專利名稱：包含聚亞烷基二醇的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物、其應(yīng)用以及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物-低聚物共軛物，并且更特定地涉及胰島素藥物-低聚物共軛物。
背景技術(shù)：
糖尿病——糖代謝的病癥，從古代起就是已知的。糖尿病是由于胰島素產(chǎn)量不足或?qū)σ葝u素的敏感性下降而導(dǎo)致的。胰島素分子由通過二硫化物鍵相連的氨基酸雙鏈所組成(mw 6,000)。胰島β細(xì)胞分泌一種被稱為胰島素原的單鏈胰島素前體。胰島素原的蛋白水解作用使得除去了四個堿性氨基酸(在胰島素原鏈上的號碼為31、32、64和65，其分別是Arg、Arg、Lys、Arg)和連接(“C”)多肽。在所得的雙鏈胰島素分子中，A鏈在氨基末端具有甘氨酸，并且B鏈在其氨基末端具有苯丙氨酸。
胰島素可以以單體、二聚物或由三個二聚物所形成的六聚體的形式存在。該六聚體與兩個Zn2+原子配位。生物活性存在于該單體中。雖然到目前為止幾乎僅用牛和豬胰島素來治療人的糖尿病，但是種屬間胰島素的許多差異是已知的。豬胰島素與人胰島素最相似，其與人胰島素的區(qū)別僅在于其在B-鏈C-末端上具有丙氨酸而不是蘇氨酸殘基。盡管有這種差異，大多數(shù)哺乳動物胰島素具有類似的特定活性。到目前為止，動物提取物提供了用于治療該疾病的所有胰島素。重組技術(shù)的出現(xiàn)使得可以大規(guī)模制造人胰島素(例如，HumulinTM胰島素，其可由Eli Lilly and Company，Indianapolis，IN商業(yè)獲得)。
胰島素對于體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞對葡萄糖的正常利用而言是必需的。對于患有糖尿病的患者而言，其利用葡萄糖的正常能力受到了抑制，從而使得血糖水平增加(高血糖)。隨著葡萄糖在血液內(nèi)的積聚，尿中排泄的糖水平過量(糖尿)。糖尿病的其它癥狀包括尿量和頻率增加、口渴、瘙氧、饑餓、體重下降、和虛弱。
有兩種類型的糖尿病。I型是胰島素-依賴性糖尿病，或IDDM。IDDM在以前被稱為青少年起病型糖尿病。在IDDM中，胰腺不分泌胰島素，胰島素必需由外部來源提供。雖然在一些嚴(yán)重情況中需要使用胰島素，但是II型成人起病型糖尿病通常可以通過飲食來進(jìn)行控制。
在二十世紀(jì)二十年代將胰島素分離出來之前，大多數(shù)患者在發(fā)病后短時間內(nèi)死亡。未進(jìn)行治療的糖尿病會導(dǎo)致酮癥，脂肪分解的產(chǎn)物——酮在血液中的積聚；之后會出現(xiàn)伴有惡心和嘔吐的酸中毒(酸在血液中的積聚)。隨著紊亂的糖代謝和脂肪代謝的毒性產(chǎn)物的增加，患者陷入糖尿病昏迷。
糖尿病的治療一般需要規(guī)律注射胰島素。當(dāng)Banting等人(“在糖尿病治療中的胰腺提取物，(Pancreatic Extracts in the Treatmentof Diabetes Mellitus)”Can.Med.Assoc.J.，12141-146(1922))表明從胰腺中獲得的活性提取物對糖尿病狗有療效時，胰島素才在1922年被用于糖尿病的治療。在同一年，用胰腺提取物對糖尿病患者進(jìn)行的治療產(chǎn)生了顯著的救生臨床改善。由于胰島素注射不便，所以已經(jīng)進(jìn)行了大量努力來改善胰島素給藥和生物同化。
已經(jīng)嘗試通過口服給藥來進(jìn)行胰島素的傳遞。在藥學(xué)和醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中廣泛記錄了與通過胰島素口服給藥來使糖尿病患者血糖正常時有關(guān)的問題。在GI道中的消化酶使胰島素迅速降解，產(chǎn)生生物學(xué)無效的分解產(chǎn)物。例如，在胃中，口服給藥的胰島素經(jīng)受了酶的蛋白水解和酸降解。小腸中的幸存者被進(jìn)一步蛋白水解。在該腔中，胰島素受到了包括胃酶和胰酶、外肽酶和內(nèi)肽酶、以及刷狀緣肽酶在內(nèi)的酶的干擾。即使胰島素幸運(yùn)地逃過了這種酶攻擊，胰島素在體內(nèi)達(dá)到其受體前所必須穿越的生物屏障也可能限制胰島素的口服給藥。例如，胰島素可能具有限制其通過脈管到達(dá)血液能力的低的膜滲透性。
已經(jīng)將藥學(xué)活性的多肽如胰島素與多分散的聚乙二醇混合物或多分散的包含聚乙二醇的聚合物進(jìn)行配合來提供多分散的藥物-低聚物共軛物混合物。例如，US 4,179,337，Davis等人提出了與各種聚乙二醇如由Union Carbide提供的MPEG-1900和MPEG-5000共軛的多肽如胰島素。
US 5,567,422，Greenwald提出了與聚乙二醇如m-PEG-OH(UnionCarbide)共軛的生理活性的親核試劑，其具有5,000道爾頓的數(shù)均分子量。
US 5,359,030，Ekwuribe提出了與聚乙二醇改性的糖脂聚合物和聚乙二醇改性的脂肪酸聚合物共軛的多肽。由各組合所產(chǎn)生的聚合物具有約500至約10,000道爾頓的數(shù)均分子量。
聚乙二醇一般是通過堿催化的環(huán)氧乙烷的開環(huán)聚合來進(jìn)行制備的。該反應(yīng)是通過在用氫氧化鉀作為催化劑的情況下向乙二醇中加入環(huán)氧乙烷來開始的。這種過程產(chǎn)生一種多分散的具有給定范圍的數(shù)均分子量的聚乙二醇的混合物。例如，由Milwaukee提供的PEG產(chǎn)品，Wisconsin是以多分散混合物的形式被提供的，如PEG 400(Mn380-420)；PEG 1,000(Mn 950-1,050)；PEG 1,500(Mn 1,400-1,600)；和PEG 2,000(Mn 1,900-2,200)。
希望提供非多分散的其中該低聚物包含聚乙二醇的胰島素-低聚物共軛物的混合物。
本發(fā)明的概述已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明實施方案的非多分散的包含聚乙二醇的胰島素-低聚物共軛物的混合物在體內(nèi)表現(xiàn)出比具有相同數(shù)均分子量的類似共軛物的多分散混合物的活性更高的活性。這種增加的活性可以滿足較低劑量的需要。此外，本發(fā)明實施方案包含聚乙二醇的胰島素-低聚物共軛物的非多分散的混合物在腸消化的體外模型中一般比類似共軛物的多分散混合物更有效。此外，本發(fā)明實施方案包含聚乙二醇的胰島素-低聚物共軛物的非多分散的混合物在產(chǎn)生個體間差異方面一般也低于類似共軛物的多分散的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，提供了共軛物基本單分散的混合物，其中所說的共軛物各自包含與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物。該聚乙二醇部分優(yōu)選地具有至少兩個、三個或四個聚乙二醇亞基，更優(yōu)選地具有至少七個聚乙二醇亞基。該低聚物優(yōu)選地進(jìn)一步包含一種親脂性部分。該胰島素藥物優(yōu)選地是人胰島素。該低聚物優(yōu)選地與人胰島素的LysB29共價偶合。該共軛物優(yōu)選地具有親油親水平衡從而使得該共軛物是水溶性的并能穿透生物膜。該混合物優(yōu)選地是一種單分散的混合物并且最優(yōu)選地一種純單分散的混合物。在一些實施方案中，該低聚物包含通過一種不可水解的鍵與胰島素共價偶合的第一聚乙二醇部分和通過一種可水解的鍵與該第一聚乙二醇部分偶合的第二聚乙二醇部分。
根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的基本單分散混合物，其中各共軛物包括在人胰島素的LysB29上與一種低聚物的羧酸部分共價偶合的人胰島素，其中所說的低聚物包含一種在該羧酸部分的遠(yuǎn)末端上與具有至少7個聚乙二醇亞基的甲基結(jié)尾的聚乙二醇部分共價偶合的己酸。
當(dāng)與多分散混合物的這些性質(zhì)相比時，本發(fā)明這些實施方案基本單分散的共軛物混合物具有得到了改善的性質(zhì)。在一個實施方案中，提供了一種基本單分散的共軛物混合物，其中各共軛物包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且該聚合物具有比與該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。
在另外的實施方案中，提供了一種基本單分散的共軛物混合物，其中各共軛物包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且該混合物具有比與該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體外活性高的體外活性。
還是在另外的實施方案中，提供了一種基本單分散的共軛物混合物，其中各共軛物包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且當(dāng)和與該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比時，該聚合物具有增強(qiáng)的對抗糜蛋白酶降解的能力。
還是在另外的實施方案中，提供了一種基本單分散的共軛物混合物，其中各共軛物包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且該混合物具有比與該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的個體間差異低的個體間差異。
本發(fā)明實施方案基本單分散的共軛物混合物優(yōu)選地具有兩種或多種上述性質(zhì)。更優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案基本單分散的共軛物混合物具有三種或多種上述性質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案基本單分散的共軛物混合物具有所有的上述四種性質(zhì)。
還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的混合物，其中各共軛物包括一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且該混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布。
還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的混合物，其中各共軛物包括一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且該混合物具有高于10,000的分散系數(shù)(DC)，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣品中不同分子的數(shù)目；Ni是樣品中ith分子的數(shù)目；和Mi是ith分子的質(zhì)量。
根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的混合物，其中各共軛物包括一種與低聚物偶合的胰島素藥物并具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)。
還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的混合物，其中各共軛物是相同的并如下式所示胰島素藥物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p(A)其中B是一種結(jié)合部分；L是一種銜接物部分；G、G′和G″各自是一種所選擇的間隔部分；R是一種親脂性部分并且R′是一種聚亞烷基二醇部分，或R′是親脂性部分并且R是聚亞烷基二醇部分；T是一種終止部分；j、k、m和n各自是0或1；和p是一個1至該胰島素藥物上的親核性殘基數(shù)目之間的整數(shù)。
還提供了包含本發(fā)明共軛物混合物的藥物組合物以及通過使用有效量的該類藥物組合物對需要進(jìn)行該類治療的個體的胰島素不足進(jìn)行治療的方法。此外，還提供了合成該類共軛物混合物的方法。
與常規(guī)的多分散的胰島素-低聚物共軛物混合物系相比，本發(fā)明實施方案的胰島素-低聚物共軛物混合物可以提供增加的體內(nèi)活性和/或降低的個體間差異和/或降低的糜蛋白酶降解性。
附圖簡要說明

圖1說明了用于合成本發(fā)明實施方案包含聚乙二醇部分和脂肪酸部分的活性聚合物混合物的一般流程圖；圖2說明了用于合成本發(fā)明實施方案的mPEG混合物的流程圖；圖3說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性mPEG7-己基低聚物混合物的流程圖；圖4說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性mPEG7-辛基低聚物混合物的流程圖；圖5說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性mPEG-癸基低聚物混合物的流程圖；圖6說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性硬脂酸酯-PEG6低聚物混合物的流程圖；圖7說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性硬脂酸酯-PEG8低聚物混合物的流程圖；圖8說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性PEG3低聚物混合物的流程圖；圖9說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性棕櫚酸酯-PEG3低聚物混合物的流程圖；圖10說明了用于合成本發(fā)明實施方案活性PEG6低聚物混合物的流程圖；圖11說明了用于合成本發(fā)明實施方案各種丙二醇單體的流程圖；圖12說明了用于合成本發(fā)明實施方案各種丙二醇聚合物的流程圖；圖13說明了用于合成本發(fā)明實施方案各種丙二醇聚合物的流程圖；
圖14說明了用為化合物活性提供了一種指示的CytosensorMicrophysiometer所得的結(jié)果的比較，將本發(fā)明實施方案的胰島素-低聚物共軛物混合物與僅僅是為了進(jìn)行比較而不是本發(fā)明組成部分的多分散的共軛物混合物和胰島素進(jìn)行了比較；圖15說明了本發(fā)明實施方案的胰島素-低聚物共軛物的糜蛋白酶降解與僅僅是為了進(jìn)行比較而不是本發(fā)明組成部分的常規(guī)多分散的胰島素-低聚物共軛物混合物的糜蛋白酶降解的比較；圖16說明了本發(fā)明實施方案的mPEG7-己基-胰島素，單共軛物混合物對禁食的比格爾犬血漿葡萄糖的影響；圖17說明了用于進(jìn)行比較的不是本發(fā)明的組成部分的多分散的mPEG7avg-己基-胰島素，單共軛物混合物對禁食比爾格犬血漿葡萄糖的影響；圖18說明了被給藥于禁食比格爾犬的本發(fā)明實施方案的mPEG4-己基-胰島素單共軛物混合物的個體間差異；圖19說明了被給藥于禁食比格爾犬的本發(fā)明實施方案的mPEG7-己基-胰島素單共軛物混合物的個體間差異；圖20說明了被給藥于禁食比格爾犬的本發(fā)明實施方案的mPEG10-己基-胰島素單共軛物混合物的個體間差異；和圖21說明了被給藥于禁食比格爾犬的用于進(jìn)行比較的不是本發(fā)明組成部分的多分散的mPEG7avg-己基-胰島素單共軛物混合物的個體間差異。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明現(xiàn)在將對本發(fā)明在這里所描述的優(yōu)選實施方案進(jìn)行說明。但是，應(yīng)當(dāng)意識到的是這些實施方案是為了對本發(fā)明進(jìn)行說明，而不能被認(rèn)為是要對權(quán)利要求所確定的本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。
這里所用的術(shù)語“非多分散的”是用來描述一種具有與US4,179,337，Davis等人；US 5,567,422，Greenwald；US 5,405,877，Greenwald等人；和US 5,359,030，Ekwuribe所描述的多分散混合物相對的分散性的化合物的混合物。
這里所用的術(shù)語“基本單分散的”是用來描述一種其中在所說的混合物中至少約95％的化合物具有相同分子量的化合物混合物。
這里所用的術(shù)語“單分散的”是用來描述一種其中在所說的混合物中約100％的化合物具有相同分子量的化合物混合物。
這里所用的術(shù)語“基本純單分散的”是用來描述一種其中在所說的混合物中至少約95％的化合物具有相同分子量并且具有相同分子結(jié)構(gòu)的化合物混合物。因此，基本純單分散的混合物是一種基本單分散的混合物，但是基本單分散的混合物卻不一定是一種基本純單分散的混合物。
這里所用的術(shù)語“純單分散的”是用來描述一種其中在所說的混合物中約100％的化合物具有相同的分子量并具有相同的分子結(jié)構(gòu)的化合物混合物。因此，純單分散的混合物是一種單分散的混合物，但是單分散的混合物卻不一定是一種純單分散的混合物。
這里所用的術(shù)語“重均分子量”被定義為在混合物中所給出分子的重量分?jǐn)?shù)乘以混合物中各分子分子重量的結(jié)果的和?！爸鼐肿恿俊庇梅朚w來進(jìn)行表示。
這里所用的術(shù)語“數(shù)均分子量”被定義為混合物的總重量除以該混合物的分子數(shù)，其用符號Mn來進(jìn)行表示。
這里所用的術(shù)語“分散系數(shù)”(DC)是用下式來進(jìn)行定義的DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣品中不同分子的數(shù)目；Ni是樣品中第i個分子的數(shù)目；和Mi是第i個分子的質(zhì)量。
這里所用的術(shù)語“個體內(nèi)差異”指的是當(dāng)該個體在不同的時間使用相同劑量的藥物或藥物組合物時在相同個體間發(fā)生的活性差異。
這里所用的術(shù)語“個體間差異”指的是當(dāng)各個體使用相同劑量的藥物或藥物組合物時在兩個或多個個體之間活性的差異。
這里所用的術(shù)語“胰島素藥物”指的是具有胰島素生物活性的全部或一部分的藥物。
這里所用的術(shù)語“胰島素”指的是人胰島素、牛胰島素、豬胰島素或鯨胰島素，其是由天然、合成或基因工程來源提供的。
這里所用的術(shù)語“胰島素類似物”指的是其中一個或多個氨基酸已經(jīng)被替換但保留了胰島素的一些或全部活性的胰島素。該類似物是通過標(biāo)明替換氨基酸以及其后用上標(biāo)表示的胰島素替換位來進(jìn)行描述的。例如，“ProB29胰島素，人”指的是通常出現(xiàn)在人胰島素分子B29位上的賴氨酸已經(jīng)被脯氨酸所替換。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣，胰島素類似物可以通過各種方法來獲得。例如，胰島素結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可被其它氨基酸替換，而其與如，例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子結(jié)合部位之類的結(jié)構(gòu)進(jìn)行相互結(jié)合的能力不會產(chǎn)生可察覺的降低。因為胰島素相互作用的能力和性質(zhì)確定了其生物學(xué)功能活性，所以可以在氨基酸序列中進(jìn)行某些氨基酸序列的替換并仍然保留具有相似性質(zhì)的多肽。
在進(jìn)行該類替換時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。在現(xiàn)有技術(shù)中通常理解親水性氨基酸指數(shù)在使多肽具有相互作用的生物學(xué)功能中的重要性。公認(rèn)該氨基酸的相對親水性有助于所得多肽的二級結(jié)構(gòu)，其又確定了蛋白質(zhì)與其它分子例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等等的相互作用。已經(jīng)根據(jù)其疏水性和電荷特性而指定了各氨基酸的親水指數(shù)，各氨基酸的親水指數(shù)如下異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣，某些氨基酸可以被具有相似親水性指數(shù)或得分的氨基酸所替換并仍然能產(chǎn)生具有相似生物學(xué)活性的多肽，即，仍然獲得生物學(xué)功能相等的多肽。在進(jìn)行該類變化時，優(yōu)選其親水性指數(shù)在彼此±2之內(nèi)的氨基酸的替換，特別優(yōu)選這些在彼此±1之內(nèi)的這些物質(zhì)的替換，并且更特別優(yōu)選在彼此±0.5之內(nèi)的這些物質(zhì)的替換。
在現(xiàn)有技術(shù)中還知道可以在親水性基礎(chǔ)上有效進(jìn)行相似氨基酸的取代。US 4,554,101提出，在被其相鄰氨基酸的親水性所控制時，蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。正如在US4,554,101中所詳細(xì)描述的那樣，給氨基酸殘基指定了下面的親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(±3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(seine)(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣，可以將氨基酸替換成另一種具有相似親水性值的氨基酸并仍然可獲得生物等效，并且特別是免疫學(xué)等效的多肽。在該類變化中，優(yōu)選其親水性值在彼此±2之內(nèi)的氨基酸的替換，并且特別優(yōu)選在彼此±1之間的這些替換，并且更特別優(yōu)選在彼此±0.5之內(nèi)的這些替換。
正如上面所概括的那樣，氨基酸替換一般是以氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性為基礎(chǔ)的，例如以其疏水性、親水性、電荷、大小等等的相似性為基礎(chǔ)?？紤]各種上述特性進(jìn)行的實例性的替換(即，可以相互替換而不會顯著改變該多肽的生物學(xué)活性的氨基酸)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，并且包括，例如精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
這里所用的術(shù)語“胰島素片段”指的是在胰島素中發(fā)現(xiàn)的保留了該胰島素的一些或全部活性的氨基酸序列的片段。胰島素片段是通過表明在氨基酸序列上的位置(位置們)，然后在對該氨基酸進(jìn)行描述來進(jìn)行表示的。例如，“B25-B30人胰島素”片段是相應(yīng)于在人胰島素氨基酸序列中B25、B26、B27、B28、B29和B30位上的六個氨基酸序列。
這里所用的術(shù)語“胰島素片段類似物”指的是在該胰島素分子中發(fā)現(xiàn)的胰島素序列的片段，其中在該片段中的一個或多個氨基酸已經(jīng)被替換而同時保留了胰島素的一些或全部活性。
這里所用的術(shù)語“PEG”指的是直鏈或支鏈的聚乙二醇聚合物，并且包聚乙二醇(mPEG)的單甲醚。術(shù)語“PEG亞基”和聚乙二醇亞基指的是單個的聚乙二醇單元，即，-(CH2CH2O)-。
這里所用的術(shù)語“親脂性”指的是能溶解于脂類物質(zhì)的能力和/或滲透到生物膜、與生物膜相互作用和/或穿越生物膜的能力，“親脂性部分”或“親脂體”指的是為親脂性的部分和/或當(dāng)與其它化學(xué)部分相連時增加了該類化學(xué)實體的親脂性的部分。親脂性部分的實例非限制性地包括烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、膽甾烯基、金剛烷基(adamantly)等等。
這里所用的術(shù)語“低級烷基”指的是具有一至五個碳原子的被取代或未被取代的烷基部分。
這里所用的術(shù)語“高級烷基”指的是具有六個或更多個碳原子的被取代或未被取代的烷基部分。
在本發(fā)明的實施方案中，提供了一種基本單分散的胰島素-低聚物共軛物的混合物。優(yōu)選地，該混合物中至少約96、97、98或99％的共軛物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，該混合物是一種單分散的混合物。更優(yōu)選地，該混合物是一種基本純單分散的混合物。還更優(yōu)選地，該混合物中至少約96、97、98或99％的共軛物具有相同的分子量并具有相同的分子結(jié)構(gòu)。最優(yōu)選地，該混合物是一種純單分散的混合物。
該胰島素藥物優(yōu)選地是胰島素。更優(yōu)選地，該胰島素藥物是人胰島素。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是，該胰島素藥物可以選自對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言公知的各種胰島素藥物，包括，例如，胰島素原、胰島素類似物、胰島素片段、和胰島素片段類似物。胰島素類似物非限制性地包括AspB28人胰島素、LysB28人胰島素、LeuB28人胰島素、ValB28人胰島素、AlaB28人胰島素、AspB28ProB29人胰島素、LysB28ProB29人胰島素、LeuB28ProB29人胰島素、ValB28ProB29人胰島素、AlaB28ProB29人胰島素、以及用上述替換準(zhǔn)則所提供的類似物。胰島素片段非限制性地包括B22-B30人胰島素、B23-B30人胰島素、B25-B30人胰島素、B26-B30人胰島素、B27-B30人胰島素、B29-B30人胰島素、人胰島素的A鏈、和人胰島素的B鏈。胰島素片段類似物可以通過在胰島素片段中如上所述的替換一個或多個氨基酸來獲得。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可以是包含聚乙二醇部分的各種低聚物。優(yōu)選地，該低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。更優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基并且，最優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞基。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可以包含一個或多個其它部分，所說的其它部分非限制性地包括另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、銜接物部分、和終端部分。在該低聚物中的各部分可以通過可水解或不可水解的鍵彼此共價結(jié)合。
該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(即，除該聚乙二醇部分外的部分)，其非限制性地包括，糖類、聚環(huán)氧烷、和多元胺/PEG共聚物。因為聚乙二醇是一種聚環(huán)氧烷，所以該另外的親水性部分也可以是一種聚乙二醇部分。如果毗連的聚乙二醇部分是通過醚鍵相結(jié)合的，則將認(rèn)為其是相同的部分。例如，-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一種具有六個聚乙二醇亞基的單一的聚乙二醇部分。如果這種部分是該低聚物中唯一的親水性部分，則該低聚物將不包含另外的親水性部分。如果該毗連的聚乙二醇部分不是通過醚鍵相連的，則認(rèn)為該部分是不同的部分。例如， 是一種具有四個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞基的另外的親水性部分。優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案的低聚物包含一種聚乙二醇部分并且不包含另外的親水性部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分。該親脂性部分優(yōu)選地是一種飽和或不飽和的直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)該親脂性部分是一種烷基部分時，其優(yōu)選地是一種具有1至28個碳原子的直鏈的飽和或不飽和烷基部分。更優(yōu)選地，該烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)該親脂性部分是一種脂肪酸部分時，其優(yōu)選地是一種具有2至18個碳原子的直鏈的飽和或不飽和的天然脂肪酸部分。更優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分。例如，間隔部分可以被用來將親水性部分與親脂性部分分離開、將親脂性部分或親水性部分與胰島素藥物分離開、將第一親水性或親脂性部分與第二親水性或親脂性部分分離開、或?qū)⒂H水性部分或親脂性部分與銜接物部分分離開。間隔部分優(yōu)選地選自糖、膽固醇和甘油部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個用于將該低聚物與胰島素藥物連接起來的銜接物部分。該銜接物部分優(yōu)選地選自烷基和脂肪酸部分。
該低聚物可進(jìn)一步包含位于未與胰島素藥物進(jìn)行連接的低聚物的一個或多個末端上的一個或多個終端部分。該終端部分優(yōu)選地是一種烷基或烷氧基部分，并且更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，該終端部分是甲基或甲氧基。雖然該終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，當(dāng)應(yīng)當(dāng)清楚的是，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該終端部分可以是各種部分，其非限制性地包括，糖、膽固醇、醇類、或脂肪酸類。
