專利名稱：用于抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的含有多糖偶聯物的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物組合物，該組合物包含多糖衍生物或其鹽作為活性成分，該多糖衍生物包括具有通過氨基酸或由2-8個相同或不同氨基酸組成的肽與具有抗腫瘤活性的活性物質，例如下式(I)或(II)的喜樹堿衍生物結合的羧基的多糖。
背景技術：
在發(fā)達國家中惡性腫瘤是導致死亡的一個主要病因，并且大多數惡性腫瘤有關性死亡歸因于轉移到遠處器官或局部治療后向遠處器官轉移所伴隨的復發(fā)。通過血原性轉移或淋巴原性轉移可以誘發(fā)向遠處器官轉移，并且已知患有淋巴原性轉移的患者在局部治療后存在惡性腫瘤復發(fā)的高危性。復發(fā)的主要器官是腦、肺、肝和骨。尤其是，消化器官內的腫瘤，例如大量患者患有的結腸癌，經?？梢郧秩氩U散到肝臟中，并且乳腺癌和肺癌也經常侵入并傳播到肝臟中。此外，淋巴瘤和淋巴性白血病可主要擴散到淋巴系統(tǒng)，而且據報導通過尸體解剖發(fā)現向肝臟高速轉移為了阻止復發(fā)，包括向遠處器官轉移(例如向肝臟轉移)和延長生命，化療等被用作局部治療后的維持性護理，但化療毒性強且無法用于長期給藥。此外，幾乎不能報告稱采用化療的維持性護理比單獨局部治療更久地延長生命。譬如，在對成為一種消化器官癌癥-晚期胃癌的手術對象的患者進行術后化療的試驗中，嘗試過多種抗惡性腫瘤藥物的臨床試驗，但仍然無法建立起比單獨手術具有更良好存活率的治療方法。
在這些情況下，希望發(fā)現在局部治療后有效抑制復發(fā)或延長生命的新藥物，它適用于淋巴結和轉移的遠處器官且具有低副作用，并且適合長時間給藥。
另一方面，WO 94/19376，WO 97/46260，WO 97/38727，JP-A-10-72467和JP-A-10-95802公開了一種多糖衍生物，其含有通過氨基酸或肽與抗腫瘤活性的活性物質結合的多糖。
然而，這些出版物公開了這些多糖在癌癥治療中通過在腫瘤位點蓄積并殺死腫瘤細胞的用途，但是從沒有指出過抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的新的藥物組合物。
本發(fā)明人進行了大量研究，并且發(fā)現包含具有通過氨基酸或肽與具備抗腫瘤活性的活性物質結合的羧基的多糖的多糖衍生物在抑制轉移和/或預防惡性腫瘤復發(fā)中表現出優(yōu)異的效果，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明涉及一種轉移或抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物組合物，它含有多糖衍生物或其鹽作為活性成分，該多糖衍生物包含具有通過氨基酸或由2-8個相同或不同氨基酸組成的肽與具有抗腫瘤活性的活性物質結合的羧基的多糖。
附圖簡述

圖1表示腫瘤植入后的天數和M 5076肝臟轉移模型中存活動物的數量。
實現發(fā)明的最佳方式具有本發(fā)明的羧基的多糖包括那些公開在上述WO 94/19376和WO97/46260中的相同多糖，并且包括在其結構中原本具有羧基的多糖(例如，透明質酸，果膠酸，藻酸，軟骨素，肝素等)，和原本不具有羧基但引入羧基的多糖(例如，支鏈淀粉，葡聚糖，甘露聚糖，殼多糖，甘露葡聚糖(mannoglucan)，殼聚糖等)，和在其結構中原本沒有羧基但在多元醇形成后引入羧基的多糖(例如，具有羧基的多糖多元醇)。
原本不具有羧基但引入羧基的多糖是指原本不具有羧基的多糖的部分或全部羥基的氫原子通過被羧基-C1-4烷基取代制成的多糖。
在本發(fā)明中，具有一個多糖的多糖包括通過用還原劑處理原本不具有羧基的多糖，并且隨后產物的部分或全部羥基的氫原子被羧基-C1-4烷基取代來制成的多糖。
具有羧基的多糖多元醇包括，例如，羧基-C1-4烷基-多糖多元醇，它是按照WO 97/46260所述方法通過依次用高碘酸鈉和硼氫化鈉處理原本不具有羧基的多糖得到多糖多元醇，其進一步用鹵代C1-4烷基羧酸處理來制成。
取代上述多糖(包括多糖多元醇)的羥基氫原子的羧基-C1-4烷基的烷基部分可以是直鏈烷基或支鏈烷基。
