專利名稱：含有桿菌型非致病性細菌孢子的固體組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用在制藥、獸醫(yī)和營養(yǎng)學領域中含有非致病性細菌孢子的固體組合物，特別是含有桿菌類細菌孢子的組合物。
背景技術：
配制人或動物用的孢子是很難的，也存在一定問題，這是因為涉及到活質，若使用不適當方法，可能會喪失大量活性成分。
現(xiàn)已知道各種孢子基的固體組合物。這些組合物通過各種技術而制成，例如，凍干法或“噴霧干燥技術”；類似地，孢子液體懸浮液或孢子與常規(guī)賦形劑組成的簡單混合物在制藥領域中是公知的，例如，WO 99/49877敘述了由產生乳酸的細菌制成的孢子組合物用于降低膽固醇。
現(xiàn)有技術其中一個主要缺點是組合物的穩(wěn)定性差，導致組合物不能儲存相當一段長時間，為了盡可能保持孢子的性質不變，使用前需要低溫儲存和保存組合物。
由現(xiàn)有技術制成的組合物的另一個缺點是活性成分的濃度低，所以可引入實際組合物中的孢子濃度低。
市場上有售孢子基液體組合物，例如，商標名為“Enterogermina”的桿菌孢子懸浮液在意大利已銷售了一段長時間。雖然它是有效的，長期以來也為消費者所喜愛，但這種懸浮液所含的活性成分的濃度不很高(活性成分濃度高是指超過20億個孢子/5毫升)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于非致病性細菌孢子(下文簡稱“孢子”)的固體組合物，其生產簡單，儲存方便，活性成分的含量很高，而且能夠長時間保持穩(wěn)定。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過氣流化床技術使孢子在合適的基質上吸收，可得到一種具有高濃度孢子的固體形式，它在工業(yè)上處理容易，而且十分穩(wěn)定。
具體地說，已發(fā)現(xiàn)，這種固體形式(下文稱為“組合物”)可以使大量孢子吸附在基質上，形成一種高濃度固體組合物，其粒度和比表面使得它特別適合在體內沿胃腸道釋放全部孢子。
另外，還發(fā)現(xiàn)，該組合物的流動性極好，所以可經工業(yè)處理配制成單劑量或多劑量組合物，無需對它再作后續(xù)處理。
所以，本發(fā)明的一個方面涉及一種含桿菌類非致病性細菌孢子的組合物，所述孢子吸收在由至少一種非水溶性吸收化合物和一纖維素衍生物組成的基質上，這可通過氣流化床技術實現(xiàn)。
更具體地說，本發(fā)明涉及一種含桿菌類非致病性細菌孢子的組合物，其可用一種包括以下步驟的方法制成按照氣流化床技術，用由一種非水溶性吸收化合物和纖維素衍生物組成的基質處理所述孢子的液體懸浮液。
本發(fā)明的術語“吸收化合物”指可被攝取并有吸收性質的任何化合物或化合物的混合物，非水溶性吸收化合物優(yōu)選為粘土、高嶺土、碳酸鈣、硅膠、硅酸鎂鋁、纖維素和膨潤土的衍生物，特別優(yōu)選為高嶺土。
本發(fā)明的術語“纖維素衍生物”指可被攝取的任何纖維素衍生物，例如，微晶纖維素、甲基纖維素、羥基丙甲基纖維素等，它們全部都在市場上有售，特別優(yōu)選為微晶纖維素。
應懂得，即使本文沒有明確指出，但本發(fā)明組合物的所有成分是可被人和/或動物攝取的，即“無毒的”。具體地說，將按組合物的最終用途來選擇這些成分的性質和品質，所以，它們的種類和純度將適合并與該組合物的最終用途相適應；所以，作為舉例說明，當組合物用于藥物治療，則成分的種類和純度必須從藥物的角度來看是可接受的，如此類推。
本發(fā)明的術語“吸收孢子”、“吸收”或“吸附”用來指孢子留在基質表面上，所述孢子可從該基質表面釋放在消化道內。
孢子可通過任何一種吸附形式即通過任何可行的吸附(化學、生物、物理等)留在基質上，取決于所用的基質類型。
構成基質的兩種成分的相對含量可在一寬的范圍內變化。例如，吸收化合物與纖維素衍生物的重量比可在90∶10和10∶90的范圍之內，優(yōu)選在70∶30和30∶70的范圍之內，更好是在60∶40和40∶60的范圍之內，兩種成分在基質中的重量比最好約50∶50。
任何情況下本發(fā)明的基質是一種相對于孢子是惰性的非水溶性混合物，術語“相對于孢子是惰性的”用來指它不會對孢子產生負面影響。
本發(fā)明所用的孢子優(yōu)選是特別用在制藥、獸醫(yī)和/或營養(yǎng)學領域中的非致病性細菌孢子。本發(fā)明的組合物可含有一種桿菌的孢子或者多種混合桿菌的孢子。
