專利名稱：利用基于mmb2中某序列的化合物抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的新方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明概括地涉及醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及抑制腫瘤生長(zhǎng)和組織中血管發(fā)生或檢測(cè)血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的方法和組合物，在這些方法和組合物中利用了基于MMP-2中特定序列的化合物。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是一種新血管得以形成的基礎(chǔ)生理過(guò)程，對(duì)于多種正常的生理活動(dòng)(如生殖、發(fā)育和傷口修復(fù))至關(guān)重要。雖然對(duì)于這一過(guò)程的機(jī)理尚不十分清楚，但一般認(rèn)為它涉及到促進(jìn)和抑制內(nèi)皮細(xì)胞(毛細(xì)血管的初級(jí)細(xì)胞)生長(zhǎng)的分子間復(fù)雜的相互作用。在正常情況下，這些分子在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)將微脈管系統(tǒng)維持在休眠狀態(tài)(即毛細(xì)血管不生長(zhǎng)的狀態(tài)之一)，時(shí)間可達(dá)數(shù)周，在某些情況下甚至長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年。但是當(dāng)需要時(shí)(如傷口修復(fù)期間)，這些細(xì)胞可快速增殖并且在5天內(nèi)得以更新(Folkman，J.和Shing，Y.，The Journal of Biological Chemistry，267(16)10931-10934；以及Folkman J.和Klagsbrun，M.，Science，235442-447(1987))。
雖然在正常情況下血管發(fā)生是一個(gè)高度受控的過(guò)程，但是很多疾病(按其特征定義為“血管發(fā)生性疾病”)卻是因?yàn)殚L(zhǎng)期不受控的血管發(fā)生所造成的。換而言之，不受控的血管發(fā)生可以直接造成一些特殊的疾病或者使已有的病情惡化。例如，有證據(jù)暗示眼部新血管形成是導(dǎo)致失明的最主要的原因，同時(shí)也是近20種眼部疾病的主要病因。在某些已有的疾病如關(guān)節(jié)炎中，新形成的毛細(xì)血管侵入關(guān)節(jié)并且破壞軟骨。在糖尿病中，視網(wǎng)膜內(nèi)新形成的毛細(xì)血管侵入玻璃體中，造成出血并導(dǎo)致失明。實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移也是血管發(fā)生依賴性的(Folkman，J.，Cancer Research，46；467-473(1986)，F(xiàn)olkman，J.，Journal of the National Cancer Institute，8244(1989))。例如，現(xiàn)已證明，大于2mm的腫瘤自身必須具備血液供應(yīng)，這種血液供應(yīng)的獲得是通過(guò)誘導(dǎo)新毛細(xì)血管生成而獲得的。一旦這些新毛細(xì)血管在腫瘤上著床，這些血管就為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處，如肝臟、肺或骨骼提供了渠道(Weidner，N.等人，The New EnglandJournal of Medicine，324(1)1-8(1991))。
腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移每年都對(duì)很多人的生活造成了沖擊(據(jù)估計(jì)僅在美國(guó)每年新診斷出的癌癥患者就超過(guò)600,000人，Varner J.A.，Brooks，P.C.和Cheresh，D.A.(1995)Cell Adh.Commun.3，367-374)，治療這類疾病的組合物及方法具有廣闊的用途。從以往的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，顯而易見(jiàn)，阻斷血管發(fā)生對(duì)于減慢腫瘤生長(zhǎng)以及治療其他疾病有可能是有效的。事實(shí)上，已有充分的證據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)，即，在多種動(dòng)物模型中阻斷腫瘤新血管發(fā)生可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且人體臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)也開(kāi)始支持這種觀點(diǎn)(Varner，J.A.，Brooks，P.C.和Cheresh，D.A.(1995)Cell Adh.Commun.3，367-474)。
盡管目前已有幾種血管發(fā)生抑制劑處于開(kāi)發(fā)階段，用于治療血管發(fā)生性疾病(Gasparini，G.和Harris A.L.，J Clin Oncol 13(3)765-782，(1995))，但是這些化合物自身存在一些缺點(diǎn)。例如，蘇拉明是一種強(qiáng)效血管發(fā)生抑制劑，但是對(duì)人體而言會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的全身性毒性(在具有抗腫瘤活性所需的劑量下)。其他化合物，如類視色素，干擾素和抗雌激素對(duì)人體是安全的，但僅有微弱的抗血管發(fā)生作用。此外，還有一些化合物制備起來(lái)困難或成本過(guò)高。類似地，雖然很多研究者將目標(biāo)定在引起血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子上(Varner等人，1995；Blood和Zetter 1990；Weidner等人，1992；Weidner等人，1991；Brooks等人，1995；Brooks等人，1994；Brooks等人，1997)，但是能夠刺激血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的數(shù)目龐大，由于這種冗余性的存在，阻斷一種細(xì)胞因子所產(chǎn)生的治療效果可能有限。
因此，需要發(fā)明其他的用于抑制血管發(fā)生的抗血管發(fā)生的靶點(diǎn)和方法。短肽的制備相對(duì)簡(jiǎn)單，因此，在與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療以及血管發(fā)生靶向抑制劑的設(shè)計(jì)中，采用短肽是一種經(jīng)濟(jì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的方法和組合物，其中采用了在胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白水解重組中起作用的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。具體而言，本發(fā)明提供一種基于MMP-2片斷并用于抑制血管發(fā)生的新型組合物和方法。
本發(fā)明中一個(gè)特別的方面提供包含一種多肽的抑制血管發(fā)生的組合物，所述多肽含有MMP-2中某一特定的氨基酸序列。在本發(fā)明主要的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含以下氨基酸序列的肽SEQ.ID.NO.1-Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg。
此外，在上述序列的兩側(cè)可以包夾其他氨基酸。例如，如下所示可以在這個(gè)9個(gè)氨基酸序列的N-端和C-端包夾半胱氨酸殘基SEQ.ID.NO.2-Cys-Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg-Cys。
此外，本發(fā)明還提供用于抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的組合物，其包含基于上述氨基酸序列或其中包夾有這種MMP-2序列的優(yōu)化氨基酸序列的有機(jī)或非肽類模擬物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供抑制血管發(fā)生的組合物，其包含由MMP-2中特定氨基酸序列定義的位點(diǎn)的激動(dòng)劑。此外，本發(fā)明提供用于抑制血管發(fā)生的拮抗劑，這種拮抗劑特異性地指向MMP-2中的特定位點(diǎn)。這種拮抗劑也包含該抗原決定簇的有機(jī)、肽類或非肽類模擬物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含上述多肽和藥學(xué)可接受載體的組合物，用于治療選自癌癥、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、因感染或手術(shù)導(dǎo)致的眼部血管生成、黃斑變性以及糖尿病性視網(wǎng)膜病等疾病。
本發(fā)明的另一方面包括一種將組織與上述組合物接觸抑制血管生成的方法。被治療的組織可以是任何需要抑制血管生成的組織，如出現(xiàn)新血管生成的病變組織。示例性的組織包括感染的組織、實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移性病灶、發(fā)生再狹窄的組織等。本發(fā)明還提供治療選自癌癥、關(guān)節(jié)炎、黃斑變性以及糖尿病性視網(wǎng)膜病等疾病的方法，其包括對(duì)病人給藥治療有效量的上述多肽。
本發(fā)明還提供檢測(cè)血管生成、腫瘤組織、轉(zhuǎn)移性病灶以及癌癥侵入組織的方法，其包括使本發(fā)明的組合物與組織接觸的步驟。
