專利名稱：經鼻吸收用藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及經鼻吸收用藥物組合物，更具體來說，本發(fā)明涉及含有等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽作為活性組分和能提高該肽的生物利用度的添加劑的經鼻吸收用藥物組合物。
背景技術：
生物活性多肽是表現(xiàn)出各種特定藥理活性的高分子量化合物，是已經在醫(yī)藥領域中出于各種目的而使用的具有顯著實用價值的化合物。例如，胰高血糖素樣肽I(下文中稱為GLP-1)—源自胰高血糖素前體(前胰高血糖素)的一種肽類激素是已知的(Bell等人，Nature，304，368，1983)。已經在哺乳動物中鑒定出來的前胰高血糖素是一種由160個氨基酸組成的前體蛋白，是在胰島即格罕氏島(Langerhans島)A-細胞和腸L-細胞中產生的。在胰腺中，加工酶將前胰高血糖素加工成胰高血糖素和主要的前胰高血糖素片段，而在腸中，前胰高血糖素被以不同方式加工以生成腸高血糖素(glicentin)、GLP-1和胰高血糖素樣肽-2(下文中稱為GLP-2)(Mojsovr等人，J.Biol.Chem.，261，11880，1986)。
由前胰高血糖素的氨基酸72-108形成的肽(相當于GLP-1)表現(xiàn)出促進胰島素分泌的活性。在已知的胰島素分泌促進劑當中，GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2是最有效的胰島素分泌促進劑，GLP-1(7-37)是通過除去GLP-1的前6個N-末端氨基酸而形成的，GLP-1(7-36)NH2是通過GLP-1(7-37)在36位的酰胺化而形成的(Majsov等人，J.Clin.Invest.，79，616，1987)。它們還具有抑制胰高血糖素分泌的活性。據(jù)表明，GLP-1以GLP-1(7-36)NH2的形式從腸L-細胞分泌到血液循環(huán)中(Gutniak等人，N.Engl.J.Med.，326，1316，1993)。
作為對于食物消化刺激的反應，GLP-1(7-36)NH2立即從腸L-細胞分泌出來，并作用于胰腺以促進胰島素分泌。同時，其降低胰高血糖素分泌，提高胰島素分泌細胞中的mRNA表達，降低肝臟中的糖異生，并抑制胃腸道的活動。這意味著GLP-1，包括GLP-1(7-36)NH2可作為根據(jù)人體中能量代謝的需要來調節(jié)的腸降血糖素(胰島素分泌刺激劑)起著至關重要的作用。
由于具有上述生物活性，這些肽可用于治療糖尿病。具體來說，GLP-1(7-36)NH2可在進餐之前給藥，以抑制餐后血糖水平的增高，這樣其可用作II型糖尿病患者的有效治療劑?；酋ｋ孱愃幬锞哂写龠M胰島素分泌的類似活性，但是它們會帶來血糖水平過低的危險性，因為無論血糖水平如何，這類藥物都表現(xiàn)出其活性。當長期施用時，該藥物還會引起產生胰島素的細胞變得沒有活力。與之不同，因為GLP-1(7-36)NH2促進胰島素分泌的活性受反映血糖濃度的反饋機制的調控，GLP-1(7-36)NH2很少導致過低的血糖水平。此外，GLP-1(7-36)NH2刺激產生胰島素的細胞。因此，GLP-1(7-36)NH2與目前在臨床上用作糖尿病藥物的磺酰脲類藥物有著顯著不同。
GLP-1(7-36)NH2的各種活性，包括抑制肝臟中的糖異生、激活產生胰島素的細胞、促進肌肉攝取糖、抑制胃腸道活動和經由中樞神經系統(tǒng)抑制食欲給人們帶來了這樣的期望，即除了讓餐后血糖水平恢復正常以外，長期施用GLP-1(7-36)NH2可使得完整的全身葡萄糖代謝恢復正常和激活這種代謝，和抑制肥胖—糖尿病的重要因素之一。
具有和GLP-1(7-36)NH2類似的腸降血糖素活性(即刺激胰島素分泌)的另一種肽是exendin-4，它是從毒蜥(一種爬行動物)中分離出來的，并且已確定了其結構。在血漿中，該肽比GLP-1(7-36)NH2更不容易發(fā)生降解，因此能夠長時間保持其促進胰島素分泌的活性。與GLP-1(7-36)NH2一樣，已知exendin-4能誘導β-細胞分化/新生。
