂，其中兩個烴鏈的長度上一般為約14-22個碳原子并且具有各種不飽和度。上述的其?；溈删哂懈鞣N不飽和度的脂質(zhì)和磷脂可以通過商業(yè)途徑獲得或者可以根據(jù)已經(jīng)被公開的方法來進行制備。優(yōu)選的用于本發(fā)明的二?；?鏈兩親性脂質(zhì)包括二酰基甘油、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)，并且最優(yōu)選地是磷脂酰乙醇胺(PE)。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中使用的是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
適于對該兩親性脂質(zhì)進行衍生化的親水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羥丙基甲基丙烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、以及聚天冬酰胺(polyaspartamide)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該親水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，優(yōu)選地是分子量為500-10,000道爾頓的PEG鏈，該PEG鏈的分子量更優(yōu)選地為2,000-10,000道爾頓，并且最優(yōu)選地為1,000-5,000道爾頓。
可釋放的鍵
如上所述，該親水性聚合物通過一種可釋放的鍵與該成囊的脂質(zhì)相連，其中所說的可釋放的鍵即在與特定刺激相接觸時裂解的鍵，其中所說的特定刺激如熱、pH改變、或外源性給予的化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該鍵是一種對內(nèi)源性刺激(體內(nèi)刺激)有響應(yīng)的鍵，其中所說的內(nèi)源性刺激非限制性地包括在細胞、血液(血漿)中或在靶細胞表面附近的化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)。
適宜的可釋放鍵包括，例如肽鍵、酯鍵或二硫化物鍵。酯鍵和肽鍵可以通過內(nèi)源性或外源性的酯酶或肽酶而被裂解。二硫化物鍵可以通過使用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)、谷胱甘肽或抗壞血酸鹽而被裂解，或可以被體內(nèi)還原劑如胱氨酸或存在于血漿或細胞內(nèi)的還原酶所裂解。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該可釋放的鍵是一種二硫化物鍵，其廣義地指的是包含硫的鍵。正如現(xiàn)有技術(shù)中所公知和例如在US6,043,094中所描述的那樣，可以對該包含硫的鍵進行合成以獲得所選擇的不穩(wěn)定度。可變的不穩(wěn)定度使之可以改變該親水性聚合物包衣從脂質(zhì)體表面上釋放的速度。一般而言，當(dāng)需要長循環(huán)的持續(xù)時間時，使用較不易變化的鍵。
一種二硫化物鍵的實例是如現(xiàn)有技術(shù)中所描述的二硫代丙?；?DTP)(Kirpotin等人，F(xiàn)EBS Letters，388115(1996))。被DTP連接到脂質(zhì)二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)上的聚乙二醇(PEG)的合成是通過將二硫代二(丙酸琥珀酰亞胺酯)的琥珀基酰亞胺酯與過量的mPEG-NH2進行反應(yīng)從而形成N-琥珀酰亞胺基-[2-(甲氧基聚(氧乙烯基)-α-氨基羰基)乙基-二硫代丙酸酯，mPEG-DTP-Osu來完成的。將其與DSPE進行反應(yīng)從而形成所需的共軛物，mPEG-DTP-DSPE(Id.)。
正如在待審的申請序列號為09/556,056和09/556,610的美國申請中所描述的那樣，另一種優(yōu)選的可釋放的鍵是一種二硫代芐基(DTB)鍵(Zalipsky等人，Bioconjugate Chemistry，10(5)703(1999)；WO00/64483和WO00/64484)，兩篇專利文件在這里都被引入作為參考。該鍵可以由如下所示的一般結(jié)構(gòu)來進行表示
其中R1是一種包含用于連接到二硫代芐基部分上的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(shè)(C＝O)R4、S(C＝O)R4、和O(C＝S)R4；R4包含一種包含胺的脂質(zhì)，例如如上所述的成囊脂質(zhì)；和R5選自H、烷基和芳基；并且其中CH2-R3的定位選自鄰位和對位。
圖1A表示了一種本發(fā)明實例性化合物的結(jié)構(gòu)，其中R1是親水性聚合物——甲氧基-聚乙二醇，mPEG＝CH3O(CH2CH2O)n，其中n為約10至約2300，其分子量相當(dāng)于約440道爾頓至約100,000道爾頓。該聚合物的分子量在一定程度上取決于R3的選擇。在其中R3是一種用于脂質(zhì)體包含胺的脂質(zhì)的實施方案中，PEG分子量的優(yōu)選范圍為約750至約10,000道爾頓，更優(yōu)選地為約2,000至約5,000道爾頓。在該實施方案中的mPEG包括一種尿烷鏈接部分。將意識到R1可選自各種親水性聚合物，并且該聚合物的實例如上所述。還將意識到該聚合物的分子量將取決于該脂質(zhì)體組合物所包括的聚合物-DTB-脂質(zhì)共軛物的數(shù)量，其中當(dāng)組合物中聚合物-DTB-脂質(zhì)的量較小時通常選擇較大分子量的聚合物，從而產(chǎn)生較少數(shù)目的與脂質(zhì)體相連的聚合物鏈。
繼續(xù)參考圖1A，在該示范性化合物中的R2和R5是氫(H)，但是R2或R5或R2和R5還可以是直鏈或支鏈的烷基或芳基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R5是H并且R2是烷基，并且下面給出了一些實例。在圖1A所示的化合物中，R3的一般形式為O(C＝O)-(NH2-配體)，其中NH2-配體可以是任何包含胺的脂質(zhì)。R3還可以是O(C＝S)-(NH2-配體)或S(C＝O)-(NH2-配體)的形式。
圖1B表示了圖1A的mPEGDTB-(NH2-脂質(zhì))化合物的硫解機理。該對-或鄰-二硫代芐基氨基甲酸酯部分在溫和的硫解條件下裂解，如在存在半胱氨酸或其它天然存在的還原劑的情況下進行裂解。一旦裂解，則該包含胺的脂質(zhì)就以其天然的未改性的形式再生。下面所述的本發(fā)明的研究表明體內(nèi)的天然生理條件足以開始并完成該DTB鍵的裂解。應(yīng)當(dāng)意識到，還可以使用還原劑以人為地誘發(fā)足以使該化合物裂解和分解的硫解條件。
適用于聚合物-DTB-脂質(zhì)共軛物的脂質(zhì)優(yōu)選地是具有至少一條包含至少約8個碳原子的?；湹乃蝗苄苑肿?，并且所說的酰基鏈更優(yōu)選地包含約8-24個碳原子。一種優(yōu)選的脂質(zhì)是具有包含胺的極性頭和酰基鏈的脂質(zhì)。脂質(zhì)的實例有具有單一?；湹牧字缬仓；?，或具有兩條?；湹闹|(zhì)。優(yōu)選的具有包含胺的頂頭基團的磷脂包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸。該磷脂的尾部(尾部們)具有約12至24個碳原子并且可以是完全飽和或不飽和的。一種優(yōu)選的磷脂是二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)，但是本領(lǐng)技術(shù)人員將想到許多屬于本說明書范圍的磷脂。還應(yīng)當(dāng)意識到該磷脂可自然地包括一種胺基團或可以被進行衍生化從而包含一種胺基團。其它不包含酰基尾部的磷脂部分如膽固醇胺也是適用的。
已經(jīng)在別處對聚合物-DTB-脂質(zhì)化合物的合成進行了描述((Zalipsky等人，Bioconjugate Chemistry，10(5)703(1999)；WO00/64483和WO 00/64484)并且在圖2中對示范性的合成路線進行了圖解式描述。具有甲氧基羰基二硫代烷基末端基團的mMPEG衍生物(MW為2000和5000道爾頓)是通過將2-(甲氧基羰基二硫代)乙烷胺與mPEG-氯甲酸鹽進行反應(yīng)來進行制備的，mPEG-氯甲酸鹽可以容易的通過干mPEG-OH溶液的光氣化作用來進行制備(Zalipsky，S.，等人，Biotechnol.Appl.Biochem.15100-114(1992))。前一種化合物可以根據(jù)所公開的方法(Brois，S.J.，等人，J. Amer.Chem.Soc.927629-7631(1970)；Koneko，T.，等人，Bioconjugate Chem.2133-141(1991))，通過將2-氨基乙硫醇鹽酸鹽與等量甲氧基羰基烴基硫化氯進行反應(yīng)來進行制備。將巰基芐醇的對位和鄰位異構(gòu)體(Grice，R.，等人，J.Chem.Soc.1947-1954(1963))干凈地與所得的聯(lián)有PEG的?；蚧镞M行偶合，得到帶有二硫代芐醇末端基團的mPEG。用未進行衍生化的mPEG-OH來引入活性碳酸酯，得到對-酰基苯基碳酸酯。加入在乙醇胺中的DSPE可形成所需的mPEG-DTB-DSPE產(chǎn)物。鄰-和對-DTB-脂質(zhì)化合物都是通過這種方法來進行制備的，然后可以用硅膠色譜來對其進行純化并用NMR和MALDI-TOFMS來對其進行定性。
圖3表示了mPEG-DTB-DSPE共軛物的硫解機理。一旦裂解，則該磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)(DSPE)就會以其天然未改性的形式再生。
末端官能團化的聚合物-脂質(zhì)共軛物