本發(fā)明還提供篩選本發(fā)明組合物的方法。
在本發(fā)明的說(shuō)明書中，1、SEQ.ID.NO1代表以下序列Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg。
2、SEQ.ID.NO2代表以下序列Cys-Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg-Cys。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示全身性給藥Pexstatin對(duì)于雞胚胎中黑素瘤生長(zhǎng)的影響作用。
圖2顯示全身性給藥Pexstatin對(duì)于裸鼠體內(nèi)黑素瘤生長(zhǎng)的影響作用。
圖3顯示全身性給藥Pexstatin對(duì)于體內(nèi)血管生成的影響作用。
圖4是一個(gè)棒圖，顯示了檢查全身性給藥Pexstatin對(duì)于體內(nèi)血管生成影響作用的試驗(yàn)中的血管生成指數(shù)。
圖5顯示Pexstatin對(duì)于體內(nèi)B16黑素瘤轉(zhuǎn)移性病灶的影響作用。
具體實(shí)施例方式
在生理?xiàng)l件下，結(jié)締組織的合成與胞外基質(zhì)的降解處于動(dòng)態(tài)平衡。這種降解作用部分是由于基質(zhì)金屬蛋白酶(一類蛋白酶)參與了結(jié)締組織的降解和重組。這種肽鏈內(nèi)切酶被結(jié)締組織中的或與結(jié)締組織有關(guān)的多種類型的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及侵入的或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞以酶原形式分泌出來(lái)。在局部的組織環(huán)境中，MMP的表達(dá)被生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子所促進(jìn)，此時(shí)這些酶的作用是特異性降解胞外基質(zhì)中的蛋白成份，如膠原蛋白、蛋白多糖(蛋白內(nèi)核)、粘連蛋白和層粘連蛋白。這些普遍存在的胞外基質(zhì)成份存在于關(guān)節(jié)的襯里、間質(zhì)結(jié)締組織、基底膜和軟骨中。MMP具有多種性質(zhì)，包括是鋅和鈣依賴性的，以酶原形式分泌，40-50％的氨基酸序列同源性。
多種慢性和急性疾病的發(fā)病原因與MMP使胞外基質(zhì)過(guò)度降解有關(guān)，例如，多項(xiàng)研究已經(jīng)證明(綜述見(jiàn)Exp.Opin.Invest.Drugs，5，323-335，(1996))MMP的表達(dá)和活化對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)、侵入和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MMP的活性是血管生成所必需的，而血管生成又是腫瘤生長(zhǎng)以及其他病變?nèi)琰S斑變性所需的。
這一類酶包括但不限于膠原酶(MMP-1)、明膠酶或IV型膠原酶(MMP-2，MMP-9)、matrilysin(MMP-7，PUMP-1)和溶基質(zhì)素(MMP-3)。
本發(fā)明中特別重要的酶是明膠酶MMP-2。
定義術(shù)語(yǔ)“烷基”指直鏈或支鏈的飽和烴除去一個(gè)氫原子衍生出的單價(jià)基團(tuán)。烷基的實(shí)例有甲基、乙基、正丙基或異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基或叔丁基等。
此處術(shù)語(yǔ)“N-保護(hù)基”指本領(lǐng)域的合成中用于保護(hù)氨基，避免出現(xiàn)不必要反應(yīng)，同時(shí)易于脫去并可選擇性脫去的基團(tuán)。在本領(lǐng)域中采用N-保護(hù)基避免基團(tuán)發(fā)生不必要的反應(yīng)是眾所周知的，很多的這種保護(hù)基也是已知的，例如，T.H，Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第2版，John Wiky & Sons，New York(1991)中所描述的保護(hù)基。N-保護(hù)基的實(shí)例包括但不限于酰基，如乙酰基、三氟乙酰基、酰基異硫氰酸酯、氨基己?；?、苯甲酰基等，以及酰氧基，包括叔丁氧羰基(BOC)和芐氧羰基等。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的鹽”指這樣一些鹽，根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷，這些鹽適用于和人類以及更低級(jí)動(dòng)物的組織接觸而不產(chǎn)生明顯的毒性，刺激性和過(guò)敏反應(yīng)等，同時(shí)具有合理的安全比。在本領(lǐng)域中藥學(xué)可接受的鹽是眾所周知的，例如S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences，1977，6611-19中描述的藥學(xué)可接受的鹽?？梢栽诒景l(fā)明化合物最終分離和純化期間原位生成這些鹽，或采用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸與堿性基團(tuán)反應(yīng)制備這些鹽。代表性的酸加成鹽有乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、camphorate、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊基丙酸鹽、二葡糖酸鹽(digluconate)、十二烷基磺酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、十二烷基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過(guò)硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等，以及無(wú)毒性的銨鹽，季銨鹽，以及胺的陽(yáng)離子鹽，包括但不限于銨鹽、四甲基銨鹽、四乙基銨鹽、甲胺鹽、二甲胺鹽、三甲胺鹽、三乙胺鹽、乙胺鹽等。
此處采用術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的酯”指在體內(nèi)水解的酯，包括易于在體內(nèi)斷裂生成母體化合物及其鹽的酯。例如，適用的酯基包括由藥學(xué)可接受的脂肪酸，特別是烷酸、鏈烯酸、環(huán)烷酸和烷基二酸衍生的酯，其中烷基和鏈烯基最好不要超過(guò)6個(gè)碳。酯的具體實(shí)例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯以及丁二酸乙酯。
除采用前綴“D”指示外，發(fā)明公開(kāi)書以及所附權(quán)利要求中多肽中氨基酸以及氨基酸殘基中的I-碳的構(gòu)型為天然的或“L”構(gòu)型。采用Cahn-Ingold-Prelog的R和S標(biāo)識(shí)具體描述本發(fā)明多肽的N-端某些酰基取代基中手性中心的立體構(gòu)型。符號(hào)“R，S”指兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)物構(gòu)成的外消旋體。命名遵從R.S.Calm等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl，5，385-415(1966)中的規(guī)定。
在大多數(shù)情況下，對(duì)于天然或非天然氨基酸殘基的命名遵從IUPACCommission on the Nomenclature of Organic Chemistry和IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature在“Nomenclature of I-AminoAcids(Recommendations，1974)”″Biochemistry，14(2)，(1975)中的規(guī)定。當(dāng)本發(fā)明的說(shuō)明書以及所附權(quán)利要求書中氨基酸以及氨基酸殘基的命名和縮寫與上述規(guī)定不同時(shí)，按以下方式使讀者可以看明白。
眾所周知，可以對(duì)多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改變而基本不影響多肽的生物學(xué)功能。例如，對(duì)于指定的多肽而言，可以采用其他氨基酸替代某些氨基酸而不明顯損失其功能。在作這些改變時(shí)，以氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，如大小、電荷、疏水性、親水性等為基本相同為原則進(jìn)行氨基酸的替代。
如美國(guó)專利4,554,101中所述(此處引用作為參考)，以下為各氨基酸殘基的親水性Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+3.0)；ASn(+2.0)；Gln(+2.0)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)和Trp(-3.4)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)道氨基酸殘基可以具有類似親水性(如，親水性在+2.0至-2.0之間)的氨基酸殘基取代，得到生物學(xué)等價(jià)的多肽。
類似地，可以按親水性指數(shù)類似的原則進(jìn)行氨基酸的取代。根據(jù)氨基酸殘基的疏水性和電性特征各氨基酸殘基的親水性指數(shù)已經(jīng)得到了確定，各氨基酸殘基的親水性指數(shù)如下Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。對(duì)于基于親水性指數(shù)的替代，優(yōu)選親水性指數(shù)在+2.0至-2.0之間。