因為GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2的8位被活體內存在的二肽肽酶IV(DPP-IV)裂解，所以希望其中8位的Ala被不易于裂解的氨基酸例如Val取代的衍生物，即[Val8]-GLP-1(7-37)，和其中GLP-1被脂肪酸修飾以通過控制溶解速度來延長表觀血漿半衰期的衍生物，即[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚酰基)}]-GLP-1(7-37)具有相同作用。另一方面，最近的研究表明，在8位裂解的GLP-1(9-37)具有相同的降低血糖水平的作用(Deacon等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Matb.282，873-879，2002)。由于該發(fā)現(xiàn)，需要查證將GLP-1(7-36)NH2在8位的氨基酸殘基轉化和用脂肪酸修飾GLP-1(7-36)NH2以延長表觀血漿半衰期的優(yōu)點。
胃抑制多肽(下文中稱為GIP)是一種葡萄糖依賴性刺激胰島素分泌的肽，它與GLP-1和exendin-4不同，因為除了促進胰島素分泌的活性以外，它還可以促進胰高血糖素分泌。
在這些肽類腸降血糖素當中，GLP-1(7-36)NH2具有哺乳動物中共有的氨基酸序列，并且被視為理想的抗糖尿病藥物。然而，GLP-1(7-36)NH2由于其肽的性質，難以從胃腸道吸收。這嚴重妨礙了肽作為糖尿病藥物的發(fā)展。
如已知的那樣，除了口服給藥，肽可通過皮下注射給藥。然而，長期皮下注射必須在醫(yī)師的觀察下進行操作，由于去醫(yī)院看病的負擔和在注射部位的疼痛，注射不是長期施用糖尿病治療藥物的合適途徑。雖然在每次餐后給藥后可有效調節(jié)高血糖水平，但是為了施用肽而每天皮下注射3次顯然不現(xiàn)實。另外，不僅施用給I型糖尿病患者，而且也施用給II型糖尿病患者的自我控制型胰島素注射似乎不能與自我控制型GLP-1注射制劑聯(lián)合使用。
為了解決上述問題，已經進行了很多嘗試來讓GLP-1(7-36)NH2以貼劑制劑經由口腔粘膜吸收(Gutniak等人，Diabetes care，20，1874，1997)。然而，該特定形式的給藥涉及使用吸收促進劑，例如牛磺膽酸鈉，?；悄懰徕c是一種膽汁酸，并且具有高度刺激性。結果是，刺激性是不可避免的，并會使粘膜喪失，因而該給藥途徑不適合長期給藥。
因此，迄今為止，尚沒有安全、可實現(xiàn)高生物利用度、適于頻繁給藥的施用GLP-1(7-36)NH2的實用非注射的技術。人們渴望開發(fā)出這樣的技術。
與低分子量化合物不同，生物活性多肽不能通過除注射以外的任何給藥途徑有效地給藥。主要原因是生物活性多肽會被胃、小腸和大腸中存在的消化酶或者這些器官、鼻腔和肺的吸收上皮消化吸收，并且由于其較大的分子量，多肽不能經由典型的運輸途徑運送。出于這些原因，最近已經提出了用于鼻吸收的鼻用肽制劑來作為可使用的施用肽的非注射技術。典型地，這樣的鼻用肽制劑是通過在吸收促進劑存在下用噴霧器將肽溶液噴霧到鼻腔內來進行給藥。該方法的一個問題是，具有在酸性或中性范圍內的等電點(在下文中稱為pI)的多種已知的生物活性多肽，一些肽，包括GLP-1(7-36)NH2在酸性或中性溶液中往往變得不穩(wěn)定。
例如，本發(fā)明者們所做的觀察已揭示，當經鼻施用給大鼠和其它動物時，雖然GLP-1(7-36)NH2的溶液被以一定程度吸收，但是當把該溶液貯存幾十小時時，該肽變得不溶解(參見下文中的參考實施例)。因此，溶液制劑不適用于藥物組合物，即使溶液是在每次使用該制劑時才將肽溶解的類型時也是如此。
同樣，胰高血糖素和胰島素具有在酸性或中性pH范圍內的等電點，并且已知在酸性或中性溶液中將變得不溶解或結晶。許多這樣的肽已知都具有在酸性或中性pH范圍內的等電點，并因此在酸性或中性溶液中將變得不溶解或結晶。因此，基本上不能以酸性或中性溶液制劑的形式經鼻施用這些肽。