本發(fā)明一優(yōu)選組合物包含枯草芽孢桿菌或clausii桿菌孢子。
本發(fā)明的組合物最好包含一或多種clausii桿菌孢子(以前的分類名稱為枯草芽孢桿菌)，所述孢子的保藏符合布達佩斯條約，保藏在法國巴德斯研究學院的微生物保藏中心(CNCM)，查詢號I-273、I-274、I-275和I-276。
利用已為本領域技術人員公知的氣流化床技術制備組合物。
按照這種技術，在為這種技術提供的裝置如氣流化床造粒機中，將含有孢子的水懸浮液(下文稱“濃縮懸浮液”)噴涂在由至少一種吸收化合物和一纖維素衍生物混合而成的基質上，而所述基質在整個過程中一直用氣流攪動。
濃縮懸浮液是水懸浮液，其孢子濃度很高。
本發(fā)明特別優(yōu)選的濃縮懸浮液是這樣制成的在培養(yǎng)基(例如基于蛋白胨和礦物鹽的培養(yǎng)基)中接種培養(yǎng)一或多種桿菌，在有氧條件和適合的溫度下接種培養(yǎng)混合物48-72小時，用蒸餾水從培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中離心分離出細胞，然后使所得的懸浮液進行巴氏滅菌。在本文的實驗部分給出這樣一種制備方法的例子。
所得的濃縮懸浮液的桿菌孢子濃度大于每克100億個孢子，通常為每克約150至約250億個孢子，或者更高。
一般而言，濃縮懸浮液最好冷凍保存，這是因為它在環(huán)境溫度下非常不穩(wěn)定。在此特定情況下，濃縮懸浮液在用于本發(fā)明方法之前才解凍。
另外，濃縮懸浮液也可以是由以凍干在水中的形式保存的孢子即時制成的懸浮液。
本發(fā)明方法所用的氣流溫度在環(huán)境溫度與孢子可承受的最高溫度之間；本發(fā)明一優(yōu)選方法的溫度在40至90℃之間，最好在60至80℃之間。
一旦濃縮基質的噴涂和吸收完成，接下來就可以通過加熱氣流將所得的組合物保持在懸浮液中，直至達到所希望的殘余含水量，優(yōu)選直至含水量少于3％，最好少于或等于2％。
這個過程的持續(xù)時間由待噴涂的濃縮懸浮液的數(shù)量、噴涂速率以及氣流溫度確定。要處理約30千克基質，通常需要約2小時來完成該過程。
組合物的制備方法是本發(fā)明的另一個主題。
如上所述，本發(fā)明的組合物可制成高濃度形式，濃度范圍例如每克最終組合物含30至300億個孢子，例如每克最終組合物含50至200億個孢子，優(yōu)選為每克最終組合物含約100億個孢子，這樣，就能以較小的體積給予一致的孢子量。這種重要性質意味著組合物的使用特別容易，例如可將組合物放在小軟膠囊或小藥囊中，或者與食物或其他組合物混合。若需要，組合物也可重懸于水或其他合適的液體中之后再給予。
已證明，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的，甚至在高出環(huán)境溫度的溫度(約40℃)下可以長時間保持效價不變。
本發(fā)明組合物的孢子效價可用任何口口來測定，例如常規(guī)培養(yǎng)板上計數(shù)。
如上所述，因為粒度很精細，所以本發(fā)明的組合物具有較大的比表面，組合物中高達90％的顆粒具有少于或等于130微米的尺寸，優(yōu)選為組合物中60％的顆粒具有少于或等于60微米的尺寸。
另外，組合物無臭無味，因而可加入食物或飲品中或者加在其他組合物中，不會改變它們原來的味道。
若有需要的話，組合物可適當?shù)睾刑砑觿砑觿╇S最終消費者、吸收模式或需要對其所作的后續(xù)處理類型而有所不同，唯一條件是添加劑相對于孢子是惰性的。
例如，可以加入潤滑劑、稀釋劑等，或者能夠增強其流動或有利于其他特定物理性質的任何其他試劑，目的在于使該組合物的后續(xù)處理更容易。
例如，當需要將組合物放在硬明膠膠囊時，加入硬脂酸鎂和/微晶纖維素是有幫助的。
另一個選擇是與上述添加劑一起，可加入能夠使組合物有特定香味或味道的香味劑。
可在孢子被吸收之前將可能的后續(xù)成分加在基質中，或者很簡單地將可能的后續(xù)成分加在由本發(fā)明方法所得的最終組合物中。
有需要的話，組合物可以是后續(xù)修飾的物質；所以當需要將組合物壓縮時，可用公知技術將它磨成粒狀，或者可用公知技術對它進行處理，以便得到控釋組合物，從而改變它在腸內釋放的時間長短。
按照給予的需要可給予可變量的組合物。通常，給予人時可每日給予100億個孢子，甚至更多，優(yōu)選每日給予10至80億個孢子，例如每日20億、40億或60億個孢子，可以單劑量或重復形式給予。