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物進一步包含一種靶向部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，該靶向配體被共價連接于該錨定于脂質(zhì)體的親水性聚合物鏈的末端。例如，在如上所述的該脂質(zhì)體-DTB-聚合物中，聚合物的游離末端可以被改性成包括一種適于與靶向部分分子內(nèi)的官能團進行偶合的末端反應(yīng)基團(末端官能團化)。該類聚合物末端的反應(yīng)基團在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且可以根據(jù)所要連接的靶向配體來對其進行選擇。例如，在靶向部分是抗體或抗體片段的情況中，將該聚合物鏈官能團化成包含適于與例如存在于該抗體中的巰基、氨基、以及醛或酮(一般得自該抗體碳水化合物部分的適度氧化)進行偶合的反應(yīng)基團。該類PEG-末端反應(yīng)基團的實例包括馬來酰亞胺(用于與巰基進行反應(yīng))、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)或NHS-碳酸酯(用于與伯胺進行反應(yīng))、酰肼或肼(用于與醛或酮進行反應(yīng))、碘乙?；?優(yōu)選地與巰基進行反應(yīng))和二硫代吡啶(硫醇反應(yīng))。
其它適宜的反應(yīng)末端基團包括馬來酰亞胺和肼。馬來酰亞胺被廣泛地用作蛋白質(zhì)改性劑并且當(dāng)該馬來酰亞胺是雜雙官能團交聯(lián)劑中的兩種官能團之一時尤其有用。馬來酰亞胺與巰基的反應(yīng)包括硫醇基向被活化的雙鍵進行的邁克爾加成。通過相同的機理與氨基進行反應(yīng)，但是反應(yīng)速率更低。因為硫醇是最具反應(yīng)性的類型，特別在中性pH下更是如此，所以可以用馬來酰亞胺基團靶向于靶向部分中的巰基，其通常可以獲得良好的選擇性。
酰肼或肼與醛基進行反應(yīng)。酰肼還可以被活性酯或被碳二亞胺活化的羧基所?；Ｗ鳛轷；镔|(zhì)的酰疊氮基反應(yīng)物可以容易地由酰肼獲得并可使之連接到包含氨的分子上。
制備末端官能團化聚合物-脂質(zhì)共軛物的方法在現(xiàn)有技術(shù)中一般是公知的。例如，同時擁有的US5,620,689公開了制備和用馬來酰亞胺、酰肼、和2-吡啶基二硫代丙酰胺末端基團來使抗體或抗體片段與聚合物鏈偶合的方法；該公開物在這里被引入作為參考。
應(yīng)當(dāng)意識到該靶向配體還通過一種沒有連接脂質(zhì)和聚合物的可釋放鍵的脂質(zhì)體-聚合物共聚物而被包含在該脂質(zhì)體內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)意識到任何適于形成上述脂質(zhì)體的親水性聚合物包衣的脂質(zhì)都可用來形成該改性的聚合物-脂質(zhì)共軛物，并且任何上述親水性聚合物都是適用的。優(yōu)選地，在將一種靶向部分連接到PEG-功能化的脂質(zhì)時，該靶向部分的活性不會受到任何損害。
該靶向部分可以通過在脂質(zhì)體中包括該末端官能團化的聚合物-脂質(zhì)共軛物，然后在脂質(zhì)體形成后，將所需的靶向配體與預(yù)先形成的脂質(zhì)體中的反應(yīng)性聚合物末端進行反應(yīng)而被連接到脂質(zhì)體表面。或者，該配體-聚合物-脂質(zhì)可以在脂質(zhì)體形成時被包括在該脂質(zhì)組合物內(nèi)部。還可通過插入而將該配體-聚合物-脂質(zhì)共軛物混入到該預(yù)先形成的脂質(zhì)體內(nèi)，其中將該配體-聚合物-脂質(zhì)共軛物在適于使得該共軛物變成插入到該脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的條件下用預(yù)先形成的脂質(zhì)體進行培養(yǎng)。該插入技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)進行了描述，例如在US6,056,973中進行了描述。
靶向部分
考慮使用許多靶向部分，并且其實例包括這些例如在US5,891,468中所描述的物質(zhì)，該專利對配體進行描述的部分在這里被引入作為參考。一般而言，該靶向部分是一種可以有效與靶細胞表面的細胞表面受體特定結(jié)合的配體。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該配體是一種抗體或抗體片段，其可將抗原特定地靶向于靶細胞的受體上?？贵w可以是單克隆抗體或抗體片段，其具有靶向特異性。在一個優(yōu)選的實施方案中，該被連接到脂質(zhì)體上的抗體是可特定地結(jié)合到B-細胞表位上的抗-CD19、抗-CD20、或抗-CD22。這些抗體或抗體片段一般得自對受影響的B-細胞表現(xiàn)出陽性反應(yīng)的雜交瘤。同樣可以使用可靶向于體內(nèi)任何其它細胞的其它抗體或抗體片段。
在本發(fā)明的研究中，用抗-CD19抗體來將包含所捕獲物質(zhì)的脂質(zhì)體靶向于惡性B-細胞。該抗體可識別B-細胞上的唯一表位——CD19表面抗原。如下所述，具有靶向部分的pH-敏感的脂質(zhì)體可以有效的將所捕獲的物質(zhì)傳遞到細胞內(nèi)。
脂質(zhì)體所捕獲的治療物質(zhì)被捕獲在脂質(zhì)體中的物質(zhì)是要傳遞到靶細胞內(nèi)的治療物質(zhì)。在脂質(zhì)囊中可以捕獲各種治療物質(zhì)，包括可被穩(wěn)定包封在囊的水性隔室中水溶性物質(zhì)、可被穩(wěn)定分配在囊的脂相中的親脂性化合物、或可被穩(wěn)定的連接到外部囊表面(例如通過靜電進行連接)的物質(zhì)。水溶性化合物的實例包括小的水溶性有機化合物、肽、蛋白質(zhì)、DNA質(zhì)粒、低聚核苷酸和基因片段。
被脂質(zhì)體捕獲的化合物還可以是用于追蹤疾病進展的顯影劑。顯影劑包括放射性核素的螯合物，如锝-99、銦-111、以及碘-125。
被捕獲的物質(zhì)還可以是一種用于體外診斷試驗的受體分子，如酶或熒光團。該類具有所捕獲的受體分子的脂質(zhì)體可以通過與靶細胞或包含受體的脂質(zhì)體進行融合來進行傳遞。
在一個實施方案中，該化合物可用于治療血漿細胞病癥，如多發(fā)性骨髓瘤，其特征在于B-淋巴細胞血統(tǒng)細胞瘤。用于治療多發(fā)性骨髓瘤的治療物質(zhì)包括美法侖、環(huán)磷酰胺、泊尼松、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、地塞米松、阿霉素、順鉑、紫杉醇、長春新堿、環(huán)己亞硝脲、以及干擾素。對于這些藥物中的一些而言，其標(biāo)準(zhǔn)化療所用的一般劑量如下美法侖，每天8mg/m2體表面積；環(huán)磷酰胺，每天200mg/m2；苯丁酸氮芥，每天8mg/m2；泊尼松，每天25-60mg/m2，長春新堿(1.4mg/m2)和阿霉素(60-75mg/m2)。
還考慮通過質(zhì)粒、反義低聚核苷酸以及合酶的胞質(zhì)內(nèi)傳遞來治療癌癥和和病毒感染。
在本發(fā)明中，對于對個體進行的胃腸外給藥而言，治療物質(zhì)通過下面所討論的方法被捕獲在脂質(zhì)體內(nèi)。脂質(zhì)體給藥的劑量最初以標(biāo)準(zhǔn)化療劑量為基礎(chǔ)，然后根據(jù)在治療過程中對疾病進程進行的監(jiān)測而對其進行調(diào)整。
III.pH敏感的靶向脂質(zhì)體的制備
包含所捕獲物質(zhì)的脂質(zhì)體可以根據(jù)眾所周知的方法如脂質(zhì)膜的水合、反相蒸發(fā)、以及溶劑浸泡來進行制備。在親脂性化合物的情況中，被傳遞的化合物被包含在該脂質(zhì)膜內(nèi)，或者在水溶性治療物質(zhì)的情況中被包含在水合介質(zhì)中?；蛘?，該治療物質(zhì)可以被裝填在預(yù)先形成的囊中，例如逆著離子梯度來裝填一種可離子化的化合物。
一種形成多層囊(MLVs)的眾所周知的方法是簡單的脂質(zhì)膜水合技術(shù)。在這種操作中，將形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)混合物溶解于適宜的有機溶劑中，然后將該溶劑蒸發(fā)以形成一種薄脂質(zhì)膜。然后將該脂質(zhì)膜用水性介質(zhì)進行水合從而形成MLVs，其大小一般為約0.1至10微米。
要被傳遞的治療化合物可以通過在形成脂質(zhì)體前將藥物添加到形成囊的脂質(zhì)中而被混入到脂質(zhì)體中從而將藥物捕獲在形成的脂質(zhì)體中。如果該藥物是疏水性的，則其可以被直接加入到該疏水性混合物中，而親水性藥物可以被加入到覆蓋著該干脂質(zhì)薄膜的水性介質(zhì)中?；蛘?，該藥物可以通過主動轉(zhuǎn)運機理如少量裝填被混入到預(yù)成形的脂質(zhì)體中，通過該機理，化合物作為一種梯度如硫酸銨梯度(US5,192,549；Bolotin等人，J.Liposome Res.，4455(1994))或鉀或氫濃度的響應(yīng)而被吸收到脂質(zhì)體中。
在形成后，調(diào)整脂質(zhì)體的大小。對于MLVs而言，一種有效調(diào)整大小的方法包括將該脂質(zhì)體的水性混懸液擠壓通過一系列聚碳酸酯膜，所說的聚碳酸酯膜具有所選擇的范圍為0.03至0.2微米的均勻孔尺寸，其孔尺寸一般為0.05、0.08、0.1或0.2微米。該膜的孔尺寸大概相當(dāng)于通過由該膜擠出而制備的脂質(zhì)體的最大尺度，特別是使其兩次或多次通過相同的膜來進行擠壓地進行制備時更是如此。還可用勻化法將脂質(zhì)體的大小降低到100nm或更小。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，將脂質(zhì)體擠壓通過一系列孔尺寸為0.2至0.08μm的膜，從而得到直徑大約為120±10μm的脂質(zhì)體。
本發(fā)明的脂質(zhì)體一般是用如下摩爾比的脂質(zhì)組分來進行制備的約70-90％的成囊脂質(zhì)，1-20％用于形成該可釋放聚合物鏈的表面包衣的聚合物-脂質(zhì)體共軛和0.1-5％用于與靶向部分偶合的末端官能團化的聚合物脂質(zhì)共軛物。應(yīng)當(dāng)意識到可以將該具有可釋放鍵的聚合物-脂質(zhì)共軛物末端官能團化以與一種靶向配體相偶合，或者該脂質(zhì)體可以包含兩種不同類型的聚合物-脂質(zhì)——一種是帶有可釋放鍵的聚合物-脂質(zhì)共聚物，另一種是沒有可釋放鍵但是連接有靶向部分的聚合物-脂質(zhì)共軛物。