優(yōu)選的羧基-C1-4烷基是，例如，羧甲基，1-羧甲基，3-羧丙基，1-甲基-3-羧丙基，2-甲基-3-羧丙基，4-羧丁基等，和更優(yōu)選羧甲基。
在本發(fā)明中，具有羧基的多糖優(yōu)選羧基-C1-4烷基葡聚糖或羧基-C1-4烷基葡聚糖多元醇，和尤其優(yōu)選羧基-C1-4葡聚糖。
在上述制備羧基-C1-4烷基-多糖多元醇的步驟中多元醇形成的程度(依次通過用高碘酸鈉氧化和用硼氫化鈉還原)沒有具體規(guī)定，但中間體多糖多元醇優(yōu)選是通過在基本上幾乎完全形成多元醇的可能條件下處理多糖得到的那些。
此外，在本發(fā)明中，具有羧基的多糖優(yōu)選是羧甲基化葡聚糖或羧甲基化葡聚糖多元醇，并且在這些多糖中，特別是更為優(yōu)選具有20,000-500,000的平均分子量的葡聚糖，并且最優(yōu)選具有50,000-350,000的平均分子量的葡聚糖(所述的平均分子量是通過凝膠滲透色譜(GPC)法測定，Shinseikagaku，Jikken Koza，vol.20，p.7，Tokyo-Kagaku-Dojin，November5，1991)。
當向多糖中引入羧基烷基時，其引入的程度表示為″取代度″，它是由每個糖殘基的羧烷基數目確定的(包括這些基團引入的肽鏈的基團)。它用下面的公式表示。

當羧基是羧甲基時，取代的程度有時表示為羧甲基化的程度(CM-度)。
當多糖是葡聚糖，其取代度優(yōu)選在0.3-0.8的范圍內。當多糖是葡聚糖多元醇時，其取代度優(yōu)選在0.3-0.5的范圍內。
本發(fā)明的氨基酸或肽在具有羧基的多糖與具有抗腫瘤活性的活性物質之間發(fā)揮間隔基的作用，并且氨基酸和形成所述肽的氨基酸包括天然氨基酸和合成氨基酸(包括D-氨基酸，L-氨基，其混合物)，并且還包括中性氨基酸、堿性氨基酸或酸性氨基酸。此外，本發(fā)明的氨基酸不但可以是α-氨基酸，而且還可以是β-氨基酸，γ-氨基酸，ε-氨基酸等。
氨基酸的實例是甘氨酸，α-丙氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，systeine，蛋氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，瓜氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，組氨酸，色氨酸，脯氨酸，羥脯氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸等。
本發(fā)明的肽包括由相同或不同的2-8個氨基酸、優(yōu)選2-5個氨基酸組成的肽。所述肽的實例是甘氨?；?甘氨?；?L-或D-苯丙氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酰基-甘氨酸，L-或D-苯丙氨?；?甘氨酸，L-或D-酪氨?；?甘氨酸，L-或D-亮氨?；?甘氨酸，L-或D-苯丙氨?；?瓜氨酸和L-或D-纈氨?；?瓜氨酸(這些肽的N-末端引入到多糖的羧基上)。
在這些肽中，優(yōu)選甘氨?；?甘氨?；?L-或D-苯丙氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨?；?甘氨酰基-甘氨酸，甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酰基-甘氨?；拾彼幔蚅-或D-苯丙氨?；?甘氨酸。
具有本發(fā)明的抗腫瘤活性的活性物質可以包括多種稱作抗腫瘤藥的化合物，并且可以是細胞毒性藥物或細胞生長抑制劑。細胞毒性藥物優(yōu)選喜樹堿衍生物和紫杉烷衍生物，并且細胞生長抑制劑優(yōu)選血管生成抑制劑，EGF受體抑制劑。更優(yōu)選，細胞毒性藥物是喜樹堿衍生物，并且細胞抑生長制劑是血管生成抑制劑。
喜樹堿衍生物的實例是公開在JP-A-10-72467中的式(I)的化合物 其中R1是取代的或未取代的低級烷基，X1是下式的基團-NHR2(R2是氫原子或低級烷基)且Alk是在其鏈內任選含有氧原子的直鏈或支鏈C1-6亞烷基。其中，優(yōu)選的化合物是10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿。