本發(fā)明的組合物用來給予時，在適當情況下可配制成劑量單位形式；例如，根據(jù)它的性質可輕易配制成明膠膠囊，如形式0、1或2的明膠膠囊，由該方面的專家按照劑量選取。
含有本發(fā)明組合物的軟膠囊或小藥囊劑量單位是本發(fā)明的另一個主題。
例如，這些劑量單位可含有10至100億個所述孢子，優(yōu)選含有20至50億個所述孢子，50至500毫克高嶺土，例如50至250毫克高嶺土，以及例如50至600毫克，例如50至300毫克微晶纖維素。
這些劑量單位可按需要每日給予1次或多次，取決于劑量單位的濃度。
例如，可制備含50至70億個孢子，優(yōu)選含約60億個孢子的劑量單位，每日僅給予1次所述劑量單位。
因為涉及到活質，故微生物效價顯然是可改變的；因此最好把相對于預計劑量過量10-20％的孢子加在組合物的制劑中。假定產品沒有毒性，這種過量不會引起任何問題。
取一批裝在玻璃或聚乙烯中的本發(fā)明組合物進行穩(wěn)定性研究，以評估不同溫度(5℃至40℃)和濕度(相對濕度最高為75％)下它們的性能。24個月后結果顯示，在任何測試條件下組合物的效價沒有明顯減少。此外，在相同條件下評估針對抗生素的抗性和生物性質，結果顯示與該產品的原有性質一致。
本發(fā)明的組合物用在制藥、獸醫(yī)和/或營養(yǎng)學領域中。
具體地說，它與市售產品Enterogermina具有相同的應用；具體地說，本發(fā)明的組合物對腸和免疫系統(tǒng)產生有益的作用，特別適合用來治療和預防腸微生物病(intestinal dysmicrobism)和內源性維生素失調癥，在經抗生素處理或化療后而改變的腸內菌群復原中也起著共輔助治療作用，它適合例如與抗生素結合用來對抗幽門螺桿菌。
本發(fā)明的再一個主題是一種含有上述所限定的細菌孢子的藥物。
以下實施例用來舉例說明本發(fā)明，但對本發(fā)明沒有任何限制作用。
具體實施例方式
濃縮懸浮液的制備在30升發(fā)酵培養(yǎng)基中使600毫升濃度為5億個孢子/毫升并含4種clausii桿菌I-273、I-274、I-275和I-276(比例相等)的懸浮液前發(fā)酵7小時。使前發(fā)酵的懸浮液在1000升基于蛋白胨和礦物鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)；接種培養(yǎng)在37℃有氧條件下進行48至72小時，用蒸餾水離心分離細胞與培養(yǎng)基，直至達到100升終體積，懸浮液在70℃進行巴氏滅菌30分鐘。由此得到一種含約200億/克clausii桿菌孢子的濃縮懸浮液。
實施例1將15千克具有藥學性質的高嶺土和15千克具有藥學性質的微晶纖維素裝入一個氣流化床方法的系統(tǒng)中，該混合物以60℃氣流加熱數(shù)分鐘。在層流罩下，將15千克濃度為200億個孢子/克并含clausii桿菌I-273、I-274、I-275和I-276孢子混合物的水懸浮液(按上述方法制備濃縮懸浮液)裝入配有蠕動泵的容器內，所述泵與直徑為1.2毫米的噴嘴和氣流化床裝置相連。所以，使?jié)饪s孢子懸浮液噴涂在加熱混合物上，壓力為2bar，流速為135毫升/分，利用60℃空氣使混石物保持在懸浮液中。大約110分鐘后，該系統(tǒng)結束，可以進行冷卻，回收組合物。由此得到具有下列性質的組合物-效價，通過培養(yǎng)板上計數(shù)確定為100億個孢子/克；-殘余含水量2％；-用Malvern激光粒度分析儀在軟化水中測定粒度90％顆粒＜100μm，60％顆粒＜50μm-比表面積3-5平方米/克。
實施例2進行實施例1所述的程序，但只用clausii桿菌I-274，得到具有下列性質的產物-效價，通過培養(yǎng)板上計數(shù)確定為100億個孢子/克；
-殘余含水量2％；-用Malvern激光粒度分析儀在軟化水中測定粒度90％顆粒＜130μm，60％顆粒＜60μm；-比表面積3.5-5平方米/克。
實施例3進行實施例1所述的程序，但只用clausii桿菌I-276，得到具有下列性質的產物-效價為120億個孢子/克；-殘余含水量3％；-用Malvern激光粒度分析儀在軟化水中測定粒度90％顆粒＜130μm，60％顆粒＜60μm；-比表面積3-5平方米/克。