本發(fā)明的化合物多肽根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)中由氨基酸582-590界定的特定區(qū)域強(qiáng)烈抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。
基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供用于抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的，序列為SEQ.ID.NO1的新多肽以及一種新的十一肽，命名為Pexstatin，序列為SEQ.ID.NO2。以下實(shí)施例表明，這些肽在體內(nèi)強(qiáng)烈抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的化合物，包括但不限于實(shí)施例中所述的化合物，具有抗血管生成活性。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法合成本發(fā)明的多肽。對(duì)于固相多肽合成而言，其方法綜述可參見(jiàn)J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co，(San Francisco)，1963，以及J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p46，Academic Press(New York)，1973。對(duì)于經(jīng)典的溶液合成法而言，可參見(jiàn)G.Schroder和K.Lupke，The Peptides，vol.1，Acacemic Press(New York)，1965。
概括而言，這些方法包括逐步添加一種或多種氨基酸或恰當(dāng)保護(hù)的氨基酸增長(zhǎng)肽鏈。通常第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基均被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基所保護(hù)。然后將保護(hù)的或衍生化的氨基酸連接到惰性的固體載體上，或者添加到溶液中，在適合形成酰胺鍵的條件下添加序列中的下一個(gè)氨基酸(該氨基酸具有一個(gè)被適當(dāng)保護(hù)的互補(bǔ)基團(tuán)(氨基或羧基))。然后將新形成的氨基酸殘基中的保護(hù)基脫除，再加入下一個(gè)(被適當(dāng)保護(hù)的)氨基酸，以此類推。當(dāng)所有氨基酸按正確序列被連接起來(lái)以后，分步或同時(shí)將剩余的保護(hù)基脫除以得到最終的多肽。對(duì)這一通用程序進(jìn)行簡(jiǎn)單的改變就有可能同時(shí)連接一個(gè)以上的氨基酸，以增長(zhǎng)肽鏈，例如，對(duì)保護(hù)的三肽和適當(dāng)保護(hù)的二肽進(jìn)行偶聯(lián)(在手性中心不發(fā)生外消旋化的條件下)，脫保護(hù)后可以得到五肽。
制備本發(fā)明化合物的一個(gè)方法涉及固相肽合成法。在這種方法中，采用酸或堿敏感的基團(tuán)保護(hù)α-氨基。這種保護(hù)基在形成肽鍵的條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，同時(shí)又是容易脫除的，脫保護(hù)的反應(yīng)條件不會(huì)破壞肽鏈或使肽鏈中所包含的手性中心外消旋化。適用的保護(hù)基為9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、聯(lián)苯異丙氧羰基、特戊氧羰基、異冰片氧羰基、(I，I)二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基、鄰硝基苯基亞磺?；?、2-氰基-叔丁氧羰基等。優(yōu)選為9-芴甲氧羰基(Fmoc)。
特別優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基有，賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈氨基2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?pmc)、硝基、對(duì)苯甲磺酰基、4-甲氧基苯甲磺?；?、Cbz、Boc、以及金剛烷氧羰基；酪氨酸芐基、鄰溴芐氧羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基以及乙?；唤z氨酸叔丁基、芐基和四氫吡喃基；組氨酸三苯甲基、芐基、Cbz、對(duì)苯甲磺酰基和2，4-二硝基苯基；色氨酸甲?；?br> 在固相肽合成方法中，C-端氨基酸被連接至適當(dāng)?shù)墓滔噍d體或樹(shù)脂上。適用于上述合成的固相載體為對(duì)于這種分步縮合-脫保護(hù)反應(yīng)的試劑和反應(yīng)條件惰性，同時(shí)在所用反應(yīng)介質(zhì)中不溶的材料。用于合成C-端為羧基的肽的固體載體為4-羥甲基苯氧甲基共聚物(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。優(yōu)選地，用于合成C-端為酰胺基的肽的固體載體為4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺基乙基樹(shù)脂，該樹(shù)脂可以從Applied Biosystem公司得到。
在采用或不采用N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸尿(HBTU)，在采用或不采用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-羥基苯并三唑(HOBT)，苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸膦(BOP)或二(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦(BOPCl)的條件下，將C-端氨基酸偶聯(lián)至樹(shù)脂之上，反應(yīng)溫度在50至100℃之間，反應(yīng)時(shí)間在1至24小時(shí)之間，溶劑為二氯甲烷或DMF。當(dāng)固相載體為4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺基乙基樹(shù)脂時(shí)，在采用上述方法偶聯(lián)C-端氨基酸之前，采用二級(jí)胺如哌啶脫除Fmoc基。偶聯(lián)去保護(hù)的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺基乙基樹(shù)脂的優(yōu)選方法是在DMF中采用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸尿(HBTU，1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。
已知可以在自動(dòng)多肽合成儀上進(jìn)行經(jīng)保護(hù)氨基酸的順序偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，增長(zhǎng)的肽鏈中的氨基酸的α-氨基由Fmoc基保護(hù)。采用二級(jí)胺如哌啶處理除去肽鏈中N-端的Fmoc基。然后將各保護(hù)的氨基酸按摩爾比三倍過(guò)量的用量加入，偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)試劑一般為O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸尿(HBTU，1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。
固相合成結(jié)束時(shí)，將多肽從樹(shù)脂上除去并去保護(hù)，可以分步進(jìn)行并一步完成。將連接有樹(shù)脂的多肽用裂解試劑，如thianisole、水、乙二硫醇和三氟乙酸處理，可以一步脫下多肽并去保護(hù)。
對(duì)于多肽C-端為烷基酰胺的情況，采用烷基胺進(jìn)行氨解裂解樹(shù)脂。此外，如采用甲醇轉(zhuǎn)移酯化，然后氨解或直接轉(zhuǎn)移酰胺化脫除多肽。此時(shí)可以純化經(jīng)保護(hù)的多肽或直接用于下一步反應(yīng)?？梢圆捎蒙鲜龅牧呀饨M合試劑除去側(cè)鏈的保護(hù)基。
利用系列色譜步驟純化完全去保護(hù)的多肽，色譜方法可以是以下的幾種或全部采用乙酸鹽形式的弱堿性離子交換色譜；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(如AMBERLITEXAD)上進(jìn)行的疏水性吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上進(jìn)行的離子交換色譜；分配色譜，如在SEPHADEXG-25，LH-20上進(jìn)行的分配色譜；高效液相色譜(HPLC)，特別是采用辛基或十八烷基硅基-硅膠鍵和柱的反相HPLC。
血管生成試驗(yàn)可以測(cè)試本發(fā)明化合物對(duì)于組織中血管生成的調(diào)控能力?？刹捎萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的合適試驗(yàn)監(jiān)測(cè)這一效應(yīng)。以下描述幾種方法。
例如，在一種試驗(yàn)中測(cè)量雞絨毛尿囊膜(CAM)中的血管生成，稱為CAM試驗(yàn)。CAM試驗(yàn)已被其他人詳細(xì)描述，并且被進(jìn)一步用于測(cè)量腫瘤組織中的血管生成和新血管形成。參見(jiàn)Ausprunk等人，Am.J.Pathol.，79597-618(1975)以及Ossonski等人，Cancer Res.，402300-2309(1980)。