該低聚物優(yōu)選地與胰島素藥物共價結(jié)合。在一些實施方案中，用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)將該胰島素藥物與該低聚物進(jìn)行連接?？伤獾倪B接可以提供一種作為前體藥物的胰島素藥物-低聚物共軛物。在某些情況中，例如在該胰島素藥物-低聚物共軛物沒有活性的情況中(即，該共軛物缺乏通過胰島素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的連接可以提供一種緩釋放或控制釋放作用，在給定時間內(nèi)以一種或多種低聚物形式進(jìn)行給藥的該胰島素藥物從其各自的胰島素藥物-低聚物共軛物上裂解下來從而提供了活性藥物。在其它實施方案中，用一種不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將該胰島素藥物與該低聚物進(jìn)行連接。當(dāng)需要使該胰島素藥物-低聚物共軛物在血液中長時間循環(huán)，優(yōu)選至少循環(huán)2小時時，可優(yōu)選地使用不可水解的鍵。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，當(dāng)該低聚物與胰島素藥物共價結(jié)合時，該低聚物進(jìn)一步包含一個或多個用來將該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合的結(jié)合部分。結(jié)合部分優(yōu)選地選自共價鍵(共價鍵們)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分。該低聚物一種以上的部分可以與該胰島素藥物共價結(jié)合。
雖然該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合，但是應(yīng)當(dāng)清楚的是，該低聚物可以不與該胰島素藥物共價結(jié)合地形成一種非共價結(jié)合的共軛的胰島素藥物-低聚物復(fù)合體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，非共價結(jié)合非限制性地包括氫鍵、離子鍵、Van der Waals鍵、或膠束或脂質(zhì)體包封。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以適宜地對低聚物進(jìn)行構(gòu)造、改性和/或適宜的功能化從而使其具有以所選擇的方式非共價結(jié)合的能力(例如，使其具有能形成氫鍵的能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用各種化合物對低聚物進(jìn)行衍生化，其中所說的各種化合物非限制性地包括，氨基酸類、寡肽類、肽類、膽汁酸類、膽汁酸衍生物類、脂肪酸類、脂肪酸衍生物類、水楊酸類、水楊酸衍生物類、氨基水楊酸類、和氨基水楊酸衍生物類。所得的低聚物可與藥物分子、藥用產(chǎn)品、和/或藥用賦形劑非共價地結(jié)合(復(fù)合體)。所得的復(fù)合體優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用胺和/或烷基胺類對低聚物進(jìn)行衍生化。在適宜的酸性條件下，所得的低聚物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑非共價地形成共軛的復(fù)合體。得自該類絡(luò)合作用的產(chǎn)品優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。
一種以上的低聚物(即，許多低聚物)可以與胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合。這些低聚物優(yōu)選地是相同的。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是這些低聚物可以彼此不同，或者這些低聚物中的一些可以相同而一些可以不同。當(dāng)有一些低聚物與胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合時，優(yōu)選地用可水解的鍵將一個或多個低聚物和該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合并用不可水解的鍵將一個或多個低聚物和該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合?；蛘?，將這些低聚物與該胰島素藥物結(jié)合起來的所有鍵都是可水解的，但是各鍵具有不同的可水解度，例如一個或多個低聚物在體內(nèi)通過水解迅速從該胰島素藥物上除去而一個或多個低聚物在體內(nèi)通過水解緩慢地從該胰島素藥物上除去。
該低聚物可以與該胰島素藥物在該胰島素藥物的各種親核殘基上進(jìn)行結(jié)合，其非限制性地包括，親核的羥基官能基和/或氨基官能基。當(dāng)該胰島素藥物是多肽時，可以發(fā)現(xiàn)親核的羥基官能基，例如，可在絲氨酸和/或酪氨酸殘基上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)，并可以發(fā)現(xiàn)親核的氨基官能基，例如，可以在組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或在該多肽的一個或多個N-末端上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)。當(dāng)該低聚物與一個或多個胰島素多肽的N-末端相結(jié)合時，該連接優(yōu)選地形成一種仲胺。當(dāng)該胰島素藥物是人胰島素時，例如，該低聚物可以與該胰島素的氨基官能度相連，其中所說的氨基官能團(tuán)包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、以及LysB29的氨基官能度。當(dāng)一個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與LysB29的氨基官能度相結(jié)合。當(dāng)兩個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相結(jié)合。雖然可以有一種以上的低聚物與人胰島素相連，但是觀察到單共軛的人胰島素活性較高(改善的葡萄糖降低能力)。
本發(fā)明基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物可以用各種方法來合成。例如，由羧酸和聚乙二醇所組成的基本單分散的低聚物混合物可以通過將基本單分散的羧酸混合物與基本單分散的聚乙二醇混合物在足以提供一種單分散的低聚物混合物的情況下進(jìn)行接觸來進(jìn)行合成。然后，將該基本單分散混合物的低聚物進(jìn)行活化以使其能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)從而提供一種胰島素藥物-低聚物共軛物。圖3說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的一個實施方案并在下面的實施例11-18中進(jìn)行了描述。圖4說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例19-24中進(jìn)行了描述。圖5也說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例25-29中進(jìn)行了描述。圖6也說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例30-31中進(jìn)行了描述。圖7說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例32-37中進(jìn)行了描述。圖8也說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例38中進(jìn)行了描述。圖9也說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例39中進(jìn)行了描述。圖10說明了用于提供基本單分散的活性聚合物混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例40中進(jìn)行了描述。
可以將該基本單分散的活性低聚物的混合物與基本單分散的胰島素藥物的混合物在足以提供胰島素藥物-低聚物共軛物的條件下進(jìn)行反應(yīng)。在下面的實施例41中對一種優(yōu)選的合成進(jìn)行了描述。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以對該反應(yīng)條件進(jìn)行控制(例如，所選擇的摩爾比例、溶劑混合物和/或pH)以使得得自該基本單分散的活性低聚物混合和基本單分散的胰島素藥物混合物的反應(yīng)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物是一種基本單分散的混合物。例如，通過將反應(yīng)溶液的pH維持在低于賴氨酸pKa的水平上就可以抑制在賴氨酸氨基官能度上的結(jié)合?；蛘?，可以使用例如下面實施例50中所描述的HPLC將該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物分離并離析出來從而得到基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物，所說的共軛物例如單-、二-、或三-共軛物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)對特定分離出來的共軛物的共軛度(例如所分離出來的分子是單、二-、還是三-共軛物)進(jìn)行測定和/或驗證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，質(zhì)譜。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)對特定共軛物結(jié)構(gòu)(例如，該低聚物是在人胰島素單共軛物的GlyA1、PheB1還是LysB29上)進(jìn)行測定和/或驗證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括序列分析、肽譜圖、選擇性酶裂解、和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以阻斷位于胰島素藥物上的一個或多個反應(yīng)部位，例如可以通過將該胰島素藥物與適宜的試劑進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行阻斷，所說的適宜試劑如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)。當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽并且希望形成一種在該多肽的N-末端上具有低聚物的不飽和共軛物(即，其中不是所有的親核殘基都被共軛)時可優(yōu)選這種方法。在該類阻斷后，可以將該基本單分散的進(jìn)行了阻斷的胰島素藥物的混合物與基本單分散的活性低聚物的混合物進(jìn)行反應(yīng)從而得到具有與一個或多個親核性殘基相結(jié)合的低聚物(低聚物們)和與其它親核性殘基相結(jié)合的阻斷部分的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，在該共軛反應(yīng)后，可以將該胰島素藥物-低聚物共軛物去阻斷。如果需要的話，然后可以將該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物如上所述的那樣進(jìn)行分離從而得到一種基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物?；蛘呖梢栽谌プ钄嘀皩υ撘葝u素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離。
根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種基本單分散的共軛物混合物，其中各共軛物包括在該胰島素的LysB29上與低聚物的羧酸部分共價結(jié)合的人胰島素，其中所說的低聚物包含在該羧酸部分遠(yuǎn)側(cè)末端上與具有至少7個聚乙二醇亞基的甲基結(jié)尾的聚乙二醇部分共價結(jié)合的己酸。在該基本單分散的混合物中的各共軛物優(yōu)選地由在胰島素的LysB29上與低聚物的羧酸部分共價結(jié)合的人胰島素所組成，其中所說的低聚物由在羧酸部分的遠(yuǎn)側(cè)末端上與具有7個聚乙二醇亞基的甲基結(jié)尾的聚乙二醇部分共價結(jié)合的己酸所組成。
當(dāng)與多分散混合物的這些性質(zhì)相比時，本發(fā)明這些實施方案基本單分散的共軛物混合物具有改善的性質(zhì)。例如，基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物優(yōu)選地具有比和該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對該基本單分散的混合物的數(shù)均分子量和該多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，其中所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法如凝膠滲透色譜法，例如在H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)中所述的方法。
作為另一個實例，基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體外活性高的體外活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對該基本單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對特定混合物的體外活性進(jìn)行測量。優(yōu)選地，體外活性是用一種可以從MolecularDevices Corporation of Sunnyvale，加利福尼亞，商業(yè)獲得的CytosensorMicrophysiometer來測量的。作為向transwell中所培養(yǎng)的細(xì)胞中加入的藥物的響應(yīng)，Microphysiometer監(jiān)測器以細(xì)胞外酸化的速率發(fā)生微小的改變。這種響應(yīng)與所研究分子的活性成比例。優(yōu)選地，該基本單分散的混合物的體外活性比該多分散混合物的體外活性高至少約5％。更優(yōu)選地，該基本單分散的混合物的體外活性比該多分散混合物的體外活性高至少約10％。
作為另一個實例，和與該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物對于糜蛋白酶降解的抵抗力相比，基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有增強(qiáng)的糜蛋白酶降解抵抗力。對糜蛋白酶的抵抗力相當(dāng)于用與下面實施例52所概述的方法將試驗分子用糜蛋白酶進(jìn)行消解時剩余的百分比。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對該基本單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。優(yōu)選地，該基本單分散的混合物對于糜蛋白酶降解的抵抗力比該多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約10％。更優(yōu)選地，該基本單分散的混合物對于糜蛋白酶降解的抵抗力比該多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約20％。
還是作為另一個實例，基本單分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比和該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異低的個體間差異。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對該基本單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對個體間差異進(jìn)行測量。該個體間差異優(yōu)選地計算如下。測定各個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(即在劑量響應(yīng)曲線和基準(zhǔn)值之間的面積)。通過將各個體的AUCs相加求和并用該和除以個體數(shù)來測定所有個體的平均AUC。然后測定個體的AUC和平均AUC之間差異的絕對值。然后將所得差異的絕對值求和得到表示個體間差異的值。較低的值表示較低的個體間差異，較高的值表示較高的個體間差異。優(yōu)選地，該基本單分散的混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約10％。更優(yōu)選地，該基本分散的混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約25％。
本發(fā)明實施方案基本單分散的共軛物混合物優(yōu)選地具有兩種或多種上述性質(zhì)。更優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案基本單分散的共軛物混合物具有三種或多種上述性質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案基本單分散的共軛物混合物具有所有上述四種性質(zhì)。
還是在本發(fā)明其它的實施方案中，提供了具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的共軛物的混合物。在該混合物中的各共軛物包括與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物。該標(biāo)準(zhǔn)偏差優(yōu)選地小于約14道爾頓并且更優(yōu)選地小于約11道爾頓?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來測定分子量分布，其中所說的方法非限制性地包括，大小排阻色譜法如例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，然后可以用統(tǒng)計學(xué)方法對該分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行測定。
該胰島素藥物優(yōu)選地是胰島素。更優(yōu)選地，該胰島素藥物是人胰島素。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是該胰島素藥物可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的各種胰島素藥物，其包括例如，胰島素原、胰島素類似物、胰島素片段、和胰島素片段類似物。胰島素類似物非限制性地包括AspB28人胰島素、LysB28人胰島素、LeuB28人胰島素、ValB28人胰島素、AlaB28人胰島素、AspB28ProB29人胰島素、LysB28ProB29人胰島素、LeuB28ProB29人胰島素、ValB28ProB29人胰島素、AlaB28ProB29人胰島素、以及用上述的替換準(zhǔn)則提供的類似物。胰島素片段非限制性地包括B22-B30人胰島素、B23-B30人胰島素、B25-B30人胰島素、B26-B30人胰島素、B27-B30人胰島素、B29-B30人胰島素、人胰島素的A鏈、和人胰島素的B鏈。可以通過如上所述的那樣將胰島素片段中的一個或多個氨基酸進(jìn)行替換來獲得胰島素片段類似物。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可以是各種包含聚乙二醇部分的低聚物。優(yōu)選地，該低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。更優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基并且，最優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞基。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可以包含一個或多個其它部分，所說的其它部分非限制性地包括，另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、銜接物部分、和終端部分。在該低聚物中的各種部分可以通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價結(jié)合。
該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(即，除該聚乙二醇部分外的部分)，其非限制性地包括糖、聚環(huán)氧烷、和多元胺/PEG共聚物。因為聚乙二醇是一種聚環(huán)氧烷，所以該另外的親水性部分可以是一種聚乙二醇部分。如果毗連的聚乙二醇部分是通過醚鍵相連的，則將認(rèn)為其是相同的部分。例如，-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一種具有六個聚乙二醇亞基的單一的聚乙二醇部分。如果這種部分是該低聚物中唯一的親水性部分，則該低聚物將不包含另外的親水性部分。如果毗連的聚乙二醇部分不是通過醚鍵相連的，則認(rèn)為其是不同的部分。例如， 是具有四個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞基的另外的親水性部分。優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案的低聚物包含聚乙二醇部分并且不包含另外的親水性部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分。該親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)該親脂性部分是一種烷基部分時，其優(yōu)選地是具有1至28個碳原子的直鏈飽和或不飽和烷基部分。更優(yōu)選地，該烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)該親脂性部分是一種脂肪酸部分時，其優(yōu)選地是具有2至18個碳原子的直鏈飽和或不飽和的天然脂肪酸部分。更優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分。例如可以用間隔部分將親水性部分與親脂性部分分離開、將親脂性部分或親水性部分與胰島素藥物分離開、將第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分分離開、將親水性部分或親脂性部分與銜接物部分分離開。間隔部分優(yōu)選地選自糖、膽固醇和甘油部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個用于將低聚物與該胰島素藥物結(jié)合起來的銜接物部分。銜接物部分優(yōu)選地選自烷基和脂肪酸部分。
該低聚物可以進(jìn)一步在未與該胰島素藥物相結(jié)合的低聚物的一個或多個末端上包含一個或多個終端部分。該終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，并且更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，該終端部分是甲基或甲氧基、雖然該終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該終端部分可以是各種部分，其非限制性地包括，糖、膽固醇、醇類、和脂肪酸類。
該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合。在一些實施方案中，用可水解的鍵(例如，酯或碳酸酯鍵)將該胰島素藥物與低聚物相結(jié)合?？伤獾倪B接可以提供一種作為前體藥物的胰島素藥物-低聚物共軛物。在某些情況中，例如在該胰島素藥物-低聚物共軛物無活性(即，該共軛物缺乏通過胰島素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)的情況中，可水解的結(jié)合可以提供緩釋放或控制釋放作用，在給定時期內(nèi)將一種或多種低聚物形式進(jìn)行給藥的胰島素藥物從其各自的胰島素藥物-低聚物共軛物上裂解下來從而提供了該活性藥物。在其它實施方案中，用不可水解的鍵(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將該胰島素藥物與低聚物結(jié)合起來。當(dāng)其需要使得該胰島素藥物-低聚物共聚物長期在血液中循環(huán)時，可優(yōu)選使用不可水解的鍵，其中所說的長期優(yōu)選至少2小時。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，當(dāng)該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合時，該低聚物進(jìn)一步包含一個或多個用于將該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合的結(jié)合部分。結(jié)合部分優(yōu)選地選自共價鍵(共價鍵們)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分?？梢詫⒁环N以上的低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合。
雖然該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合，但應(yīng)當(dāng)清楚的是該低聚物可以與該胰島素藥物非共價結(jié)合形成一種非共價結(jié)合的共軛的胰島素藥物-低聚物復(fù)合體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，非共價結(jié)合非限制性地包括氫鍵、離子鍵、范德華鍵(Van der Waals)鍵、和膠束或脂質(zhì)體包封。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以對該低聚物進(jìn)行適宜地構(gòu)造、改性和/或功能化從而賦予其以以所選擇方式非共價結(jié)合的能力(例如，使其具有產(chǎn)生氫鍵的能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用各種化合物對低聚物進(jìn)行衍生化，所說的各種化合物非限制性地包括，氨基酸類、寡肽類、肽類、膽汁酸類、膽汁酸衍生物類、脂肪酸類、脂肪酸衍生物類、水楊酸類、水楊酸衍生物類、氨基水楊酸類、和氨基水楊酸衍生物類。所得的低聚物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑非共價結(jié)合(復(fù)合體)。所得的復(fù)合體優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用胺和/或烷基胺對低聚物進(jìn)行衍生化。在適宜的酸性條件下，所得聚合物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑形成非共價共軛的復(fù)合體。得自該類絡(luò)合作用的產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性或親水性。
可以將一種以上的低聚物(即，許多低聚物)與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合。這些低聚物優(yōu)選地是相同的。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是這些低聚物可以彼此不同，或者這些低聚物中的一些相同而另一些不相同。當(dāng)有許多低聚物與該胰島素藥物相結(jié)合時，優(yōu)選地將一個或多個低聚物用可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合并且將一個或多個低聚物用不可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合?；蛘?，將許多低聚物與胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合的所有鍵可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，從而使得，例如，一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解迅速從該胰島素藥物上被除去并且一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解緩慢地從該胰島素藥物上被除去。