實施例4將57克微晶纖維素和3克硬脂酸鎂加入240克實施例1制成的組合物中?；旌虾?，所得的組合物配制成形式1硬明膠有蓋膠囊，每個膠囊含300毫克下列組合物含約20億個clausii桿菌(I-273、I-274、I-275和I-276) 毫克240.00孢子的基質(高嶺土+微晶纖維素)微晶纖維素 毫克57.00硬脂酸鎂 毫克3.00實施例5含275毫克下列組合物的形式1硬明膠膠囊含約20億個clausii桿菌(I-273、I-274、I-275和I-276) 毫克200.00*孢子的基質(高嶺土+微晶纖維素)微晶纖維素 毫克72.25植物天然硬脂酸鎂 毫克2.75(*對應于劑量過量10％，生產配方為220.00毫克)
實施例6含255毫克下列組合物的形式1硬明膠膠囊含約20億個clausii桿菌(I-273、I-274、I-275和I-276) 毫克200.00*孢子的基質(高嶺土+微晶纖維素)微晶纖維素 毫克52.25植物天然硬脂酸鎂 毫克2.75(*對應于劑量過量10％，生產配方為220.00毫克)
權利要求
1.一種含桿菌類非致病性細菌孢子的組合物，其特征在于所述孢子吸收在由至少一種非水溶性吸收化合物和一纖維素衍生物組成的基質上，這可通過氣流化床技術實現(xiàn)。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述組合物可通過一種包括以下步驟的方法制成按照氣流化床技術以由至少一種非水溶性化合物和一纖維素衍生物組成的基質處理所述孢子液體懸浮液。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其特征在于每克所述組合物含30至300億個所述孢子。
4.如權利要求3所述的組合物，其特征在于每克所述組合物含50至200億個所述孢子。
5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于每克所述組合物含約100億個所述孢子。
6.如權利要求1至5中任何一項所述的組合物，其特征在于所述吸收化合物是高嶺土。
7.如權利要求1至5中任何一項所述的組合物，其特征在于所述吸收化合物是碳酸鈣。
8.如權利要求1至7中任何一項所述的組合物，其特征在于所述纖維素衍生物是微晶纖維素。
9.如權利要求1至8中任何一項所述的組合物，其特征在于所述吸收化合物與所述纖維素衍生物之重量比在90∶10和10∶90之間。
10.如權利要求9所述的組合物，其特征在于所述重量比在70∶30和30∶70之間。
11.如權利要求10所述的組合物，其特征在于所述重量比約為50∶50。
12.如權利要求1至11中任何一項所述的組合物，其特征在于所述組合物配制成軟膠囊或小藥囊劑量單位形式。
13.如權利要求12所述的組合物，其特征在于所述組合物每劑量單位含有10至100億個所述孢子、50至500毫克高嶺土和50至600毫克微晶纖維素。
14.如權利要求13所述的組合物，其特征在于所述組合物每劑量單位含有20至50億個所述孢子、50至250毫克高嶺土和50至300毫克微晶纖維素。
15.如權利要求12所述的組合物，其特征在于所述組合物軟膠囊每劑量單位含有約20億個所述孢子。
16.如權利要求12所述的組合物，其特征在于所述組合物軟膠囊每劑量單位含有約60億個所述孢子。
17.如權利要求1至16中任何一項所述的組合物，其特征在于所述孢子是枯草芽孢桿菌或clausii桿菌孢子。
18.如權利要求17所述的組合物，其特征在于所述孢子來自clausii桿菌I-273、I-274、I-275和I-276之一種或多種。
19.如權利要求1至16中任何一項所述的組合物，其特征在于所述孢子是不同桿菌孢子的混合物。
20.一種含有權利要求1至19中任何一項述的組合物的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有桿菌型非致病性細菌孢子的組合物，所述細菌孢子吸收在由至少一種非水溶性吸收化合物和一纖維素衍生物形成的基質上。本發(fā)明的組合物通過氣流化床技術而制得，所述組合物適合用在制藥、獸醫(yī)和營養(yǎng)學領域。
文檔編號A61K9/16GK1558776SQ02818939
公開日2004年12月29日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權日2001年7月27日
發(fā)明者T·普拉托, T 普拉托 申請人:沙諾費-辛芷拉保Oct股份公司