另一方面，預計酸性生物活性多肽在堿性溶劑是高度溶解的。然而，當把酸性生物活性多肽暴露于堿性溶液時，酸性生物活性多肽不僅變得容易降解例如水解—也可以在酸性環(huán)境中發(fā)生，而且往往會發(fā)生外消旋化。結果使得其化學穩(wěn)定性下降。酸性和堿性生物活性多肽都會發(fā)生這些副反應。已知例如，酪蛋白(pI＝約4.6)—一種堿性生物活性多肽在堿性溶液中變得不穩(wěn)定，這是因為其氨基酸殘基天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和丙氨酸發(fā)生外消旋化(Friedman等人，J.FoodSci.，47，760-764，1982)。有機酸包括多種物質，包括各自是生物化合物的乙酸和丁酸，和長鏈羧酸例如都是營養(yǎng)素的辛酸和癸酸。很多這些有機酸可在藥物組合物中用作添加劑。另一方面，已知多種有機堿例如血清素和多巴胺表現(xiàn)出藥理活性。堿金屬例如鈉在很多情況下不適于用作藥物組合物中的添加劑，因為它們會使組合物的pH調節(jié)很困難，并且往往會與酸性肽形成鹽，從而影響肽的性質。出于這些原因，考慮到這些添加組分的化學穩(wěn)定性和選擇性，不優(yōu)選提供堿性溶液形式的酸性生物活性多肽。
如上所述，不優(yōu)選提供酸性或中性溶液制劑以及堿性溶液制劑形式的酸性生物活性多肽。因此，酸性生物活性多肽不適于在經鼻給藥的溶液制劑中使用。
對于某些類型的生物活性多肽例如胰島素、降鈣素、甲狀旁腺激素(PTH)、人生長激素(HGH)和下丘腦激素(LH-RH)，已經有人提出了用于鼻吸收的粉末制劑來代替溶液型鼻用制劑。迄今為止，為了生物活性多肽的經鼻給藥，已經試驗了很多化合物作為這些經鼻給藥用粉末制劑的載體的可能性，并且已提出了使用幾種不同載體的不同粉末組合物。
通過研究發(fā)現(xiàn)，不溶于水或者在水中的溶解度很小，但是在酸性條件下可溶于水的物質可用作經鼻施用生物活性多肽的粉末制劑的高度有效的載體。例如，已經提出了使用多價金屬化合物例如羥磷灰石和碳酸鈣(日本專利特開平8-27031)，能夠修復或保護粘膜，特別是胃粘膜的物質(日本專利特開平9-255586)或谷粉(日本專利特開平2000-239187)作為載體的經鼻給藥用藥物組合物。
然而，當對動物經鼻給藥時，通過將GLP-1(7-36)NH2分散和吸附在載體例如多價金屬化合物上而制得的一種粉末制劑表現(xiàn)出的GLP-1(7-36)NH2生物利用度，在狗中約為4％，在猴子中為1％或以下。因此，該制劑的鼻吸收不令人滿意。
等電點在酸性或中性pH范圍內的生物活性多肽例如GLP-1(7-36)NH2在酸性或中性pH范圍內具有低的溶解度，并且即使溶解在溶液中時，也往往會發(fā)生聚集。這些多肽不僅當以溶液形式經鼻給藥時不能達到足夠的生物利用度，而且即使是以粉末制劑形式經鼻給藥也不能達到足夠的生物利用度。因此，施用這些肽的有效非注射途徑仍有待建立。
WO01/52894 A2中公開了由環(huán)肽和多價金屬組合物載體組成的經鼻給藥用組合物。該專利還公開了可加入吸收促進劑例如米粉和淀粉，并且這些促進劑的粒徑應當優(yōu)選為250μm或更小，更優(yōu)選為20-180μm。雖然如此，其中沒有關于本發(fā)明方法的描述，即通過加入粒徑與等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽的載體大約相同粒徑的促進劑來提高生物利用度的方法。
因此，本發(fā)明的目的是提供能夠經鼻施用等電點在酸性或中性pH范圍內的生物活性多肽的藥物組合物。當經口或經由其它非注射給藥途徑給藥時，這樣的多肽具有不良生物利用度，在酸性或中性pH范圍內具有低的溶解度，并且即使溶解在溶液中時，也往往會發(fā)生聚集。本發(fā)明藥物組合物是安全的，能夠達到高的生物利用度，同時不引起任何刺激性。
為了找到實現(xiàn)該目的的方法，本發(fā)明者們試驗了可能的添加劑，以確定它們作為用于經鼻給藥肽的組合物成分的可能性。首先研究了淀粉來確定其是否能夠作為添加劑來有助于穩(wěn)定肽。
淀粉—谷物中富含的一種營養(yǎng)物是可安全地用作經鼻吸收用組合物的添加劑的物質。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，直鏈淀粉由通過α-1，4鍵連接以形成直鏈的葡萄糖單元構成，而支鏈淀粉包括α-1，6鍵，因而是支鏈的。
使用多價金屬化合物作為載體，與作為添加劑的幾種不同類型的含有不同比例的直鏈淀粉和支鏈淀粉的淀粉聯(lián)合用于制備經鼻吸收用藥物組合物。測試了每種藥物組合物的經鼻可吸收度，還測試了作為藥物組合物添加劑的淀粉的粒徑對鼻吸收增強的影響。