喜樹堿衍生物的其他實例是公開在JP-A-10-95802中下式(II)的化合物 其中R2-R6中彼此相鄰的兩個基團結合形成低級亞烷基，并且所述低級亞烷基的一個碳原子被氨基取代，和R2-R6的其余三個基團是氫原子、低級烷基或鹵素原子。
其中，優(yōu)選的化合物是(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮等。
紫杉烷衍生物的實例是紫杉醇、Taxotere、13-[(2′R，3′R)-3′N-叔丁氧基羰基-3′-環(huán)丙基]-10-脫乙?；?漿果赤霉素III等。
在本發(fā)明的活性成分中，多糖與具有抗腫瘤活性的活性物質的比例可以按照使用的多糖的種類進行選擇，但當多糖是葡聚糖或葡聚糖多元醇時，則具有抗腫瘤活性的活性物質的含量優(yōu)選在0.1-20％(重量)的范圍內，更優(yōu)選在2-10％(重量)的范圍內，基于活性成分的總重量計。
在本發(fā)明的活性成分中，優(yōu)選多糖衍生物或其鹽，其中氨基酸或由2-8個相同或不同氨基酸組成的肽通過酰胺鍵引入到具有羧基的多糖的部分或全部羧基內，并且其余部分或全部沒有參與和上述肽的羧基結合的氨基或羧基經過酰胺鍵或酯鍵與具有抗腫瘤活性的活性物質的羧基、氨基或羥基結合。
尤其優(yōu)選的活性成分是多糖衍生物，其中具有羧基的多糖是羧甲基化葡聚糖，具有抗腫瘤活性的活性物質是10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿，并且所述的肽是甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酸，或其鹽。尤其優(yōu)選的是多糖衍生物或其鹽，其中具有羧基的多糖是平均分子量為60,000-200,000且其羧甲基化的程度是0.3-0.8的羧甲基化葡聚糖。
其他優(yōu)選的活性成分是多糖衍生物，其中具有羧基的多糖是羧基-C1-4烷基葡聚糖多元醇，具有抗腫瘤活性的活性物質是(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮，和所述的肽是甘氨?；?甘氨?；?L-或D-苯丙氨?；?甘氨酸，或其鹽，和尤其優(yōu)選的是多糖衍生物或其鹽，其中具有羧基的多糖是平均分子量是200,000-400,000且其取代度是在0.3-0.5范圍內的羧基-C1-4烷基葡聚糖多元醇。
本發(fā)明的活性成分的多糖衍生物或其鹽可以按照WO 94/19376，WO97/46260，WO 97/38727，JP-A-10-72467，和JP-A-10-95802公開的方法制備。
本發(fā)明的藥物組合物可以高度蓄積在癌癥可以擴散到的例如淋巴結或肝臟的位置，可以以適當速率釋放活性物質使該活性物質難以作用于正常細胞但抑制性作用于腫瘤細胞的生長，因此本發(fā)明的藥物組合物有效抑制轉移或預防惡性腫瘤的復發(fā)。具體地，本發(fā)明的藥物組合物有效抑制淋巴結轉移和肝臟轉移，特別是有效抑制淋巴結轉移。而且，在淋巴結轉移中，本發(fā)明的藥物組合物有效抑制由結腸向淋巴結內轉移，或由肺向淋巴結內轉移。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可以不但在轉移開始之前，而且還可以在轉移開始之后發(fā)揮其作用。所以，本發(fā)明的藥物組合物也有效抑制轉移或預防局部治療后惡性腫瘤的復發(fā)(例如，手術，放療，溫熱療法，冷凍療法，激光灼燒療法等)。此外，本發(fā)明的藥物組合物也適合長時間的反復給藥，并且可以與局部療法聯合使用。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選經非腸道給藥(例如，靜脈內給藥)，并且常常以液體制劑的形式給藥，例如溶液、混懸劑、乳劑等。
本發(fā)明的藥物組合物適宜用注射用蒸餾水、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液配制為注射劑或滴注劑的形式。
本發(fā)明的藥物組合物的劑量可以根據給藥方法、患者的年齡、體重或狀況等改變，但一般單劑量在0.002-50mg/kg的范圍內，更優(yōu)選在0.01-5mg/kg的范圍內，以轉算為活性物質的量計。