可以將該低聚物在該胰島素藥物的各種親核性殘基上與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合，所說的親核性殘基非限制性地包括親核的羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽時，可發(fā)現(xiàn)親核的羥基官能團(tuán)，例如可以在絲氨酸和/或酪氨酸殘基上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)，并且可發(fā)現(xiàn)親核的氨基官能團(tuán)，例如，可在組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或該多肽的一個或多個N-末端上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)。當(dāng)將低聚物與該胰島素多肽的一個或多個N-末端相結(jié)合時，該結(jié)合優(yōu)選地形成一種仲胺。當(dāng)該胰島素藥物是一種人胰島素時，例如，該低聚物可以與該胰島素的氨基官能度相結(jié)合，包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、和LysB29的氨基官能度。當(dāng)一個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與LysB29的氨基官能度相結(jié)合。當(dāng)兩個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相結(jié)合。雖然可以將一種以上的低聚物與人胰島素相結(jié)合，但是觀測到單共軛的人胰島素具有較高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
可以用各種方法來合成具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。例如，由羧酸或聚乙二醇組成的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的低聚物混合物是通過將具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的羧酸混合物與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的聚乙二醇混合物在足以提供具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的低聚物混合物的條件下進(jìn)行接觸來合成。然后，將具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的混合物的低聚物進(jìn)行活化以使得其能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)從而提供一種胰島素藥物-低聚物共軛物。圖3說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的一個實施方案并在下面的實施例11-18中進(jìn)行了描述。圖4說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例19-24中進(jìn)行了描述。圖5也說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例25-29中進(jìn)行了描述。圖6也說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例30-31中進(jìn)行了描述。圖7也說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例32-37中進(jìn)行了描述。圖8也說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例38中進(jìn)行了描述。圖9也說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并且在下面的實施例39中進(jìn)行了描述。圖10也說明了用于提供一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例40中進(jìn)行了描述。
將具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物的混合物在足以提供胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的情況下進(jìn)行反應(yīng)。在下面的實施例41中對一種優(yōu)選的合成進(jìn)行了描述。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以對反應(yīng)條件(例如，所選擇的摩爾比例、溶劑混合物和/或pH)進(jìn)行控制，從而使得由具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物和具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物的混合物的反應(yīng)而獲得的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物是一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的混合物。例如，可以通過將反應(yīng)溶液的pH維持在低于該賴氨酸的pKa的水平下來抑制在賴氨酸氨基官能度上的結(jié)合?；蛘?，可以用例如下面實施例50中所描述的HPLC來進(jìn)行胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的分離和離析從而得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物，所說的共軛物例如單-、二-、或三-共軛物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)來對所分離出的特定共軛物的結(jié)合程度(例如，所分離出來的分子是單-、二-還是三-共軛物)進(jìn)行測定和/或確證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，質(zhì)譜。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)對特定的共軛物結(jié)構(gòu)(例如，該低聚物是在人胰島素單共軛物的GlyA1、PheB1還是LysB29上)進(jìn)行測定，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，序列分析、作肽圖、選擇性酶裂解、和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以阻斷該胰島素藥物上的一個或多個反應(yīng)部位，例如可以通過將該胰島素藥物與適宜的阻斷劑如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行阻斷。例如，當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽并希望形成一種在該多肽的N-末端具有低聚物的不飽和共軛物(即，不是其中所有的親核殘基都被結(jié)合的共軛物)時，可優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行該類阻斷后，可以將具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的被阻斷的胰島素藥物的混合物與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的活性低聚物的混合物進(jìn)行反應(yīng)從而獲得一種具有與一個或多個親核殘基相結(jié)合的低聚物(低聚物們)和與其它親核殘基相結(jié)合的阻斷部分的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。在該共軛反應(yīng)后，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以將該胰島素藥物-低聚物共軛物去阻斷。如果需要的話，然后可如上所述的那樣對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離，從而得到一種具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物?；蛘撸梢栽谌プ钄嘀皩υ撘葝u素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離。
與多分散混合物的這些性質(zhì)相比，本發(fā)明實施方案具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有得到了改善的性質(zhì)。例如，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性高的體外活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法如，例如in H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMERCHEMISTRY 394-402(第2版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性高的體外活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來測量特定混合物的體外活性。優(yōu)選地，用從Molecular Devices Corporationof Sunnyvale，加利福尼亞，商業(yè)獲得的CytosensorMicrophysiometer來對體外活性進(jìn)行測量。作為對添加到培養(yǎng)于transwell中的細(xì)胞中的藥物的響應(yīng)，該Microphysiometer監(jiān)測器以細(xì)胞外酸化的速率發(fā)生微小的變化。這種響應(yīng)與所研究分子的活性成比例。優(yōu)選地，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約5％。更優(yōu)選地，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約10％。
還是作為另一個實例，和與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。對糜蛋白酶的抵抗力相當(dāng)于用與下面實施例52所概述的方法相似的方法用糜蛋白酶對試驗分子進(jìn)行消解時剩余的百分比。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的數(shù)均分子量或多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測定，其中所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。優(yōu)選地，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約10％。更優(yōu)選地，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約20％。
還是作為另一個實例，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物優(yōu)選地具有比與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異低的個體間差異。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對個體間差異進(jìn)行測量。個體間差異優(yōu)選地用如下的方法進(jìn)行計算。測定各個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(即，劑量響應(yīng)曲線和基準(zhǔn)值之間的面積)。通過將各個體的AUC相加求和并用該和除以個體的數(shù)目來測定對所有個體而言的平均AUC。然后測定對于各個體而言個體AUC和平均AUC之間差異的絕對值。然后對所得差異的絕對值求和從而得到表示個體間差異的值。較低的值表示較低的個體間差異，較高的值表示較高的個體間差異。優(yōu)選地，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約10％。更優(yōu)選地，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約25％。
本發(fā)明實施方案具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有兩種或多種上述性質(zhì)。更優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有三種或多種上述性質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有所有上述四種性質(zhì)。
還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的混合物，其中各共軛物包括與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，并且該混合物具有高于10,000的分散系數(shù)(DC)，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣品中不同分子的數(shù)目；Ni是樣品中第i個分子的數(shù)目；和Mi是第i個分子的質(zhì)量。
共軛物混合物優(yōu)選地具有一種高于100,000的分散系數(shù)。更優(yōu)選地，該共軛物混合物的分散系數(shù)高于500,000并且，最優(yōu)選地，該分散系數(shù)高于10,000,000。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對變量n、Ni、和Mi進(jìn)行測定，所說的各種方法非限制性地包括，在下面實施例49中所述的方法。
該胰島素藥物優(yōu)選地是胰島素。更優(yōu)選地，該胰島素藥物是人胰島素。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是該胰島素藥物可以選擇各種對本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的胰島素藥物，其包括，例如，胰島素原、胰島素類似物、胰島素片段、和胰島素片段類似物。胰島素類似物非限制性地包括AspB28人胰島素、LysB28人胰島素、LeuB28人胰島素、ValB28人胰島素、AlaB28人胰島素、AspB28ProB29人胰島素、LysB28ProB29人胰島素、LeuB28ProB29人胰島素、ValB28ProB29人胰島素、AlaB28ProB29人胰島素、以及用上訴替代準(zhǔn)則所提供的類似物。胰島素片段非限制性地包括B22-B30人胰島素、B23-B30人胰島素、B25-B30人胰島素、B26-B30人胰島素、B27-B30人胰島素、B29-B30人胰島素、人胰島素的A鏈、或人胰島素的B鏈?？梢酝ㄟ^在胰島素片段中如上所述的替換一個或多個氨基酸來提供胰島素片段類似物。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可以是包含聚乙二醇部分的各種低聚物。優(yōu)選地，該低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。更優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基，并且最優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞基。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可包含一個或多個其它部分，所說的其它部分非限制性地包括，另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、銜接物部分、和終端部分。在該低聚物中的各種部分可以通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價結(jié)合。
該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(即，除該聚乙二醇部分外的部分)，所說的另外的親水性部分非限制性地包括，糖、聚環(huán)氧烷、或多元胺/PEG共聚物。因為聚乙二醇是一種聚環(huán)氧烷，該另外的親水性部分可以是一種聚乙二醇部分。
如果毗連的聚乙二醇部分是通過醚鍵相連的，則將認(rèn)為其是相同的部分。例如，-O-C2H4-0-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一種具有六個聚乙二醇亞基的單一的聚乙二醇部分。如果這種部分是該低聚物中唯一的親水性部分，則該低聚物將不包含另外的親水性部分。如果毗連的聚乙二醇部分不是通過醚鍵相連的，則認(rèn)為其是不同的部分。例如，下面的部分 是具有四個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞基的另外的親水性部分。優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案的低聚物包含聚乙二醇部分并且不包含另外的親水性部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分。該親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)該親脂性部分是一種烷基部分時，其優(yōu)選地是具有1至28個碳原子的直鏈飽和或不飽和烷基部分。更優(yōu)選地，該烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)該親脂性部分是一種脂肪酸部分時，其優(yōu)選地是具有2至18個碳原子的直鏈飽和或不飽和的天然脂肪酸部分。更優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分。例如，可以用間隔部分將親水性部分與親脂性部分分離開、將親脂性部分或親水性部分與胰島素藥物分離開、將第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分分離開、將親水性部分或親脂性部分與銜接物部分分離開。間隔部分優(yōu)選地選自糖、膽固醇和甘油部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個用于將該低聚物與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合的銜接物部分。銜接物部分優(yōu)選地選自烷基和脂肪酸部分。
該低聚物可以進(jìn)一步在未與該胰島素藥物相結(jié)合的低聚物的一個或多個末端上包含一個或多個終端部分。該終端部分優(yōu)選地是一種烷基或烷氧基部分，并且更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，該終端部分是甲基或甲氧基。雖然該終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該終端部分可以是各種部分，其非限制性地包括，糖、膽固醇、醇類、和脂肪酸類。
該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合。在一些實施方案中，用可水解的鍵(例如，酯或碳酸酯鍵)將該胰島素藥物與低聚物相結(jié)合?？伤獾倪B接可以提供一種作為前體藥物的胰島素藥物-低聚物共軛物。在某些情況中，例如在該胰島素藥物-低聚物共軛物無活性(即，該共軛物缺乏通過胰島素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)的情況中，可水解的結(jié)合可以提供緩釋放或控制釋放作用，在給定時期內(nèi)將一種或多種低聚物形式進(jìn)行給藥的胰島素藥物從其各自的胰島素藥物-低聚物共軛物上裂解下來從而提供了該活性藥物。在其它實施方案中，用不可水解的鍵(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將該胰島素藥物與低聚物結(jié)合起來。當(dāng)其需要使得該胰島素藥物-低聚物共聚物長期在血液中循環(huán)時，可優(yōu)選使用不可水解的鍵，其中所說的長期優(yōu)選至少2小時。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，當(dāng)該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合時，該低聚物進(jìn)一步包含一個或多個用于將該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合的結(jié)合部分。結(jié)合部分優(yōu)選地選自共價鍵(共價鍵們)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分?？梢詫⒁环N以上的低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合。
雖然該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合，但應(yīng)當(dāng)清楚的是該低聚物可以與該胰島素藥物非共價結(jié)合形成一種非共價結(jié)合的共軛的胰島素藥物-低聚物復(fù)合體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，非共價結(jié)合非限制性地包括氫鍵、離子鍵、范德華鍵、和膠束或脂質(zhì)體包封。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以對該低聚物進(jìn)行適宜地構(gòu)造、改性和/或功能化從而賦予其以以所選擇方式非共價結(jié)合的能力(例如，使其具有產(chǎn)生氫鍵的能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用各種化合物對低聚物進(jìn)行衍生化，所說的各種化合物非限制性地包括，氨基酸類、寡肽類、肽類、膽汁酸類、膽汁酸衍生物類、脂肪酸類、脂肪酸衍生物類、水楊酸類、水楊酸衍生物類、氨基水楊酸類、和氨基水楊酸衍生物類。所得的低聚物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑非共價結(jié)合(復(fù)合體)。所得的復(fù)合體優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用胺和/或烷基胺對低聚物進(jìn)行衍生化。在適宜的酸性條件下，所得聚合物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑形成非共價共軛的復(fù)合體。得自該類絡(luò)合作用的產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性或親水性。
可以將一種以上的低聚物(即，許多低聚物)與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合。這些低聚物優(yōu)選地是相同的。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是這些低聚物可以彼此不同，或者這些低聚物中的一些相同而另一些不相同。當(dāng)有許多低聚物與該胰島素藥物相結(jié)合時，優(yōu)選地將一個或多個低聚物用可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合并且將一個或多個低聚物用不可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合?；蛘?，將許多低聚物與胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合的所有鍵可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，從而使得，例如，一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解迅速從該胰島素藥物上被除去并且一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解緩慢地從該胰島素藥物上被除去。
可以將該低聚物在該胰島素藥物的各種親核性殘基上與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合，所說的親核性殘基非限制性地包括親核的羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽時，可發(fā)現(xiàn)親核的羥基官能團(tuán)，例如可以在絲氨酸和/或酪氨酸殘基上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)，并且可發(fā)現(xiàn)親核的氨基官能團(tuán)，例如，可在組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或該多肽的一個或多個N-末端上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)。當(dāng)將低聚物與該胰島素多肽的一個或多個N-末端相結(jié)合時，該結(jié)合優(yōu)選地形成一種仲胺。當(dāng)該胰島素藥物是一種人胰島素時，例如，該低聚物可以與該胰島素的氨基官能度相結(jié)合，包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、和LysB29的氨基官能度。當(dāng)一個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與LysB29的氨基官能度相結(jié)合。當(dāng)兩個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相結(jié)合。雖然可以將一種以上的低聚物與人胰島素相結(jié)合，但是觀測到單共軛的人胰島素具有較高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
可以用各種方法來合成分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。例如，由羧酸和聚乙二醇所組成的分散系數(shù)高于10,000的低聚物的混合物是通過將分散系數(shù)高于10,000的羧酸的混合物與分散系數(shù)高于10,000的聚乙二醇的混合物在足以提供一種分散系數(shù)高于10,000的低聚物的混合物的條件下進(jìn)行接觸來合成的。然后，將該分散系數(shù)高于10,000的混合物的低聚物進(jìn)行活化，從而使其能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)從而提供一種胰島素藥物-低聚物共軛物。圖3說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的一個實施方案并在下面的實施例11-18中進(jìn)行了描述。圖4說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例19-24中進(jìn)行了描述。圖5也說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例25-29中進(jìn)行了描述。圖6也說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例30-31中進(jìn)行了描述。圖7說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例32-37中進(jìn)行了描述。圖8也說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例38中進(jìn)行了描述。圖9也說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例39中進(jìn)行了了描述。圖10說明了用于提供一種分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例40中進(jìn)行了描述。