在本發(fā)明進行的研究中，根據(jù)實施例1的描述制備了pH-敏感性脂質(zhì)體和非pH-敏感性脂質(zhì)體。靶向或非靶向并且具有可釋放或不可釋放的包衣pH-敏感的脂質(zhì)體——立體化學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體是由DOPE或DOPE/CHEM(摩爾比為6∶4)所制備的，并且包含mPEG-DSPE(不可釋放)或mPEG-S-S-DSPE(可釋放包衣)，并且在一些情況中包含能連接靶向配體的偶合于DSPE的馬來酰亞胺-結(jié)尾的聚乙二醇——Mal-PEG-DSPE。在圖例和各實驗的描述中表明了不同制劑的脂質(zhì)摩爾比。
非pH-敏感性脂質(zhì)體是由氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇(CHOL)、mPEG-DSPE所制備的并且可包含(靶向)或不包含(非靶向)馬來酰亞胺-PEG-DSPE，其摩爾比分別為2∶1∶0.08∶0.02的HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/馬來酰亞胺-PEG-DSPE或2∶1∶0.08的HSPC/CHOL/mPEG-DSPE。該脂質(zhì)體是用水合技術(shù)通過將脂質(zhì)組分溶解于氯仿中而形成的。在將組分進行混合后，除去氯仿并用適宜的緩沖液對該干脂質(zhì)膜進行水合，隨后將其擠壓通過一系列孔尺寸為0.2至0.8μm的聚碳酸酯過濾器。
如實施例1中所描述的那樣，按照硫酸銨梯度法通過少量裝填而將治療藥物阿霉素(DXR)包封到預(yù)成型的脂質(zhì)體中。在一些研究中，pH-敏感的脂質(zhì)體還裝填有8-羥基芘三磺酸三鈉對-二甲苯-二吡啶鎓(pyridimium)(HPTS-DPX)(一種熒光染料)或放射性標(biāo)記的tyraminylinulin([125I]TI)以對該脂質(zhì)雙分子層的穩(wěn)定性進行評估。如實施例1所描述的那樣，HPTS-DPX或[125I]TI的包封是通過將該薄脂質(zhì)膜用所需化合物的溶液(pH9.0)進行水合來完成的。
在下面所述的一些研究中，具有偶合于Mal-PEG-DSPE的馬來酰亞胺終端的抗-CD19抗體的靶向脂質(zhì)體是根據(jù)實施例2所描述的方法來進行制備的。
IV.脂質(zhì)體組合物的體外穩(wěn)定性
這里所描述的pH-敏感的脂質(zhì)體被一種可釋放的聚合物包衣所穩(wěn)定，從而使得即使在酸性pH下該脂質(zhì)體仍然保有所包封的化合物。通過裂解所有的聚合物包衣或該聚合物包衣的一部分而回復(fù)了該脂質(zhì)體的pH敏感性以及因此而產(chǎn)生的在酸性pH下的去穩(wěn)定作用，從而造成了該脂質(zhì)體的去穩(wěn)定作用并同釋放出脂質(zhì)體內(nèi)含物。如實施例3-5所述的，該脂質(zhì)體組合物的這種特征通過體外裂解實驗而得到了證明。在存在或不存在二硫蘇糖醇(DTT)的情況下，在pH為7.5或5.5的緩沖液中對pH-敏感性脂質(zhì)體和非pH-敏感性脂質(zhì)體在無細胞提取物(CFE)、人血漿、以及包含10％胎牛血清(FEBS)的細胞培養(yǎng)介質(zhì)中的穩(wěn)定性進行了比較。所捕獲溶質(zhì)——8-羥基芘三磺酸三鈉-對-二甲苯-二-吡啶鎓溴化物(HPTS-DPX，一種熒光染料)或阿霉素(DXR)從該脂質(zhì)體的釋放或泄漏是用一種熒光-脫熄滅(dequenching)實驗來進行測量的。
pH-敏感脂質(zhì)體在緩沖液中的穩(wěn)定性用實施例3所述的方法對在37℃下，HPTS從在pH7.5和5.5的緩沖液進行培養(yǎng)的被mPEG-DSPE(圖4A和5A)或mPEG-S-S-DSPE(圖4B和5B)所穩(wěn)定的DOPE(圖4A-4B)和DOPE/CHEMS(圖5A-5B)脂質(zhì)體中的泄漏進行了評估。此外，在存在二硫蘇糖醇(DTT)(100nM)的情況下，對HPTS從在pH7.4和5.5的緩沖液中進行培養(yǎng)的包含mPEG-S-S-DSPE的脂質(zhì)體中的泄漏進行了評估(圖5B)。DTT誘導(dǎo)了二硫化物鍵的硫解并且引起了穩(wěn)定化聚合物包衣的釋放。
如圖4A和4B所示，pH敏感的脂質(zhì)體可以在雙分子層狀態(tài)被包含的小摩爾百分比的具有龐大的頂頭基團的分子所穩(wěn)定。即在5.5-7.4的pH范圍內(nèi)，PEG-脂質(zhì)衍生物可以穩(wěn)定雙分子層狀態(tài)中的DOPE或DOPE/CHEMS，并且當(dāng)該包衣被釋放時該脂質(zhì)體的pH敏感性被恢復(fù)。當(dāng)在pH為7.4(●)或5.5(○)的緩沖液中進行培養(yǎng)時，僅由DOPE所形成的脂質(zhì)體釋放其內(nèi)含物(圖4A)。向該DOPE制劑中混入5mol％的mPEG-DSPE(圖4A)或mPEG-S-S-DSPE(圖4B)可以形成當(dāng)在pH為7.4(▲，5mol％ mPEG-DSPE(圖4A)，和■，5mol％ mPEG-S-S-DSPE(圖4B))或5.5(△，5mol％mPEG-DSPE(圖4A)，和，5mol％mPEG-S-S-DSPE(圖4B)的緩沖液中培養(yǎng)24小時不泄漏的脂質(zhì)體。
用二硫蘇糖醇(DTT)對脂質(zhì)體進行處理誘發(fā)了mPEG-S-S-DSPE從該脂質(zhì)膜錨凹(DSPE)上的硫解。在存在DTT的情況下，在7.4的pH下，包含5mol％mPEG-S-S-DSPE的DOPE脂質(zhì)體在24小時內(nèi)幾乎沒有內(nèi)含物的釋放(■，圖4B)；但是在pH為5.5時，用DTT進行處理導(dǎo)致在約10h內(nèi)逐漸釋放了約50％的HPTS(，圖4B)。在pH為5.5時，一種包含3mol％mPEG-S-S-DSPE的DOPE制劑具有更迅速的內(nèi)含物釋放(在2h內(nèi)釋放100％，數(shù)據(jù)未表示出)。
如圖5A和5B所闡明的，DOPE脂質(zhì)體還可以在雙分子層狀態(tài)被具有龐大的和/或電荷相斥的親水性部分的兩親物所穩(wěn)定。沒有mPEG-DSPE的DOPE/CHEMS制劑在7.4的pH下幾乎沒有泄漏(●，圖5A)，但是其在5.5的pH下迅速釋放出所包含的染料(○，圖5A)。在5.5或7.4的pH下，當(dāng)這些脂質(zhì)體被5mol％mPEG-DSPE(圖5A△，pH5.5和▲，pH7.4)或5mol％mPEG-S-S-DSPE(圖5B，pH5.5和■，pH7.4)所穩(wěn)定時，在24小時所發(fā)生的泄漏小于10％。在存在DDT的情況下，包含5mol％mPEG-S-S-DSPE的DOPE/CHEMS脂質(zhì)體在pH為5.5時的釋放半衰期約為8小時(，圖5B)，而在7.4的pH下幾乎不發(fā)生泄漏(□，圖5B)。對用3mol％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE/CHEMS脂質(zhì)體進行DTT處理產(chǎn)生了中等的泄漏速率(數(shù)據(jù)未表示出)。
如圖4B和5B所示，雖然內(nèi)含物的釋放相對慢于不含PEG的相似脂質(zhì)體(○，圖4A和5A)，但包含mPEG-S-S-DSPE(在圖4B和5B中都是)的pH-敏感的脂質(zhì)體在5.5的pH下內(nèi)含物的釋放速率增加。這種較迅速的釋放可能部分是由于mPEG-S-S-DSPE的不完全裂解(一種可有利地用來改變和制訂所捕獲物質(zhì)的釋放的特征)。例如，可以用所選擇的不能完全釋放的可釋放鍵來減緩內(nèi)含物的釋放速率，而可以用所選擇的在所選擇刺激下易于裂解的鍵來獲得被捕獲物質(zhì)的全部快速釋放。
pH敏感脂質(zhì)體在無細胞提取物(CFE)中的穩(wěn)定性無細胞提取物(CFE)包含在裂解mPEG-S-S-DSPE時能模擬二硫蘇糖醇(DTT)作用的細胞質(zhì)和溶酶體的酶。從而親水的不能滲透膜的染料8-羥基芘三磺酸三鈉(HPTS)從與CFE接觸的制劑上的裂解表示了被mPEG-DSPE或mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的pH敏感脂質(zhì)體在細胞內(nèi)環(huán)境中的去穩(wěn)定作用過程。
圖6A-6B表示了作為時間函數(shù)的被包封的HPTS染料從被脂質(zhì)混合物中不同比例的mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體中的泄漏，其中所說的脂質(zhì)體在3 7℃下被培養(yǎng)于pH為5.5的無細胞培養(yǎng)物(溶酶體pH大約為5至6.5)中。該研究是按照實施例4所描述的方法來進行的。用相對于用Triton X-100(100％釋放)進行處理的預(yù)培養(yǎng)樣品的樣品熒光增加百分比來對泄漏進行測定；結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D.。
圖6A表示了對于分別由DOPE(●)、被3mol％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE(▲)和被5mol％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE(■)所組成的脂質(zhì)體而言，作為時間函數(shù)的HPTS染料的釋放百分比。僅由DOPE所組成的脂質(zhì)體或由被3mol％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE所組成的脂質(zhì)體出現(xiàn)了其內(nèi)含物的迅速釋放，半衰期為1.7小時。被5mol％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE制劑(■)在CFE中的釋放速率較慢，在24小時內(nèi)釋放出40％被包封的染料。
圖6B表示了被截留在分別由DOPE/CHEMS(○)、DOPE/CHEMS/1.8mol％mPEG-S-S-DSPE(△)；以及DOPE/CHEMS/3mol％mPEG-S-S-DSPE(□)所組成的脂質(zhì)體中的HPTS的釋放百分比。在CFE中在pH為5.5時，三種制劑迅速脂肪出其內(nèi)含物，8小時時幾乎釋放完全。在pH被調(diào)至7.4的CFE中進行培養(yǎng)的DOPE/CHEMS和DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE制劑以更緩慢的速率釋放HPTS(數(shù)據(jù)未被表示)。
