專利名稱：作為用于治療惡性腫瘤的藥劑的異種寡或/和多核糖核苷酸的制作方法
描述本發(fā)明涉及異種寡或/和多核糖核苷酸作為制劑用于治療惡性腫瘤。本發(fā)明還涉及異種寡或/和多核糖核苷酸在生產(chǎn)用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
在60年代末和70年代初，在移植研究范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)用異種異源核酸預(yù)處理的組織或弱抗原在多種不同的免疫學(xué)測(cè)試方法中顯示出基本上增加的抗滴度。這些結(jié)果用多種抗原在體外和體內(nèi)研究中進(jìn)行了進(jìn)一步的確認(rèn)?？墒?，沒(méi)有跡象表明異種來(lái)源的核酸尤其是寡或/和多核糖核苷酸可能適合于治療惡性腫瘤。
首先在USA，同時(shí)用指定的合成的多和寡核苷酸(尤其是核糖核苷酸)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，可是其由于體內(nèi)的高毒性而不再繼續(xù)研究。
因此本發(fā)明的目的是生產(chǎn)適合于治療惡性腫瘤的藥物。根據(jù)本發(fā)明，惡性腫瘤不包括惡性皮膚疾病。
本發(fā)明的目的是通過(guò)生產(chǎn)用于治療惡性腫瘤的藥物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該藥物含有異種寡或/和多核糖核苷酸作為活性物質(zhì)，并優(yōu)選地以它們與待治療腫瘤的細(xì)胞的共軛物形式。
根據(jù)本發(fā)明，“異種的”表示核糖核酸來(lái)源自與將用其治療的生物體不同的生物體，也就是這樣的寡或/和多核糖核苷酸，即它們不來(lái)源自藥物將施于的同一個(gè)生物體。根據(jù)本發(fā)明而使用的異種寡或/和多核糖核苷酸優(yōu)選地為那些來(lái)自動(dòng)物組織(例如牛組織，胎牛組織)、植物和單細(xì)胞生物體(優(yōu)選地來(lái)自酵母細(xì)胞，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的核糖核苷酸。優(yōu)選地使用在進(jìn)化上離待測(cè)試的生物體盡可能遠(yuǎn)的生物體的寡或/和多核糖核苷酸。因此，優(yōu)選地在用于人的藥物中使用來(lái)自動(dòng)物組織的RNA，或者特別優(yōu)選地使用來(lái)自植物或單細(xì)胞生物體如酵母的RNA。
根據(jù)本發(fā)明所使用的寡或/和多核糖核苷酸為無(wú)毒的和它們單獨(dú)時(shí)不是抗原。
可以有效地使用總RNA及其鹽和化合物的制備物。tRNA是特別優(yōu)選的。獲得可根據(jù)本發(fā)明而使用的RNA的特別優(yōu)選方法為苯酚提取，特別是此處標(biāo)明為方法I和II的方法。
此外，發(fā)現(xiàn)異種核糖核酸(RNA)聯(lián)合肽、多肽和蛋白質(zhì)可增加其抗原性?；谶@些觀察，不僅在體外和而且在體內(nèi)用異種RNA處理相關(guān)患者的腫瘤組織。優(yōu)選地在體外用異種RNA處理患者的腫瘤組織細(xì)胞，優(yōu)選地用tRNA。然后將該混合物全身性地施用于該患者。在淺層惡性腫瘤的情況下，RNA也可以合適的蓋侖氏制劑形式進(jìn)行局部應(yīng)用。
除了用本發(fā)明的異種寡或/和多核糖核苷酸治療人以外，也可以這種方式治療溫血?jiǎng)游锶珩R、牛、綿羊等等。
下面的實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1根據(jù)本發(fā)明可用的寡或/和多核糖核苷酸的獲得相關(guān)的文獻(xiàn)描述了大量的獲取核酸、核苷酸和核苷的方法，其對(duì)于任何具有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的人員來(lái)說(shuō)是已知的。這里優(yōu)選地應(yīng)用兩種具有小修改的方法，它們都基于苯酚處理，方法I用于獲得總RNA(Georgiev，G.P.和Mantieva，V.L.，Biochim.Biophys.acta 61，153(1962))，和方法II用于獲得tRNA(Bauer，S.等人，Biotechnology andBioengineering 15，1081(1973))。這兩個(gè)方法都適合于較大量的提取。