將分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物的混合物與分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物的混合物在足以提供胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的情況下進(jìn)行反應(yīng)。在下面的實施例41中對一種優(yōu)選的合成進(jìn)行了描述。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以對反應(yīng)條件(例如，所選擇的摩爾比例、溶劑混合物和/或pH)進(jìn)行控制以使得得自分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物的混合物和分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物的混合物的反應(yīng)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物是一種分散系數(shù)高于10,000的混合物。例如，可以通過將反應(yīng)溶液的pH維持在低于該賴氨酸的pKa的水平下來抑制在賴氨酸氨基官能度上的結(jié)合?；蛘?，可以用例如下面實施例50所描述的HPLC對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離和離析，從而得到分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物，所說的共軛物例如單-、二-或三-共軛物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)來對所分離出的特定共軛物的結(jié)合程度(例如，所分離出來的分子是單-、二-還是三-共軛物)進(jìn)行測定和/或確證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，質(zhì)譜。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所裂解的那樣，可以用各種技術(shù)來對特定的共軛物結(jié)構(gòu)特定的共軛物結(jié)構(gòu)(例如，該低聚物是在人胰島素單共軛物的GlyA1、PheB1還是LysB29上)進(jìn)行測定和/或驗證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，序列分析、作肽圖、選擇性酶裂解、和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以阻斷該胰島素藥物上的一個或多個反應(yīng)部位，例如可以通過將該胰島素藥物與適宜的阻斷劑如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行阻斷。例如，當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽并且需要形成一種在該多肽的一個或多個N-末端上具有低聚物的不飽和共軛物(即，其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，可優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行該類阻斷后，可將分散系數(shù)高于10,000的被阻斷的胰島素藥物的混合物與分散系數(shù)高于10,000的活性低聚物的混合物進(jìn)行反應(yīng)從而得到一種具有與一個或多個親核殘基相結(jié)合的低聚物(低聚物們)和與其它親核殘基相結(jié)合的阻斷部分的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。在該共軛反應(yīng)后，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以將該胰島素藥物-低聚物共軛物去阻斷。如果需要的話，然后可如上所述的那樣對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離，從而得到一種分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物?；蛘?，可以在去阻斷之前對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離。
與多分散混合物的這些性質(zhì)相比，本發(fā)明實施方案分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有改善的性質(zhì)。例如，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法如，例如在H.R.Allcock &F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體外活性高的體外活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來測量特定混合物的體外活性。優(yōu)選地，用從Molecular Devices Corporationof Sunnyvale，加利福尼亞，商業(yè)獲得的CytosensorMicrophysiometer對體外活性進(jìn)行測量。作為對添加到培養(yǎng)于transwell中的細(xì)胞中的藥物的響應(yīng)，該Microphysiometer監(jiān)測器以細(xì)胞外酸化的速率發(fā)生微小的變化。這種響應(yīng)與所研究分子的活性成比例。優(yōu)選地，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約5％。更優(yōu)選地，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約10％。
還是作為另一個實例，與和分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。對糜蛋白酶的抵抗力相當(dāng)于用與下面實施例52所概述的方法相似的方法用糜蛋白酶對試驗分子進(jìn)行消解時剩余的百分比。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。優(yōu)選地，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約10％。更優(yōu)選地，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約20％。
還是作為另一個實例，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的個體間差異低的個體間差異。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對個體間差異進(jìn)行測量。個體間差異優(yōu)選地計算如下。測定各個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(即，劑量-響應(yīng)曲線和基準(zhǔn)值之間的面積)。通過將各個體的AUCs相加求和并然后將該和除以個體數(shù)來測定對于所有個體而言的平均AUC。然后測定對于各個體而言個體AUC和平均AUC之間差異的絕對值。然后對所得差異的絕對值求和從而得到表示個體間差異的值。較低的值表示較低的個體間差異，較高的值表示較高的個體間差異。優(yōu)選地，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約10％。更優(yōu)選地，分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約25％。
本發(fā)明實施方案分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有兩種或多種上述性質(zhì)。更優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有三種或多種上述性質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案分散系數(shù)高于10,000的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有所有上述四種性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的低聚物，其中各共軛物包括一種與低聚物相結(jié)合的胰島素藥物并具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)。
胰島素藥物優(yōu)選地是胰島素。更優(yōu)選地，該胰島素藥物是人胰島素。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是該胰島素藥物可以選擇各種對本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的胰島素藥物，其包括，例如，胰島素原、胰島素類似物、胰島素片段、和胰島素片段類似物。胰島素類似物非限制性地包括AspB28人胰島素、LysB28人胰島素、LeuB28人胰島素、ValB28人胰島素、AlaB28人胰島素、AspB28ProB29人胰島素、LysB28ProB29人胰島素、LeuB28ProB29人胰島素、ValB28ProB29人胰島素、AlaB28ProB29人胰島素、以及用上訴替代準(zhǔn)則所提供的類似物。胰島素片段非限制性地包括B22-B30人胰島素、B23-B30人胰島素、B25-B30人胰島素、B26-B30人胰島素、B27-B30人胰島素、B29-B30人胰島素、人胰島素的A鏈、以及人胰島素的B鏈?？梢酝ㄟ^在胰島素片段中如上所述的替換一個或多個氨基酸來提供胰島素片段類似物。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可以是包含聚乙二醇部分的各種低聚物。優(yōu)選地，該低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。更優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基并且，最優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞基。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可包含一個或多個其它部分，所說的其它部分非限制性地包括，另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、銜接物部分、和終端部分。在該低聚物中的各種部分可以通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價結(jié)合。
該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(即，除該聚乙二醇部分外的部分)，其非限制性地包括，糖、聚環(huán)氧烷、和多元胺/PEG共聚物。因為聚乙二醇是一種聚環(huán)氧烷，該另外的親水性部分可以是一種聚乙二醇部分。如果毗連的聚乙二醇部分是通過醚鍵相連的，則將認(rèn)為其是相同的部分。例如，下面的部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一種具有六個聚乙二醇亞基的單一的聚乙二醇部分。如果這種部分是該低聚物中唯一的親水性部分，則該低聚物將不包含另外的親水性部分。如果毗連的聚乙二醇部分不是通過醚鍵相連的，則認(rèn)為其是不同的部分。例如，下面的部分 是具有四個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞基的另外的親水性部分。優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案的低聚物包含聚乙二醇部分并且不包含另外的親水性部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分。該親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)該親脂性部分是一種烷基部分時，其優(yōu)選地是具有1至28個碳原子的直鏈飽和或不飽和烷基部分。更優(yōu)選地，該烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)該親脂性部分是一種脂肪酸部分時，其優(yōu)選地是具有2至18個碳原子的直鏈飽和或不飽和的天然脂肪酸部分。更優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分。例如，可以用間隔部分將親水性部分與親脂性部分分離開、將親脂性部分或親水性部分與胰島素藥物分離開、將第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分分離開、將親水性部分或親脂性部分與銜接物部分分離開。間隔部分優(yōu)選地選自糖、膽固醇和甘油部分。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該低聚物可進(jìn)一步包含一個或多個用于將該低聚物與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合的銜接物部分。銜接物部分優(yōu)選地選自烷基和脂肪酸部分。
該低聚物可以進(jìn)一步在未與該胰島素藥物相結(jié)合的低聚物的一個或多個末端上包含一個或多個終端部分。該終端部分優(yōu)選地是一種烷基或烷氧基部分，并且更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，該終端部分是甲基或甲氧基。雖然該終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該終端部分可以是各種部分，其非限制性地包括，糖、膽固醇、醇類、和脂肪酸類。
該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合。在一些實施方案中，用可水解的鍵(例如，酯或碳酸酯鍵)將該胰島素藥物與低聚物相結(jié)合?？伤獾倪B接可以提供一種作為前體藥物的胰島素藥物-低聚物共軛物。在某些情況中，例如在該胰島素藥物-低聚物共軛物無活性(即，該共軛物缺乏通過胰島素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)的情況中，可水解的結(jié)合可以提供緩釋放或控制釋放作用，在給定時期內(nèi)將一種或多種低聚物形式進(jìn)行給藥的胰島素藥物從其各自的胰島素藥物-低聚物共軛物上裂解下來從而提供了該活性藥物。在其它實施方案中，用不可水解的鍵(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將該胰島素藥物與低聚物結(jié)合起來。當(dāng)其需要使得該胰島素藥物-低聚物共聚物長期在血液中循環(huán)時，可優(yōu)選使用不可水解的鍵，其中所說的長期優(yōu)選至少2小時。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，當(dāng)該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合時，該低聚物進(jìn)一步包含一個或多個用于將該低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合的結(jié)合部分。結(jié)合部分優(yōu)選地選自共價鍵(共價鍵們)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分?？梢詫⒁环N以上的低聚物與該胰島素藥物共價結(jié)合。
雖然該低聚物優(yōu)選地與該胰島素藥物共價結(jié)合，但應(yīng)當(dāng)清楚的是該低聚物可以與該胰島素藥物非共價結(jié)合形成一種非共價結(jié)合的共軛的胰島素藥物-低聚物復(fù)合體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，非共價結(jié)合非限制性地包括氫鍵、離子鍵、范德華鍵、和膠束或脂質(zhì)體包封。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以對該低聚物進(jìn)行適宜地構(gòu)造、改性和/或功能化從而賦予其以以所選擇方式非共價結(jié)合的能力(例如，使其具有產(chǎn)生氫鍵的能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用各種化合物對低聚物進(jìn)行衍生化，所說的各種化合物非限制性地包括，氨基酸類、寡肽類、肽類、膽汁酸類、膽汁酸衍生物類、脂肪酸類、脂肪酸衍生物類、水楊酸類、水楊酸衍生物類、氨基水楊酸類、和氨基水楊酸衍生物類。所得的低聚物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑非共價結(jié)合(復(fù)合體)。所得的復(fù)合體優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，可以用胺和/或烷基胺對低聚物進(jìn)行衍生化.在適宜的酸性條件下，所得聚合物可以與藥物分子、藥用產(chǎn)品和/或藥用賦形劑形成非共價共軛的復(fù)合體。得自該類絡(luò)合作用的產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。
可以將一種以上的低聚物(即，許多低聚物)與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合。這些低聚物優(yōu)選地是相同的。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是這些低聚物可以彼此不同，或者這些低聚物中的一些相同而另一些不相同。當(dāng)有許多低聚物與該胰島素藥物相結(jié)合時，優(yōu)選地將一個或多個低聚物用可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合并且將一個或多個低聚物用不可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合?；蛘?，將許多低聚物與胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合的所有鍵可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，從而使得，例如，一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解迅速從該胰島素藥物上被除去并且一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解緩慢地從該胰島素藥物上被除去。
可以將該低聚物在該胰島素藥物的各種親核性殘基上與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合，所說的親核性殘基非限制性地包括親核的羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽時，可發(fā)現(xiàn)親核的羥基官能團(tuán)，例如可以在絲氨酸和/或酪氨酸殘基上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)，并且可發(fā)現(xiàn)親核的氨基官能團(tuán)，例如，可在組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或該多肽的一個或多個N-末端上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)。當(dāng)將低聚物與該胰島素多肽的一個或多個N-末端相結(jié)合時，該結(jié)合優(yōu)選地形成一種仲胺。當(dāng)該胰島素藥物是一種人胰島素時，例如，該低聚物可以與該胰島素的氨基官能度相結(jié)合，所說的氨基官能度包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、和LysB29的氨基官能度。當(dāng)一個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與LysB29的氨基官能度相結(jié)合。當(dāng)兩個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相結(jié)合。雖然可以將一種以上的低聚物與人胰島素相結(jié)合，但是觀測到單共軛的人胰島素具有較高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
其中混合物中的各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物可以用各種方法來進(jìn)行合成。例如，其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的由羧酸和聚乙二醇所組成的低聚物的混合物是通過將羧酸的混合物與其中混合物中各聚乙二醇分子具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的聚乙二醇在足以產(chǎn)生其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的低聚物混合物的條件下進(jìn)行接觸來進(jìn)行合成的。然后，將其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的混合物的低聚物進(jìn)行活化，從而使其能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)從而提供一種胰島素藥物-低聚物共軛物。圖3說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的一個實施方案并在下面的實施例11-18中進(jìn)行了描述。圖4說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例19-24中進(jìn)行了描述。圖5也說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例25-29中進(jìn)行了描述。圖6也說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例30-31中進(jìn)行了描述。圖7說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例32-37中進(jìn)行了描述。圖8也說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例38中進(jìn)行了描述。圖9也說明了用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例39中進(jìn)行了描述。圖10說明了用于用于提供一種其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例40中進(jìn)行了說明。
將其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物的混合物基與胰島素藥物的混合物在足以提供胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的情況下進(jìn)行反應(yīng)。在下面的實施例41中對一種優(yōu)選的合成進(jìn)行了描述。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以對反應(yīng)條件(例如，所選擇的摩爾比例、溶劑混合物和/或pH)進(jìn)行控制以使得得自其中各混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物的活性混合物和其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的共軛物的混合物的反應(yīng)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物是一種其中混合物中的各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的共軛物混合物。例如，可以通過將反應(yīng)溶液的pH維持在低于該賴氨酸的pKa的水平下來抑制在賴氨酸氨基官能度上的結(jié)合。或者，可以用力如下面實施例50中所述的HPLC來對胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離和離析從而得到其中混合物中的各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物，例如單-、二-、或三-共軛物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)來對所分離出的特定共軛物的結(jié)合程度(例如，所分離出來的分子是單-、二-還是三-共軛物)進(jìn)行測定和/或驗證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，質(zhì)譜。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣，可以用各種技術(shù)來對特定的共軛物結(jié)構(gòu)(例如，該低聚物是在人胰島素單共軛物的GlyA1、PheB1或LysB29上)進(jìn)行測定和/或驗證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，序列分析、作肽圖、選擇性酶裂解、和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以對該胰島素藥物的一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行阻斷，例如，可以通過將胰島素藥物與適宜的阻斷試劑如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行阻斷。例如，當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽并且需要形成一種在該多肽的一個或多個N-末端上具有低聚物的不飽和共軛物(即，其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，可優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行該類阻斷后，可以將進(jìn)行了阻斷的胰島素藥物的混合物與其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的活性低聚物的混合物基進(jìn)行反應(yīng)，從而得到具有與一個或多個親核殘基相結(jié)合的低聚物(低聚物們)和與其它親核殘基相結(jié)合的阻斷部分的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。在該共軛反應(yīng)后，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以將該胰島素藥物-低聚物共軛物去阻斷。如果需要的話，然后可如上所述的那樣對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離從而得到其中混合物中的各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物。或者，可以在去阻斷之前對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離。
與多分散混合物的這些性質(zhì)相比，本發(fā)明實施方案其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有改善的性質(zhì)。例如，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有比與其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法如，例如在H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)中所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性高的體外活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來測量特定混合物的體外活性。優(yōu)選地，用從Molecular Devices Corporationof Sunnyvale，加利福尼亞，商業(yè)獲得的CytosensorMicrophysiometer對體外活性進(jìn)行測量。為對添加到培養(yǎng)于transwell中的細(xì)胞中的藥物的響應(yīng)，該Microphysiometer監(jiān)測器以細(xì)胞外酸化的速率發(fā)生微小的變化。這種響應(yīng)與所研究分子的活性成比例。優(yōu)選地，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約5％。更優(yōu)選地，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約10％。
還是作為另一個實例，當(dāng)和與其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比時，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。對糜蛋白酶的抵抗力相當(dāng)于用與下面實施例52所概述的方法相似的方法用糜蛋白酶對試驗分子進(jìn)行消解時剩余的百分比。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。優(yōu)選地，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約10％。更優(yōu)選地，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約20％。