pH-敏感的脂質(zhì)體在人血漿中的穩(wěn)定性
在實施例5所詳細描述的另一項研究中，在37℃下，在90％人血漿(pH7.4)和包含10％FBS的細胞培養(yǎng)介質(zhì)中對親水性染料從各種脂質(zhì)體制劑中泄漏的速率進行了評估。將HPTS以水溶性(但熒光熄滅的)復(fù)合體——HPTS-DPX的形式被動地裝填到脂質(zhì)體中。當(dāng)HPTS-DPX從脂質(zhì)體中漏出時，其分離成游離的HPTS和DPX，當(dāng)在413nm下被繼發(fā)時，HPTS熒光增加。發(fā)現(xiàn)在人血漿中，在24小時內(nèi)從DOPE/mPEG-DSPE、DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE、DOPE/mPEG-S-S-DSPE或DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE制劑中泄漏出的被包封的HPTS小于20％(未表示出)。
一般在約5.5的pH下通過用硫酸銨梯度在脂質(zhì)體內(nèi)形成沉淀((DXR-NH3)2SO4來將阿霉素(DXR)主動裝填到脂質(zhì)體中(Bolotin等人，J.Liposome Res.，4455(1994))。這種脂質(zhì)體阿霉素制劑非常穩(wěn)定并具有低藥物釋放速率。但是，在裝配DOPE或DOPE/CHEMS所需的較高pH下，迄今為止仍然不知道在該主動裝填期間DXR是否會在該脂質(zhì)體內(nèi)形成一種沉淀以及DXR從pH-敏感脂質(zhì)體中的釋放速率將是什么樣子。正如在圖7A-7B中所看到的那樣，檢查了對于由DOPE/4mol％mPEG-DSPE，(●)；DOPE/CHEMS/2mol％mPEG-DSPE(▲)，DOPE/4mol％mPEG-S-S-DSPE(■)和DOPE/CHEMS/2mol％mPEG-S-S-DSPE()所組成的抗-CD19-靶向的pH-敏感脂質(zhì)體而言在人血漿中的DXR泄漏。DXR從除DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE(▲，圖7A)外的所有制劑中都迅速泄漏，從DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE制劑中的泄漏相對緩慢，但是仍然具有迅速的釋放速率。在存在人血漿的情況下，抗-CD19-靶向和相似的非靶向制劑(包含5mol％mPEG)之間在DXR的釋放速率之間沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未表示出)。
還對各種pH-敏感脂質(zhì)體組合物在包含10％FBS的細胞培養(yǎng)物中的穩(wěn)定性進行了評估。所有的試驗脂質(zhì)體都包含一種抗-CD19靶向配體并包含被截留在隔室內(nèi)的DXR。該脂質(zhì)體組合物包含DOPE/4mol％mPEG-DSPE、DOPE/CHEMS/2mol％mPEG-DSPE、DOPE/4mol％mPEG-S-S-DSPE和DOPE/CHEMS/2mol％mPEG-S-S-DSPE。所有的脂質(zhì)體組合物都是穩(wěn)定的，其在37℃下進行培養(yǎng)時在24小時內(nèi)DXR的泄漏都小于10％(數(shù)據(jù)未表示出)。
V.脂質(zhì)體組合物的藥物傳遞功效
根據(jù)本發(fā)明的方法，當(dāng)與非pH-敏感的靶向脂質(zhì)體或非-pH敏感的非靶向脂質(zhì)體進行比較時，上述脂質(zhì)體能在較低的pH條件下在靶細胞內(nèi)或就在靶細胞外部迅速釋放其內(nèi)含物從而使得藥物的細胞內(nèi)濃度增加。這種細胞內(nèi)濃度的增加在下面部分A中所述的本發(fā)明所進行的研究中得到了證實。因為在該靶向脂質(zhì)體內(nèi)在化后脂質(zhì)體包封的阿霉素從該溶酶體裝置中釋放到細胞核的速率是脂質(zhì)體包封阿霉素細胞毒性的決定性因素，所以在這些研究中測定了阿霉素在細胞核中的積聚速率。在部分B中對阿霉素核積聚試驗的結(jié)果進行了討論。部分C用小鼠模型描述了脂質(zhì)體的血液消除研究，并且部分D用體內(nèi)研究說明了用本發(fā)明的方法進行治療時所獲得的療效的改善。
被穩(wěn)定化的靶向pH-敏感脂質(zhì)體的體外細胞毒性
用Namalwa細胞用實施例6所述的體外增生試驗對游離DXR和各種脂質(zhì)體制劑的體外細胞毒性進行了評估。進行評估的脂質(zhì)體制劑被列于表1中。除該靶向pH-敏感的脂質(zhì)體外，還對常規(guī)的非-pH敏感的立體化學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體(DXR-SL)和游離形式的阿霉素進行了試驗。在受控條件下將各試驗制劑用Namalwa細胞培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，將細胞毒性表示為抑制濃度，即，將細胞生長抑制50％所需的濃度(IC50)。結(jié)果被列于表1中。
表1 游離阿霉素(DXR)和DXR的脂質(zhì)體制劑(含或不含抗-CD19)對CD19+Namalwa細胞的細胞毒性裝填了DXR的脂質(zhì)體制劑IC50(μMDXR)1DOPE/mPEG-DSPE(1∶0.05) 7.0±2.2DOPE/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE[anti-CD19](1∶0.04∶0.01)0.2±0.1DOPE/mPEG-S-S-DSPE(1∶0.03) 8.9±4.7DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE[anti-CD19](1∶0.02∶0.01)1.5±0.7DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE(6∶4∶0.3) 4.2±1.1DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE[anti-CD19] 0.4±0.1(6∶4∶0.24∶0.08)DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE(6∶4∶0.18) 6.0±0.8DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE[anti-CD19] 3.3±1.0(6∶4∶0.12∶0.06)HSPC/CHOL/mPEG-DSPE(″DXR-SL＂) ＞200HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE[anti-CD19](2∶1∶0.08∶0.02)35.4±12.7(＂DXR-SIL＂)游離DXR 0.8±0.71用MTT試驗來測定細胞毒性并將細胞毒性表示為細胞生長被抑制50％時的平均藥物濃度(IC50±S.D)。
如表1所示，靶向或非靶向的所有DOPE或DOPE/CHEMS制劑都有顯著低于DXR-SL(HSPC/CHOL/mPEG-DSPE)或DXR-SIL[抗-CD19](HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE[抗-CD19])制劑的IC50(P＜0.001)。IC50的顯著降低可能是由于與阿霉素從DXR-SL或DXR-SL[抗-CD19]中具有相當(dāng)慢藥物釋放速率的釋放相比，阿霉素從DOPE或DOPE/CHEMS制劑釋放的速度迅速(Lopes de Menezes等人，Cancer Res.，583320(1998))。靶向DOPE和DOPE/CHEMS制劑在大多數(shù)情況中具有可以與游離阿霉素相比的IC50(表1)。裝填有阿霉素的DOPE或DOPE/CHEMS(被mPEG-DSPE或mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定)靶向制劑的IC50顯著低于非靶向制劑的IC50(P＜0.05至P＜0.001)。值得注意地，對于包含mPEG-DSPE的制劑而言，不管是靶向還是非靶向，其細胞毒性都有略微高于包含mPEG-SS-DSPE的制劑的傾向。未包封阿霉素的靶向制劑在低于0.06μM DOPE的濃度下沒有毒性，如果該制劑包含阿霉素的話，則其將與34.5μM的阿霉素濃度相對應(yīng)(未表示出)。
從表1的數(shù)據(jù)中可以清楚地看出靶向或非靶向的pH-敏感的脂質(zhì)體的IC50顯著低于非pH-敏感的脂質(zhì)體(例如，由HSPC/CHOL/mPEG-DSPE制備的脂質(zhì)體)。非-pH敏感脂質(zhì)體的IC50對于非靶向和靶向制劑而言分別為200μM阿霉素和35uM阿霉素。使用pH-敏感脂質(zhì)體DOPE或DOPE/CHEMS而不是HPSC/CHOL可以使IC50增加22-48倍。這種細胞毒性的大大增加是出乎意料的，因此，本發(fā)明設(shè)計了一種通過將藥物截留在pH-敏感的脂質(zhì)體中而將被脂質(zhì)體所捕獲藥物的細胞毒性增加至少約10倍，更優(yōu)選地增加約20倍，并且最優(yōu)選地增加約40倍的方法。從表1的數(shù)據(jù)還可以看出，通過在該pH-敏感的脂質(zhì)體中包含一種靶向配體可以使得細胞毒性增加。因此，本發(fā)明還考慮通過在脂質(zhì)體中包含一種靶向配體來增加被捕獲在pH-敏感脂質(zhì)體中的藥物的細胞毒性。正如所測定的相對于缺乏該靶向配體的pH-敏感脂質(zhì)體而言其IC50那樣，該靶向配體可有效地使細胞毒性增加至少2倍，優(yōu)選地增加4倍，更優(yōu)選地增加6倍，并且最優(yōu)選地增加10倍。
核積聚試驗
如實施例7所述的那樣進行阿霉素的核積聚試驗。簡單地講，將維持在對數(shù)生長條件下的Namalwa細胞用捕獲了阿霉素的脂質(zhì)體制劑在8μM的阿霉素濃度下進行處理。在各時間點(0、2、4、8、12小時)，將被處理細胞的等分試樣破裂以回收核。將核中的DNA進行酶消化，然后測定阿霉素?zé)晒?。結(jié)果如圖8A-8C所示。