方法I將釀酒酵母于緩沖液(A)(0.001M EDTA，0.01M Tris-HCl緩沖液(pH5-6)，25％蔗糖，0.5％SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.3％脫氧膽酸鈉)中的15％懸浮液在韋林氏攪切器中并于10℃和3000rpm進(jìn)行勻漿3分鐘。將勻漿物與相同體積的溶液(B)(于緩沖液(A)中的80％重結(jié)晶的苯酚，0.1％8-羥基喹啉，1.2％焦碳酸二乙酯)混和，然后于60℃緩慢攪拌30分鐘。所有的緩沖溶液用去離子水制備，該去離子水預(yù)先用皂土進(jìn)行攪動(dòng)。然后將苯酚處理的勻漿物于室溫(大約20℃)用10,000g離心15分鐘。移去水相，并將酚和中間相丟棄。將水相與相同體積的溶液(B)和氯仿/異戊醇(96∶4)的1∶1混合物進(jìn)行混和，并按上面的描述進(jìn)行提取。水相用一半體積的乙醚提取3次以除去剩余的苯酚。將溶液調(diào)整至2％的乙酸鈉，并用2.5體積的無(wú)水乙醇沉淀RNA。
通過(guò)于0℃和5,000rpm離心來(lái)移除沉淀的RNA，并將其溶解在冰冷的0.01M Tris-HCl緩沖液(pH7.0)和0.001M MgCl2中。通過(guò)向溶液中添加電泳純的胰DNA酶(4μg/ml)并于22℃溫育3小時(shí)來(lái)降解可能存在的DNA。然后將蛋白質(zhì)剩余物即DNA酶和RNA酶用鏈霉蛋白酶(10μg/ml)于37℃消化3小時(shí)。在這期間，鏈霉蛋白酶也通過(guò)自身消化而被破壞。按照上面的描述用溶液(B)于60℃溫和地?cái)嚢?0分鐘來(lái)提取RNA溶液，通過(guò)離心來(lái)分離相，移除水相并用乙醚提取。在添加乙酸鈉(最終濃度為2％)之后，用2.5體積的乙醇沉淀RNA并通過(guò)離心將其移除。將沉淀物溶解在冷的2％乙酸鈉中，然后用2.5體積的乙醇沉淀，并讓其于-20℃留在醇混合物中過(guò)夜。然后通過(guò)離心移除沉淀，并用75％乙醇洗滌兩次，用無(wú)水乙醇洗滌兩次，和用乙醚洗滌兩次。在烘箱中干燥之后，可獲得疏松干燥的RNA，將其于室溫貯存在黑色玻璃容器中。
方法II該方法也適合于提取大量的酵母(千克的量)。
將給定重量的酵母在冷室中用4倍量的緩沖液(A)(見(jiàn)上面的方法I)進(jìn)行勻漿。向勻漿物中加入40％v/v的苯酚溶液(B)和5％w/v由去離子水構(gòu)成的冰塊，然后將混合物攪拌30分鐘。通過(guò)抽吸移除上清液，然后按方法I的描述用苯酚再處理兩次。將含水的上清液收集在一個(gè)容器中，該容器含有相當(dāng)于所收集的上清液一半體積的DEAE-纖維素懸浮液(大約10％w/v，Whatman DE-22)。DEAE懸浮液通過(guò)攪拌保持懸浮狀態(tài)30分鐘。然后讓DEAE沉積1小時(shí)。通過(guò)抽吸移除上清液。在這期間，將中間相和酚相用等分量的溶液(C)(83％去離子水，15％w/v冰塊，2％乙酸鎂濃縮物(0.5M乙酸鎂于0.25巰基乙醇中))再攪拌兩次各30分鐘，然后讓其分離70-80分鐘。將含水的上清液轉(zhuǎn)移至含有DEAE的容器中，然后再次攪拌并讓其沉積。通過(guò)抽吸移除上清液，再如上所述洗滌DEAE，首先用溶液C洗滌兩次，然后再用溶液(D)(2體積的乙酸鎂濃縮物，2體積的NaCl濃縮物(3.75M NaCl的水溶液)，0.2體積的Tris-HCl濃縮物(2.5M Tris-HCl水溶液，pH7.5，96體積的水))洗滌一次。
然后將DEAE-纖維素裝入在底部封閉的柱中。所有的進(jìn)一步步驟在4℃的冷室中進(jìn)行。柱用12倍柱容量的溶液(D)進(jìn)行洗滌，流速為1.4L/h，(只通過(guò)重力)。然后用溶液E(2體積的乙酸鎂濃縮物，0.2體積的Tris-HCl濃縮物，14體積的NaCl濃縮物和84體積的水，最終NaCl濃度為0.525M)洗脫tRNA，流速為3L/h。合并含有高于35A260nm單位/毫升的部分，并用1.5體積的乙醇沉淀。進(jìn)一步的程序與方法I一致。
可選擇地，最終的沉淀物可以溶解在水中和可以凍干。
該方法的一個(gè)變體為起始材料的通常的苯酚處理用異丙醇從上層相中沉淀出粗制的tRNA。在離心之后，用乙酸鈉緩沖液提取沉淀物并在DEAE-纖維素上進(jìn)行色譜法。用乙酸鈉/氯化鈉梯度進(jìn)行洗脫，這對(duì)于該方面有經(jīng)驗(yàn)的生物化學(xué)家來(lái)說(shuō)是已知的。通過(guò)商數(shù)測(cè)量來(lái)確定合適的部分(見(jiàn)上)，并將其合并。用乙醇沉淀tRNA，將沉淀物如上溶解，優(yōu)選地進(jìn)行凍干。
下面的測(cè)試是用于分析總RNA和tRNA的純度并用于表征它們蛋白質(zhì)根據(jù)Lowry，O.H.等人的方法(J.Biol.Chem.193，265(1951))和通過(guò)A260/A280≈2進(jìn)行測(cè)定，DNA根據(jù)Dische的方法(Mikrochemie 8，4(1930))進(jìn)行測(cè)定，總RNA根據(jù)Mejbaum的方法(Physiol.Chem.258，117(1939))進(jìn)行測(cè)定，tRNA和氨基酸結(jié)合的定量測(cè)定根據(jù)Sprinzl和Sternbach的方法(Methods inEnzymology 59，182(1979))來(lái)進(jìn)行，毒性根據(jù)M.Nldner的方法(個(gè)人通信)進(jìn)行測(cè)定，致熱原的缺乏在體外根據(jù)DAB 1997(LAL測(cè)試)來(lái)確定和在體內(nèi)根據(jù)Ph.Eur./DAB 1997來(lái)確定。