由于整個(gè)組織發(fā)生新血管形成，并且真正的雞胚胎血管長(zhǎng)進(jìn)了絨毛尿囊膜或生長(zhǎng)在CAM之上的組織中，所以CAM試驗(yàn)作為測(cè)量體內(nèi)血管生成的試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵训玫搅似毡榈恼J(rèn)同。
如本發(fā)明所述，就新血管生長(zhǎng)的數(shù)目和程度而言，CAM試驗(yàn)表明出現(xiàn)了對(duì)新血管形成的抑制作用。而且也可以容易地監(jiān)測(cè)移植到CAM上的組織如腫瘤組織的生長(zhǎng)。最后，這種試驗(yàn)是特別有用的，因?yàn)樵囼?yàn)體系中存在衡量毒性的內(nèi)標(biāo)。雞胚胎暴露于所有的受試試劑中，因此胚胎的健康情況可以指示毒性。
測(cè)量血管生成的第二個(gè)試驗(yàn)是體內(nèi)兔眼模型，稱為兔眼試驗(yàn)。兔眼試驗(yàn)已被其他人詳細(xì)描述，并且被進(jìn)一步用于測(cè)量在血管生成抑制劑如沙利度胺存在下的血管生成和新血管形成。參見(jiàn)D′Amato等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.914082-4085。
兔眼試驗(yàn)也是一個(gè)被廣泛認(rèn)同的用于測(cè)量體內(nèi)血管生成的試驗(yàn)?zāi)Ｐ停@是因?yàn)橐酝醚転槔?，通過(guò)本身為透明的眼角膜可以容易地觀察到從角膜邊緣生長(zhǎng)至角膜中的新血管形成過(guò)程。此外，也可以容易地監(jiān)測(cè)到新血管形成促進(jìn)作用或抑制作用隨時(shí)間變化的程度和數(shù)量，或者可以檢測(cè)到新血管形成的衰退隨時(shí)間變化的程度和數(shù)量。
最后，兔眼暴露于所有的受試試劑中，因此兔眼的健康情況可以指示毒性。
第四個(gè)測(cè)試血管生成的試驗(yàn)是嫁接雜種的小鼠嫁接人組織的小鼠的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，稱為嫁接雜種的小鼠試驗(yàn)。該試驗(yàn)已被其他人詳細(xì)描述，用于測(cè)量血管生成、新血管形成和腫瘤組織的衰退。參見(jiàn)Yan等人(1993)J.Clin.Invest.91986-996。
嫁接雜種的小鼠試驗(yàn)是一種在體內(nèi)測(cè)量血管生成的有用試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，因?yàn)橐浦驳钠つw在組織學(xué)上與人正常皮膚非常接近，而且整個(gè)組織均出現(xiàn)新血管形成，真正的人血管從人皮膚移植體中生長(zhǎng)至處于移植的人皮膚之上的人腫瘤組織中?？梢圆捎脤?duì)人內(nèi)皮細(xì)胞有特異性的標(biāo)記進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，證明在人組織移植體內(nèi)出現(xiàn)了新血管形成。
就新血管生長(zhǎng)的數(shù)量和程度兩方面而言，嫁接雜種的小鼠試驗(yàn)證明出現(xiàn)了新血管形成的衰退。此外，這一試驗(yàn)也可以容易地監(jiān)測(cè)植于皮膚移植體上的組織如腫瘤組織的生長(zhǎng)情況。最后，由于在試驗(yàn)體系中有衡量毒性的內(nèi)標(biāo)，這種試驗(yàn)是有用的。因?yàn)榧藿与s種的小鼠暴露于受試試劑中，因此小鼠的健康情況可以指示毒性。
治療用組合物本發(fā)明的化合物可以與其他用于治療疾病的組合物和方法聯(lián)合使用。例如，可以聯(lián)合使用常規(guī)的手術(shù)治療、放療或化療以及本發(fā)明的多肽對(duì)腫瘤進(jìn)行治療，隨后對(duì)病人給藥本發(fā)明的多肽以延長(zhǎng)微小轉(zhuǎn)移的休眠期并且穩(wěn)定和抑制任何殘留的原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。此外，本發(fā)明的化合物可以和藥學(xué)可接受的賦形劑、以及任選的緩釋基材如可生物降解的聚合物復(fù)合，構(gòu)成治療用組合物。
如本發(fā)明所述，緩釋基材是一種由原料，通常是在酶或酸水解或溶解的作用下可以降解的聚合物構(gòu)成的基材。一旦進(jìn)入體內(nèi)，這種基材就被酶和體液所作用。理想的緩釋基材選自生物相容性的材料，如脂質(zhì)體；聚乳酸；聚乙醇酸(乙醇酸的聚合物)；聚乳酸-乙醇酸(乳酸和乙醇酸的共聚物)；聚酸酐；聚(原酸)酯；多肽；透明質(zhì)酸；膠原蛋白；硫酸軟骨素；羧酸；脂肪酸；磷脂；多糖；核酸；聚氨基酸，氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸；多聚核苷酸；聚乙烯基丙烯；聚乙烯吡咯烷酮和硅橡膠。優(yōu)選的可生物降解的基材選自聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸-乙醇酸(乳酸和乙醇酸的共聚物)。
當(dāng)用于以上或其他治療方法中時(shí)，可以采用治療有效量的本發(fā)明化合物，化合物可以采取純品形式或藥學(xué)可接受的鹽的形式(如果存在這種形式的話)。術(shù)語(yǔ)本發(fā)明的化合物的“治療有效量”指可用于醫(yī)療的，具有合理安全比的，有效治療血管生成性疾病(如抑制腫瘤生長(zhǎng)或減慢或阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移)的化合物的用量。但是，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明化合物和組合物每天的用量應(yīng)由主治醫(yī)師根據(jù)病情加以確定。眾所周知，對(duì)于指定病人而言，具體的治療有效劑量依多種因素的不同而變化，所述因素包括所治療疾病的性質(zhì)、疾病的嚴(yán)重程度、所采用化合物的活性、所采用的配方、患者的年齡、體重、體質(zhì)、性別和飲食情況、給藥時(shí)間、給藥途徑、所采用化合物的消除速度、治療方案的時(shí)長(zhǎng)、與所采用化合物聯(lián)合使用的藥物的情況。例如，開(kāi)始治療時(shí)化合物的劑量可以低于達(dá)到理想治療效果所需的劑量，然后再逐步增加劑量，直至出現(xiàn)理想的治療效果為止。
本發(fā)明的化合物可以采取由無(wú)機(jī)和有機(jī)酸衍生出的鹽的形式。這些鹽包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、camphorate、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽(isethionate)、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過(guò)硫酸鹽、戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。由此可以制備水或油溶性的或水或油分散的產(chǎn)物。
可用于形成藥學(xué)可接受的酸加成鹽的酸的實(shí)例包括無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、硫酸和磷酸，有機(jī)酸如馬來(lái)酸、琥珀酸和檸檬酸。其他鹽包括堿金屬或堿土金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與有機(jī)堿構(gòu)成的鹽。本發(fā)明化合物優(yōu)選的鹽包括磷酸鹽、tris和乙酸鹽。
此外，本發(fā)明的化合物可以藥物組合物的形式進(jìn)行給藥，該組合物中包含所采用的化合物以及一種和多種藥學(xué)可接受的賦形劑。藥學(xué)可接受的載體或賦形劑指無(wú)毒的固體、半固體或液體填料、稀釋劑、封裝材料或任何類型的制劑助劑。
非腸道注射用的藥物組合物中包括藥學(xué)可接受的滅菌水溶液或非水溶液、分散體系、混懸液或乳液，以及在使用前可被配制成滅菌的可注射溶液或分散體系的滅菌粉末。適用的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或媒介包括水、乙醇、多元醇(如甘油、乙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纖維素及其混合物、植物油(如橄欖油)、以及可注射用的有機(jī)酯，如油酸乙酯。為維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如，可以添加成膜材料，如卵磷脂；對(duì)于分散體系可以通過(guò)維持其所需的粒徑達(dá)到此目的，或者使用表面活性劑達(dá)到此目的。
這些組合物還可包含輔料如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢约尤攵喾N抗菌和抗真菌劑，如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等對(duì)抗微生物的作用。加入等滲試劑，如糖、氯化鈉等也是需要的?？梢约尤胙泳徫盏脑噭┤鐔斡仓徜X或明膠使注射用的組合物具有緩釋功能。
可以采用生物可降解的材料，如聚乳酸-乙醇酸、聚(原酸)酯和聚酸酐構(gòu)成藥物的微膠囊，制成可注射用的“儲(chǔ)池式”的形式。根據(jù)藥物/聚合物的比例以及所采用聚合物的性質(zhì)可以控制藥物的釋放速度。也可以將藥物載入具有組織相容性的脂質(zhì)體或微乳中構(gòu)成可注射用的“儲(chǔ)池式”制劑。
為了對(duì)可注射用的制劑進(jìn)行滅菌，例如，可以采用細(xì)菌不能通過(guò)的過(guò)濾器過(guò)濾，或者在滅菌的固體組合物中加入滅菌劑，其中固體組合物在使用前可以溶于或分散于滅菌水或其他滅菌的可注射用的媒介中。
局部給藥包括對(duì)皮膚或粘膜如肺和眼的表面進(jìn)行給藥。用于局部給藥的組合物，包括用于吸入給藥的組合物，可以被制成加壓或不加壓的干粉形式。在不加壓的干粉組合物中，可以將活性成份的細(xì)粉和粒徑較大的藥學(xué)可接受的惰性載體混合，其中惰性載體的粒徑可達(dá)100μm。適用的惰性載體包括糖，如乳糖。以重量計(jì)，理想的情況是95％的活性成份的粒徑在0.01至10μm之間。