在本發(fā)明說明書中，低級烷基和低級亞烷基可以是具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的那些，并且所述的鹵素原子是氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
試驗試驗1(M 5076肝臟轉移模型)將1百萬的M 5076細胞(小鼠卵巢肉瘤細胞)植入到BDF1雄性小鼠(5-周齡，8動物/組)的尾靜脈中。將測試化合物(化合物A；下面制劑1得到的化合物和Irinotecan(CPT-11))溶解在生理鹽水溶液中，并且在植入后第4、8和12天靜脈內給予小鼠下表1中所示的各個用量，并且植入腫瘤后120天觀察小鼠。在對照組(未用測試化合物處理)中，只給予生理鹽水溶液。測定測試化合物處理組和對照組中的存活時間(天)，并且按照下面的公式計算存活的延長率。結果如表1和圖1所示。
存活的延長率＝(測試化合物-處理組中存活天數/對照組中存活天數-1)×100
表1

如表1所示，下面制備例1得到的化合物(化合物A)在M 5076肝臟轉移模型中表現出優(yōu)良的延長生命的作用。同時，Irinotecan無法被視作是抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物，但只作為喜樹堿衍生物的藥物來測試。
試驗2(HT-29轉移模型)將段(2mm2)的HT-29細胞(人結腸癌)植入到100NCr nu/nu雌性小鼠(5-6周齡，10動物/組)的蠕蟲樣闌尾中。測試化合物(化合物A；下面制備例1得到的化合物，化合物B；下面制備例4得到的化合物，和Irinotechan(CPT-11))溶解在生理鹽水溶液中，并且在植入腫瘤后第15、19、23和25天靜脈內給予小鼠下表2所示的各個用量。另一方面，在對照組(未用測試化合物處理)中，只給予生理鹽水溶液。在植入腫瘤后第84天檢查各器官是否存在轉移灶。結果如表2所示。
表2

*MI是指轉移發(fā)生率**P是指標準偏差，其中所有處理組利用Fishcer精確測試與對照組對比。
***包括隔膜、腹腔和胸腔。
****轉化為10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿的劑量*****轉化為(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的劑量試驗3(HT-29轉移模型)將一段(2mm2)的HT-29細胞(人結腸癌)植入到100NCr nu/nu雌性小鼠(5-6周齡，10動物/組)的蠕動樣闌尾。從植入腫瘤后第49天觀察淋巴結轉移，將測試化合物(化合物A；下面制備例1得到的化合物，和Irinotechan(CPT-11))溶解在生理鹽水溶液中，并且在植入腫瘤后第51、55、59和63天靜脈內給予小鼠下表3所述的各個用量。另一方面，在對照組(未用測試化合物處理)中，只給予生理鹽水溶液。在植入腫瘤后第84天檢查各器官是否存在轉移灶。結果如下表3所示。
表3

*MI是指轉移發(fā)生率**P是指標準偏差，其中所有處理組利用Fishcer精確測試與對照組對比。
***包括隔膜、腹腔和胸腔。
****轉化為10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿的劑量試驗4(H460轉移模型)將一段(2mm2)的H460細胞(人肺癌)植入到100NCr nu/nu雌性小鼠(5-6周齡，10動物/組)的左肺。從在另一對照組植入腫瘤后第14天觀察轉移，將測試化合物(化合物A；下面制備例1得到的化合物，化合物B；下面制備例4得到的化合物，化合物C；和Irinotechan(CPT-11))溶解在生理鹽水溶液中，并且在植入腫瘤后第14、18、22和26天靜脈內給予小鼠下表4所述的各個用量。另一方面，在對照組(未用測試化合物處理)中，只給予生理鹽水溶液。在植入腫瘤后第36天檢查各器官是否存在轉移灶。結果如下表4所示。
表4

*MI是指轉移發(fā)生率**P是指標準偏差，其中所有處理組利用Fishcer精確測試與對照組對比。