還是作為另一個實例，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的個體間差異低的個體間差異。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對個體間差異進(jìn)行測量。個體間差異優(yōu)選地計算如下。測定各個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(即，劑量響應(yīng)曲線和基準(zhǔn)值之間的面積)。通過將各個體的AUC相加求和并用該和除以個體的數(shù)目來測定對所有個體而言的平均AUC。然后測定對于各個體而言個體AUC和平均AUC之間差異的絕對值。然后對所得差異的絕對值求和從而得到表示個體間差異的值。較低的值表示較低的個體間差異，較高的值表示較高的個體間差異。優(yōu)選地，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約10％。更優(yōu)選地，其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約25％。
本發(fā)明實施方案其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有兩種或多種上述性質(zhì)。更優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有三種或多種上述性質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案其中混合物中各共軛物具有相同聚乙二醇亞基數(shù)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有所有上述四種性質(zhì)。
還是根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，提供了一種共軛物的混合物，其中各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)胰島素藥物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p(A)其中B是一種結(jié)合部分；L是一種銜接物部分；G、G′和G″各自是一種所選擇的間隔部分；R是一種親脂性部分并且R′是一種聚亞烷基二醇部分，或R′是親脂性部分并且R是聚亞烷基二醇部分；T是一種終止部分；j、k、m和n各自是0或1；和p是一個1至該胰島素藥物上的親核性殘基數(shù)目之間的整數(shù)。
該胰島素藥物優(yōu)選地是胰島素。更優(yōu)選地，該胰島素藥物是人胰島素。但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是該胰島素藥物可以選擇各種對本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的胰島素藥物，其包括，例如，胰島素原、胰島素類似物、胰島素片段、和胰島素片段類似物。胰島素類似物非限制性地包括AspB28人胰島素、LysB28人胰島素、LeuB28人胰島素、ValB28人胰島素、AlaB28人胰島素、AspB28ProB29人胰島素、LysB28ProB29人胰島素、LeuB28ProB29人胰島素、ValB28ProB29人胰島素、AlaB28ProB29人胰島素，以及用上訴替代準(zhǔn)則所提供的類似物。胰島素片段非限制性地包括B22-B30人胰島素、B23-B30人胰島素、B25-B30人胰島素、B26-B30人胰島素、B27-B30人胰島素、B29-B30人胰島素、人胰島素的A鏈、以及人胰島素的B鏈?？梢酝ㄟ^在胰島素片段中如上所述的替換一個或多個氨基酸來提供胰島素片段類似物。
根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，該低聚物的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選地具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。更優(yōu)選地，該聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基并且，最優(yōu)選地，該聚乙二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。該聚亞烷基二醇部分優(yōu)選地是低級聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分、或聚丁二醇部分。更優(yōu)選地，該聚亞烷基二醇部分是聚乙二醇部分或聚丙二醇部分。最優(yōu)選地，該聚亞烷基二醇部分是聚乙二醇部分。當(dāng)該聚亞烷基二醇部分是聚丙二醇部分時，該部分優(yōu)選地具有一種均勻的(即，非隨機(jī)的)結(jié)構(gòu)。一種具有均勻結(jié)構(gòu)的實例性的聚丙二醇部分如下所示 這種均勻的聚丙二醇結(jié)構(gòu)被描述為在該聚丙二醇鏈中毗鄰各氧原子的只有一個甲基取代的碳原子。該類均勻的聚丙二醇部分既可表現(xiàn)出親脂性又可表現(xiàn)出親水性，因此可用于提供一種不使用親脂性聚合物部分的兩親性胰島素藥物-低聚物共軛物。此外，將該聚丙二醇的仲醇部分與一種藥物相結(jié)合可提供對酶所造成的降解具有改善的抵抗性的胰島素藥物(例如，人胰島素)，其中所說的酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶，例如，在腸中所發(fā)現(xiàn)的這些酶。
本發(fā)明實施方案均勻的聚丙二醇優(yōu)選地是如圖11至13所示的那樣來進(jìn)行合成的，現(xiàn)在將對其進(jìn)行描述。正如圖11所示的那樣，將1，2-丙二醇53與一種伯醇阻斷劑進(jìn)行反應(yīng)以提供一種仲醇延伸單體54。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該伯醇阻斷劑可以是各種伯醇阻斷劑，其非限制性地包括，甲硅烷基氯化物類化合物如叔-丁基二苯基甲硅烷基氯化物和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物、以及酯化試劑如Ac2O。優(yōu)選地，該伯醇阻斷劑是一種基本不與仲醇類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的伯醇阻斷劑，如叔-丁基二苯基甲硅烷基氯化物或叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物?？蓪⒃撝俅佳由靻误w(54)與甲磺酰氯(MeSO2Cl)進(jìn)行反應(yīng)，從而得到伯醇延伸單體甲磺酸酯55。
或者，可將該仲醇延伸單體54與仲醇阻斷劑進(jìn)行反應(yīng)以得到化合物56。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該仲醇阻斷劑可以是各種仲醇阻斷劑，其非限制性地包括，芐基氯?？蓪⒒衔?6與一種B1去-阻斷劑進(jìn)行反應(yīng)以除去阻斷部分B1并提供一種伯醇延伸單體57。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該B1去-阻斷劑可選自各種去-阻斷劑。當(dāng)通過形成酯來對該伯醇進(jìn)行阻斷時，該B1去-阻斷劑是一種去-酯化劑試劑，如一種堿(例如，碳酸鉀)。當(dāng)用一種甲硅烷基氯化物來對該伯醇進(jìn)行阻斷時，該B1去-阻斷劑優(yōu)選地是氟化四丁銨(TBAF)。可將該伯醇延伸單體57與甲烷磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)，從而獲得一種仲醇延伸單體甲磺酸酯58。
該伯醇延伸單體54和仲醇延伸單體57可如下所述的那樣進(jìn)行封端。可將仲醇延伸單體54與一種封端劑進(jìn)行反應(yīng)，得到化合物59。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該封端劑可以是各種封端劑，其非限制性地包括鹵代烷如氯代甲烷?？蓪⒒衔?9與一種B1去-阻斷劑進(jìn)行反應(yīng)從而得到伯醇封端的單體60?？蓪⒃摬挤舛说膯误w60與甲烷磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)，從而得到仲醇封端的單體甲磺酸酯61?？蓪⒉佳由靻误w57與一種封端劑進(jìn)行反應(yīng)，從而得到化合物62。該封端劑可以是如上所述的各種封端劑?？蓪⒒衔?2與B2去-阻斷試劑進(jìn)行反應(yīng)以除去阻斷部分B2并提供一種仲醇封端的單體63。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該B2去-阻斷試劑可以是各種去阻斷劑，其非限制性地包括，存在鈀/活性碳催化劑情況下的H2。可將該仲醇封端的單體與甲磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)，從而得到一種伯醇封端的單體甲磺酸酯64。雖然圖11所說明的實施方案表明了封端單體的合成，但應(yīng)當(dāng)清楚的是可以進(jìn)行類似的反應(yīng)來獲得封端聚合物。
一般而言，可以通過將伯醇延伸單體或聚合物如伯醇延伸單體57與伯醇延伸單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延伸單體甲磺酸酯55進(jìn)行反應(yīng)來完成鏈延伸從而得到各種均勻的聚丙烯鏈，或者可以通過將仲醇延伸單體或聚合物如仲醇延伸單體54與仲醇延伸單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延伸單體甲磺酸酯58進(jìn)行反應(yīng)來完成鏈延伸。
例如，在圖13中，將伯醇延伸單體甲磺酸酯55與伯醇延伸單體57進(jìn)行反應(yīng)從而得到二聚物化合物65?；蛘撸梢詫⒅俅佳由靻误w甲磺酸酯58與仲醇延伸單體54進(jìn)行反應(yīng)從而得到二聚物化合物65?？梢杂萌缟纤龅腂1去-阻斷試劑除去該二聚物化合物上的B1阻斷部分從而得到上述伯醇延伸二聚物66?？蓪⒉佳由於畚?6與甲烷磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)，從而得到仲醇延伸二聚物甲磺酸酯67?；蛘撸梢杂萌缟纤龅腂2去-阻斷試劑除去該二聚物化合物上的B2阻斷部分，從而得到仲醇延伸二聚物69?？蓪⒅俅佳由於畚?9與甲烷磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)，從而得到伯醇延伸二聚物甲磺酸酯70。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以重復(fù)進(jìn)行鏈延伸過程以得到各種其它鏈長度。例如，如圖13所說明的那樣，可以將伯醇延伸二聚物66與伯醇延伸二聚物甲磺酸酯70進(jìn)行反應(yīng)，得到一種四聚物化合物72。正如圖13所進(jìn)一步說明的那樣，一般的鏈延伸反應(yīng)流程圖包括將伯醇延伸單體或聚合物73與伯醇延伸單體或聚合物甲磺酸酯74進(jìn)行反應(yīng)，從而得到均勻的聚丙烯聚合物75。m和n的值可以各自為0至1000或更高。優(yōu)選地，m和n各自為0至50。雖然圖13所說明的實施方案表示的是伯醇延伸單體和/或聚合物與伯醇延伸單體和/或聚合物甲磺酸酯進(jìn)行反應(yīng)，但應(yīng)當(dāng)清楚的是可以用仲醇延伸單體和/或聚合物和仲醇延伸單體和/或聚合物甲磺酸酯來進(jìn)行類似的反應(yīng)。
可以將伯醇延伸單體或聚合物的末端或伯醇延伸單體或聚合物甲磺酸酯的末端分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物進(jìn)行反應(yīng)，從而得到被封端的均勻的聚丙烯鏈。例如，如圖12所說明的那樣，將伯醇延伸二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60進(jìn)行反應(yīng)，得到被封端/被阻斷的伯醇延伸三聚物71。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可將B1阻斷部分除去并可將所得的封端伯醇延伸三聚物與伯醇延伸單體或聚合物甲磺酸酯進(jìn)行反應(yīng)以延長被封端的三聚物71的鏈。
可將仲醇延伸單體或聚合物的末端或仲醇延伸單體或聚合物甲磺酸酯的末端與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物進(jìn)行反應(yīng)，從而得到一種被封端的均勻的聚丙烯鏈。例如，如圖12所說明的那樣，將仲醇延伸二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63進(jìn)行反應(yīng)，得到被封端/被阻斷的伯醇延伸三聚物68?？扇缟纤龅哪菢映2阻斷部分并可將所得的被封端的仲醇延伸三聚物與仲醇延伸鏈節(jié)甲磺酸酯進(jìn)行反應(yīng)以延長被封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所說明的實施方案表明二聚物與封端單體的反應(yīng)可提供一種三聚物，但應(yīng)當(dāng)清楚的是可以在該均勻聚丙二醇部分合成中的任何點(diǎn)上來進(jìn)行該封端過程，或，另外可以提供一種未被封端的均勻的聚丙二醇部分。雖然圖12所說明的實施方案表明可通過用封端單體進(jìn)行合成來完成聚丁烯低聚物的封端，但應(yīng)當(dāng)清楚的是可以如上面圖11中所述的那樣用一種封端劑將本發(fā)明的聚丁烯低聚物直接封端(即，不需要添加封端單體)。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可用各種方法將本發(fā)明實施方案均勻的聚丙二醇部分與胰島素藥物、親脂性部分如羧酸、和/或各種其它部分相結(jié)合，其中所說的各種部分非限制性地包括這里在涉及聚乙二醇部分時所描述的這些方法。
根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，該親脂性部分是一種本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的親脂性部分。該親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)該親脂性部分是一種烷基部分時，其優(yōu)選地是具有1至28個碳原子的直鏈飽和或不飽和烷基部分。更優(yōu)選地，該烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)該親脂性部分是一種脂肪酸部分時，其優(yōu)選地是具有2至18個碳原子的直鏈飽和或不飽和的天然脂肪酸部分。更優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，該脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，間隔部分——G、G′和G″，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的間隔部分。間隔部分優(yōu)選地選自糖、膽固醇和甘油部分。優(yōu)選地，這些實施方案的低聚物不包括間隔部分(即，k、m和n優(yōu)選地為0)。
根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用銜接物部分L將該低聚物與藥物進(jìn)行結(jié)合。銜接物部分優(yōu)選地選自烷基和脂肪酸部分。
根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，該終端部分優(yōu)選地是一種烷基或烷氧基部分，并且更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，該終端部分是甲基或甲氧基。雖然該終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，該終端部分可以是各種部分，其非限制性地包括，糖、膽固醇、醇類、和脂肪酸類。
根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，將由式A的結(jié)構(gòu)的括號部分所表示的低聚物與胰島素藥物共價結(jié)合。在一些實施方案中，用可水解的鍵(例如，酯或碳酸酯鍵)將該胰島素藥物與低聚物相結(jié)合?？伤獾倪B接可以提供一種作為前體藥物的胰島素藥物-低聚物共軛物。在某些情況中，例如在胰島素藥物-低聚物共軛物無活性的情況中(即，該共軛物缺乏通過胰島素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的結(jié)合可以提供緩釋放或控制釋放作用，在給定時期內(nèi)將一種或多種低聚物形式進(jìn)行給藥的胰島素藥物從其各自的胰島素藥物-低聚物共軛物上裂解下來從而提供了該活性藥物。在其它實施方案中，用不可水解的鍵(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將該胰島素藥物與低聚物結(jié)合起來。當(dāng)其需要使得該胰島素藥物-低聚物共聚物長期在血液中循環(huán)時，可優(yōu)選使用不可水解的鍵，其中所說的長期優(yōu)選至少2小時。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，結(jié)合部分B可以是各種結(jié)合部分。結(jié)合部分優(yōu)選地選自共價鍵(共價鍵們)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。
變量p是從1至該胰島素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。當(dāng)p大于1時，有一個以上的低聚物(即多個低聚物)與藥物相結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，這多個低聚物中的低聚物是相同的。當(dāng)有許多低聚物與該胰島素藥物相結(jié)合時，優(yōu)選地將一個或多個低聚物用可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合并且將一個或多個低聚物用不可水解的鍵與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合?；蛘?，將這些低聚物與胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合的所有鍵可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，從而使得，例如，一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解迅速從該胰島素藥物上被除去并且一個或多個低聚物可以通過體內(nèi)水解緩慢地從該胰島素藥物上被除去。
可以將該低聚物在該胰島素藥物的各種親核性殘基上與該胰島素藥物進(jìn)行結(jié)合，所說的親核性殘基非限制性地包括親核的羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽時，可發(fā)現(xiàn)親核的羥基官能團(tuán)，例如可以在絲氨酸和/或酪氨酸殘基上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)，并且可發(fā)現(xiàn)親核的氨基官能團(tuán)，例如，可在組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或該多肽的一個或多個N-末端上發(fā)現(xiàn)該基團(tuán)。當(dāng)將低聚物與該胰島素多肽的一個或多個N-末端相結(jié)合時，該結(jié)合優(yōu)選地形成一種仲胺。當(dāng)該胰島素藥物是一種人胰島素時，例如，該低聚物可以與該胰島素的氨基官能度相結(jié)合，所說的氨基官能度包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、和LysB29的氨基官能度。當(dāng)一個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與LysB29的氨基官能度相結(jié)合。當(dāng)兩個低聚物與人胰島素相結(jié)合時，該低聚物優(yōu)選地與PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相結(jié)合。雖然可以將一種以上的低聚物與人胰島素相結(jié)合，但是觀測到單共軛的人胰島素具有較高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
可以用各種方法來合成混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。例如，可以通過將羧酸的混合物與聚乙二醇的混合物在足以提供低聚物混合物的條件進(jìn)行接觸來合成由羧酸和聚乙二醇所組成的低聚物的混合物。然后可將該混合物的低聚物進(jìn)行活化，從而使其能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)從而提供一種胰島素藥物-低聚物共軛物。圖3說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的一個實施方案并在下面的實施例11-18中進(jìn)行了描述。圖4說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例19-24中進(jìn)行了描述。圖5也說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例25-29進(jìn)行了描述。圖6也說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例30-31中進(jìn)行了描述。圖7說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例32-37中進(jìn)行了描述。圖8也說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例38中進(jìn)行了描述。圖9也說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例39中進(jìn)行了描述。圖10說明了用于提供一種其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物合成途徑的另一個實施方案并在下面的實施例40中進(jìn)行了描述。
將其中各低聚物具有相同的分子量并具有式A的低聚物結(jié)構(gòu)的活性低聚物的混合物與其中混合物中各藥物具有相同分子量的胰島素藥物的混合物在足以提供胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的情況下進(jìn)行反應(yīng)。在下面的實施例41中對一種優(yōu)選的合成進(jìn)行了描述。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以對反應(yīng)條件(例如，所選擇的摩爾比例、溶劑混合物和/或pH)進(jìn)行控制，從而使得得自其中各低聚物具有相同的分子量并具有式A的低聚物結(jié)構(gòu)的活性低聚物的混合物和胰島素藥物的混合物的反應(yīng)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物是一種其中各共軛物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的共軛物的混合物。例如，可以通過將反應(yīng)溶液的pH維持在低于該賴氨酸的pKa的水平下來抑制在賴氨酸氨基官能度上的結(jié)合。或者，可以用例如在實施例50中所述的HPLC來對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離和離析，從而得到其中混合物中的各共軛物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物，其中所說的共軛物例如單-、二-、或三-共軛物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)來對所分離出的特定共軛物的結(jié)合程度(例如，所分離出來的分子是單-、二-還是三-共軛物)進(jìn)行測定和/或確證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，質(zhì)譜。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種技術(shù)對特定的共軛物結(jié)構(gòu)(例如，該低聚物是在人胰島素單共軛物的GlyA1、PheB1還是LysB29上)進(jìn)行測定和/或驗證，所說的各種技術(shù)非限制性地包括，序列分析、作肽圖、選擇性酶裂解、和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以阻斷該胰島素藥物上的一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)，例如，可通過將該胰島素藥物與適宜的阻斷劑如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行阻斷。例如，當(dāng)該胰島素藥物是一種多肽并且需要形成一種在該多肽的一個或多個N-末端上具有低聚物的不飽和共軛物(即，其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，可優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行該類阻斷后，可將該被阻斷胰島素藥物的混合物與其中混合物中的各共軛物具有相同分子量并具有式A的低聚物結(jié)構(gòu)的活性低聚物混合物進(jìn)行反應(yīng)，從而得到一種具有與一個或多個親核殘基相結(jié)合的低聚物(低聚物們)和與其它親核殘基相結(jié)合的阻斷部分的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。在該共軛反應(yīng)后，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以將該胰島素藥物-低聚物共軛物去阻斷。如果需要的話，然后可如上所述的那樣對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離，從而得到一種其中混合物中的各共軛物具有相同數(shù)目分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物?；蛘?，可以在去阻斷之前對該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物進(jìn)行分離。
與多分散混合物的這些性質(zhì)相比，本發(fā)明實施方案其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有改善的性質(zhì)。例如，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與其中混合物中的各共軛物具有相同分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來對其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法如，例如在H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY394-402(第2版，1991)中所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性高的體外活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行側(cè)測量，所說的各種方法非限制性地包括大小排阻色譜法。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法來測量特定混合物的體外活性。優(yōu)選地，用從Molecular Devices Corporationof Sunnyvale，加利福尼亞，商業(yè)獲得的CytosensorMicrophysiometer來對體外活性進(jìn)行測量。作為對添加到培養(yǎng)于transwell中的細(xì)胞中的藥物的響應(yīng)，該Microphysiometer監(jiān)測器以細(xì)胞外酸化的速率發(fā)生微小的變化。這種響應(yīng)與所研究分子的活性成比例。優(yōu)選地，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約5％。更優(yōu)選地，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的體外活性比多分散混合物的體外活性高至少約10％。