此外，組合物可以被加壓，從而含有供拋射用的壓縮氣體，如氮?dú)饣蛞夯瘹怏w。優(yōu)選地，在液化的拋射介質(zhì)和整個(gè)組合物中活性成分不明顯溶解。加壓的組合物中也可包含表面活性劑，如液體或固體非離子表面活性劑或者固體陰離子表面活性劑。優(yōu)選地，采用鈉鹽形式的固體陰離子表面活性劑。
局部給藥的另一種形式是經(jīng)眼給藥。將本發(fā)明的化合物加到藥學(xué)可接受的眼用載體中進(jìn)行給藥，使得化合物能夠與眼睛表面接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，使藥物滲入眼睛的角膜和內(nèi)部區(qū)域，如前房、后房、玻璃體、房水、玻璃體液、角膜、虹膜/眼睫、脈絡(luò)膜/視網(wǎng)膜和鞏膜中。例如，藥學(xué)可接受的眼用載體可以是軟膏、植物油或包膠材料。此外，本發(fā)明的化合物也可以直接注射進(jìn)房水和玻璃體液中。
用于直腸或陰道的組合物優(yōu)選為栓劑，可以將本發(fā)明的化合物和適用的無(wú)刺激性的賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑用蠟混合進(jìn)行制備，這些賦形劑或載體在室溫下為固體，但在體內(nèi)溫度下為液體，從而在直腸或陰道中熔融而釋放出活性化合物。
本發(fā)明的化合物也可以脂質(zhì)體的形式進(jìn)行給藥。眾所周知，一般采用磷脂或其他脂類物質(zhì)構(gòu)成脂質(zhì)體。將單層或多層水合液晶分散在水性介質(zhì)中形成脂質(zhì)體?？梢允褂萌魏螣o(wú)毒的、生理可接受的、可形成脂質(zhì)體的可代謝脂質(zhì)。除本發(fā)明化合物外，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可包含穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等，優(yōu)選的脂質(zhì)為天然或合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。構(gòu)成脂質(zhì)體的方法是已知的，例如可參見(jiàn)Prescott編輯，Methods in CellBiology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，p.33等。
雖然本發(fā)明的化合物可按單一用藥的方式進(jìn)行給藥，它們也可以和一種或多種常規(guī)用于治療血管生成性疾病的藥物聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明的化合物可以在短時(shí)間內(nèi)使腫瘤對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性療法如化療或放療更為敏感。本發(fā)明的化合物也可以提高細(xì)胞毒性佐劑抗癌的治療效果。本發(fā)明的化合物也可以和其他的抗血管生成藥物聯(lián)合使用以提高其療效，或者與其他的抗血管生成藥物以及其他細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合使用。特別地，用于實(shí)體瘤的治療時(shí)，本發(fā)明的化合物可以和IL-2、類視色素、干擾素、制管張素、endostatin、沙利度胺、凝血栓蛋白-1、凝血栓蛋白-2、captopryl、抗腫瘤藥物如α-干擾素、COMP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤和潑尼松)、依托泊苷、mBACOD(甲氨蝶呤、博來(lái)霉素、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和地塞米松)、PRO-MACE/MOPP(潑尼松、甲氨蝶呤(w/leucovin rescue)、阿霉素、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷/氮芥、長(zhǎng)春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、angioinhibins、TNP-470、戊聚糖多硫酸鹽、血小板因子-4、制管張素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙利度胺、SP-PG等以及輻射。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到與本發(fā)明化合物聯(lián)合使用的用于抑制、治療或預(yù)防血管生成性疾病的藥物并不僅局限于上述藥物，原則上包括任何適用于治療或預(yù)防血管生成性疾病的藥物。
抑制血管生成和治療疾病的方法本發(fā)明提供一種用于抑制組織中血管生成從而抑制組織中因血管生成而出現(xiàn)的病變的方法。概括而言，這種方法包括對(duì)組織給藥組合物，該組合物包含優(yōu)選抑制血管生成劑量的本發(fā)明的化合物，如Pexstatin。
如前所述，血管生成包括了多個(gè)涉及組織中新血管形成的過(guò)程，如“萌發(fā)”、血管形成或血管長(zhǎng)大，所有這些血管生成過(guò)程均涉及血管中胞外基質(zhì)膠原蛋白瓦解。除外傷愈合、黃體形成和胚胎形成外，據(jù)信決大多數(shù)的血管生成均與疾病有關(guān)，因此，本發(fā)明的治療方法適用于治療疾病。
作為血管生成抑制劑，本發(fā)明的化合物如Pexstatin適用于治療原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤，包括在乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、下咽部、食道、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸、尿路(包括腎、膀胱和尿路上皮)，雌性生殖道(包括子宮頸、子宮、卵巢以及絨毛癌和妊娠滋養(yǎng)層疾病)，雄性生殖道(包括前列腺、精囊、睪丸和生殖細(xì)胞腫瘤)，內(nèi)分泌腺(包括甲狀腺、腎上腺、和腦垂體)，和皮膚上的癌變，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(骨骼和軟組織中發(fā)生的肉瘤以及卡波西肉瘤)，大腦、神經(jīng)、眼睛和腦膜中發(fā)生的腫瘤(包括星細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、眼癌、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、許旺氏細(xì)胞瘤、腦膜瘤)。這些化合物也用于治療造血系統(tǒng)癌變產(chǎn)生的實(shí)體瘤，如白血病(即綠色瘤、漿細(xì)胞瘤、以及蕈樣肉芽腫的斑點(diǎn)和腫瘤和皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤/白血病)，也可用于治療淋巴瘤(何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤)。此外，如上所述，不論是單獨(dú)使用或與放療或其他化療藥物聯(lián)合使用，這些化合物也可用于預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移。
其他用途包括治療和預(yù)防自體免疫疾病，如風(fēng)濕病，免疫性或退化性關(guān)節(jié)炎，多種眼部疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病，早熟性視網(wǎng)膜病，角膜移植排異，晶體后纖維組織增生，新生血管性青光眼，因黃斑變性，缺氧引起的虹膜，角膜新血管形成，與感染或手術(shù)有關(guān)的血管生成，以及其他的眼部非正常的新血管形成；皮膚疾病如牛皮癬；血管疾病如血管瘤，以及動(dòng)脈粥樣化斑塊中的毛細(xì)血管增殖，Osler-Webber綜合癥，心肌血管生成，斑塊新血管形成，毛細(xì)血管擴(kuò)張，血友病性關(guān)節(jié)，血管纖維瘤，和傷口顆?；Ｆ渌猛景ㄖ委熞蜻^(guò)度或不正常地刺激內(nèi)皮細(xì)胞所導(dǎo)致的疾病，此處不作界定，包括腸粘連，克羅恩氏病，動(dòng)脈硬化癥，硬皮病以及肥厚性瘢痕，即瘢痕疙瘩。其他用途作為避孕藥物，抑制排卵和形成胎盤。本發(fā)明的化合物也可用于治療這樣一類疾病，其中疾病的發(fā)生產(chǎn)生了血管生成現(xiàn)象，如貓抓病(Rochele ninalia quintosa)和潰瘍(Helicobacter pylori)。在手術(shù)，特別是治療可切除的腫瘤之前，給藥本發(fā)明的化合物可以減少出血。
本發(fā)明的方法是有效的，這部分是因?yàn)橹委煂?duì)于血管生成具有高度的選擇性而不作用于其他的生理過(guò)程。此外，本發(fā)明的化合物是強(qiáng)效的，使用劑量低，這也可以給治療帶來(lái)好處。
能夠使血管生成變?yōu)椴B(tài)的組織或器官(包括組織化的組織)包括皮膚、肌肉、內(nèi)臟、結(jié)締組織、關(guān)節(jié)、骨骼等組織，受到血管生成的刺激后血管能夠侵入到這些組織中。本發(fā)明所采用術(shù)語(yǔ)“組織”也包含所有的體液、分泌物等，如血清、血液、腦脊髓液、血漿、尿、關(guān)節(jié)滑液、玻璃體液。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，被治療的組織是發(fā)炎的組織，所抑制的血管生成是在發(fā)炎的組織中造成新血管形成的發(fā)炎組織的血管生成。在這種情況下，本發(fā)明的方法試圖抑制關(guān)節(jié)組織，如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病病人的關(guān)節(jié)組織，免疫性或非免疫性發(fā)炎的組織，牛皮癬組織等中的血管生成。