***包括隔膜、腹腔和胸腔。
****轉化為10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿的劑量*****轉化為(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的劑量制備例制備例1CM-葡聚糖-7-乙基-10-[3′-(甘氨酰基-甘氨?；?甘氨?；被?丙氧基]-(20S)-喜樹堿 (CM-葡聚糖是指羧甲基葡聚糖，下文相同)(1)將10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿鹽酸鹽(500mg)溶解在乙腈(25ml)中，并且向其中依次加入叔丁氧基羰基甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酸(345mg)、N-甲基嗎啉(121mg)、N-羥基苯并三唑(161mg)和1-(3-二甲基氨基-丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(228mg)，和將該混合物攪拌過夜。通過過濾收集沉淀的產物，通過硅膠柱色譜純化得到淺黃色泡沫狀粉末，它由正丙醇重結晶得到7-乙基-10-[3′-(叔丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨?；?甘氨?；被?丙氧基]-(20S)-喜樹堿(663mg)，其為無色結晶。
M.p.157-159℃。
(2)7-乙基-10-[3′-(叔丁氧基羰基-甘氨?；?甘氨?；?甘氨?；被?丙氧基]-(20S)-喜樹堿(3-86g)在純水(64ml)中乳化，并且向其中加入6N鹽酸水溶液(32ml)，并且將該混合物室溫下攪拌反應2小時。濃縮溶劑，并且向其中加入正丙醇沉淀出粉狀產物。通過過濾收集所得粉狀產物，并且由含水正丙醇重結晶得到7-乙基-10-[3′-(甘氨?；?甘氨酰基-甘氨?；被?丙氧基]-(20S)-喜樹堿鹽酸鹽(2.56g)，其為黃色結晶。
(3)CM-葡聚糖鈉鹽(CM-度＝0.44，50g)溶解在水(2.5升)中，并且其pH值用0.2N鹽酸水溶液在攪拌和15℃下調至pH 5.0，并且向其中加入7-乙基-10-[3′-(甘氨?；?甘氨?；?甘氨?；被?丙氧基]-(20S)-喜樹堿鹽酸鹽(4.01g)。向該混合物加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(50g)，在此過程中反應溶液的pH值用0.2N鹽酸保持在5.0-5.5。該混合物在15℃和攪拌下反應1小時，并且用純水稀釋至10L的總體積。在pH值保持在pH 4.0左右的同時，利用超濾模塊(ACP-1010，Asahi KaseiIndustries，Ltd.制造)除去低分子餾分，并且其pH值用0.1N氫氧化鈉水溶液調至pH 8，并且隨后進行離子交換樹脂MSC-1(Na-type，Dowex制造)。濃縮含有所需化合物的餾分，并且經濾器(0.45μm)過濾。所得物與乙醇(10L)混合并攪拌，向其中在攪拌下滴加3M鹽水(40ml)。通過過濾收集得到的沉淀，并且溶解在純水(21L)中。該溶液的pH值用0.2N鹽酸水溶液調至pH 4.0，并且在此進行超濾，在此期間pH值保持在pH 4.0。濃縮溶劑至1.5升的總體積，并且經濾器(0.45μm)過濾。所得物與乙醇(9升)混合，并且向其中在攪拌下滴加3M鹽水(35ml)。通過過濾收集所得沉淀，并且依次用乙醇和丙酮洗滌，減壓下濃縮得到所需化合物(54.9g)，其為淺黃色粉末。作為10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿鹽酸鹽的含量通過在367.5nm下的吸光度證實為4.2％。通過GPC(凝膠滲透色譜)分析，所需產物的平均分子量是121kDa，并且分布的程度(Mw/Mn)為1.47。
制備例2CM-葡聚糖-13-[(2′R，3′S)-3′-N-叔丁氧基羰基-3′-苯基-2′-O-L-苯丙氨?；?甘氨酰基-異絲氨?；鵠-10-脫?；?漿果赤霉素III的制備 (Bz是苯甲酰基，此后相同)