還是作為另一個實例，當(dāng)和與其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比時，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。對糜蛋白酶的抵抗力相當(dāng)于用與下面實施例52所概述的方法相似的方法用糜蛋白酶對試驗分子進(jìn)行消解時剩余的百分比。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。優(yōu)選地，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的A混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約10％。更優(yōu)選地，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的A混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力高至少約20％。
還是作為另一個實例，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有比與其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異低的個體間差異。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物的數(shù)均分子量和多分散混合物的數(shù)均分子量進(jìn)行測量，所說的各種方法非限制性地包括，大小排阻色譜法。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法對個體間差異進(jìn)行測量。個體間差異優(yōu)選地計算如下。測定各個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(即，劑量-響應(yīng)曲線和基準(zhǔn)值之間的面積)。通過將各個體的AUC相加求和并用該和除以個體的數(shù)目來測定對所有個體而言的平均AUC。然后測定對于各個體而言個體AUC和平均AUC之間差異的絕對值。然后對所得差異的絕對值求和從而得到表示個體間差異的值。較低的值表示較低的個體間差異，較高的值表示較高的個體間差異。優(yōu)選地，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約10％。更優(yōu)選地，其中混合物中的各共軛物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異比多分散混合物的個體間差異低至少約25％。
本發(fā)明實施方案其中混合物中的各共軛物具有相同分子量并具有式A結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物優(yōu)選地具有兩種或多種上述性質(zhì)。更優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案其中混合物中的各共軛物具有相同分子量并具有式A結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有三種或多種上述性質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明實施方案其中混合物中的各共軛物具有相同分子量并具有式A結(jié)構(gòu)的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物具有所有上述四種性質(zhì)。
還提供了包含本發(fā)明實施方案的共軛物混合物的藥物組合物。可根據(jù)公知的技術(shù)將上述胰島素藥物-低聚物共軛物的混合用藥用載體制備成適于給藥的形式。見，例如，Remington，The Science AndPractice of Pharmacy(第9版，1995)。在本發(fā)明實施方案的藥物組合物的制備中，一般將該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物與惰性的，特別是可藥用的載體進(jìn)行混和。當(dāng)然，該載體在與該藥物組合物中任何其它成分可相容的意義上必需是可接受的并且對于個體而言無害。該載體可以是固體或液體，或者可以是固體和液體，并且優(yōu)選地與該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物一起制備成單位劑量制劑，例如片劑，其可包含約0.01或0.5％至約95％或99％重量的胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物?？梢杂萌魏伪娝苤乃帉W(xué)技術(shù)來制備該藥物組合物，所說的技術(shù)非限制性地包括將包含或不包含一種或多種補(bǔ)充成分的組分進(jìn)行混和。
本發(fā)明實施方案的藥物組合物包括適于口服、直腸、局部、吸入(例如，通過氣霧劑被吸入)、口腔(例如，舌下)、陰道、胃腸外(例如，皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即，皮膚和粘膜表面，包括呼吸道表面)和經(jīng)皮給藥的這些物質(zhì)，但是在任何給定情況中最適宜的途徑將取決于被治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及所用特定胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的性質(zhì)。
用于口服給藥的藥物組合物可以以離散單元如膠囊、扁囊劑、錠劑或片劑的形式存在，其各自包含預(yù)定數(shù)量的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物；可以為粉劑或顆粒劑；可以為在水性或非水性液體中的溶液或混懸液；或可以為水包油或油包水乳劑。該類制劑可以用任何包括將胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物與適宜載體(其可如上面所表明的那樣包含一種或多種補(bǔ)充成分)相聯(lián)合步驟的適宜藥學(xué)方法來進(jìn)行制備。一般而言，本發(fā)明實施方案的藥物組合物是通過將胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物與液態(tài)或分割的很細(xì)的固態(tài)載體或液態(tài)載體和分割的很細(xì)的固態(tài)載體均勻地仔細(xì)進(jìn)行混和，然后，如果需要的話，將所得的混合物進(jìn)行成型來進(jìn)行制備的。例如，片劑可以通過將包含該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物并包含或不包含一種或多種補(bǔ)充成分的粉末或顆粒進(jìn)行壓縮或模塑來進(jìn)行制備。壓縮片可以通過在適宜的機(jī)器中將自由流動形式，如混有或不混有粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、和/或表面活性/分散劑的粉末或顆粒進(jìn)行壓縮來進(jìn)行制備。模塑片可以通過在適宜的機(jī)器中將用惰性液態(tài)粘合劑潤濕的粉狀化合物進(jìn)行模塑來進(jìn)行制備。
適于頰(舌下)給藥的藥物組合物包括在有味道基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯膠中包含胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的錠劑；和在惰性基質(zhì)如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含該胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的軟錠劑。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，適于胃腸外給藥的藥物組合物包括該胰島素藥物-低聚物共軛物混合物無菌的水性和非水性注射溶液，該制劑優(yōu)選地與將接收其的接受者的血液等滲。這些制劑可包含抗氧劑、緩沖劑、制菌劑和使該組合物與接受其的接受者的血液等滲的溶質(zhì)。水性和非水性的無菌混懸液可包含混懸劑和增稠劑。該組合物可以存在于單位\劑量或多劑量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并可以在冷凍-干燥(冷凍干燥)條件下進(jìn)行儲存，其僅需要在使用之前立即添加無菌的液體載體，例如生理鹽水或注射用水。臨時的注射溶液和混懸液可以由無菌粉末、顆粒和上述類型的片劑來進(jìn)行制備。例如，可提供一種位于密封容器中的單位劑型的包含胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的可注射的穩(wěn)定的無菌組合物。該胰島素藥物-低聚物共軛物混合物可以以能用適宜的可藥用載體重組成適于將其注射給個體的液體組合物的冷凍干燥物的形式被提供。單位劑型一般包含約10mg至約10克胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物。當(dāng)該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物基本是水不溶性時，可以以足以將該胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物乳化到水性載體中的足夠數(shù)量使用足夠量的生理上可接受的乳化劑。一種該類有用的乳化劑是磷脂酰膽堿。
適于直腸給藥的藥物組合物優(yōu)選地是以單位劑量栓劑的形式存在的。其可通過將胰島素藥物-低聚物共軛物的混合物與一種或多種常規(guī)固體載體如可可脂進(jìn)行混和，然后將所得的混合物成型來進(jìn)行制備。
適于局部給藥于皮膚的藥物組合物優(yōu)選地以軟膏、霜、洗劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、或油的形式存在?？捎玫妮d體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇類、醇類、經(jīng)皮增強(qiáng)劑、以及其兩種或多種的組合。
適于經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以以適于與接受者的表皮在長時間內(nèi)保持親密接觸的離散貼劑的形式存在。適于經(jīng)皮給藥的組合物還可以通過離子電滲療法來進(jìn)行傳遞(見，例如，Pharmaceutical Research3(6)318(1986))并且一般采用該胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的緩沖或未進(jìn)行緩沖的水性溶液的形式。適宜的制劑包含載體或bis\tris緩沖劑(pH 6)或乙醇/水并包含0.1至0.2M的活性成分。
還提供了通過使用有效量的該類藥物組合物來治療需要進(jìn)行該類治療的個體的胰島素缺乏的方法。任何胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的有效量、其在本發(fā)明范圍的應(yīng)用對于不同混合物而言都不同，其將取決于各種因素，如個體的年齡和病癥以及傳遞途徑。該類劑量可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)藥理學(xué)方法來確定。作為一種一般性比例，約0.1至約50mg/kg的劑量將具有療效，所有的重量都是以該胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的重量為基礎(chǔ)的。與較高劑量有關(guān)的毒性將靜脈內(nèi)劑量限制在較低的水平如高至約10mg/kg的水平上，所有的重量都是以活性成分的重量為基礎(chǔ)的。對于口服給藥而言可以使用約10mg/kg至約50mg/kg的劑量形式。對于肌內(nèi)注射而言，一般可使用約0.5mg/kg至5mg/kg的劑量形式。給藥頻率通常為每天一、二、或三次或可以根據(jù)控制病癥的需要來進(jìn)行給藥?；蛘?，該藥物-低聚物共軛物可以通過連續(xù)滴注來進(jìn)行給藥。治療的持續(xù)時間取決于被治療胰島素缺陷的類型并且可以長至伴隨個體的一生。
還提供了合成本發(fā)明共軛物混合物的方法。雖然下面的合成途徑實施方案涉及基本單分散的混合物的合成，但可以用類似的合成途徑來合成本發(fā)明實施方案其它的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物。
如反應(yīng)1所說明的那樣提供了一種包含聚乙二醇部分的基本單分散的聚合物的混合物R1(OC2H4)nO-X++R2(OC2H4)mOMs→R2(OC2H4)m+nOR11(I)(II) (III)R1是H或一種親脂性部分。R1優(yōu)選地是H、烷基、芳基烷基、芳族部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯、膽甾烯基、或金剛烷基。R1更優(yōu)選地是H、低級烷基、或芳族部分。R1最優(yōu)選地是H、甲基、或芐基。
在式I中，n為1至25。n優(yōu)選地為1至6。
X+是一種陽離子。X+優(yōu)選地是化合物如強(qiáng)堿中的任何陽離子，其能將PEG上的羥基部分離子化。陽離子的實例非限制性地包括鈉離子、鉀離子、鋰離子、銫離子、和鉈離子。
R2是H或一種親脂性部分。R2優(yōu)選地是直鏈或支鏈烷基、芳基烷基、芳族部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯。R2更優(yōu)選地是低級烷基、芐基、具有1至24個碳原子的脂肪酸部分、或具有1至24個碳原子的脂肪酸部分的酯。R2最優(yōu)選地是甲基、具有1至18個碳原子的脂肪酸部分或具有1至18個碳原子的脂肪酸部分的酯。
在式II中，m為1至25。m優(yōu)選地為1至6。
Ms是甲磺酸酯部分(即，CH3S(O2)-)。
正如反應(yīng)1所說明的那樣，將具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的混合物與具有式II結(jié)構(gòu)的化合物的混合物進(jìn)行反應(yīng)，從而得到包含聚乙二醇部分并具有式III結(jié)構(gòu)的聚合物的混合物。具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的混合物是一種基本單分散的混合物。優(yōu)選地，在式I化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更優(yōu)選地，式I化合物的混合物是一種單分散的混合物。式II化合物的混合物是一種基本單分散的的混合物。優(yōu)選地，在式II化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更優(yōu)選地，式II化合物的混合物是一種單分散的混合物。式III化合物的混合物是一種基本單分散的的混合物。優(yōu)選地，式III化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，式III化合物的混合物是一種單分散的混合物。
反應(yīng)1優(yōu)選地是在約0℃至約40℃下進(jìn)行的，更優(yōu)選地是在約15℃至約35℃下進(jìn)行的，并且最優(yōu)選地是在室溫(約25℃)下進(jìn)行的。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，反應(yīng)1可以進(jìn)行各種時間長度。反應(yīng)1優(yōu)選地進(jìn)行約0.25、0.5或0.75小時至約2、4或8小時。
反應(yīng)1優(yōu)選地是是在一種質(zhì)子惰性溶劑中進(jìn)行的，其中所說的質(zhì)子惰性溶劑非限制性地如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、乙醚、甲基叔-丁醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、或其混合物。更優(yōu)選地，該溶劑是DMF、DMA或甲苯。
式I的化合物與式II的化合物的摩爾比優(yōu)選地高于約1∶1。該摩爾比更優(yōu)選地為至少約2∶1。通過提供過量的式I的化合物可確保基本上所有的式II的化合物都進(jìn)行了反應(yīng)，其有助于如下所討論的式III的化合物的回收率。
式I的化合物優(yōu)選地是如下面反應(yīng)2所說明的那樣來進(jìn)行制備的
R1和X+如上所述并且式IV化合物的混合物基本是單分散的；優(yōu)選地，式IV化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量；并且，更優(yōu)選地，式IV化合物的混合物是一種單分散的混合物。
能將式IV化合物上PEG部分的羥基部分離子化的各種化合物對本領(lǐng)域技術(shù)人人員而言將是顯而易見的。能將羥基部分離子化的化合物優(yōu)選地是強(qiáng)堿。更優(yōu)選地，能將羥基部分離子化的化合物選自氫化鈉、氫化鉀、叔-丁醇鈉、叔-丁醇鉀、丁基鋰(BuLi)、和二異丙胺鋰。能將羥基部分離子化的化合物更優(yōu)選地是氫化鈉。
能將式IV化合物PEG部分上的羥基離子化的化合物與式IV化合物的摩爾比優(yōu)選地為至少約1∶1，并且更優(yōu)選地為至少約2∶1。提供過量的能將羥基部分離子化的化合物可確保式IV的化合物基本上全部反應(yīng)以得到式I的化合物。因此，可以避免如果式IV的化合物和式I的化合物都存在于反應(yīng)產(chǎn)物中時發(fā)生的分離困難的情況。
反應(yīng)2優(yōu)選地是在約0℃至約40℃下進(jìn)行的，更優(yōu)選地是在約0℃至約35℃下進(jìn)行的，并且最優(yōu)選地是在約0℃至約室溫(約25℃)下進(jìn)行的。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，反應(yīng)2可以進(jìn)行各種時間長度。反應(yīng)2優(yōu)選地進(jìn)行約0.25、0.5或0.75小時至約2、4或8小時。
反應(yīng)2優(yōu)選地是在一種質(zhì)子惰性溶劑中進(jìn)行的，其中所說的質(zhì)子惰性溶劑非限制性地如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、乙醚、甲基叔-丁醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、氯仿、四氫萘、十氫萘、1，2二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、或其混合物。更優(yōu)選地，該溶劑是DMF、二氯甲烷或甲苯。
式II的化合物優(yōu)選地是如反應(yīng)3所說明的那樣來進(jìn)行制備的
R2和Ms如上所述并且式V的化合物是以式V化合物基本單分散混合物的形式存在的；在式V化合物的混合物中優(yōu)選地至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量；并且，更優(yōu)選地，式V化合物的混合物是一種單分散的混合物。
Q是一種鹵化物，優(yōu)選地是氯化物或氟化物。
CH3S(O2)Q是甲磺?；u化物。該甲磺?；u化物優(yōu)選地是甲磺酰氯或甲磺酰氟。更優(yōu)選地，該甲磺?；u化物是甲磺酰氯。
該甲磺酰基鹵化物與式V的化合物的摩爾比優(yōu)選地高于約1∶1，并且更優(yōu)選地為至少約2∶1。通過提供過量的甲磺?；u化物可確保式V的化合物基本全部進(jìn)行反應(yīng)以提供式II的化合物。因此，可以避免如果式V的化合物和式II的化合物都存在于反應(yīng)產(chǎn)物中時發(fā)生的分離困難的情況。
反應(yīng)3優(yōu)選地是在約-10℃至約40℃下進(jìn)行的，更優(yōu)選地是在約0℃至約35℃下進(jìn)行的，并且最優(yōu)選地是在約0℃至室溫(約25℃)下進(jìn)行的。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，反應(yīng)3可以進(jìn)行各種時間長度。反應(yīng)3優(yōu)選地進(jìn)行約0.25、0.5或0.75小時至約2、4或8小時。
反應(yīng)3優(yōu)選地是在存在脂族胺的情況下進(jìn)行的，其中所說的脂族胺非限制性地包括，一甲胺、二甲胺、三甲胺、一乙胺、二乙胺、三乙胺、單一異丙胺、二異丙胺、單-正-丁胺、二-正-丁胺、三-正-丁胺、單環(huán)己胺、二環(huán)己胺、或其混合物。更優(yōu)選地，該脂族胺是一種叔胺，如三乙胺。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，各種基本單分散的式V化合物的混合物可以通過商業(yè)途徑獲得。例如，當(dāng)R2是H或甲基時，式V的化合物分別是PEG或mPEG化合物，可以從Aldrich ofMilwaukee，Wisconsin；Fluka of Switzerland，和/或TCl America ofPortland，Oregon商業(yè)獲得。
當(dāng)R2是一種親脂性部分如，例如，高級烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、膽甾烯基、或金剛烷基時，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，式V的化合物可以用各種方法來獲得。式V的化合物優(yōu)選地是用如下的方法提供的R2-OMs+R3(OC2H4)m-O-X2+→R3(OC2H4)m-OR24(VI)(VII) (VIII)R3(OC2H4)m-OR2→H(OC2H4)m-OR25(VIII) (V)R2是一種親脂性部分，優(yōu)選地是高級烷基、脂肪酸酯、膽甾烯基、或金剛烷基，更優(yōu)選地是脂肪酸的低級烷基酯，并且最優(yōu)選地是具有1至18個碳原子的脂肪酸的乙基酯。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，R3是H、芐基、三苯甲基、四氫吡喃、或其它醇保護(hù)基團(tuán)。
X2+是如上面在描述X+時所描述的陽離子。
m的值如上所述。
對于反應(yīng)4而言，將式VI化合物的混合物與式VII化合物的混合物在與反應(yīng)1所描述的這些條件相似的條件下進(jìn)行反應(yīng)。式VI化合物的混合物是基本單分散的混合物。優(yōu)選地，在式VI化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，式VI化合物的混合物是一種單分散的混合物。式VII化合物的混合物是一種基本單分散的混合物。優(yōu)選地，在式VII化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，式VII化合物的混合物是一種單分散的混合物。
對于反應(yīng)5而言，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以用各種方法將式VIII的化合物水解，從而將R3部分轉(zhuǎn)化成一種醇。當(dāng)R3是芐基或三苯甲基時，該水解優(yōu)選地是如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣，在存在鈀-炭催化劑的情況在用H2進(jìn)行的。當(dāng)然，當(dāng)R3是H時，反應(yīng)5是不必要的。
式VI的化合物可以通過商業(yè)途徑獲得或可以參考反應(yīng)3如上所述的那樣獲得。式VII的化合物可參考反應(yīng)2如上所述的那樣獲得。
可進(jìn)一步將基本單分散的包含PEG部分并具有上面式III的結(jié)構(gòu)的聚合物的混合物與其它基本單分散的包含PEG部分的聚合物進(jìn)行反應(yīng)來延長PEG鏈。例如，可以使用下面的流程圖 R2(OC2H4)m+n-OMs+R4(OC2H4)p-O-X2+→R2(OC2H4)m+n+p-OR4(IX) (X) (XI)Ms、m和n如上面反應(yīng)1所述；p與n和m相似，并且X2+與上面反應(yīng)1所述的X+相似。Q如上面反應(yīng)3所述。R2如上面反應(yīng)1所述并優(yōu)選地是低級烷基。R1是H。反應(yīng)6優(yōu)選地是用與上面反應(yīng)3所述的方法相似的方法來進(jìn)行的。反應(yīng)7優(yōu)選地是用與上面反應(yīng)1所述的方法相似的方法來進(jìn)行的。優(yōu)選地，在式III化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更優(yōu)選地，式III化合物的混合物是一種單分散的混合物。式X化合物的混合物是一種基本單分散的混合物。優(yōu)選地，在式X化合物的混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更優(yōu)選地，式X化合物的混合物是一種單分散的混合物。
圖1所示的流程圖說明了本發(fā)明實施方案的一種方法，現(xiàn)在將對其進(jìn)行描述。基本單分散的包含聚乙二醇的低聚物的合成是通過基本單分散的單芐基醚(1)的制備來開始的。將過量的可通過商業(yè)途徑獲得的基本單分散的聚乙二醇與芐基氯在存在水性氫氧化鈉的情況下如Coudert等人(Synthetic CommuNications，16(1)19-26(1986))所述的那樣來進(jìn)行反應(yīng)。然后通過添加NaH來制備1的鈉鹽，并使這種鈉鹽與由羥基鏈烷酸(2)的酯合成的甲磺酸酯進(jìn)行反應(yīng)。通過催化氫化將甲磺酸酯置換的產(chǎn)物(3)脫芐基化從而得到醇(4)?？梢酝ㄟ^加入甲磺酰氯來制備這種醇的甲磺酸酯(5)并將其在與基本單分散的聚乙二醇衍生物單甲醚的鈉鹽的反應(yīng)中用作親電體，從而將該低聚物的聚乙二醇部分延長至所需的長度，得到了延長的酯(6)?？梢栽谒詨A中將該酯水解成酸(7)并通過與碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)而將其轉(zhuǎn)化成活性酯(8)。雖然圖1中所列舉的低聚物是用N-羥基丁二酰亞胺來進(jìn)行活化的，但應(yīng)當(dāng)清楚的是可以使用其它試劑來對本發(fā)明的低聚物進(jìn)行活化，所說的其它試劑非限制性地包括活性氯甲酸苯酯類如氯甲酸對-硝基苯酯、氯甲酸苯酯、3，4-苯基二氯甲酸酯、和3，4-苯基二氯甲酸酯；tresylation；和乙縮醛形成。
還是參考圖1，q為1至24。優(yōu)選地，q為1至18，并且q更優(yōu)選地為4至16。R4是能進(jìn)行水解從而提供羧酸的部分。R4優(yōu)選地是低級烷基并且更優(yōu)選地是乙基。變量n和m如上面反應(yīng)1所述。
在這里所述的操作中所用的所有起始材料都可通過商業(yè)途徑獲得或可用可通過商業(yè)途徑獲得的起始材料用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來進(jìn)行制備。
現(xiàn)在將參考下面的實施例來對本發(fā)明進(jìn)行描述。應(yīng)當(dāng)意識到這些實施例是用于對本發(fā)明的各方面進(jìn)行說明，而不是要對如權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。
實施例實施例1至10除非特別說明，否則實施例1至10的反應(yīng)是在氮?dú)庀掠么帕嚢柽M(jìn)行的?！昂筇幚?Work-up)”表示的是用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取、將有機(jī)相用飽和NaCl溶液進(jìn)行洗滌、干燥(MgSO4)、并蒸發(fā)(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))。薄層色譜法是用使用硅膠60°F-254進(jìn)行了預(yù)涂布的Merck玻璃板進(jìn)行的，用碘蒸氣使斑點(diǎn)顯色。所有的質(zhì)譜都是用MacromolecularResources Colorado State UNiversity，CO進(jìn)行測定的，并以m/z，(相對強(qiáng)度)的順序來進(jìn)行報告。元素分析和熔點(diǎn)是用GalbraithLaboratories，Inc.，Knoxville，TN進(jìn)行的。實施例1-10涉及圖2所示的流程圖。
實施例18-甲氧基-1-(甲基磺?；?氧基-3，6-二氧雜辛烷(9)將非多分散的三甘醇單甲醚分子(4.00mL，4.19g，25.5mmol)和三乙胺(4.26mL，3.09g，30.6mmol)在無水二氯甲烷(50mL)中的溶液在冰浴上進(jìn)行冷卻并將其放放置在氮?dú)鈿夥障?。通過添加漏斗向其中滴加甲磺酰氯(2.37mL，3.51g，30.6mmol)在無水二氯甲烷(20mL)中的溶液。在完成氯化物添加后10分鐘，將該反應(yīng)混合物從冰浴上取下并使之回復(fù)至室溫。將該混合物再攪拌1小時，此時的TLC(用帶有15％MeOH的CHCl3作為洗脫劑)表明沒有殘留的三甘醇單甲醚。
將該反應(yīng)混合物用另外75mL二氯甲烷進(jìn)行稀釋并將其連續(xù)用飽和NaHCO3、水和鹽水進(jìn)行洗滌。將有機(jī)相用Na2SO4進(jìn)行干燥，過濾并在真空下進(jìn)行濃縮，得到澄清油狀物形式的非多分散的化合物9的混合物(5.31g，86％)。
實施例2乙二醇單甲醚(10)(m＝4，5，6)在N2下，向進(jìn)行著攪拌的非多分散的化合物11(35.7mmol)在無水DMF(25.7mL)中的溶液中分次加入60％NaH在礦物油中的分散體，并將該混合物在室溫下攪拌1小時。向這種鹽12中一次全部加入非多分散的甲磺酸酯9(23.36)在無水DMF(4ml)中的溶液，然后將該混合物在室溫下攪拌3.5小時。用TLC(12％CH3OH-CHCl3)對反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測。將該反應(yīng)混合物用等量的1N HCl進(jìn)行稀釋，然后用乙酸乙酯(2×20ml)進(jìn)行萃取并將之棄去。通過水溶液的萃取和后處理得到非多分散的聚合物10(收率82-84％)。