以對阿霉素的熒光進行測定的方式，圖8A比較了用游離阿霉素(●)；包封了阿霉素的非靶向非pH敏感的脂質(zhì)體(■)(HSPC/CHOL/mPEG-DSPE，摩爾比為2∶1∶0.1)；和包封了阿霉素的靶向非pH敏感的脂質(zhì)體(▲)(HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE，摩爾比為2∶1∶0.08∶0.02)進行處理的Namalwa細胞內(nèi)阿霉素的核積聚。正如可以看到的那樣，在非pH敏感性脂質(zhì)體給藥后在核中幾乎找不到可測量的阿霉素。
圖8B比較了在用包封有阿霉素的抗-CD19靶向的由DOPE/mPEGDSPE/Mal-PEG-DSPE(摩爾比為1∶0.04∶0.01)組成的脂質(zhì)體(●)；包封有阿霉素的抗-CD19靶向的由DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(摩爾比為6∶4∶0.24∶0.06)組成的脂質(zhì)體(▲)；包封有阿霉素的由DOPE/mPEG-DSPE(摩爾比為1∶0.05)組成的脂質(zhì)體(○)；包封有阿霉素的由DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE(摩爾比為6∶4∶0.3)組成的脂質(zhì)體(□)進行處理的Namalwa細胞中阿霉素的核積聚。正如可以看到的那樣，pH-敏感的脂質(zhì)體在核中產(chǎn)生了藥物的積聚(圖8A表示了與非pH敏感脂質(zhì)體的比較)，加入靶向配體有效地獲得了更高水平的積聚。
圖8C表示了在用包封有阿霉素的抗-CD19-靶向的由DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(摩爾比為6∶4∶0.12∶0.06)組成的脂質(zhì)體()；抗-CD19靶向的由DOPE/mPEG-S-SDSEP/Mal-PEG-DSPE(摩爾比為1∶0.02∶0.01)組成的脂質(zhì)體(■)；非靶向的由DOPE/mPEG-S-S-DSPE(摩爾比為1∶0.03)組成的脂質(zhì)體(□)；由DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE(摩爾比為6∶4∶0.18)組成的非靶向脂質(zhì)體()進行處理的Namalwa細胞內(nèi)的阿霉素核積聚。正如可以看到的那樣，具有可釋放的PEG鏈和靶向配體的pH-敏感脂質(zhì)體在細胞核內(nèi)獲得了脂質(zhì)體所捕獲藥物的積聚。
圖8A-8C所代表的數(shù)據(jù)表明在核內(nèi)游離阿霉素以最快的速率進行積聚(圖8A)。對于靶向的mPEG-DSPE-穩(wěn)定化(圖8B)或mPEG-S-S-DSPE穩(wěn)定化的(圖8C)DOPE或DOPE/CHEMS制劑而言，阿霉素的釋放速率遠遠快于靶向非pH敏感脂質(zhì)體的阿霉素釋放速率(圖8A)。得自脂質(zhì)體制劑的阿霉素的核積聚次序為游離藥物＞靶向的pH-敏感的mPEG-S-S-DSPE＞靶向的pH-敏感的mPEG-DSPE＞非靶向的pH-敏感的mPEG-S-S-DSPE＞非靶向的pH-敏感的Mpeg-DSPE＞靶向的非-pH敏感的＞非-pH敏感的。有趣地是，雖然細胞毒性不高于包含mPEG的制劑(表1)，但是包含mPEG-S-S-DSPE的制劑在這些實驗的時間過程中表現(xiàn)出更迅速的阿霉素核積聚。
表1所報道的細胞毒性(IC50)值與核積聚數(shù)據(jù)平行，表明脂質(zhì)體藥物的吸收總量以及被包封藥物的釋放速率控制著脂質(zhì)體藥物的細胞毒性。可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)在化作用機理來增加脂質(zhì)體藥物的總細胞吸收，可以通過諸如這里所描述的pH-敏感的觸發(fā)釋放機理來增加細胞內(nèi)的藥物釋放。因此，該數(shù)據(jù)支持一種通過提供這里所描述的脂質(zhì)體并將該脂質(zhì)體進行給藥來增加治療物質(zhì)進入到細胞核內(nèi)的積聚的方法，其中所說的脂質(zhì)體包含pH-敏感的脂質(zhì)、可釋放聚合物鏈的包衣、以及靶向部分。該給藥可以有效地獲得(i)可釋放鍵的裂解，以釋放出所有的親水性聚合物鏈或該鏈的一部分；(ii)，脂質(zhì)體所鍵合的配體與靶細胞之間的結(jié)合，其中該結(jié)合可以在聚合物鏈的裂解之前或之后發(fā)生；和(iii)脂質(zhì)體進入到靶細胞中的內(nèi)在化作用。脂質(zhì)體的內(nèi)在化作用將使得pH-敏感的脂質(zhì)與可有效造成脂質(zhì)體去穩(wěn)定作用的條件相接觸，從而向細胞內(nèi)釋放出所捕獲的內(nèi)含物。該給藥可以有效地獲得比用不含pH-敏感脂質(zhì)、可釋放鍵、和/或靶向配體的脂質(zhì)體所獲得的脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)在細胞核內(nèi)的積聚至少高兩倍的積聚。
血液藥動學(xué)
用根據(jù)本發(fā)明進行制備并包含放射性標(biāo)記[125I]TI的脂質(zhì)體對脂質(zhì)體制劑在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)進行了評估。如實施例8所述，用包封于各種脂質(zhì)體制劑中的0.2ml[125I]TI的單劑量通過尾靜脈對小鼠進行靜脈內(nèi)給藥(0.5μmol PL/小鼠)。在注射后所選擇的時間采集血樣并對125I標(biāo)記進行分析。通過放射性的下降來測定脂質(zhì)體從血液中的清除/消除。結(jié)果如圖9A-9D所示。
圖9A表示了DOPE脂質(zhì)體的消除，其是以作為時間(小時)函數(shù)的每分鐘體內(nèi)計數(shù)百分比(cpm)來進行表示的，該脂質(zhì)體是四種具有不同mPEG-DSPE含量的脂質(zhì)體組合物。該脂質(zhì)體組合物是僅為DOPE(◆)；DOPE/mPEG-DSPE，摩爾比為1.0∶0.03(■)；DOPE/mPEG-DSPE，摩爾比為1.0∶0.05(▲)；DOPE/mPEG-DSPE，摩爾比為1.0∶0.1(●)。血液消除曲線隨著脂質(zhì)體中mPEG-DSPE含量的變化而變化，較高的mPEG-DSPE含量使得脂質(zhì)體從血液中的消除變慢。
圖9B是用DOPE/CHEMS所制備的并具有不同mPEG-DSPE含量的脂質(zhì)體的類似繪圖。該脂質(zhì)體制劑是DOPE/CHEMS，摩爾比為6∶4(□)；DOPE/CHEMS/mPEG/DSPE，摩爾比為6∶4∶0.18(◇)；DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，摩爾比為6∶4∶0.3(△)；DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE，摩爾比為6∶4∶0.6(○)。血液消除曲線隨著脂質(zhì)體中mPEG-DSPE數(shù)量的變化而變化，較高的mPEG-DSPE含量可以減緩脂質(zhì)體從血液中的消除。
圖9C表示了作為時間函數(shù)的具有不同mPEG-S-S-DSPE含量的DOPE脂質(zhì)體從血液中的消除曲線。脂質(zhì)體的組成如下DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，摩爾比為1.0∶0.02∶0.01(■)；DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，摩爾比為1.0∶0.04∶0.01(▲)；DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，摩爾比為1.0∶0.09∶0.01(●)，將各脂質(zhì)體如實施例8所述的那樣給藥于小鼠。在這里，隨著mPEG-S-S-DSPE數(shù)量的增加對循環(huán)持續(xù)時間的依賴性下降，制劑具有基本相同的消除曲線。
在圖9D中也看到了相似的觀察結(jié)果，圖9D表示了作為時間函數(shù)的具有各種不同mPEG-S-S-DSPE含量的DOPE/CHEMS脂質(zhì)體的消除。這里，該制劑分別由如下的物質(zhì)所組成DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG/DSPE，摩爾比為6∶4∶0.012∶0.06(□)；DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，摩爾比為6∶4∶0.024∶0.06(△)；DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE，摩爾比為6∶4∶0.054∶0.06(○)。所有的制劑又具有基本相同的消除曲線，同時可裂解的PEG(mPEG-S-S-DSPE)數(shù)量增加對循環(huán)時間沒有可察覺的影響。
總之，循環(huán)時間隨著DOPE或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體制劑中mPEG-DSPE含量的增加而增加(圖9A-9B)。在將包含10mol％ mPEG-DSPE的脂質(zhì)體進行注射后24小時，在血液中仍然保留有約5-10％所注射的脂質(zhì)體。注射未被mPEG-DSPE所穩(wěn)定的DOPE或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體使得脂質(zhì)體被迅速清除。包含2至9mol％的mPEG-S-S-DSPE不會增加DOPE(圖9C)或DOPE/CHEMS(圖9D)制劑的循環(huán)時間。在靶向?qū)嶒炛兴械膍PEG-S-S-DSPE制劑都包含1mol％mPEG/DSPE以模擬向該制劑中添加1mol％偶合脂質(zhì)的作用。增加制劑中mPEG-S-S-DSPE的數(shù)量并不能在任何程度上增加該制劑的循環(huán)半衰期(圖9A-9B)。