分析結(jié)果(總RNA和tRNA的特性，來(lái)自10個(gè)測(cè)試的平均值)吸收A260/A280≈1.94-2.0C、H、N分析C 32.67 32.42H 5.22 5.20N 2.29 2.00用多種總RNA和tRNA的相應(yīng)值。
UV和IR光譜UV和IR光譜相應(yīng)于生物物質(zhì)而變化，它們幾乎相同，但不同一。分子量來(lái)自酵母的總RNA和tRNA≈22,000-27,000道爾頓平均值，對(duì)于不同的制備物而變化；蛋白質(zhì) DNA(總含量)2.3％neg.釀酒酵母細(xì)胞的總RNA1.9％neg.釀酒酵母細(xì)胞的tRNA0.9％neg.牛來(lái)源的總RNA平均值，一般通常的質(zhì)量。經(jīng)提高的純度不會(huì)導(dǎo)致顯著改善的治療作用，而同時(shí)導(dǎo)致不相稱的較高成本。
對(duì)于tRNA的氨基酸結(jié)合，10個(gè)分析的平均值賴氨酸 69-85pmol/A260單位苯丙氨酸 41-55絲氨酸 39-50纈氨酸 77-90這些平均值在不同批次的酵母中于規(guī)定的范圍內(nèi)變化。
毒性小鼠中急性毒性測(cè)試動(dòng)物 NMRI小鼠，雄性，F(xiàn)a.Janvier，法國(guó)施用 以靜脈內(nèi)方式進(jìn)入尾靜脈觀察期間 24小時(shí)隨機(jī)樣品的數(shù)目n＝10，以最高濃度測(cè)試物質(zhì) a.?？俁NAb.來(lái)自醇酒酵母細(xì)胞的tRNA溶劑 0.9％NaCl的水(p.i.)溶液結(jié)果直至1g/kg/10ml i.v.的最大劑量，測(cè)試動(dòng)物在24小時(shí)的觀察期間內(nèi)絲毫沒(méi)有顯示出顯著的特征。
致熱原的缺乏A.如已描述的，總RNA和tRNA的致熱原含量根據(jù)DAB 1997(LAL測(cè)試)用對(duì)于內(nèi)毒素的體外測(cè)試來(lái)測(cè)定，和根據(jù)Ph.Eur./DAB 1997在兔上進(jìn)行測(cè)定。
1.總RNA內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)EC 5變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物-公布的靈敏度0.06 EU/ml-測(cè)得的靈敏度0.06 EU/ml測(cè)試溶液100mg RNA溶解在20ml水-LAL(0.5％)中結(jié)果用水-LAL作0.5％1∶5稀釋的測(cè)試溶液的內(nèi)毒素含量＜0.03EU/ml。
2.tRNA內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)EC 5變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物-公布的靈敏度0.06 EU/ml-測(cè)得的靈敏度0.06 EU/ml測(cè)試溶液100mg RNA溶解在20ml水-LAL(0.5％)中結(jié)果用水-LAL作0.5％1∶10稀釋的測(cè)試溶液的內(nèi)毒素含量＜0.03EU/ml。
B.根據(jù)DAB/Ph.Eub.(2000標(biāo)準(zhǔn))的致熱原缺乏的測(cè)試。
1.總RNA1％的測(cè)試物質(zhì)于無(wú)致熱原的水(p.i.)中的測(cè)試溶液劑量1.0ml/動(dòng)物動(dòng)物3只兔，根據(jù)DAB/Ph.Eub.(2000標(biāo)準(zhǔn))結(jié)果3只兔的溫度差異總和為1.05℃，因此不能檢測(cè)到致熱原。
2.tRNA1％的測(cè)試物質(zhì)于無(wú)致熱原的水(p.i.)中的測(cè)試溶液劑量 1.0ml/動(dòng)物動(dòng)物 2次各6只兔，根據(jù)DAB/Ph.Eub.(2000標(biāo)準(zhǔn))結(jié)果a.6只兔的溫度差異總和1.02℃b.6只兔的溫度差異總和1.06℃，不能檢測(cè)到致熱原。