結果本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，在鼻腔中施用下述鼻用粉末組合物可實現(xiàn)改善的鼻吸收，并因此可以提供有效的臨床治療。所述組合物是這樣制得的借助于添加劑例如米粉(Domyo-ji粉)、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉以及它們的預膠化或部分預膠化淀粉，所述淀粉各自含有特定比例的支鏈淀粉和直鏈淀粉，將酸性生物活性多肽例如GLP-1(7-36)NH2均勻地分散和包埋在粉末或晶狀多價金屬化合物載體的表面上，所述多價金屬化合物載體不溶于水或者在水中的溶解度很小，并且平均粒徑為100μm或更小，例如二價或更高價金屬化合物，例如鈣化合物。
本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，對于酸性肽例如GLP-1(7-36)NH2，當使用水不溶性淀粉作為添加劑和平均粒徑為100μm或更小的多價金屬化合物例如碳酸鈣作為載體時，粒徑小于載體的水不溶性淀粉表現(xiàn)出顯著的吸收促進效果?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明得以完成。
本發(fā)明公開因此，本發(fā)明提供了經鼻吸收用藥物組合物，其中包含等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽，不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和用于將多肽分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。
本發(fā)明還提供了經鼻吸收用藥物組合物，其中包含等電點為7或低于7，即在中性或酸性pH范圍內的生物活性多肽，多價金屬化合物載體，和用于將多肽分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。
本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物的一個具體實施方案包含有效劑量的等電點在中性或酸性pH范圍內的生物活性多肽和平均粒徑為1μm-20μm的添加劑，這樣多肽均勻分散和包埋在平均粒徑為100μm或更小的粉末或晶狀多價金屬化合物載體的表面上。
本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物的另一個具體實施方案含有肽腸降血糖素，多價金屬化合物載體，更具體來說，本發(fā)明涉及組合物，其中包含不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和平均粒徑為100μm或更小的細粉末或晶體形式的多價金屬化合物，以及用于將肽腸降血糖素分散和包埋在所述載體表面上的平均粒徑為1μm-20μm的添加劑。
當制劑是通過本發(fā)明方法使用具有預膠化淀粉的淀粉組合物或包括預膠化淀粉的組分制得時，添加劑的平均粒徑是在載體表面上的不溶于水或者在水中的溶解度很小的淀粉組合物的平均粒徑。
附圖簡述附

圖1表示的是，在實施例2中，皮下給藥后，GLP-1(7-36)NH2血漿濃度的改變。
附圖2表示的是，在實施例2中，經鼻施用不含添加劑的組合物后，GLP-1(7-36)NH2血漿濃度隨時間的變化過程。
附圖3表示的是，在實施例2中，經鼻施用不含添加劑的使用硫糖鋁作為載體的組合物后，GLP-1(7-36)NH2血漿濃度隨時間的變化過程。
附圖4表示的是，在實施例2中，經鼻施用含有添加劑的組合物后，GLP-1(7-36)NH2血漿濃度隨時間的變化過程。