相對于包含不可裂解的mPEG-DSPE的脂質(zhì)體而言，由于在體內(nèi)二硫化合物鍵被血液組分例如半胱氨酸迅速裂解，所以包含mPEG-S-S-DSPE的脂質(zhì)體具有縮短的血液循環(huán)半衰期。由于脂質(zhì)體上PEG的損失而造成的空間位阻損失將降低其在血液中的穩(wěn)定性并增加MPS對脂質(zhì)體的吸收?？贵w靶向的脂質(zhì)體結(jié)合于靶細胞并被靶細胞迅速內(nèi)在化(Lopes de Menezes等人，J.Liposome Res.，9199(1999)；Lopes de Menezes等人，Cancer Res.，583320(1998))。因此，本發(fā)明考慮使用靶向pH-敏感的包含可裂解聚合物鏈的脂質(zhì)體來完成靶向配體和靶細胞的結(jié)合、脂質(zhì)體的內(nèi)在化、聚合物鏈的裂解、以及隨后向細胞內(nèi)釋放出脂質(zhì)內(nèi)含物的脂質(zhì)雙分子層的瓦解。
體內(nèi)治療處理
在本發(fā)明的另一項研究中，將小鼠用具有可釋放PEG鏈的靶向pH-敏感脂質(zhì)體進行處理。脂質(zhì)體中所捕獲的物質(zhì)是治療物質(zhì)阿霉素(DXR)。如實施例9中所描述的那樣，將小鼠用單劑量3mg DXR/kg游離形式或被脂質(zhì)體所捕獲形式的藥物進行處理。將脂質(zhì)體制劑概括地列于表2中并在實施例8中進行了詳細描述。
表2.荷有CD19±人B-淋巴瘤(Namalwa)細胞的小鼠的存活時間

1治療組號(3)-(8)是包含所捕獲的阿霉素的脂質(zhì)體制劑。
2相對于對照小鼠存活時間而言增加的壽命。
表2表示了各治療組的平均存活時間和增加的壽命，其是以對照動物的平均存活時間(MST)為基礎(chǔ)來進行計算的。在任何試驗動物中都沒有顯現(xiàn)出藥物毒性的跡象。與對照組相比，用非靶向脂質(zhì)體制劑進行處理的動物((3)-(5)組)在治療功效方面幾乎沒有改善(P＞0.05)。但是，用靶向脂質(zhì)體制劑進行處理的動物((6)-(8)組)的壽命比對照組或用非靶向制劑進行處理的動物組的壽命顯著增加(＞100％ILS)(P＞0.001)。與其它靶向治療組(組6和組8)相比，用DXR-DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE[抗CD19]進行處理的組(7)具有顯著增加的％ILS。
表2所列的和圖所示的數(shù)據(jù)表明具有可裂解的PEG的靶向pH-敏感脂質(zhì)體的治療功效高于非靶向或非-pH-敏感的脂質(zhì)體。即，相對于缺乏觸動釋放性的靶向制劑，即DXR-HSPC/CHOL/mPEG-DSPE[抗-CD19]而言，被mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的靶向pH-敏感制劑可以有效地將所包封的阿霉素傳遞到靶細胞的細胞質(zhì)內(nèi)并且在體外可以改善所包封阿霉素的細胞毒性。該靶向pH-敏感的可裂解聚合物鏈制劑可以增加脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞。
V1.實施例
用下面的實施例來對這里所描述的本發(fā)明進行進一步的說明，這些實施例并不是要在任何方面對本發(fā)明的范圍進行限制。
材料
氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)得自LipoidKG(Ludwigshafen，Germany)，mPEG2000-二硬脂?；字；?乙醇胺(mPEG2000-DSPE，也被縮寫為mPEG-DSPE)可以用標(biāo)準(zhǔn)方法來進行合成(Zalipsky，S.，等人，聚(乙二醇)化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(J.M.Harris，Ed.)Plenum Press，347-370頁(1992))。阿霉素(DXR)購自Sigma Chamial Company，St. Louis，Mo。馬來酰亞胺-衍生化的PEG2000-DSPE(Mal-PEG-DSPE)(Kirpotin，D.等人，Biochemistry，3666(1997))是由Shearwater Polymers(Huntsville，AL)定制合成的。膽固醇(CHOL)和二油?；字Ｒ掖及?DOPE)購自Avanti PolarLipids(Alabaster，AL)。N-[2-w-甲氧基聚(乙二醇)-α氨基羰基-乙基-二硫代丙?；鵠-DSPE(mPEG-S-S-DSPE，二硫化物-銜接物)是根據(jù)所描述的來進行合成的。Sephadex G-50和Sepharose CL-4B購自Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)。Na125I和膽甾醇基-[1，2-[3H](N)]十六烷基醚([3H]CHE)購自MandelScientific(Guelph，ON)。半琥珀酸膽甾醇酯(CHEMS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)和iminothiolane購自Sigma Chemicals(Oakville，ON)。對-二甲苯-二-吡啶鎓溴化物(DPX)和-羥基芘三磺酸三鈉(HPTS)購自Molecular Probes(Eugene，OR)。IgG的碘化是根據(jù)別處所描述的方法來進行的(Lopes de Menezes等人，Cancer Res.，583320(1998))。以前已經(jīng)對Tyraminylinulin(TI)的合成和[125I]TI的制備進行過描述(Sommerman，E.F.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，122319(1984))。鼠科動物單克隆抗體(mAb)抗-CD19是用得自Dr.H.Zola(Children′s Health ResearchInstitute，Australia)的FMC-63鼠科動物抗-CD19雜交瘤細胞系來制備的。人B-淋巴瘤細胞系Namalwa(ATCC CRL1432)得自AmericanType Culture Collection(MD，USA)。人血漿得自the University ofAlberta，Department of Pharmacology中的健康志愿者。核微孔(Nuclepore)聚碳酸酯膜(0.08、0.1和0.2μm孔大小)購自NorthernLipids(Vancouver，BC)。所有其它化學(xué)品都是分析等級。
實施例1pH-敏感和非pH-敏感脂質(zhì)體的制備
立體化學(xué)穩(wěn)定的pH-敏感脂質(zhì)體是用二油?；字Ｒ掖及?DOPE)或DOPE/CHEMS(半琥珀酸膽甾醇酯)和mPEG-DSPE或mPEG-S-S-DSPE(如Kirpotin等人所述的那樣來進行制備)和DSPE-PEG-馬來酰亞胺(Mal-PEG-DSPE；如US6,326,353中所述的那樣來進行制備)的混合物按照所需制劑的脂質(zhì)摩爾比來進行制備的。將所需的脂質(zhì)混合物溶解于氯仿中，通過用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓下進行旋轉(zhuǎn)來將其干燥成一種薄膜。通過向其中加入一種水性緩沖劑來將該干燥的膜進行水化從而形成脂質(zhì)體。通過用一種Lipex Extruder(LipexBiomembranes，Vancouver，BC)將該脂質(zhì)體擠壓通過一系列孔大小為0.2至0.08μm的核微孔聚碳酸酯過濾器來對脂質(zhì)體的大小進行調(diào)整。用Brookhaven BI-90 Particle Sizer(BrookhavenInstruments，Holtsville，NY)通過動態(tài)光散射來對脂質(zhì)體的平均直徑進行測定。所擠出的脂質(zhì)體的直徑在120±10nm的范圍內(nèi)。
對于加載有HPTS-DPX或[125I]TI的脂質(zhì)體而言，用HPTS-DPX溶液(30mM HPTS，30mM DPX，pH9.0，用NaCl調(diào)至290mosmol)或[125I]TI溶液(pH9.0)對該脂質(zhì)膜進行水化。在擠出后，通過用分別使用Sephadex G-50或Sepharose CL-4B柱的色譜法，用HEPES緩沖劑，pH7.4(25mM HEPES，140mM NaCl)進行洗脫來除去所捕獲的染料或[125I]TI。
如對Bolotin等人(J.Liposome Res.，4455(1994))所述方法進行了微小改動的方法那樣，通過用使用硫酸銨梯度的少量加載法來將治療物質(zhì)——阿霉素進行加載。簡單地說，將該脂質(zhì)膜在250mM硫酸銨中進行水合，對于包含DOPE/CHEMS的制劑而言pH為8.5，對于包含DOPE的制劑而言，pH為9.0。在一些情況中向其中加入微量的NaOH以使得水合完全。在擠塑后，通過使用用10％蔗糖、適宜的話pH為8.5或9.0的25mM Trizma堿進行平衡的Sephadex G-50柱進行洗脫來對外部緩沖劑進行交換從而使雙分子層形成。將DXR以0.2∶1(w/w)的DXR/脂質(zhì)比例添加到該預(yù)形成的脂質(zhì)體中，然后將該脂質(zhì)體在22℃下培養(yǎng)15分鐘。通過用脫氣的HEPES緩沖劑進行洗脫的使用Sephadex G-50柱的色譜法將脂質(zhì)體包封的DXR與游離DXR分離開來。在用甲醇進行提取后，通過分光光度法(A＝490nm)測定脂質(zhì)體所捕獲的DXR濃度。用Fiske-Subbarow比色法試驗來測定磷脂濃度(Bartlett，G.R.，J.Biol.Chem，234466(1959))。
實施例2抗體與預(yù)成型脂質(zhì)體的偶合
抗-CD19mAb與脂質(zhì)體上馬來酰亞胺(Mal)-PEG-DSPE的偶合是根據(jù)以前所描述的方法(Lopes de Menezes等人，J.LiposomeRes.，9199(1999))用125I-標(biāo)記的抗-CD19mAb作為示蹤劑來進行的。
首先用Traut′s試劑(2-iminothiolane)以20∶1(Traut′sIgG)的摩爾比在10mg IgG/ml緩沖劑的濃度下在25℃下在pH為8.0的HEPES緩沖劑(25mM HEPES，140mM NaCl)中將抗體活化1小時。用G-50柱除去未進行反應(yīng)的Traut′s試劑。偶合反應(yīng)是在25℃下，在氬氣氣氛下以1∶2000的IgG與磷脂摩爾比進行18小時來進行的。通過使該偶合混合物通過在pH為7.4的HEPES緩沖液中的Sepharose CL-4B柱來從該脂質(zhì)體中除去未偶合的Ab。偶合效率平均為80％。