實(shí)施例2本發(fā)明物質(zhì)的腫瘤效應(yīng)的證明10名患各種癌的患者已做過(guò)外科手術(shù)，他們的身體已被許多的轉(zhuǎn)移侵襲并不再對(duì)于化療作出響應(yīng)，治療他們的腫瘤學(xué)家判斷他們的生命只能持續(xù)幾個(gè)星期，用tRNA/腫瘤細(xì)胞共軛物(溫育大約30分鐘)全身性地治療這些患者，即將6×106腫瘤細(xì)胞與50-100mg tRNA，在14天內(nèi)進(jìn)行2次。
在這樣治療之后，一位女性患者還用溫和的化療進(jìn)行支持性治療幾個(gè)星期。在差不多2年之后，她死于無(wú)關(guān)的基本疾病。
所有其他經(jīng)治療的患者在無(wú)化療的情況下存活了＞1-2年，并且具有無(wú)副作用的良好生存質(zhì)量。
這些結(jié)果證明在患者中使用這種RNA是適當(dāng)?shù)?，特別是因?yàn)樗麄儾恍业夭辉賹?duì)于化療作出響應(yīng)，而且在延長(zhǎng)的生存期間絲毫沒(méi)有觀察到負(fù)作用或毒性效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)用于治療惡性腫瘤的藥物的方法，其特征在于，異種寡或/和多核糖核苷酸被轉(zhuǎn)化成可全身性施用的形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，異種寡或/和多核糖核苷酸以它們與待治療腫瘤的細(xì)胞的共軛物形式進(jìn)行使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于異種寡或/和多核糖核苷酸在體外與待治療腫瘤的細(xì)胞進(jìn)行溫育，并將獲得的經(jīng)溫育的材料作為活性物質(zhì)使用。
4.根據(jù)前述的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，加入生理上可接受的賦形劑、輔助劑、稀釋劑或/和添加劑。
5.根據(jù)前述的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，活性物質(zhì)包括來(lái)自動(dòng)物組織、植物或/和單細(xì)胞生物體的寡或/和多核糖核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，活性物質(zhì)包括來(lái)自酵母細(xì)胞的寡或/和多核糖核苷酸。
7.根據(jù)前述的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，活性物質(zhì)包括異種tRNA。
8.根據(jù)前述的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，活性物質(zhì)包括通過(guò)苯酚提取獲得的異種寡或/和多核糖核苷酸。
9.根據(jù)前述的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，異種寡或/和多核糖核苷酸來(lái)源于在進(jìn)化上遠(yuǎn)離待治療的生物體的生物體。
10.異種寡或/和多核糖核苷酸用于治療惡性腫瘤的用途。
11.異種寡或/和多核糖核苷酸以與待治療腫瘤的細(xì)胞的共軛物形式的用途，以實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求10的目的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的使用，其特征在于，使用已在體外與待治療的惡性腫瘤的細(xì)胞進(jìn)行溫育的異種寡或/和多核糖核苷酸。
13.治療惡性腫瘤的方法，其特征在于，將異種寡或/和多核糖核苷酸以50-100mg tRNA的有效量全身性地施用于需要如此治療的患者或動(dòng)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，tRNA以與待治療腫瘤的腫瘤細(xì)胞的共軛物形式進(jìn)行施用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，105-108腫瘤細(xì)胞與50-100mg tRNA在體外溫育的混合物一次或幾次全身性地進(jìn)行施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及異種寡或/和多核糖核苷酸作為制劑用于治療惡性腫瘤。本發(fā)明還涉及異種寡或/和多核糖核苷酸在生產(chǎn)用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1520304SQ02812860
公開(kāi)日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者B·梅斯里姆勒, B 梅斯里姆勒 申請(qǐng)人:I·P·L·國(guó)際制藥有限公司, I P L 國(guó)際制藥有限公司