將CM-葡聚糖(2008mg，CM-度0.47，平均分子量170kDa)在攪拌下溶解于純水(90ml)，并且向其中加入13-[(2′R，3′S)-3′-N-叔丁氧基羰基-3′-苯基-2′-O-L-苯丙氨?；?甘氨?；?異絲氨?；鵠-10-脫酰基-漿果赤霉素III甲磺酰鹽(119mg)和二甲基甲酰胺(90ml)，并且攪拌該混合物至溶解。攪拌下向該混合物加入2-乙氧基-1-(2H)-喹啉甲酸(4.0g)，并且在室溫下攪拌該混合物過夜。在攪拌下向該反應溶液中加入乙醇(720ml)，并且在攪拌下向其中進一步滴加3M鹽水(1.8ml)。通過離心收集沉淀，并且溶解在水(200ml)中，且用0.2N氫氧化鈉水溶液將該溶液的pH值調至pH 7。將該溶液在攪拌下傾入乙醇(800ml)，并且在攪拌下向其中滴加3M鹽水(4ml)。通過離心收集所得的沉淀，并且按照制備例1-(3)相同的方式純化得到所需化合物(600mg)，作為白色粉末。
活性物質的含量2.4％(UV法，(λ＝276nm))制備例3CM-葡聚糖-2′-O-苯丙氨酰基-甘氨?；?紫杉醇的制備 CM-葡聚糖(1.294g，CM-度0.47，平均分子量170kDa)在攪拌下溶解在純水(70ml)中，并且向其中加入2′-O-苯基-丙氨酰基-甘氨?；仙即技谆撬猁}(77mg)和二甲基甲酰胺(70ml)，和將該混合物進一步攪拌以便溶解。攪拌下將2-乙氧基-1(2H)-喹啉甲酸(2.59g)加入到該混合物中，并且使該混合物反應同時攪拌過夜。攪拌下將該反應溶液加入到乙醇(700ml)，并且在攪拌下向其中滴加3M鹽水(1.4ml)。通過離心收集沉淀，并且溶于水(240ml)，攪拌下與乙醇(1200ml)混合。攪拌下向該混合物中滴加3M鹽水(4.8ml)以便沉淀。以相同方式，進一步重復3次沉淀得到所需產物(746mg)，其為白色粉末。
活性物質的含量4.8％(UV法(＝273nm))制備例4羧甲基葡聚糖-多元醇-(1S，9S)-(甘氨酰基-甘氨?；?L-苯丙氨酰基-甘氨?；被?-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indoridino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮(1)(1S，9S)-1-(叔丁氧基羰基-甘氨?；?甘氨?；?L-苯丙氨?；?甘氨酰基氨基)-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮 向(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并-[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮鹽酸鹽(167mg；0.354mmol)，叔丁氧基羰基甘氨酰基-甘氨?；?L-苯丙氨酰基-甘氨酸(463mg；1.06mmol)和1-羥基苯并三唑一水合物(HOBT)(143mg；1.06mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(10ml)中的溶液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽(270mg；1.42mmol)、三乙胺(148μl；1.06mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(5mg；0.04mmol)。室溫下攪拌該反應混合物15小時，并且減壓下濃縮溶劑。殘余物溶解在氯仿中，并且洗滌該混合物，干燥，和減壓下蒸發(fā)溶劑。殘余物通過硅膠柱色譜純化(溶劑；氯仿∶甲醇＝50∶1-10∶1)得到標題化合物(228mg，收率75％)，其為淺黃色固體。
IR(Nujol)；3290，1710，1655cm-1ESI-MS；854(M+H)
(2)(1S，9S)-1-(甘氨?；?甘氨?；?L-苯基-丙酰氨基-甘氨?；被?-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的制備 攪拌下在冰浴中向(1S，9S)-1-(叔丁氧基羰基-甘氨?；?甘氨?；?L-苯丙氨酰基-甘氨酰基氨基)-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并-[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮(220mg；0.258mmol)在二噁烷(4ml)中的溶液內加入4N氯化氫的二噁烷溶液(6ml)。室溫下攪拌該混合物16小時。向反應混合物中加入乙醚(30ml)，并且該混合物在室溫下攪拌1小時。通過過濾收集沉淀，并且干燥得到標題化合物(176mg，收率；86％)，其為黃色粉末。