所有的mAb密度對于體內(nèi)實驗一般為30-60μg抗CD19/μmol磷脂，對于體外實驗一般為65-80μg抗-CD19/μmol。
實施例3在緩沖劑中脂質(zhì)體捕獲的熒光染料或脂質(zhì)體捕獲的阿霉素的泄漏
通過用熒光-脫熄滅實驗監(jiān)測被捕獲溶質(zhì)的釋放來對被各種DOPE或DOPE/CHEMS脂質(zhì)體制劑所捕獲的HPTS-DPX的泄漏進行評估。HPTS以水溶性(但熒光熄滅的)復(fù)合體——HPTS-DPX的形式被被動加載到脂質(zhì)體中。當(dāng)HPTS-DPX從脂質(zhì)體泄漏時；其分離成游離HPTS和DPX，當(dāng)在413nm進行激發(fā)時HPTS熒光增加。進行試驗的DOPE和DOPE/CHEMS制劑有脂質(zhì)組分摩爾比DOPE 1DOPE/mPEG-DSPE1∶0.05DOPE/mPEG-S-S-DSPE1∶0.05DOPE/CHEMs6∶4DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE 6∶4∶0.3DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE 6∶4∶03
在使用之前立即使包含所捕獲的HPTS-DPX的脂質(zhì)體通過一種Sephadex G-50柱以除去任何殘余的游離染料或藥物。將五十(50)μl包含所捕獲的染料(HPTS-DPX)或阿霉素的脂質(zhì)體以0.5mM的最終PL濃度在37℃下在450μ1 pH為5.5或7.4的緩沖劑中進行培養(yǎng)。包含mPEG-S-S-DSPE的pH敏感脂質(zhì)體還用二硫蘇糖醇(DTT)(100nM)在pH為5.5或7.4的緩沖液中進行培養(yǎng)。在各時間點，通過在512nm的發(fā)射波長和413nm的激發(fā)波長下用SLM-Aminco Model 8100熒光計(Spectronic Instruments，Rochester，NY)測定相對于預(yù)培養(yǎng)樣品(零釋放)而言樣品熒光的增加來測定培養(yǎng)混合物等分試樣中所釋放的HPTS百分比(Daleke，K.等人，Biochim. Biophys.Acta，1024352(1990))；將值標(biāo)準(zhǔn)化成在將預(yù)培養(yǎng)樣品用10％TritonX-100樣品水解后(100％釋放)所得熒光增加的百分比(Kirpotin等人，F(xiàn)EBS Letters，388115(1996))。
在圖4A-4B和圖5A-5B中，將在pH為5.5或7.4的緩沖劑中被包封的HPTS從被mPEG-S-S-DSPE或mPEG-DSPE所穩(wěn)定的DOPE和DOPE/CHEMS脂質(zhì)體中的泄漏對時間作圖。該結(jié)果得自有代表性的實驗，并且表示的是一式三份進行分析的結(jié)果的均值±S.D。
實施例4脂質(zhì)體捕獲的熒光染料向無細胞提取物中的釋放A.無細胞提取物的制備
在潮濕的包含5％CO2的氣氛下，將Namalwa細胞在37℃下在另外添加了10％FBS的RPMI1640中維持在對數(shù)生長條件下。通過離心法對細胞(1.0×108)進行收集，然后將其用20ml TEA緩沖液(10mM三乙醇胺、0.25M蔗糖、10mM醋酸和1mM EDTA，pH為7.4)進行洗滌。將進行了洗滌的細胞重新混懸于4ml TEA緩沖液中，以每克細胞100μl的量向其中加入所制備的用于哺乳動物細胞提取的蛋白酶抑制劑雞尾酒(4-(2-氨基-乙基)-苯磺酰氟化物、胃蛋白酶抑制劑A、反式-環(huán)氧琥珀?；?L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷、苯丁抑制素、亮抑蛋白酶肽、以及抑肽酶；Sigma，MO，USA)。將該細胞用緊密裝配的Dounce勻漿器在4℃下用40次堅實沖擊來進行破碎。通過在4℃下以1000rpm的速率離心10分鐘來使未破裂的細胞成團。從該細胞團上小心地除去CFE，然后通過添加TEA緩沖液將其稀釋成6ml。將CFE調(diào)至pH為5.5，該溶酶體的pH大約為5至6.5(Tycko，B.等人，Cell，28643(1982)；Tycko，B.等人，J.Cell Biol.，971762(1983))。
就在使用前立即使包含HPTS-DPX的脂質(zhì)體通過Sephadex G50柱以除去任何殘余染料。用熒光脫熄滅試驗對所捕獲溶質(zhì)的釋放進行研究。
在37℃下，在450mL無細胞提取物中以0.5mM的最終磷脂濃度對五十(50)ml包含所捕獲染料(HPTS-DPX)的脂質(zhì)體進行培養(yǎng)。該脂質(zhì)體制劑由未被穩(wěn)定或被3％或5％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE脂質(zhì)體、和未被穩(wěn)定或被在脂質(zhì)混合物1.8mol％或3mol％mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的DOPE/CHEMS脂質(zhì)體所組成。通過測定樣品熒光對相對于用Triton X-100進行處理的預(yù)培養(yǎng)樣品熒光(100％釋放)的增加百分比來對泄漏進行測定。在圖6A-6B中將得自有代表性實驗的結(jié)果對時間作圖。各數(shù)據(jù)點是一式三份分析的均值±S.D。
實施例5阿霉素從在人血漿中培養(yǎng)的pH-敏感脂質(zhì)體中的泄漏
檢查了DOPE/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(1∶0.04∶0.01)、DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.2∶01)、DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(1∶0.04∶0.01)和DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶02∶0.1)的抗-CD19-靶向的脂質(zhì)體在人血漿中的阿霉素(DXR)泄漏情況。
在37℃下以0.5mM的最終磷脂濃度在450μl人血漿中對五十(50)μl包含所捕獲的DXR的脂質(zhì)體進行培養(yǎng)。在各時間點，采集培養(yǎng)混合物的等分試樣并用HEPES緩沖液(pH7.4)對其進行稀釋。當(dāng)用硫酸銨法進行加載時，由于其自我締合，包含在脂質(zhì)體中的阿霉素的熒光被熄滅。通過分別在485和590nm的激發(fā)和發(fā)射波長下測定熒光脫熄滅來對阿霉素泄漏進行測定。通過測定樣品熒光相對于用10％Triton X-100％進行處理的預(yù)培養(yǎng)樣品(100％釋放)熒光的增加百分比來測定所釋放的DXR。如圖7A-7B所示，將有代表性實驗的結(jié)果對時間作圖。各數(shù)據(jù)點是一式三份分析的均值。
實施例6靶向、PEG-DSPE穩(wěn)定的pH-敏感脂質(zhì)體的體外細胞毒性
游離阿霉素和各種脂質(zhì)體制劑體外細胞毒性比較(表1)是如Lopes de Menezes等人，CancerRes.，583320(1998)所描述的那樣用Namalwa細胞，通過使用一種四唑鎓染料(MTT-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物；Mo smann，J.J.ImmunolMethods，6555(1983))的體外增值試驗來進行的。
簡單地將，將5×105Namalwa細胞鍍在96-孔板上并用游離DXR或包封于帶有或不帶有抗-CD19mAb的脂質(zhì)體中的各種阿霉素制劑進行培養(yǎng)。將單克隆抗體與馬來酰亞胺-結(jié)尾的PEG-DSPE偶合從而形成具有65-80μgmAb/μmol磷脂的脂質(zhì)體。在140-160μg阿霉素/μmol磷脂(0.24-0.28μmol阿霉素/μmol磷脂)的加載水平下將脂質(zhì)體極少量地體用阿霉素進行加載。將細胞在37℃下在95％濕度和5％CO2的氣氛下培養(yǎng)1、24、48小時。在1小時和24小時培養(yǎng)時間周期內(nèi)，在用新介質(zhì)進行替換將前將細胞洗滌兩次，然后將其分別再培養(yǎng)47小時和24小時。將所有的板一共都培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，向其中添加四唑鎓染料，然后將該板在570和650nm的雙波長下在Titertek Multiskan Plus(Flow Laboratories，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)上進行讀數(shù)。將各種脂質(zhì)體制劑的細胞毒性表達為可有效將生長抑制50％的平均濃度(IC50，μ DXR)±S.D.(n＝3-6)并將其列于表1中。
實施例7核積聚試驗
根據(jù)Kirchmeier等人的方法(J.LiposomeRes.，1115(2001))對阿霉素的核積聚進行測定。簡單地講，將在另外添加了10％FBS的RPMI 1640中被維持在對數(shù)生長條件下的4.5×108/500ml Namalwa細胞用游離DXR或各種脂質(zhì)體DXR制劑在8μM的DXR濃度下進行處理。
在各時間點(0，2，4，8，12小時)，通過在1000rpm下離心10分鐘而使100ml細胞成團，然后用20ml TEA緩沖液對其進行洗滌。將進行了洗滌的細胞重新混懸于3ml TEA緩沖液中并在4℃下用緊密裝配的Dounce勻漿器用40次堅實沖擊使其破裂。使為破裂的細胞成團，然后小心地將包含核的CFE從該細胞團上取下。為了獲得更完全的勻漿，將未破裂的細胞團混懸于TEA緩沖液(3ml)中并進行第二次破裂，然后再除去未破裂的細胞。將所合并的上清液在1000rpm下離心10分鐘以除去仍然未破裂的細胞。將得自這一離心步驟的上清液在4℃下在2000rpm下旋轉(zhuǎn)2.5分鐘以使核成團。在除去上清液后，將該小團用1ml TEA緩沖液進行稀釋，然后渦旋并超聲至通過目測該核均勻分散。