實施本發(fā)明的最佳方式如上所述，本發(fā)明提供了經鼻吸收用藥物組合物，所述組合物具有高的生物利用度，能夠經鼻施用等電點為7或低于7，在酸性或中性pH范圍內表現(xiàn)出低溶解度，并且即使溶解在溶液中時，也往往會發(fā)生聚集的生物活性多肽。這樣的多肽具有不良生物利用度，并且不適于經口給藥或經由其它非注射途徑給藥。在一個具體優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了經鼻吸收用藥物組合物，所述組合物含有GLP-1衍生物例如GLP-1、GLP-1酰胺、GLP-1(7-36)NH2、GLP-1(9-36)NH2、GLP-1(9-37)、GLP-1(7-37)、[Val8]-GLP-1(7-36)NH2、[Val8]-GLP-1(7-37)、[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)和GLP-2、exendin-3、extendin-4、胰高血糖素、胃抑制肽(GIP)或胰島素。
本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物的高生物利用度是由于借助于添加劑，生物活性多肽以穩(wěn)定且均勻的方式分散和包埋在載體表面上所致。
當使用β-預膠化或部分預膠化水不溶性或在水中的溶解度很小的淀粉作為添加劑時，使用平均粒徑很小的稻米淀粉和玉米淀粉可增加表面積，并且可以改善溶出，由此可提高吸收性。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用平均粒徑為1μm-20μm的添加劑來改善吸收性。
因此，在本發(fā)明中使用的添加劑可以是能夠使得生物活性多肽以穩(wěn)定且均勻的方式分散和包埋在載體表面上的任何添加劑，例如，含有支鏈淀粉和直鏈淀粉—二者可以是獨立存在的或者以特定比例存在—的淀粉可用作這樣的添加劑。得自稻米、玉米等的淀粉通常被分為“非粘性稻米”-型淀粉，其中含有比例為約7∶3-約8∶2的支鏈淀粉和直鏈淀粉，和“粘性稻米”-型淀粉，其中基本上只由支鏈淀粉組成。具體來說，可用于本發(fā)明的添加劑的實例包括米粉、稻米淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉，β-淀粉例如稻米β-淀粉(非粘性稻米型)、稻米β-淀粉(粘性稻米型)、玉米β-淀粉(非粘性稻米型)、玉米β-淀粉(粘性稻米型)和馬鈴薯β-淀粉(非粘性稻米型)；預膠化稻米淀粉(非粘性稻米型)、預膠化稻米淀粉(粘性稻米型)、預膠化玉米淀粉(非粘性稻米型)、預膠化玉米淀粉(粘性稻米型)、預膠化馬鈴薯淀粉(非粘性稻米型)、預膠化小麥淀粉(非粘性稻米型)以及它們的部分預膠化淀粉。
雖然在水中的溶解度很小，但是可以通過與水一起加熱膠化來引起淀粉的晶體結構松動。完全膠化淀粉(預膠化淀粉或α-淀粉)和部分預膠化淀粉都可用作本發(fā)明的添加劑。
米粉是通過將稻米種子的胚乳研磨而制得的，稻米種子的胚乳是在將種子的外殼和胚芽剝去獲得的。米粉富含淀粉，并通常用作食品和藥品添加劑。在本發(fā)明中，相對于含有預膠化淀粉(α-淀粉)或部分預膠化淀粉的熱處理的米粉，由β-淀粉組成的沒有進行熱處理的米粉是優(yōu)選的，然而，也可以使用熱處理的米粉。優(yōu)選米粉的一個實例是含有預膠化稻米淀粉的Domyo-ji粉。此外，在本發(fā)明中不僅可以使用由β-淀粉組成的玉米淀粉，而且也可以使用部分預膠化或預膠化的淀粉(α-淀粉)玉米淀粉。
此外，可以使用這些淀粉的混合物作為本發(fā)明鼻用組合物的添加劑。
在本發(fā)明中也可以使用低聚糖、羧基乙烯基聚合物、聚維酮、羥丙基纖維素(HPC)、黃原膠、果膠、藻酸鈉、阿拉伯膠粉末和明膠作為添加劑。
在本發(fā)明經鼻吸收用組合物中使用的生物活性多肽是等電點(pI)為7或低于7的那些。這樣的多肽在酸性或中性pH范圍內具有低的溶解度，并且即使溶解在溶液中時，也往往會發(fā)生聚集。
下面列出優(yōu)選的生物活性多肽的實例及其各自的等電點GLP-1(pI＝5.05)；GLP-1酰胺(pI＝5.47)；GLP-1(7-36)NH2(pI＝6.76)；GLP-1(7-37)(pI＝5.53)；GLP-1(9-36)NH2(pI＝4.68)；GLP-1(9-37)(pI＝4.87)；[Val8]-GLP-1(7-36)NH2(pI＝6.76)；[Val8]-GLP-1(7-37)NH2(pI＝5.53)；[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)(pI＝4.57)；GLP-2(pI＝4.45)；exendin-3(pI＝4.96)；exendin-4(pI＝4.96；胰高血糖素(pI＝6.75)；和胃抑制肽(GIP)(pI＝6.92)；胰島素(pI＝5.39)。