IR(Nujol)；3250，1745，1660，1605，1535cm-1ESI-MS；754(M+H)(3)葡聚糖多元醇(PA-葡聚糖)的制備將乙酸緩沖液(0.1M，pH 5.5，1000ml)置于三頸圓底燒瓶(容量；3升)。室溫下將葡聚糖T-500(10.0g，Amersham Pharmacia Biotech AB制造)在30分鐘內分次加入到上述緩沖液。將該混合物攪拌約30分鐘直至該溶液變澄清，此后，在外浴中冷卻該混合物至5℃(內溫)。
獨立地，向燒瓶(容量；1升)加入高碘酸鈉(33.0g)和水(1000ml)，并且室溫下攪拌該混合物，此后在5℃下冷卻。
攪拌和5℃下向上述葡聚糖溶液加入上述高碘酸鈉溶液，并且將該混合物暗處5℃保持5天。通過加入乙二醇(10ml)除去過量的高碘酸鈉，并且該混合物進一步在5℃下攪拌2小時。使該反應混合物冷卻至3℃，向其中加入8M氫氧化鈉水溶液，期間反應溫度保持低于6℃(反應混合物的pH值在pH 9左右變化)。攪拌下分次向該反應混合物加入硼氫化鈉(14g)，將該混合物在5℃下攪拌過夜。為了除去過量的硼氫化鈉，該反應混合物的pH值通過在3-6℃下加入乙酸調至低于pH 5.5，并且將該混合物進一步攪拌2小時。該反應混合物的pH值用8M氫氧化鈉溶液調至約pH 7.8。該混合物相對水進行透析(Spectora/Por 3膜，分子量截止＜3500)，并且冷凍干燥得到葡聚糖多元醇(8.34g)，其為無定形粉末。
(4)羧甲基葡聚糖多元醇(CM-PA-葡聚糖)的制備將水(155ml)置于三頸圓底燒瓶(容量；500ml)中，室溫下在10分鐘內向其中加入葡聚糖多元醇(5.18g)并攪拌。攪拌該混合物約10-30分鐘直至該混合物變澄清，此后攪拌下分次將氫氧化鈉(片，97.0％，21.8g)加入到葡聚糖多元醇溶液，期間在冰浴中保持內溫在30-40℃。反應燒瓶置于外浴中，并且在30℃下攪拌該混合物。攪拌和30-40℃下將氯乙酸(31.1g)分次加入到該反應混合物中。加料后，在30℃外浴下將該混合物進一步攪拌20小時。冰浴中冷卻該反應混合物，并且通過在攪拌下向其中加入乙酸中和該混合物(即，該pH值調至小于pH 9)。
將水(160ml)加入到該混合物，并且使該混合物相對于水進行透析(Spectora/Por 3膜，分子量截止＜3500)，和冷凍干燥得到羧甲基葡聚糖多元醇(6.53g)，其為無定形粉末。
(5)羧甲基葡聚糖-多元醇(1S，9S)-1-(甘氨?；?甘氨?；?L-苯丙氨酰基-甘氨?；被?-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，2H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的制備將水(40ml)置于圓底燒瓶(容量；100ml)中、室溫下在5分鐘內向其中加入羧甲基葡聚糖多元醇(1.0g)同時攪拌。將該混合物攪拌約30分鐘直至該混合物變澄清。攪拌下將(1S，9S)-1-(甘氨?；?甘氨酰基-L-苯丙氨?；?甘氨?；被?-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′6，7]indolidino[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮在二甲基甲酰胺(100mg/10ml)中的溶液加入到該混合物，并且進一步向其中加入二甲基甲酰胺(15ml)，和該混合物攪拌10分鐘。室溫下向該混合物滴加2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)在二甲基甲酰胺(1.0g/10ml)中的溶液同時攪拌，并且該混合物進一步攪拌18小時。該反應混合物相對于水進行透析(Spectora/Por 3膜，分子量截止＜3500)，并且進一步通過陽離子交換柱純化(BioRadAG；MP-50柱，Na-型，30ml)。主餾分進行透析(Spectora/Por 3膜，分子量截止＜3500)，并且冷凍干燥得到粗產物，它用丙酮粉碎，通過過濾收集，并且稀釋得到所需產物(904mg)，其為淺黃色粉末。