理想地，本發(fā)明多種實(shí)施方案的治療對(duì)象是人，雖然理論上本發(fā)明對(duì)于所有哺乳動(dòng)物均有效，在本發(fā)明中將所有哺乳動(dòng)物均歸于“患者”范疇內(nèi)。從這一角度講，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為哺乳動(dòng)物是指需要治療血管生成的任何哺乳動(dòng)物。例如，患者可以是豬、奶牛、馬、山羊、綿羊、騾子、驢、狗、貓、兔、小鼠和大鼠。
在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，被治療的組織是糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、新生血管性青光眼患者的視網(wǎng)膜組織，所抑制的血管生成是在視網(wǎng)膜組織中造成新血管形成的視網(wǎng)膜組織的血管生成。
在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，被治療的組織是實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移性病灶、皮膚癌、乳腺癌、血管瘤血管或纖維瘤等腫瘤患者的腫瘤組織，所抑制的血管生成是在腫瘤組織中造成新血管形成的腫瘤組織的血管生成。本發(fā)明方法所治療的典型實(shí)體瘤組織包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、咽喉癌、卵巢癌、卡波濟(jì)氏肉瘤等組織。實(shí)施例中描述了示例性的腫瘤組織血管生成以及血管生成抑制。
腫瘤組織血管生成的抑制是一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，因?yàn)樾卵苄纬稍谀[瘤的生長(zhǎng)中具有重要的作用。在缺乏新血管形成的腫瘤組織中，腫瘤組織不能獲得所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其生長(zhǎng)速度減緩，增大停止，衰退并且最終壞死，結(jié)果導(dǎo)致腫瘤被殺滅。通過(guò)抑制新血管形成的作用，本發(fā)明的方法對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的形成也有抑制作用，這是因?yàn)?1)轉(zhuǎn)移性病灶的形成需要母體腫瘤的血管生成，從而使轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞離開(kāi)母體腫瘤，(2)在建立新的位點(diǎn)時(shí)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞也需要新血管形成，以支持轉(zhuǎn)移性病灶生長(zhǎng)的需要。
在一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明試圖將本發(fā)明的方法與其他方法，如作用于實(shí)體瘤并抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的常規(guī)化學(xué)療法聯(lián)合使用。典型地，在化療期間或之后給藥血管生成抑制劑，雖然在化療完成后再抑制血管生成是更優(yōu)選的，因?yàn)榇藭r(shí)腫瘤組織正在誘導(dǎo)血管生成，通過(guò)向腫瘤組織提高血液和供應(yīng)進(jìn)行恢復(fù)，此時(shí)腫瘤組織對(duì)于毒性進(jìn)攻是有響應(yīng)的。此外，優(yōu)選在手術(shù)切除實(shí)體瘤后執(zhí)行抑制血管生成的方法，以防出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病灶。
再狹窄是一種平滑肌細(xì)胞(SMC)在經(jīng)皮經(jīng)管冠狀動(dòng)脈成形術(shù)位點(diǎn)上遷移和增殖的過(guò)程，阻礙了手術(shù)的成功。在再狹窄期間與血管有關(guān)的SMC的遷移和增殖涉及可以被本發(fā)明方法所抑制的血管生成的過(guò)程。因此，本發(fā)明也試圖在血管成形術(shù)后通過(guò)抑制血管生成相關(guān)的過(guò)程抑制再狹窄。對(duì)抑制再狹窄，典型地，在血管成形術(shù)后給藥本發(fā)明的化合物2至28天，更優(yōu)選地，在手術(shù)后給藥約14天。
可以采用注射或滴注非腸道給藥本發(fā)明的化合物。雖然典型的方法是通過(guò)全身性給藥使藥物進(jìn)入被治療的組織中，因而最常見(jiàn)的方法是靜脈給藥本發(fā)明的化合物，但是也可以嘗試通過(guò)其他的組織或采用其他給藥方法進(jìn)行給藥，目標(biāo)組織也有可能含有靶向分子。因此，本發(fā)明的化合物，包括多肽及其衍生物，可以通過(guò)靜脈、腹腔、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)皮、局部、眼內(nèi)、口服、鼻腔等途徑進(jìn)行給藥，也可以采用蠕動(dòng)裝置給藥。
可以通過(guò)給藥編碼本發(fā)明化合物的合成基因?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明化合物的給藥，其中在合成基因表達(dá)后產(chǎn)生了本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的藥用組合物可以采用常規(guī)的靜脈給藥，如注射的方式進(jìn)行給藥。對(duì)于本發(fā)明的藥用組合物而言，采用術(shù)語(yǔ)“單元?jiǎng)┝俊敝高m用于作為單次劑量的物理上分立的單元，各單元含有預(yù)定數(shù)量的化學(xué)材料，與所需稀釋劑，即載體或媒介一起產(chǎn)生所需的治療效果。
本發(fā)明化合物的劑量范圍依據(jù)化合物的形式以及隨后將詳細(xì)討論的效能而定，其用量應(yīng)大到產(chǎn)生所需的效果，使受血管生成調(diào)控的血管生成和癥狀減輕。劑量不能大到出現(xiàn)不良的副作用，如出現(xiàn)超高粘度綜合癥、肺氣腫、充血性心力衰竭等。概括而言，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)病人的年齡，癥狀、性別和病情的不同來(lái)確定劑量。在出現(xiàn)并發(fā)癥時(shí)也可以由醫(yī)生來(lái)調(diào)整劑量。
對(duì)于人或哺乳動(dòng)物，本發(fā)明化合物的每日總劑量(一次或分次使用)為例如每天0.0001至300mg/kg體重，更優(yōu)選為1至300mg/kg體重。
檢測(cè)方法本發(fā)明的化合物也適用于監(jiān)測(cè)組織中的血管生成。一旦與目標(biāo)組織結(jié)合后，本發(fā)明的化合物可以被直接或間接地檢測(cè)。對(duì)于包含一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記如熒光染料、放射性標(biāo)記、順磁性重金屬或診斷染料的化合物，可以直接進(jìn)行檢測(cè)。
此外，可以通過(guò)二級(jí)相互作用進(jìn)行檢測(cè)。例如，可以采用可檢測(cè)的標(biāo)記抗體監(jiān)測(cè)化合物的位置。對(duì)于不同化合物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定適用的二級(jí)抗體。
為進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)，優(yōu)選采用可檢測(cè)的標(biāo)記化合物。通過(guò)靜脈、肌肉注射等方法對(duì)患者給藥標(biāo)記的化合物。特別優(yōu)選為適用于在患者體內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)記。例如，順磁性標(biāo)記的化合物可以用核磁共振成像技術(shù)檢測(cè)，放射性標(biāo)記的化合物也可以被檢測(cè)出來(lái)。
以下為適用于檢測(cè)的本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)例在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種監(jiān)測(cè)組織中的血管生成的方法，其中將組織和本發(fā)明的化合物如Pexstatin與所述組織接觸。在這種方法中，例如，所述組織為體外的和體內(nèi)的組織，所述化合物通過(guò)靜脈給藥、經(jīng)皮給藥、滑膜內(nèi)給藥、肌肉給藥、腫瘤內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥、鼻腔給藥、鞘內(nèi)給藥、局部給藥、口服等途徑進(jìn)行給藥。此外，在這種方法中，所述化合物和熒光染料、放射性標(biāo)記、順磁性重金屬、診斷染料或酶結(jié)合。在本方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，組織和多肽接觸的步驟包括對(duì)組織給藥編碼本發(fā)明多肽的合成基因，當(dāng)基因表達(dá)后在組織中產(chǎn)生了本發(fā)明的多肽。
其他用途本發(fā)明還提供檢測(cè)本發(fā)明化合物的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)樣品中本發(fā)明多肽的方法，其包括將樣品和可與所述多肽結(jié)合或形成復(fù)合物的化合物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以生成復(fù)合物，檢測(cè)這種復(fù)合物，如果檢測(cè)到復(fù)合物就說(shuō)明檢測(cè)到了本發(fā)明的多肽。在這一實(shí)施方案中，結(jié)合本發(fā)明多肽的化合物可以是抗體。
此外，也可以用本發(fā)明的多肽制作親和柱，用于純化對(duì)于和本發(fā)明多肽抗血管生成活性有關(guān)的受體。眾所周知，受體分離和純化后可以得到氨基酸序列，以此可以鑒別和分離出編碼受體的多聚核苷酸。這樣就可以通過(guò)基因重組表達(dá)受體得到大量的受體，例如可以利用這些受體進(jìn)行高通量篩選試驗(yàn)，以鑒別出其他的血管生成抑制劑。