還可以使用可經鼻給藥的其它生物活性多肽，其實例如下(在下面，pI是指等電點，MW是指分子量，并且除了exendin-3和exendin-4以外，所有化合物都衍生自人)降鈣素(pI6.72，MW3420.88)、katacalcin(pI5.26，MW2436.62)、膽囊收縮素-12(pI3.93，MW1535.71)、膽囊收縮素-8(pI3.56，MW1064.20)、促腎上腺皮質素-促脂解素前體(pI5.22，MW8469.32)、促腎上腺皮質素樣中間肽(pI3.91，MW2309.51)、促脂解素-β(pI6.17，MW9805.94)、促脂解素-γ(pI4.66，MW6074.57)、促黑素-β(pI5.57，MW2204.40)、促腎上腺皮質素釋放素(pI5.09，MW4758.49)、內皮素-1(pI4.54，MW2495.94)、內皮素-2(pI4.54，MW2550.9)，內皮素-3(pI5.38，MW2647.09)、甘丙肽(galanin)信使相關肽(pI4.49，MW6671.52)、胃泌素-71(pI5.17，MW8066.88)、胃泌素-34(pI4.25，MW3867.26)、胃泌素-17(pI3.40，MW2116.24)、胃抑制多肽(pI6.92，MW4983.59)、腸高血糖素相關多肽(pI4.13，MW3384.50)、胰高血糖素(pI6.75，MW3482.79)、胰高血糖素樣肽-1(pI5.05，MW4167.02)、胰高血糖素樣肽-1酰胺(pI5.47，MW4111.50)、胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺(pI6.76，MW3297.68)、胰高血糖素樣肽-1(7-37)(pI5.53，MW3355.71)、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺(pI6.76，MW3326.74)、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-37)(pI5.53，MW3383.87)、[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)(pI＝4.57，MW3751.2)、GLP-1(9-36)NH2(pI4.68，MW2933.2)、GLP-1(9-37)(pI4.87，MW3090.4)、胰高血糖素樣肽-2(pI4.21，MW3922.35)、exendin-3(pI4.96，MW4202.63)、exendin-4(pI4.96，MW4186.60)、胰島素β-鏈(pI6.90，MW3429.96)、胰島素α-鏈(pI3.79，MW2383)、胰島素(pI5.39，MW5807.6)、原促性腺素釋放素-I(pI5.63，MW7893.83)、促性腺素釋放素-II(pI6.92，MW1254.33)、促性腺素釋放素相關肽-I(pI4.67，MW6370.11)、神經調節(jié)肽C(pI6.92，MW1121.28)、胰島素樣蛋白(INSL)A-鏈(pI6.36，MW3542.16)、促胃動素相關肽E(pI4.72，MW7433.47)、亮氨酸-腦啡肽(pI5.52，MW555.63)、蛋氨酸-腦啡肽(pI5.52，MW573.66)、leumorphin(pI6.21，MW3351.68)、催產素(pI5.51，MW1010.19)、后葉激素運載蛋白-1(pI4.94，MW9600.88)、后葉激素運載蛋白-2(pI5.05，MW9787.07)、copeptin(pI4.11，MW4021.46)、神經調節(jié)肽B(pI6.74，MW1133.29)、神經調節(jié)肽N(pI5.52，MW617.79)、神經肽Y(pI6.76，MW4272.72)、神經肽AF(pI6.05，MW1979.18)、PACAP相關肽(pI5.38，MW4800.32)、胰腺激素(pI6.26，MW4182.74)、pancreatic icosapeptide(pI6.01，MW2235.44)、肽YY(pI6.77，MW4310.80)、tyroliberin(pI6.74，MW380.40)、neuroquinine A(pI6.74，MW1134.32)、urocortin(pI5.58，MW4697.29)、硬骨魚緊張肽II(pI4.37，MW1390.59)、腸肽(PHM-27)(pI6.75，MW2986.43)和腸肽-42(pI6.76，MW4552.18)。