實施例33，6，9，12，15，18，21-七氧雜二十二烷醇(10)(m＝4)油狀物；Rf 0.46(甲醇∶氯仿＝3∶22)；MS m/z C15H32O8的計算值為340.21(M++1)，實測值為341.2。
實施例4
3，6，9，12，15，18，21，24-八氧雜二十五烷醇(10)(m＝5)油狀物；Rf 0.43(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C17H36O9的計算值為384.24(M++1)，實測值為385.3。
實施例53，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧雜二十八醇(10)(m＝6)油狀物；Rf 0.42(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C19H40O10的計算值為428.26(M++1)，實測值為429.3。
實施例620-甲氧基-1-(甲基磺?；?氧基-3，6，9，12，15，18-六氧雜二十烷(14)如對于9所述的那樣從醇13(m＝4)和甲磺酰氯中以定量的收率獲得非多分散的化合物14，其是一種油狀物；Rf 0.4(乙酸乙酯∶乙腈＝1∶5)；MS m/z C17H37O10的計算值為433.21(M++1)，實測值為433.469。
實施例7乙二醇單甲醚(15)(m＝3，4，5)通過上面化合物10所述的方法由二醇來制備非多分散的化合物15。
實施例83，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧雜二十一醇(15)(m＝3)油狀物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C21H44O11的計算值為472.29(M++1)，實測值為472.29。
實施例93，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧雜tetratricosanol(15)(m＝4)油狀物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C23H48O12的計算值為516.31(M++1)，實測值為516.31。
實施例103，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧雜heptatricosanol(15)(m＝5)油狀物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C25H52O13的計算值為560.67(M++1)，實測值為560.67。
實施例11至18涉及圖3所示的流程圖。
實施例11六乙烯二醇單芐基醚(16)將通過將3.99g(100mmol)NaOH溶解于4ml水中所制備的氫氧化鈉溶液緩慢加入到非多分散的六乙烯二醇(28.175g，25ml，100mmol)中。向其中加入芐基氯(3.9g，30.8mmol，3.54ml)并將該反應(yīng)混合物在攪拌的同時加熱至100℃，加熱18小時。然后將該反應(yīng)混合物冷卻，用鹽水(250ml)進(jìn)行洗滌并用二氯甲烷(200ml×2)進(jìn)行萃取。將所合并的有機(jī)層用鹽水洗滌一次，用Na2SO4進(jìn)行干燥，過濾并在真空下進(jìn)行濃縮，得到暗褐色的油狀物。將該粗品混合物用閃柱色譜法(硅膠，梯度洗脫∶乙酸乙酯至9/1的乙酸乙酯/甲醇)進(jìn)行純化，得到8.099g(70％)黃色油狀物形式的非多分散的16。
實施例126-甲基磺酰氧基己酸乙酯(17)將非多分散的6-羥基己酸乙酯(50.76ml，50.41g，227mmol)在無水二氯甲烷(75ml)中的溶液在冰浴上進(jìn)行冷卻并將其放置在氮?dú)鈿夥障隆Ｏ蚱渲屑尤肴野?34.43ml，24.99g，247mmol)。從添加漏斗向其中添加甲磺酰氯(19.15ml，28.3g，247mmol)在無水二氯甲烷(75ml)中的溶液。將該混合物攪拌三個半小時，當(dāng)冰浴熔化時其緩慢回復(fù)至室溫。將該混合物通過硅膠進(jìn)行過濾，將濾液依次用水、飽和NaHCO3、水和鹽水進(jìn)行洗滌。將有機(jī)相用Na2SO4進(jìn)行干燥，過濾并在真空下進(jìn)行濃縮，得到一種淺黃色的油狀物。該粗品的最后純化是用閃柱色譜法(硅膠，1/1己烷/乙酸乙酯)進(jìn)行的，得到一種澄清的無色油狀物形式的非多分散的產(chǎn)品。FAB MSm/e 239(M+H)，193(M-C2H5O)。
實施例136-{2-[2-(2-{2-[2-(2-芐氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(18)將氫化鈉(3.225g或60％油分散體，80.6mmol)混懸于80ml無水甲苯中，將其放置在氮?dú)鈿夥障虏⒃诒∩线M(jìn)行冷卻。將非多分散的醇16(27.3g，73.3mmol)在80ml無水甲苯中的溶液加入到該NaH混懸液中。將該混合物在0℃下攪拌30分鐘，使之回復(fù)至室溫并將其再攪拌5小時，在此期間，該混合物變成一種澄清的褐色溶液。將在80ml無水甲苯中的非多分散的甲磺酸酯17(19.21g，80.6mmol)加入到該NaH/醇混合物中，將所合并的溶液在室溫下攪拌3天。將該反應(yīng)混合物用50ml甲醇停止反應(yīng)并使其通過堿性氧化鋁進(jìn)行過濾。將濾液在真空下進(jìn)行濃縮并用閃柱色譜法(硅膠，梯度洗脫3/1的乙酸乙酯/己烷至乙酸乙酯)進(jìn)行純化，得到一種淺黃色油狀物形式的非多分散的產(chǎn)物(16.52g，44％)。FAB MSm/e 515(M+H)。
實施例146-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(19)將非多分散的芐基醚18(1.03g，2.0mmol)溶解于25ml乙醇中。向這種溶液中加入270mg 10％ Pd/C，并將該混合物放在氫氣氛下并將其攪拌4小時，此時，TLC表明起始材料完全消失。將該反應(yīng)混合物用硅藻土545過濾以除去催化劑，然后將濾液在真空下進(jìn)行濃縮，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(0.67g，79％)。FAB MSm/e425(M+H)，447(M+Na)。
實施例156-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲基磺?；已趸?乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(20)將非多分散的醇19(0.835g，1.97mmol)溶解于3.5ml無水二氯甲烷中并將其放置在氮?dú)鈿夥障?。向其中加入三乙?0.301ml，0.219g，2.16mmol)并將該混合物在冰浴上進(jìn)行冷卻。在兩分鐘后，向其中加入甲磺酰氯(0.16ml，0.248g，2.16mmol)。將該混合物在0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌2小時。將該反應(yīng)混合物用硅膠進(jìn)行過濾以除去氯化三乙銨，然后將將濾液依次用水、飽和NaHCO3、水和鹽水進(jìn)行洗滌。將有機(jī)相用Na2SO4進(jìn)行干燥，過濾并在真空下進(jìn)行濃縮。將殘余物用柱色譜法(硅膠，9/1乙酸乙酯/甲醇)進(jìn)行純化，得到澄清油狀物形式的非多分散的化合物20(0.819g，83％)。FAB MSm/e503(M+H)。
實施例166-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸乙酯(21)將NaH(88mg 60％在油中的分散體，2.2mmol)在N2下混懸于無水甲苯(3ml)中并將其冷卻至0℃。向其中加入已經(jīng)通過與甲苯共沸蒸餾進(jìn)行了干燥的非多分散的二甘醇單甲醚(0.26ml，0.26g，2.2mmol)。將該反應(yīng)混合物加溫至室溫并將其攪拌4小時，在此期間，該渾濁灰色混懸液變澄清并變黃然后變成褐色。向其中加入在2.5ml無水甲苯中的甲磺酸酯20(0.50g，1.0mmol)。在將其在室溫下攪拌一整夜，通過加入2ml甲醇使該反應(yīng)淬熄并將所得的溶液用硅膠進(jìn)行過濾。將濾液在真空下進(jìn)行濃縮，F(xiàn)AB MSm/e 499(M+H)，521(M+Na)。通過用制備色譜(硅膠，19/3氯仿/甲醇)進(jìn)行另外的純化，得到澄清的黃色油狀物形式的非多分散的產(chǎn)物(0.302g 57％)。FAB MSm/e527(M+H)，549(M+Na)。
實施例176-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸(22)將非多分散的酯21(0.25g，0.46mmol)在0.71ml 1N NaOH中攪拌18小時。在18小時后，將該混合物在真空下進(jìn)行濃縮以除去醇并將殘余物溶解于另外10ml水中。將該水性溶液用2N HCl酸化至pH為2并將產(chǎn)物萃取進(jìn)二氯甲烷(30ml×2)中。然后將所合并的有機(jī)層用鹽水(25ml×2)進(jìn)行洗滌，用Na2SO4進(jìn)行干燥，過濾并在真空下進(jìn)行濃縮，得到黃色油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(0.147g，62％)。FAB MSm/e 499(M+H)，521(M+Na)。
實施例186-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(23)將非多分散的酸22(0.209g，0.42mmol)溶解于4ml無水二氯甲烷中并在N2氣氛下將其加入到已經(jīng)包含NHS(N-羥基丁二酰亞胺)(57.8mg，0.502mmol)或EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)(98.0mg，0.502mmol)的干燥燒瓶中。將該溶液在室溫下攪拌一整夜，用硅膠過濾以除去過量的試劑和由EDC形成的脲。將濾液在真空下進(jìn)行濃縮，得到暗黃色油狀物形式的非多分散的產(chǎn)物(0.235g，94％)。FAB MSm/e 596(M+H)，618(M+Na)。
實施例19至24涉及圖4所示的流程圖。
實施例19三甘醇單甲醚的甲磺酸酯(24)向在冰浴上冷卻至0℃的CH2Cl2(100mL)中加入單分散的三甘醇單甲醚(25g，0.15mol)。然后加入三乙胺(29.5mL，0.22mol)并將該溶液在0℃下攪拌15分鐘，然后向其中滴加甲磺酰氯(13.8mL，0.18mol，溶解于20mL CH2Cl2中)。將該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，使之加溫至室溫，然后將其攪拌2小時。將粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2～200mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾，然后用H2O(300mL)、5％NaHCO3(300mL)、H2O(300mL)、飽和NaCl(300mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，然后蒸發(fā)至干燥。然后將該油狀物在真空管道中放置～2小時以確保干燥，得到黃色油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(29.15g，收率80％)。
實施例20七甘醇單甲醚(25)向非多分散的四甘醇(51.5g，0.27mol)在THF(1L)中的溶液中加入叔-丁醇鉀(14.8g，0.13mol，在約30分鐘內(nèi)分成小部分加入)。然后，將該反應(yīng)混合物攪拌1小時，然后向其中滴加溶解于THF(90mL)中的24(29.15g，0.12mol)并將該反應(yīng)混合物攪拌一整夜。將粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2，～200mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾并將其蒸發(fā)至干燥。然后將該油狀物溶解于HCl(250mL，1N)中并用乙酸乙酯(250mL)進(jìn)行洗滌以除去過量的24?？赡苄枰硗獾囊宜嵋阴?125mL)洗滌以除去剩余的24。將水相用CH2Cl2(125mL體積)反復(fù)進(jìn)行洗滌直至已經(jīng)從水相中除去了大多數(shù)25。第一次萃取液將包含24、25、和偶聯(lián)二聚物(dicoupled)副產(chǎn)品，并應(yīng)當(dāng)用HCl(125mL，1N)進(jìn)行后萃取。合并有機(jī)層并將其蒸發(fā)至干燥。然后，將所得的油狀物溶解于CH2Cl2(100mL)中并將其用H2O(50mL體積)反復(fù)進(jìn)行洗滌直至25被除去。將水性部分合并，總體積為500mL，向其中加入NaCl直至溶液變渾濁，然后將其用CH2Cl2(2×500mL)進(jìn)行洗滌。合并有機(jī)層，用MgSO4進(jìn)行干燥，然后將其蒸發(fā)至干燥，得到油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(16.9g，收率41％)?？蓪⒅貜?fù)進(jìn)行一步或多步純化操作以確保高純度。
實施例218-溴辛酸酯(octoanate)(26)向8-溴辛酸(5.0g，22mmol)在乙醇(100mL)中的溶液中加入H2SO4(0.36mL，7.5mmol)并將該反應(yīng)在攪拌下加熱至回流加熱3小時。將該粗反應(yīng)混合物冷卻至室溫并將其用H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，然后將其蒸發(fā)至干燥，得到一種澄清的油狀物(5.5g，收率98％)。
實施例22MPEG7-C8酯(27)的合成向非多分散的化合物25(3.0g，8.8mmol)在醚(90mL)中的溶液中加入叔-丁醇鉀(1.2g，9.6mmol)并將該反應(yīng)混合物攪拌1小時。然后向其中滴加溶解于乙醚(10ml)中的非多分散的化合物26(2.4g，9.6mmol)，并將該反應(yīng)混合物攪拌一整夜。將該粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2，～200mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾并將其蒸發(fā)至干燥。將所得的油狀物溶解于乙酸乙酯中并用H2O(2×200mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，并蒸發(fā)至干燥。用柱色譜法(硅膠，乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇，10∶1)進(jìn)行處理，得到澄清的油狀物形式的標(biāo)題化合物(0.843g，收率19％)。
實施例23MPEG7-C8酸(28)向非多分散化合物27的油(0.70g，1.4mmol)中加入1N NaOH(2.0mL)并將該反應(yīng)混合物攪拌4小時。將該粗反應(yīng)混合物進(jìn)行濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl進(jìn)行飽和，并將其用CH2Cl2(2×50mL)進(jìn)行洗滌。合并有機(jī)層，將其用飽和NaCl進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(0.35g，收率53％)。
實施例24MPEG7-C8酸(29)的活化將非多分散的mPEG7-C8-酸28(0.31g，0.64mmol)溶解于3ml無水二氯甲烷中，然后加入N-羥基丁二酰亞胺(0.079g，0.69mmol)或EDCI-HCl(135.6mg，0.71mmol)在無水二氯甲烷中溶液。將該反應(yīng)攪拌幾小時，然后將其用1N HCl、水進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，過濾并進(jìn)行濃縮。將粗材料用閃柱色譜法進(jìn)行純化，濃縮，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物并將其通過真空進(jìn)行干燥。
實施例25至29涉及圖5所示的流程圖。
實施例2510-羥基癸酸酯(30)向非多分散的10-羥基癸酸(5.0g，26.5mmol)在乙醇(100mL)中的溶液中加入H2SO4(0.43mL，8.8mmol)并在攪拌下將該反應(yīng)加熱至回流加熱3小時。將該粗反應(yīng)混合物冷卻至室溫并用H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，然后蒸發(fā)至干燥，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(6.9g，收率98％)。
實施例2610-羥基癸酸酯的甲磺酸酯(31)向CH2Cl2(27mL)的溶液中加入非多分散的10-羥基癸酸酯30(5.6g，26mmol)并將其在冰浴上冷卻至0℃。然后向其中加入三乙胺(5mL，37mmol)并將其在0℃下攪拌15分鐘。然后，向其中加入溶解于CH2Cl2(3mL)中的甲磺酰氯(2.7mL，24mmol)并將該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，將冰浴除去，然后將該反應(yīng)在室溫下再攪拌2小時。將該粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2，80mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾，然后將濾液用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、飽和NaCl(100mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到淡黃色油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(7.42g，收率97％)。
實施例27MPEG7-C10酯(32)向非多分散的七甘醇單甲醚25(2.5g，7.3mmol)在四氫呋喃(100mL)中的溶液中加入氫化鈉(0.194g，8.1mmol)并將該反應(yīng)混合物攪拌1小時。然后向其中滴加溶解于四氫呋喃(10mL)中的非多分散的10-羥基癸酸酯的甲磺酸酯31(2.4g，8.1mmol)，并將該反應(yīng)混合物攪拌一整夜。將該粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2，～200mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾，然后將其蒸發(fā)至干燥。將所得的油狀物溶解于乙酸乙酯中并將其用H2O(2×200mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，蒸發(fā)至干燥，用色譜法進(jìn)行處理(硅石，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，然后用色譜法進(jìn)行處理(硅石，乙酸乙酯)，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(0.570g，收率15％)。
實施例28MPEG7-C10酸(33)向非多分散的mPEG7-C10酯32的油(0.570g，1.1mmol)中加入1N NaOH(1.6mL)并將該反應(yīng)混合物攪拌一整夜。將該粗反應(yīng)混合物進(jìn)行濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和，并用CH2Cl2(2×50mL)進(jìn)行洗滌。合并有機(jī)層，用飽和NaCl(2×50mL)進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(0.340g，收率62％)。
實施例29MPEG7-C10酸(34)的活化用與上面實施例24所描述的操作相似的操作來進(jìn)行非多分散的酸33的活化。
實施例30和31涉及圖6所示的流程圖。
實施例30C18(PEG6)低聚物(36)的合成將非多分散的硬脂酰氯35(0.7g，2.31mmol)緩慢添加到PEG6(5g，17.7mmol)和吡啶(0.97g，12.4mmol)在苯中的混合物中。將該反應(yīng)混合物攪拌幾小時(～5)。然后用使用乙酸乙酯/甲醇作為展開溶劑的TLC跟隨該反應(yīng)。然后，將該反應(yīng)混合物用水進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，濃縮，真空干燥。用FABMS對進(jìn)行了純化的非多分散的化合物36進(jìn)行分析m/e 549/M+H。
實施例31C18(PEG6)低聚物的活化非多分散的C18(PEG6)低聚物的活化是分兩步進(jìn)行的1)將非多分散的硬脂酰-PEG6 36(0.8g，1.46mmol)溶解于甲苯中并將其加入到用冰浴進(jìn)行冷卻的碳酰氯溶液中(10ml，20％，在甲苯中)。將該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌1小時，然后將其在室溫下攪拌3小時。然后，將碳酰氯或甲苯蒸餾掉并將剩下的非多分散的硬脂酰PEG氯甲酸酯37用P2O5干燥一整夜。
2)向非多分散的硬脂酰PEG6氯甲酸酯36(0.78g，1.27mmol)和TEA(128mg，1.27mmol)在無水二氯甲烷中的溶液中加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)在二氯甲烷中的溶液。將該反應(yīng)混合物攪拌16小時，然后將其用水進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，過濾，濃縮，真空干燥，得到非多分散的被活化的C18(PEG6)低聚物38。
實施例32至37涉及圖7所示的流程圖。
實施例32四甘醇單芐基醚(39)向非多分散的四甘醇的油(19.4g，0.10mol)中加入NaOH溶液(4.0g在4.0mL中)并將該反應(yīng)攪拌15分鐘。然后，向其中加入芐基氯(3.54mL，30.8mmol)并將該反應(yīng)混合物加熱至100℃并將其攪拌一整夜。將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用飽和NaCl(250mL)進(jìn)行稀釋，然后用CH2Cl2(2×200mL)進(jìn)行洗滌。合并有機(jī)層，用飽和NaCl進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，然后用色譜法進(jìn)行處理(硅石，乙酸乙酯)，得到黃色油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(6.21g，收率71％)。
實施例33四甘醇單芐基醚的甲磺酸酯(40)向CH2Cl2(20mL)的溶液中加入非多分散的四甘醇單芐基醚39(6.21g，22mmol)并將其在冰浴上冷卻至0℃。然后向其中加入三乙胺(3.2mL，24mmol)并將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌15分鐘。然后，向其中加入溶解于CH2Cl2(2mL)中的甲磺酰氯(1.7mL，24mmol)并將該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴并將該反應(yīng)在室溫下再攪拌2小時。將該粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2，80mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾，將濾液用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、飽和NaCl(100mL)進(jìn)行洗滌，然后用MgSO4進(jìn)行干燥。將所得的黃色油狀物用使用包含活性炭(10g)的硅石墊的色譜法進(jìn)行處理，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(7.10g，收率89％)。
實施例34八甘醇單芐基醚(41)向包含氫化鈉(0.43g，18mmol)的四氫呋喃(140mL)溶液中滴加在四氫呋喃(10mL)中的非多分散的四甘醇(3.5g，18mmol)溶液并將該反應(yīng)混合物攪拌1小時。然后，向其中滴加溶解于四氫呋喃(10mL)中的非多分散的四甘醇單芐基醚40(6.0g，16.5mmol)的甲磺酸酯并將該反應(yīng)混合物攪拌一整夜。將該粗反應(yīng)混合物用硅藻土(用CH2Cl2，250mL進(jìn)行了洗滌)進(jìn)行過濾并將濾液用H2O進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，并蒸發(fā)至干燥。將所得的油狀物用色譜法(硅石，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)和色譜法(硅石，氯仿/甲醇，25∶1)進(jìn)行處理，得到澄清油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物(2.62g，收率34％)。
實施例35硬脂酸酯PEG8-芐基(43)的合成向進(jìn)行著攪拌的進(jìn)行了冷卻的非多分散的八甘醇單芐基醚41(0.998g，2.07mmol)和吡啶(163.9mg，2.07mmol)中加入在苯中的非多分散的硬脂酰氯42(627.7mg，2.07mmol)。將該反應(yīng)混合物攪拌一整夜(18小時)。下一天將該反應(yīng)混合物用水進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，濃縮，真空干燥。然后將該粗品用使用10％甲醇/90％氯仿的硅膠閃柱色譜法進(jìn)行處理。將包含產(chǎn)物的級分合并，濃縮，真空干燥，得到非多分散的標(biāo)題化合物。
實施例36硬脂酸酯-PEG8-芐基的氫解向非多分散的硬脂酸酯-PEG8-Bz143(0.854g 1.138mmol)的甲醇溶液中加入Pd/C(10％)(鈀，10％wt.在活性碳上)。將該反應(yīng)混合物在氫氣下攪拌一整夜(18小時)。然后，將該溶液過濾，濃縮，用使用10％甲醇/90％氯仿的閃柱色譜法進(jìn)行純化，收集Rt＝0.6的級分，濃縮，干燥，得到非多分散的酸44。
實施例37C18(PEG8)低聚物的活化如上面實施例31中硬脂酸酯-PEG6所述的那樣來進(jìn)行非多分散的硬脂酸酯-PEG8低聚物的兩步活化，得到非多分散的進(jìn)行了活化的C18(PEG8)低聚物45。
實施例38活性三甘醇單甲基低聚物的合成下面的說明涉及圖8所示的流程圖。將包含20％碳酰氯的甲苯(100ml，約18.7g，189mmol碳酰氯)在N2氣氛下冷卻至0℃。將非多分散的mTEG(三甘醇，單甲醚，7.8g，47.5mmol)溶解于25mL無水乙酸乙酯中并將其加入到進(jìn)行了冷卻的碳酰氯溶液中。將該混合物在0℃下攪拌1小時，然后使之加溫至室溫并將其再攪拌兩個半小時。通過真空蒸餾除去剩余的碳酰氯、乙酸乙酯和甲苯，剩下一種澄清油狀殘余物形式的非多分散的mTEG氯甲酸酯46。
將該非多分散的殘余物46溶解于50mL無水二氯甲烷中，向其中加入TEA(三乙胺，6.62mL，47.5mmol)和NHS(N-羥基丁二酰亞胺，5.8g，50.4mmol)。將該混合物在干燥空氣下，在室溫下攪拌二十小時，在此期間，出現(xiàn)大量白色沉淀。將該混合物過濾以除去這種沉淀并將其在真空下進(jìn)行濃縮。將所得的油狀物47用二氯甲烷進(jìn)行吸收并將其用冷去離子水洗滌兩次，用1N HCl洗滌兩次并用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用MgSO4進(jìn)行干燥，過濾，得到澄清的淡黃色油狀物形式的非多分散的標(biāo)題化合物。如果需要的話，可將該NHS酯用使用EtOAc作為洗脫劑的硅膠上的閃柱色譜法進(jìn)行進(jìn)一步純化。
實施例39活性棕櫚酸酯-TEG低聚物的合成下面的說明涉及圖9所示的流程圖。將非多分散的棕櫚酸酐(5g；10mmol)溶解于無水THF(20mL)中并在室溫下進(jìn)行攪拌。向這種進(jìn)行著攪拌的溶液中加入3mol過量的吡啶，然后加入非多分散的三甘醇(1.4mL)。將該反應(yīng)混合物攪拌1小時(反應(yīng)過程用TLC；乙酸乙酯-氯仿；3∶7來進(jìn)行監(jiān)測)。在反應(yīng)結(jié)束時，除去THF并將產(chǎn)物與10％H2SO4進(jìn)行混和，然后用乙酸乙酯(3×30mL)進(jìn)行萃取。將所合并的提取物依次用水、鹽水進(jìn)行洗滌，用MgSO4進(jìn)行干燥，蒸發(fā)，得到非多分散的產(chǎn)物48。在攪拌的同時將N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(3mmol)在DMF(約10mL)中的溶液加入到非多分散的產(chǎn)物48(1mmol)在10mL無水DMF的溶液中。向該反應(yīng)混合物中緩慢加入氫化鈉(3mmol)。將該反應(yīng)混合物攪拌幾小時(例如，5小時)。向其中加入乙醚以使得活性低聚物沉淀。將這種過程重復(fù)三次，最后將產(chǎn)物干燥。