為滿足多種用途的需要，可以將本發(fā)明的化合物與同位素、酶、載體蛋白、細(xì)胞毒性藥物、熒光分子、化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑和其他化合物化學(xué)偶聯(lián)。例如，可以對(duì)多肽作標(biāo)記，使檢測(cè)其和抗血清結(jié)合能力的試驗(yàn)易于進(jìn)行，或者使檢測(cè)具有相關(guān)受體的細(xì)胞類型的試驗(yàn)易于進(jìn)行。概括而言，以多肽中氨基酸中的官能團(tuán)為基礎(chǔ)選擇偶聯(lián)技術(shù)，所述官能團(tuán)包括但不限于氨基、巰基、羧基、酰胺基、苯酚基和咪唑基?？梢圆捎枚喾N試劑，包括戊二醛、dizodized benzidine、碳二亞胺和對(duì)苯醌。
采用適于具體偶聯(lián)反應(yīng)的技術(shù)確定偶聯(lián)反應(yīng)的效率。例如，采用氯胺T和高比活性的NaI125可以實(shí)現(xiàn)用I125標(biāo)記多肽。采用偏亞硫酸氫鈉終止反應(yīng)并且在一次性的柱中對(duì)反應(yīng)化合物進(jìn)行脫鹽。將標(biāo)記的多肽從柱中洗脫下來(lái)并收集。對(duì)各份洗脫液取樣，用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性。以此方式，所制得的標(biāo)記多肽不含游離的NaI125。
測(cè)量本發(fā)明化合物的試劑盒也是本發(fā)明的組成部分。可以采用最高效價(jià)和專一性的抗血清檢測(cè)血漿、尿、組織和細(xì)胞培養(yǎng)基提取物中的本發(fā)明多肽，采用這種抗血清可以得到快速、可靠、靈敏以及專一性檢測(cè)和定位本發(fā)明多肽的試劑盒。這種試劑盒可以采用(但不限于)以下技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，放射免疫試驗(yàn)(RIA)，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)，熒光試驗(yàn)，sandwich技術(shù)，免疫放射技術(shù)，斑點(diǎn)印跡技術(shù)，包括ELISA的酶聯(lián)免疫技術(shù)，微量滴定板，用于快速監(jiān)測(cè)尿液或血液的涂布抗體的條或浸漬片，以及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。可以采用本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘姆椒ù_定各試劑盒的范圍、靈敏度、精度、可靠性、專一性和重現(xiàn)性。
上述試劑盒可以包含使用說(shuō)明、抗血清、一種或多種本發(fā)明的多肽、以及可能被放射標(biāo)記的本發(fā)明多肽和/或用于沉淀多肽/抗體復(fù)合物的試劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣，這種試劑盒可以用于檢測(cè)具有腫瘤或不具有腫瘤的動(dòng)物和人的體液或組織提取液中的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明還試圖提供一種可用于指示或定位本發(fā)明多肽在組織或細(xì)胞中分布的試劑盒。例如通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)和試劑盒，這些技術(shù)已為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知。這種試劑盒采用抗血清作用于本發(fā)明的多肽，以及可能的封閉性血清和連接熒光分子如異硫氰酸熒光素或一些用于指示一級(jí)血清的其他試劑的二級(jí)抗血清。利用這種方法可以檢查腫瘤切片中多肽產(chǎn)生的位點(diǎn)和多肽受體的位點(diǎn)。此外，可以制作一種含有放射標(biāo)記的核酸的試劑盒，這種核酸被用于原位雜化，以檢測(cè)編碼本發(fā)明化合物的信使RNA。
所有參考文獻(xiàn)均全文引用作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1全身性給藥Pexstatin對(duì)于雞胚胎中黑素瘤生長(zhǎng)的影響作用將CS-I黑素瘤細(xì)胞(5×106)接種在10天齡的雞胚胎的雞絨毛尿囊膜(CAM)上。24小時(shí)后對(duì)胚胎靜脈注射50μg的Pexstatin或PBS空白對(duì)照。7天的溫育期結(jié)束后，將腫瘤切除并測(cè)量其濕重。結(jié)果列于圖1中。數(shù)據(jù)表示為每一條件下5-10個(gè)胚胎中腫瘤的平均重量±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
結(jié)論如圖1所示，與對(duì)照相比，全身性給藥Pexstatin在7天內(nèi)對(duì)于CS-I黑素瘤生長(zhǎng)的抑制率約為60％。這些試驗(yàn)被重復(fù)了2至3次，結(jié)果基本類似。此外，在試驗(yàn)期間沒(méi)有觀察到毒副作用。這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在這一動(dòng)物模型中Pexstatin是一種強(qiáng)效的抗腫瘤多肽。
實(shí)施例2全身性給藥Pexstatin對(duì)于裸鼠體內(nèi)黑素瘤生長(zhǎng)的影響作用將M21人黑素瘤細(xì)胞(2×106)皮下注射至雌性裸鼠體內(nèi)。24小時(shí)后每天對(duì)裸鼠靜脈注射100μg的Pexstatin或PBS空白對(duì)照。每天用卡尺測(cè)量腫瘤的大小。結(jié)果列于圖2中。數(shù)據(jù)表示為各時(shí)間點(diǎn)腫瘤的平均尺寸±標(biāo)準(zhǔn)偏差。按下式估算腫瘤的體積V＝L2×W/2，其中V＝體積，L＝長(zhǎng)度，W＝寬度。
結(jié)論如圖2所示，與對(duì)照相比，全身性給藥Pexstatin對(duì)于M21人黑素瘤生長(zhǎng)的抑制率約為80至90％。這些試驗(yàn)被重復(fù)了2次，結(jié)果基本類似。此外，在試驗(yàn)期間沒(méi)有觀察到毒副作用。這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在這一動(dòng)物模型中Pexstatin是一種強(qiáng)效的抗腫瘤多肽。
實(shí)施例3全身性給藥Pexstatin對(duì)于體內(nèi)血管生成的影響作用A)將用βFGF飽和的過(guò)濾板置于在10天齡的雞胚胎的雞絨毛尿囊膜(CAM)上。24小時(shí)后對(duì)胚胎靜脈注射50μg的Pexstatin或PBS空白對(duì)照。3天的溫育期結(jié)束后，取出過(guò)濾板和周圍的CAM組織，對(duì)過(guò)濾板區(qū)域內(nèi)的血管分杈點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，定量評(píng)價(jià)血管生成。圖3顯示了典型試驗(yàn)中CAM組織的情況。
B)圖4顯示了采用Pexstatin的血管生成試驗(yàn)的定量結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為每一條件下5-10個(gè)胚胎中的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。血管生成指數(shù)等于實(shí)驗(yàn)胚胎中血管分杈點(diǎn)的數(shù)目減去不用βFGF時(shí)CAM中血管分杈點(diǎn)的數(shù)目。
結(jié)論如圖4所示，與對(duì)照相比，全身性給藥50μg的Pexstatin抑制了βFGF誘導(dǎo)出的血管生成，與對(duì)照相比，抑制率約為90％。重要的是在試驗(yàn)期間沒(méi)有觀察到對(duì)胚胎的毒副作用。此外，對(duì)于正常的休眠血管而言，這種MMP-2的肽片斷即使是有作用，其作用也非常小。
實(shí)施例4Pexstatin對(duì)于體內(nèi)B16黑素瘤轉(zhuǎn)移的影響作用采用雞胚胎腫瘤轉(zhuǎn)移模型評(píng)價(jià)Pexstatin對(duì)于體內(nèi)B16黑素瘤轉(zhuǎn)移的影響作用。簡(jiǎn)而言之，在12天齡的雞胚胎中接種B16黑素瘤細(xì)胞(2.5×104)和靜脈注射的Pexstatin(10μg/胚胎)或?qū)φ斩嚯?。此外，還增加一個(gè)未作處理的對(duì)照(NT)。7天的溫育期結(jié)束后，將胚胎處死并取出肺作分析。對(duì)于每個(gè)肺葉上的黑素瘤病變進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果列于圖5中。數(shù)據(jù)表示為每一條件下5-10個(gè)胚胎中轉(zhuǎn)移性病灶的平均數(shù)目±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
結(jié)論如圖5所示，與對(duì)照相比，Pexstatin對(duì)于B16黑素瘤轉(zhuǎn)移的抑制率約為80％。事實(shí)上在一些胚胎中未檢測(cè)到腫瘤，或者即使檢測(cè)到了其數(shù)目也很少。由于腫瘤轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中不大可能涉及血管生成，這些結(jié)果說(shuō)明Pexstatin對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵入和內(nèi)皮細(xì)胞侵入有作用。綜合起來(lái)看，這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明Pexstatin在體內(nèi)具有強(qiáng)烈的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，為Pexstatin用于人的臨床試驗(yàn)提供了進(jìn)一步的證據(jù)。