對于各時間點而言，將三等分試樣的核部分(各份為0.2ml)放置在1.3ml TEA中。通過加入10μl洋地黃皂甙溶液(在無菌PBS中，25mg/ml，Sigma，St.Louis，MO)、10μl MgCl2溶液(在無菌PBS中，57mg/ml)和50μl DNase 1溶液(在無菌PBS中，3mg/ml，Sigma)將DNA進行酶消解。在將其在22℃下消解2小時后，記錄阿霉素的熒光(在480nm下激發(fā)并在595nm下發(fā)射)。通過測定各種細胞器的酶標(biāo)記水平來檢查核片段的純度(Lopes de Menezes等人，J.Liposome Res.，9199(1999))。
結(jié)果如圖8A-8C所示。
實施例8脂質(zhì)體在BALB/c(同系繁殖的)小鼠中的血液消除
體重為17-22g的雌性BALB/c Cr Alt B/M小鼠得自University of Alberta Health Sciences Laboratory AnimalServices，通過尾靜脈注射將單劑量為0.2ml包含所包封[125I]TI的各種脂質(zhì)體制劑進行給藥(0.5μmol PL/小鼠)。脂質(zhì)體制劑僅包含DOPE、包含DOPE與3mol％、5mol％或10mol％mPEG-DSPE、包含DOPE/CHEMS以及包含DOPE/CHEMS與1.8mol％、3mol％或6mol％mPEG-DSPE；DOPE/1mol％PEG-DSPE與2mol％、4mol％或9mol％mPEG-S-S-DSPE，和DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE(6∶4∶0.06)與1mol％、2mol％或5mol％mPEG-S-S-DSPE。
在注射后所選擇的時間點，將小鼠用氟烷進行麻醉，然后通過頸部脫臼將其處死。通過心臟穿刺采集血樣(100μl)。在Beckman 8000γ計數(shù)器上對血樣、各種器官和尸體進行125I標(biāo)記計數(shù)。用PKAnalyst(MicroMath Scientific Software)對數(shù)據(jù)進行分析。
圖9A-9D表示了得自有代表性試驗的結(jié)果。數(shù)據(jù)點是一式三份分析的均值±S.D。
實施例9體內(nèi)給藥
將Namalwa細胞i.p.給藥于CB-17/ICR Tac SCID小鼠(Charles River Laboratories，Quebec，加拿大)以形成一種具有可再生的腫瘤獲得性的毒性更強的菌株(Lopes de Menezes等人，CancerRes.，583320(1998))。在無菌PBS中收獲Namalwa細胞并將其植入到SCID小鼠體內(nèi)。在移植過程之前和之后用臺盼藍染料通過染料排除來對細胞活力進行評估。
將6-8周大的SCID小鼠(5只小鼠/組)(Charles RiverLaboratories)i.v.植入Namalwa細胞(5×106)并在移植后24小時通過靜脈內(nèi)注射單劑量——3mg的游離阿霉素、被mPEG-DSPE或mPEG-S-S-DSPE所穩(wěn)定的阿霉素-SIL[抗-CD19]或負載有DXR的靶向DOPE/CHEMS制劑對其進行治療。治療方案如下治療組制劑1(1)鹽水(2)游離阿霉素(3)由DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.24∶0.06)所組成的脂質(zhì)體(4)由DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.24∶0.06)所組成的脂質(zhì)體(5)由HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(2∶1∶0.08∶0.02)所組成的脂質(zhì)體(＂DXR-SL＂)(6)由HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(2∶1∶0.08∶0.02)和58.4μg抗-CD19/μmol磷脂所組成的脂質(zhì)體(＂DXR-SIL＂)(7)由DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.24∶0.06)和33.3μg抗-CD19/11mol磷脂所組成的脂質(zhì)體(8)由DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE(6∶4∶0.2 4∶0.06)和31.2μg抗-CD19/mol磷脂所組成的脂質(zhì)體1所有的脂質(zhì)體制劑都包含阿霉素。
所有的治療組都接受3mg阿霉素/kg。常規(guī)地對小鼠的體重下降進行檢測，并且在它們變得垂死時對其實施安樂死；記錄存活時間。在任何實驗組中都沒有觀測到藥物毒性的跡象。所有的實驗動物都得到了Health Sciences Animal Policy and Welfare Committeeof the University of Alberta(Edmonton，Alberta，Canada)的批準(zhǔn)。測定平均存活時間(MST)和相對于對照小鼠而言壽命增加(ILS)百分比并且其如表2所示。
雖然已經(jīng)用特定實施方案對本發(fā)明進行了描述，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以進行各種變化和改變而不會脫離本發(fā)明是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種用于治療物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的脂質(zhì)體組合物，其包含由如下物質(zhì)所形成的脂質(zhì)體(i)pH-敏感的脂質(zhì)；(ii)1-20mole％的用親水性聚合物衍生了的脂質(zhì)，所說的聚合物在遇到存在的或誘發(fā)的生理條件時可有效釋放該親水性聚合物鏈的鍵并被連接到所說的脂質(zhì)上；(iii)靶向配體；和(iv)所捕獲的治療物質(zhì)；其中所說的組合物適于結(jié)合于靶細胞并當(dāng)與缺乏所說可釋放鍵和/或所說靶向配體的類似脂質(zhì)體所傳遞的細胞內(nèi)物質(zhì)濃度相比時，其可釋放所說的捕獲物質(zhì)以使得該物質(zhì)的細胞內(nèi)濃度增加至少2倍。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說的pH-敏感的脂質(zhì)是二油?；字Ｒ掖及?DOPE)。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說的脂質(zhì)體進一步包含穩(wěn)定化的組分。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所說的穩(wěn)定化組分是半琥珀酸膽甾醇酯(CHEMS)。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說的脂質(zhì)衍生的聚合物是用聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說的靶向配體是一種抗體或抗體片段。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所說的抗體片段選自抗-CD19、抗-CD20和抗-CD22。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說的可釋放的鍵包含一種二硫化物鍵。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所說的二硫化物鍵是二硫代芐基鍵。
10.一種用于增加脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)細胞毒性的組合物，其包含如權(quán)利要求2-8任一項所述的脂質(zhì)體，當(dāng)被給藥時所說的脂質(zhì)體可以完成(i)可釋放鍵的裂解，從而釋放所說的親水性聚合物鏈；(ii)所說配體與靶細胞的結(jié)合，其中所說的結(jié)合發(fā)生于所說的裂解之前或之后；和(iii)所說脂質(zhì)體被所說靶細胞的內(nèi)在化，從而使得所說物質(zhì)的細胞內(nèi)毒性比由缺乏所說可釋放鍵和/或所說靶向配體的相似脂質(zhì)體所傳遞物質(zhì)的細胞內(nèi)濃度至少高兩倍。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所說的可釋放鍵的裂解是由血液中天然存在的組分來完成的。
12.一種用于增加治療物質(zhì)在細胞核內(nèi)的積聚的如權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，當(dāng)被給藥時所說的脂質(zhì)體可以完成(i)可釋放鍵的裂解，從而釋放所說的親水性聚合物鏈；(ii)所說配體與靶細胞的結(jié)合，其中所說的結(jié)合發(fā)生于所說的裂解之前或之后；和(iii)所說脂質(zhì)體被所說靶細胞的內(nèi)在化從而當(dāng)與由缺乏所說可釋放鍵和/或所說靶向配體的相似脂質(zhì)體所傳遞物質(zhì)的細胞內(nèi)濃度相比時，可以獲得所說物質(zhì)在所說靶細胞核內(nèi)至少高兩倍的積聚。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所說可釋放鍵的裂解是由血液中天然存在的組分完成的。
全文摘要
描述了一種脂質(zhì)體組合物和用該組合物完成脂質(zhì)體所捕獲物質(zhì)的細胞內(nèi)傳遞的方法。該脂質(zhì)體包含pH敏感的脂質(zhì)并包括一種將該脂質(zhì)體直接靶向于靶細胞上的靶向配體。該脂質(zhì)體還包含一種穩(wěn)定化組分，如聚合物衍生的脂質(zhì)，其中該聚合物通過一種可釋放鍵被連接到該脂質(zhì)上。該脂質(zhì)體的給藥導(dǎo)致了用于向細胞內(nèi)傳遞所捕獲物質(zhì)的脂質(zhì)體的細胞內(nèi)在化和去穩(wěn)定化。
文檔編號A61K9/54GK1509166SQ02810185
公開日2004年6月30日 申請日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月26日
發(fā)明者S·扎利普斯基, T·M·阿倫, S·K·黃, S 扎利普斯基, 阿倫, 黃 申請人:阿爾扎公司