實施例40活性六甘醇單甲基低聚物的合成下面的說明涉及圖10所示的流程圖。用與上面實施例39中非多分散的三甘醇的制備方法相類似的方法來制備非多分散的活性六甘醇單甲醚。將在甲苯溶液中的20％碳酰氯溶液(35mL，6.66g，67.4mmol碳酰氯)在N2氣氛下在冰/鹽水浴上進(jìn)行冷卻。將非多分散的六甘醇50(1.85mL，2.0g，6.74mmol)溶解于5mL無水EtOAc中并通過注射器向其中加入碳酰氯溶液。將該反應(yīng)混合物在冰浴上持續(xù)攪拌一小時，除去冰浴，將其在室溫下再攪拌2.5小時。通過真空蒸餾除去碳酰氯、EtOAc、和甲苯，剩下一種澄清的油狀殘余物形式的非多分散的化合物51。
將該非多分散的殘余物51溶解于20mL無水二氯甲烷中并將其放在一種干燥的惰性氣氛下。向其中加入三乙胺(0.94mL，0.68g，6.7mmol)，然后向其中加入NHS(N-羥基 丁二酰亞胺，0.82g，7.1mmol)，將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時。將該混合物用硅膠進(jìn)行過濾以除去白色沉淀并將其在真空下進(jìn)行濃縮。將殘余物用二氯甲烷進(jìn)行吸收，用冷水洗滌兩次，用1N HCl洗滌一次并用鹽水洗滌一次。將有機(jī)相用Na2SO4進(jìn)行干燥，過濾，濃縮。用閃柱色譜法(硅膠，EtOAc)進(jìn)行最后的純化，得到UV活性的非多分散的NHS酯52。
實施例41胰島素-低聚物共軛物的合成在224℃下向在25mL二甲基亞砜中的人胰島素(鋅或無鋅，2g，0.344mmol，以干重為基礎(chǔ))(純度＞99％)中加入8mL三乙胺(純度＞99％)。將所得的混合物在224℃下攪拌5至10分鐘。在攪拌下，在224℃下向其中迅速加入在7.5mL乙腈中的上面實施例18的活性低聚物(0.188g，0.36mmol，以100％活化為基礎(chǔ))。將該溶液攪拌45分鐘并用溫度低于27℃的醋酸使之淬熄。用分析HPLC對該反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。這種反應(yīng)條件以40-60％的收率得到單共軛的PEG7-己基-胰島素(PEG7-己基-胰島素，B29單共軛物)。將該粗反應(yīng)混合物(PEG7-己基-胰島素，B29單共軛，40-60％，未反應(yīng)的胰島素為8-25％，相關(guān)物質(zhì)為15-35％)進(jìn)行透析或二次過濾(difiltered)(除去3000-3500分子量，MWCO)以除去有機(jī)溶劑和小分子量的雜質(zhì)，用醋酸銨緩沖劑進(jìn)行交換并將其冷凍干燥。
用分析HPLC對該在B29位上單共軛的PEG7-己基-胰島素的共軛反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。這種分析HPLC法使用Waters Delta-Pak C18柱，150×3.9mm I.D.，5μm，300。溶劑系統(tǒng)的組成為溶劑B0.1％在50/50甲醇/水中的TFA，和溶劑D0.1％在甲醇中的TFA。該梯度系統(tǒng)如下

實施例42用實施例41的操作來使人胰島素與實施例24的活性低聚物進(jìn)行共軛。
實施例43用實施例41的操作來使人胰島素與實施例31的活性低聚物進(jìn)行共軛。
實施例44用實施例41的操作來使人胰島素與實施例37的活性低聚物進(jìn)行共軛。
實施例46用實施例41的操作來使人胰島素與實施例38的活性低聚物進(jìn)行共軛。
實施例47用實施例41的操作來使人胰島素與實施例39的活性低聚物進(jìn)行共軛。
實施例48用實施例41的操作來使人胰島素與實施例40的活性低聚物進(jìn)行共軛。
實施例49人胰島素-低聚物共軛物的混合物的分散系數(shù)的測定人胰島素-低聚物共軛物混合物的分散系數(shù)的測定如下。提供一種人胰島素-低聚物共軛物的混合物，例如如上面實施例41所述的那樣來提供。將該混合物的第一份樣品用HPLC進(jìn)行純化以將樣品中的各種人胰島素-低聚物共軛物分離開。假定各分離的級分包含一種純單分散共軛物混合物，則“n”等于所收集的級分?jǐn)?shù)。該混合物可包括一種或多種下面的共軛物，其是通過表明共軛位置，然后表明共軛度來進(jìn)行描述的GlyA1單共軛物；PheB1單共軛物；LysB29單共軛物；GlyA1，PheB1二共軛物；GlyA1，LysB29二共軛物；PheB1，LysB29二共軛物；和/或GlyA1，PheB1，LysB29三共軛物。用質(zhì)譜對各分離出來的混合物級分進(jìn)行分析以測定該級分的質(zhì)量，其使得各被分離的級分被分類成單-、二-、或三-共軛物并提供了對于樣品中各共軛物而言的變量“Mi”的值。
用HPLC對該混合物的第二份樣品進(jìn)行分析以提供一種HPLC痕量。假定摩爾吸收率不因為共軛而改變，則由與特定混合物相應(yīng)的HPLC痕量峰的曲線下面積占所有HPLC痕量峰的總曲線下面積的百分比可以獲得特定共軛物在該混合物中的重量百分比。收集樣品并將其冷凍干燥以測定干樣品無水的克重量。將樣品的克重量乘以各組分在樣品中的重量百分比以測定樣品中各共軛物的克重量。通過將樣品中特定共軛物的克重量除以特定共軛物的質(zhì)量并乘以系數(shù)——Avagadro’s數(shù)(6.02205×1023摩爾-1)，上面所測定的Mi來測定對于特定共軛物(ith共軛物)而言的變量“Ni”，從而得到樣品中特定共軛物的分子數(shù)Ni。然后用n、測得的各共軛物的Mi、和各共軛物的Ni來計算分散系數(shù)。
實施例50得自粗混合物的B29修飾的PEG7-己基-胰島素，單共軛物的純化用制備HPLC系統(tǒng)由實施例41的粗混合物來進(jìn)行B29單共軛的PEG7-己基-胰島素的純化。將冷凍干燥的粗混合物(0.5g，組成B29單共軛的PEG7-己基-胰島素40-60％，未反應(yīng)的胰島素8-25％，相關(guān)物質(zhì)15-35％)溶解于5-10mL 0.01M醋酸銨緩沖劑(pH 7.4)中并將其加載到用0.5％三乙胺/0.5％磷酸緩沖劑TEAP A)進(jìn)行了平衡的C-18反相HPLC柱(150×3.9mm)上。用使用TEAP A和TEAP B(80％乙腈和20％TEAP A)的溶劑系統(tǒng)對該柱進(jìn)行梯度洗脫。對于得自該粗混合物的PEG7-己基-胰島素，B29單共軛物的制備HPLC純化而言，該梯度系統(tǒng)如下

用HPCL對級分進(jìn)行分析并將PEG7-己基-胰島素，B29單共軛物純度＞97％的產(chǎn)物級分收集。通過用醋酸銨緩沖劑(0.01M，pH 7.4)透析或滲漉(MWCO 3000-3500)來除去洗脫緩沖劑和溶劑并將其交換成醋酸銨緩沖劑，然后冷凍干燥，得到PEG7-己基-胰島素，B29單共軛物的白色粉末(純度＞97％)。
用相同的柱和溶劑系統(tǒng)，按照實施例41中對反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測時所用的方法來用一種分析HPLC對PEG7-己基-胰島素，B29單共軛物進(jìn)行分析。但是，其梯度條件如下

實施例51細(xì)胞敏感度(Cytosensor)研究將已經(jīng)血清剝離了約18小時的Colo 205(得自ATCC，目錄#CCL-222的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞)細(xì)胞混懸于3∶1的Cytosensor低-緩沖RPMI-1640基質(zhì)Cytosensor瓊脂糖截留介質(zhì)中并以100,000個細(xì)胞/10μL小滴的量將其接種到Cytosensor囊杯中。使細(xì)胞在Cytosensor上與該低-緩沖RPMi-1640基質(zhì)以每分鐘100μL的流速平衡約3小時直至基準(zhǔn)酸化速率穩(wěn)定。將胰島素藥物(胰島素或胰島素共軛物)用低緩沖RPMI-1640基質(zhì)稀釋至50nM并以100μL/分鐘的速度將其應(yīng)用于細(xì)胞20分鐘。在進(jìn)行該類接觸后，將藥物溶液撤掉并在只使用連續(xù)流動的低-緩沖介質(zhì)的情況下對細(xì)胞再次進(jìn)行灌注。連續(xù)收集數(shù)據(jù)直至酸化速率回復(fù)至基準(zhǔn)水平(從使用藥物溶液開始約1小時)。結(jié)果如圖14所示。正如圖14中所用的那樣，胰島素是人胰島素；PEG4是非多分散的mPEG4-己基-胰島素，單共軛物的混合物；PEG10是非多分散的mPEG10-己基-胰島素，單共軛物的混合物；PEG7是非多分散的mPEG7己基-胰島素，單共軛物的混合物；PEG7AVG是多分散的mPEG7AVG-己基-胰島素，單共軛物的混合物。
實施例52酶穩(wěn)定性糜蛋白酶消化是在37℃下，在一種磷酸鹽緩沖劑(pH7.4)中，在振搖的水浴上進(jìn)行的。該胰島素/胰島素共軛物濃度為0.3mg/mL。糜蛋白酶濃度為2個單位/mL。在所指出的時間點(diǎn)取出100μL凝膠樣品并將其用25μL 1∶1的0.1％三氟醋酸∶異丙醇混合物停止反應(yīng)。用反相HPLC對樣品進(jìn)行分析并通過計算曲線下面積來測定胰島素/胰島素共軛物的相對濃度。
正如圖15所用的那樣，胰島素是人胰島素；PEG4是非多分散的mPEG4-己基-胰島素，單共軛物的混合物；PEG10是非多分散的mPEG10-己基-胰島素，單共軛物的混合物；PEG7是非多分散的mPEG7-己基-胰島素，單共軛物的混合物；PEG7AVG是多分散的mPEG7AVG-己基-胰島素，單共軛物的混合物。
實施例53劑量依賴活性一種用于對制劑進(jìn)行評估的有效動物模型使用標(biāo)準(zhǔn)的禁食比格爾犬。給這些狗使用0.25mg/kg至1.0mg/kg的胰島素共軛物以對各種制劑的功效進(jìn)行評估。用這種模型來證明本發(fā)明的胰島素共軛物以劑量依賴的方式提供比多分散的胰島素共軛物更低的葡萄糖水平，其中所說的多分散物只是為了進(jìn)行比較，其不是本發(fā)明的組成部分。
狗實驗的方案需要就在給藥前的時間零點(diǎn)對血液中的葡萄糖進(jìn)行測量。然后，將固體口服劑型形式的制劑插入到狗嘴中。在第15、30、60和120分鐘取血并對葡萄糖水平進(jìn)行測量和作圖。葡萄糖水平越低，該胰島素共軛物的活性越高。在圖16中，葡萄糖下降，因此，表明本發(fā)明共軛物的活性是劑量依賴性的。為了進(jìn)行比較，圖17表明膠囊制劑形式的多分散的胰島素共軛物的葡萄糖下降的劑量依賴性比本發(fā)明的共軛物低，其中所說的多分散的胰島素共軛物不是本發(fā)明的一部分。
實施例54活性和個體間差異一種用于對制劑進(jìn)行評估的有效動物模型使用標(biāo)準(zhǔn)的禁食比格爾犬。給這些狗使用0.25mg/kg胰島素共軛物以對各種制劑的功效進(jìn)行評估。用這種模型來證明本發(fā)明的胰島素共軛物可提供比多分散的胰島素共軛物的個體間差異低的個體間差異和比其高的活性，其中所說的多分散物只是為了進(jìn)行比較，其不是本發(fā)明的組成部分。
狗實驗的方案需要就在給藥前的時間零點(diǎn)對血液中的葡萄糖進(jìn)行測量。然后，將液體口服劑型形式的制劑噴射到狗嘴中。在各種情況中，給狗使用0.25mg/kg的這種溶液。在第15、30、60和120分鐘取血并對葡萄糖水平進(jìn)行測量和作圖。葡萄糖水平越低，該胰島素共軛物的活性就越高。在圖18、19和20中，用PEG4-己基-胰島素，單共軛物；PEG7-己基胰島素，單共軛物；或PEG10-己基-胰島素，單共軛物所得的結(jié)果分別表明本發(fā)明的這些PEG共軛物產(chǎn)生的個體間差異低于圖21所示多分散的PEG7AVG-己基-胰島素，單共軛物的個體間差異并且其產(chǎn)生的活性高于如圖21所示多分散的PEG7AVG-己基-胰島素，單共軛物的活性，其中所說的多分散物只是為了進(jìn)行比較，其不是本發(fā)明的組成部分。
在本說明書中，已經(jīng)公開了本發(fā)明典型的優(yōu)選實施方案，雖然使用了特定的術(shù)語，但是其是一般性并僅僅是描述性的使用，并不是要進(jìn)行限制，下面的權(quán)利要求對本發(fā)明的范圍進(jìn)行了說明。
權(quán)利要求
1.一種共軛物的混合物，所說的共軛物各自包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，其中該混合物具有高于10,000的分散系數(shù)(DC)，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣品中不同分子的數(shù)目；Ni是樣品中第i個分子的數(shù)目；和Mi是第i個分子的質(zhì)量。
2.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的分散系數(shù)高于100,000。
3.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的分散系數(shù)高于500,000。
4.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。
5.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基。
6.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞基。
7.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的胰島素藥物是人胰島素并且該低聚物與人胰島素的LysB29共價結(jié)合并且具有下式所示結(jié)構(gòu)
8.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的混合物具有高于比與該混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。
9.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的混合物具有高于比與該混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體外活性高的體外活性。
10.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中和與該混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比，所說的混合物具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。
11.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的混合物具有比與該混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異低的個體間差異。
12.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的胰島素藥物是胰島素。
13.如權(quán)利要求12所述的混合物，其中所說的低聚物與胰島素的胺官能團(tuán)共價結(jié)合。
14.如權(quán)利要求13所述的混合物，其中所說的胺官能團(tuán)在該胰島素的LysB29上。
15.如權(quán)利要求12所述的混合物，其中所說的共軛物包含一種第一低聚物和一種第二低聚物。
16.如權(quán)利要求15所述的混合物，其中所說的第一低聚物與胰島素的LysB29共價結(jié)合并且所說的第二低聚物與該胰島素的N-末端A1或N-末端B1共價結(jié)合。
17.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的胰島素藥物與低聚物共價結(jié)合。
18.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的胰島素藥物通過可水解的鍵與低聚物共價結(jié)合。
19.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的胰島素與該低聚物的聚乙二醇部分共價結(jié)合。
20.如權(quán)利要求19所述的混合物，其中所說的低聚物進(jìn)一步包含一種與聚乙二醇部分共價結(jié)合的親脂性部分。
21.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的低聚物進(jìn)一步包含一種親脂性部分。
22.如權(quán)利要求21所述的混合物，其中所說的胰島素藥物與親脂性部分共價結(jié)合。
23.如權(quán)利要求21所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分與親脂性部分共價結(jié)合。
24.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的共軛物包含一種第一低聚物和一種第二低聚物。
25.如權(quán)利要求24所述的混合物，其中所說的第一和第二低聚物是相同的。
26.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的低聚物包含一種通過不可水解的鍵與胰島素共價結(jié)合的第一聚乙二醇部分和通過可水解鍵與第一聚乙二醇部分共價結(jié)合的第二聚乙二醇部分。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所說的低聚物進(jìn)一步包含與第二聚乙二醇部分共價結(jié)合的親脂性部分。
28.如權(quán)利要求1所述的混合物，其中所說的共軛物是各自兩親性平衡的從而使得各共軛物是可水溶的并能穿透生物膜。
29.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的混合物；和可藥用的載體。
30.一種治療需要進(jìn)行該類治療的個體的胰島素缺乏的方法，所說的方法包括給該個體使用有效量的共軛物混合物以治療胰島素缺陷，其中所說的混合物各自包含與包含聚乙二醇部分的低聚物相結(jié)合的胰島素藥物，其中所說的混合物具有高于10,000的分散系數(shù)(DC)，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣品中不同分子的數(shù)目；Ni是樣品中第i個分子的數(shù)目；和Mi是第i個分子的質(zhì)量。
31.一種基本單分散的共軛物混合物，各共軛物包含與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物。
32.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。
33.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基。
34.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞基。
35.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中該混合物中至少約96、97、98或99％的共軛物具有相同的分子量。
36.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中所說的混合物是一種單分散的混合物。
37.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中所說的混合物是一種基本純單分散的混合物。
38.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中該混合物中至少約96、97、98或99％的共軛物具有相同的分子量并具有相同的分子結(jié)構(gòu)。
39.如權(quán)利要求31所述的混合物，其中所說的混合物是一種純單分散的混合物。
40.一種基本單分散的共軛物混合物，各共軛物包含與人胰島素的LysB29共價結(jié)合于羧酸的羧酸部分的人胰島素，其在羧酸部分遠(yuǎn)側(cè)末端上共價結(jié)合于具有至少7個聚乙二醇亞基的甲基結(jié)尾的聚乙二醇部分。
41.如權(quán)利要求40所述的基本單分散的混合物，其中所說的共軛物各自包含與人胰島素上的LysB29共價結(jié)合于己酸的羧酸部分上的人胰島素，其在羧酸部分遠(yuǎn)側(cè)末端上共價結(jié)合于具有至少7個聚乙二醇亞基的甲基結(jié)尾的聚乙二醇部分。
42.一種基本單分散的共軛物混合物，各共軛物包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，所說的混合物具有比和該基本單分散的混合物具有相同數(shù)均分子量的多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。
43.如權(quán)利要求42所述的混合物，其進(jìn)一步具有比多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的體外活性高的體外活性。
44.如權(quán)利要求42所述的混合物，當(dāng)與多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物對糜蛋白酶降解的抵抗力相比時，其進(jìn)一步具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。
45.如權(quán)利要求42所述的混合物，其進(jìn)一步具有比多分散的胰島素藥物-低聚物共軛物混合物的個體間差異低的個體間差異。
46.一種共軛物的混合物，所說的共軛物各自包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰島素藥物，所說的混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布。
47.如權(quán)利要求46所述的混合物，其中所說分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約14道爾頓。
48.如權(quán)利要求46所述的混合物，其中所說分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約11道爾頓。
49.如權(quán)利要求46所述的混合物，其中所說的胰島素藥物是人胰島素并且各低聚物與人胰島素的LysB29共價結(jié)合并具有下式
50.一種共軛物的混合物，其中各共軛物包含一種與低聚物相結(jié)合的胰島素藥物；并且具有相同的聚乙二醇亞基數(shù)。
51.如權(quán)利要求50所述的混合物，其中所說的胰島素藥物是人胰島素并且各低聚物與人胰島素的LysB29共價結(jié)合并具有下式
52.一種共軛物的混合物，其中各共軛物是相同的并且具有下式所示的結(jié)構(gòu)式胰島素藥物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p(A)其中B是一種結(jié)合部分；L是一種銜接物部分；G、G′和G″各自是一種所選擇的間隔部分；R是親脂性部分并且R′是一種聚亞烷基二醇部分，或R′是親脂性部分并且R是聚亞烷基二醇部分；T是一種終止部分；j、k、m和n各自是0或1；和p是從1至該胰島素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
53.如權(quán)利要求52所述的混合物，其中所說的聚亞烷基二醇基團(tuán)是一種聚乙二醇部分。
54.如權(quán)利要求53所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞基。
55.如權(quán)利要求53所述的混合物，其中所說的聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞基。
56.如權(quán)利要求53所述的混合物，其中所說的聚亞烷基二醇部分是一種具有至少7個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。
57.如權(quán)利要求53所述的混合物，其中R是烷基或亞烷基；R′具有至少7個聚乙二醇亞基的聚乙二醇；T是烷基；j是1；和k、m和n是0。
58.如權(quán)利要求53所述的混合物，其中B是羰基；R是C5亞烷基；R′是具有7個聚乙二醇亞基的聚乙二醇；T是甲氧基；和k、m和n是0。
59.一種用于合成基本單分散的共軛物混合物的方法，其中所說的各共軛物包含一種與包含聚乙二醇部分的低聚物相偶合的胰島素藥物，所說的方法包括將包含具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物與包含具有式II結(jié)構(gòu)的化合物的基本分散的混合物在足以提供包含具有式III結(jié)構(gòu)的聚合物的基本單分散的混合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)R1(OC2H4)m-O-X+(I)其中R1是H或親脂性部分；m為1至25；和X+是一種陽離子R2(OC2H4)n-OMs (II)其中R2是H或親脂性部分；和n為1至25R2(OC2H4)m+n-OR1(III)；將包含式III聚合物的基本單分散的混合物進(jìn)行活化從而得到一種單分散的能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)的活性聚合物的混合物；和將該活性聚合物的基本單分散混合物與基本單分散的胰島素藥物的混合物在足以提供一種基本單分散的各自包含一種與包含具有m+n個亞基的聚乙二醇部分的低聚物相結(jié)合的胰島素藥物的共軛物混合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所說的R2是一種脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所說的脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯包含一種長度為至少5個碳原子的烷基部分。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其中R1是甲基。
63.如權(quán)利要求59所述的方法，其進(jìn)一步包括將包含具有式V結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物R2(OC2H4)n-OH (V)與甲磺?；u化物在足以提供包含具有式II結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)R2(OC2H4)n-OMs (II)。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其進(jìn)一步包括將包含具有式VI結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物與一種包含具有式VII結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物在足以提供包含具有式VIII結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物的情況下進(jìn)行反應(yīng)R2-OMs (VI)其中R2是一種親脂性部分R3(OC2H4)m-O-X2+(VII)其中R3是芐基、三苯甲基、或THP；并X2+是一種陽離子R3(OC2H4)m-OR2(VIII)；和將包含具有式VIII結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物在足以提供一種包含具有式V結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)R2(OC2H4)m-OH (V)。
65.如權(quán)利要求59所述的方法，其進(jìn)一步包括將包含具有式IV結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物R1(OC2H4)n-OH (IV)在足以提供包含具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散的混合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)R1(OC2H4)n-O-X+(I)。
66.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所說的基本單分散的混合物的活化包括將基本單分散的式III聚合物的混合物與N-羥基丁二酰亞胺進(jìn)行反應(yīng)從而得到能與胰島素藥物進(jìn)行反應(yīng)的活性聚合物。
67.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所說的胰島素藥物是人胰島素并且其中所說的基本單分散的活性聚合物的混合物與基本單分散的胰島素的混合物的反應(yīng)包括將基本單分散的活性聚合物的混合物與人胰島素的LysB29進(jìn)行反應(yīng)，從而得到一種基本單分散的單共軛物混合物，所說的單共軛物各自包含與包含具有m+n個亞基的聚乙二醇部分的低聚物相結(jié)合的人胰島素。
全文摘要
公開了一種共軛物的混合物，其中各共軛物包含一種與低聚物相結(jié)合的胰島素藥物，所說的低聚物包括一種聚乙二醇部分。該混合物可表現(xiàn)出比相似共軛物的多分散混合物的體內(nèi)活性高的體內(nèi)活性。該混合物在小腸消化的體外模型中還可表現(xiàn)出比相似共軛物的多分散混合物的存活率更高的存活率。該混合物還可產(chǎn)生比相似共軛物的多分散混合物的個體間差異低的個體間差異。
文檔編號A61K45/06GK1538809SQ02815261
公開日2004年10月20日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月4日
發(fā)明者N·N·埃克烏里貝, C·H·普里斯, A·M·安薩里, A·L·奧登保, B·拉哈克里斯南, N N ?？藶趵镓? 奧登保, 安薩里, 普里斯, 死鎪鼓 申請人:諾貝克斯公司