實(shí)施例5Pexstatin在完整MMP-2中的相對(duì)位置的概述完整MMP-2的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被測(cè)定。圖6顯示了Pexstatin的相對(duì)位置(氨基酸582-590)，位于MMP-2中血液結(jié)合素域中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。圖中Pexstatin被表示為項(xiàng)目1。
所有在本發(fā)明中被引用的出版物均全文引用作為參考。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到以上的發(fā)明描述僅起描述和解釋作用，而不用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行精確的界定。同時(shí)也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在不背離本發(fā)明的精神的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作改動(dòng)。本發(fā)明的范圍應(yīng)由以下權(quán)利要求來(lái)界定。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其所包括的序列基本上等價(jià)于選自SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2中的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽抑制血管生成。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽抑制疾病。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述疾病為牛皮癬、黃斑變性、神經(jīng)性疾病和組織中的再狹窄。
6.一種抑制組織中血管生成的方法，其包括給藥如權(quán)利要求1所述的多肽。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述多肽通過(guò)靜脈、經(jīng)皮、滑膜內(nèi)、肌肉、腫瘤內(nèi)、眼內(nèi)、鼻腔、鞘內(nèi)、局部或口服途徑進(jìn)行給藥。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中對(duì)所述多肽的給藥包括給藥編碼所述多肽的合成基因，其中當(dāng)合成基因被表達(dá)后在體內(nèi)生成所述多肽。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述多肽與化療聯(lián)合使用。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述多肽與放療聯(lián)合使用。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中組織為發(fā)炎并且出現(xiàn)血管生成的組織。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述組織存在于哺乳動(dòng)物中。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述組織為關(guān)節(jié)炎組織，眼部組織，視網(wǎng)膜或血管瘤。
14.一種抑制組織中腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法，其包括給藥如權(quán)利要求1所述的多肽。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽通過(guò)靜脈、經(jīng)皮、滑膜內(nèi)、肌肉、腫瘤內(nèi)、眼內(nèi)、鼻腔、鞘內(nèi)、局部或口服途徑進(jìn)行給藥。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中對(duì)所述多肽的給藥包括給藥編碼所述多肽的合成基因，其中當(dāng)合成基因被表達(dá)后在體內(nèi)生成所述多肽。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽與化療聯(lián)合使用。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽與放療聯(lián)合使用。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述腫瘤為黑素瘤、惡性腫瘤、肉瘤、纖維肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星細(xì)胞瘤。
20.一種抑制牛皮癬、黃斑變性或組織中再狹窄的方法，其包括給藥如權(quán)利要求1所述的多肽。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多肽通過(guò)靜脈、經(jīng)皮、滑膜內(nèi)、肌肉、腫瘤內(nèi)、眼內(nèi)、鼻腔、鞘內(nèi)、局部或口服途徑進(jìn)行給藥。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中對(duì)所述多肽的給藥包括給藥編碼所述多肽的合成基因，其中當(dāng)合成基因被表達(dá)后在體內(nèi)生成所述多肽。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多肽與化療聯(lián)合使用。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多肽與放療聯(lián)合使用。
25.一種檢測(cè)組織中血管生成的方法，其包括使權(quán)利要求1中的多肽與所述組織接觸。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述組織為體外組織。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述組織為體內(nèi)組織，而所述多肽通過(guò)靜脈、經(jīng)皮、滑膜內(nèi)、肌肉、腫瘤內(nèi)、眼內(nèi)、鼻腔、鞘內(nèi)、局部或口服途徑進(jìn)行給藥，使所述多肽與所述組織接觸。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中將所述多肽和所述組織接觸包括對(duì)所述組織給藥編碼所述多肽的合成基因，其中當(dāng)合成基因被表達(dá)后在所述組織中生成了所述多肽。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述多肽與熒光染料、放射性標(biāo)記、順磁性重金屬、診斷染料或酶連接。
30.一種檢測(cè)組織中腫瘤和腫瘤侵入的方法，其包括給藥如權(quán)利要求1所述的多肽。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組織為體外組織。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組織為體內(nèi)組織，而所述多肽通過(guò)靜脈、經(jīng)皮、滑膜內(nèi)、肌肉、腫瘤內(nèi)、眼內(nèi)、鼻腔、鞘內(nèi)、局部或口服途徑進(jìn)行給藥，使所述多肽與所述組織接觸。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述多肽與熒光染料、放射性標(biāo)記、順磁性重金屬、診斷染料或酶連接。
34.一種檢測(cè)樣品中如權(quán)利要求1所述的多肽的方法，其包括將樣品和可與所述多肽結(jié)合或形成復(fù)合物的化合物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以生成復(fù)合物，以及檢測(cè)該復(fù)合物，如果檢測(cè)到復(fù)合物就說(shuō)明檢測(cè)到了如權(quán)利要求1所述的多肽。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述化合物是抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制腫瘤生長(zhǎng)和組織中血管發(fā)生以及治療疾病的方法和組合物，其中采用了基于基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP－2)中特定序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種多肽，其氨基酸序列為Ile－Phe－Ala－Gly－Asp－Lys－Phe－Trp－Arg，優(yōu)選地，在該序列的兩側(cè)氨基和羧基上包夾半胱氨酸。此外，本發(fā)明涉及抑制腫瘤生長(zhǎng)和組織中血管發(fā)生以及治療疾病組合物，其包含基于上述氨基酸序列的或其中包夾有這種MMP－2序列的優(yōu)化氨基酸序列的有機(jī)或非肽類模擬物。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明組合物和組織接觸以檢測(cè)血管生成、腫瘤組織、轉(zhuǎn)移性病灶和腫瘤侵入組織的方法，以及篩選本方面組合物的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1636059SQ02815235
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者彼得·C·布魯克斯, 多蘿西·羅德里格斯 申請(qǐng)人:南加利福尼亞大學(xué)