工業(yè)實用性本發(fā)明的藥物組合物可以高度蓄積在癌癥可擴散的例如淋巴結或肝臟的位置，并且抑制地作用于腫瘤細胞的生長同時不影響正常細胞，并且因此，本發(fā)明的藥物組合物有效抑制轉移，特別是抑制淋巴結轉移或肝臟轉移，或者預防惡性腫瘤的復發(fā)。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可以不但在轉移開始時也可以在轉移開始后發(fā)揮其作用。所以，本發(fā)明的藥物組合物也有效抑制轉移或預防局部治療后的惡性腫瘤復發(fā)(例如，手術，放療，溫熱療法，冷凍療法，激光灼燒療法等)。
權利要求
1.一種用于抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物組合物，它含有多糖衍生物或其鹽作為活性成分，所述多糖衍生物包括具有通過氨基酸或由2-8個相同或不同氨基酸組成的肽與具有抗腫瘤活性的活性物質結合的羧基的多糖。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述的具有抗腫瘤活性的活性物質是式(I)的喜樹堿衍生物 其中R1是取代的或未取代的低級烷基，X1是式-NHR2(R2是氫原子或低級烷基)的基團和Alk是在其鏈中任選含有氧原子的直鏈或支鏈C1-6亞烷基，或式(II)的化合物 其中R2至R6彼此相鄰的兩個基團結合形成低級亞烷基，且所述低級亞烷基的一個碳原子被氨基取代，且R2至R6的其余三個基團是氫原子、低級烷基或鹵素原子。
3.權利要求1或2的藥物組合物，其中具有羧基的多糖是羧基-C1-4烷基葡聚糖或羧基-C1-4烷基葡聚糖多元醇。
4.權利要求1或權利要求2的藥物組合物，其中具有羧基的多糖是羧基-C1-4烷基葡聚糖。
5.權利要求1、2、3和4中任一項的藥物組合物，其中所述肽是選自甘氨酰基-甘氨?；?L-或D-苯丙氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨酸，甘氨?；?甘氨酰基-甘氨酸，甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酰基-甘氨酸，甘氨酰基-甘氨?；?甘氨?；?甘氨?；?甘氨酸，L-或D-苯丙氨酰基-甘氨酸，L-或D-酪氨?；?甘氨酸，L-或D-亮氨酰基-甘氨酸，L-或D苯丙氨?；?瓜氨酸和L-或D-纈氨?；?瓜氨酸的一員。
6.權利要求1的藥物組合物，其中具有羧基的多糖是羧甲基化葡聚糖，所述的具有抗腫瘤活性的活性物質是10-(3′-氨基丙氧基)-7-乙基-(20S)-喜樹堿，并且所述肽是甘氨酰基-甘氨?；拾彼?。
7.權利要求1的藥物組合物，其中具有羧基的多糖是羧基-C1-4烷基葡聚糖多元醇，所述的具有抗腫瘤活性的活性物質是(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]-吡喃并[3′，4′:6，7]indolidino[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮，和所述的肽是甘氨酰基-甘氨?；?L-或D-苯丙氨?；?甘氨酸。
8.權利要求1-7中任一項的藥物組合物，它是用于抑制惡性腫瘤轉移的藥物組合物。
9.權利要求1-7中任一項的藥物組合物，它是預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制轉移或預防惡性腫瘤復發(fā)的藥物組合物，它含有多糖衍生物或其鹽作為活性成分，該多糖衍生物包括具有通過氨基酸或由2－8個相同或不同氨基酸組成的肽與具有抗腫瘤活性的活性物質結合的羧基的多糖。優(yōu)選的活性物質是喜樹堿衍生物。
文檔編號A61K47/48GK1545423SQ0281631
公開日2004年11月10日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權日2001年8月21日
發(fā)明者川口隆行, 奧野哲, 矢野敏朗, 朗 申請人:田邊制藥株式會社