除了上述生物活性多肽以外，本發(fā)明組合物可以是任何可經鼻給藥的生物活性肽。
在本發(fā)明中，用于攜帶生物活性多肽和添加劑的載體包括不溶于水或在水中的溶解度很小的載體。例如，可使用選自下列化合物的具有二價或更高價的多價金屬化合物鋁化合物、鈣化合物、鎂化合物、硅化合物、鐵化合物或鋅化合物。
具體來說，各類多價金屬化合物的實例如下鋁化合物包括干燥的氫氧化鋁凝膠、氯化氫氧化鋁、合成硅酸鋁、輕質氧化鋁、膠態(tài)水合硅酸鋁、氫氧化鎂鋁、氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、硫酸鋁、二羥基乙酸鋁、硬脂酸鋁、天然硅酸鋁、一硬脂酸鋁和硫酸鋁鉀。
鈣化合物包括磷灰石、羥磷灰石、碳酸鈣、乙二胺四乙酸鈣二鈉、氯化鈣、檸檬酸鈣、甘油磷酸鈣、葡糖酸鈣、硅酸鈣、氧化鈣、氫氧化鈣、硬脂酸鈣、三代磷酸鈣、乳酸鈣。泛酸鈣、油酸鈣、棕櫚酸鈣、D-泛酸鈣、藻酸鈣、無水磷酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣、乙酸鈣、糖酸鈣、硫酸鈣、磷酸一氫鈣、對氨基水楊酸鈣和生物鈣化的化合物。
鎂化合物包括L-天冬氨酸鎂、氯化鎂、葡糖酸鎂、硅酸鋁鎂、硅酸鎂、氧化鎂、氫氧化鎂、硬脂酸鎂、碳酸鎂、正硅酸鋁鎂、硫酸鎂、硅酸鈉鎂和合成的硅酸鈉鎂。
硅化合物包括水合二氧化硅、輕質無水硅酸、合成水滑石、硅藻土和二氧化硅。鐵化合物包括硫酸鐵。鋅化合物包括氯化鋅、硬脂酸鋅、氧化鋅和硫酸鋅。
這些多價金屬化合物可單獨使用或作為兩種或更多種化合物的混合物使用。在多價金屬化合物當中，鈣化合物例如羥磷灰石、碳酸鈣或乳酸鈣可產生有利結果。
如果多價金屬化合物的平均粒徑太大，則化合物的噴霧性能變差，并且顆粒會迅速沉淀。反之，如果平均粒徑太小，則顆粒難以停留在鼻腔中，而被吸入到支氣管和肺中。因此，多價金屬化合物的平均粒徑優(yōu)選為10-100μm，更優(yōu)選為20-60μm，這樣金屬化合物可有效停留在鼻腔中。
雖然生物活性多肽在本發(fā)明組合物中的量(為了施用有效劑量的多肽)可根據(jù)多種因素而改變，包括所選活性物質的類型、欲治療疾病的類型、所需給藥次數(shù)、患者年齡、體重、癥狀嚴重程度、給藥途徑、所需效果以及其它因素，但是對于例如GLP-1(7-36)酰胺，本發(fā)明組合物可以以遞送50-5000μg GLP-1(7-36)的劑量經鼻給藥。
具體來說，將有效劑量的生物活性多肽與載體(例如多價金屬化合物，包括鈣化合物、鋁化合物、鎂化合物、硅化合物、鐵化合物和鋅化合物)和添加劑干混合。不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體以粉末或晶體形式提供，并且平均粒徑為250μm或更小，優(yōu)選為100μm或更小，更優(yōu)選為20-60μm?；蛘撸蓪⒔M分在水或有機溶劑例如乙醇中彼此濕混合，然后干燥。以這些方法，可將生物活性多肽均勻分散和包埋在載體表面上，以生成本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物。
本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物可適當?shù)睾谐Ｓ糜谒幬镏苿┑妮d體，包括潤滑劑、DPP-IV抑制劑、賦形劑、增稠劑、支持劑(sustainer)、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、粘合劑、崩解劑、潤濕劑、著色劑、香料、矯味劑、懸浮劑、乳化劑、增溶劑、緩沖劑、等滲劑、表面活性劑、緩和劑以及各種其它功能組分。
潤滑劑包括硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、硬脂酸和滑石粉。
穩(wěn)定劑包括季銨鹽例如苯扎氯銨、芐索氯銨、氯化十六烷基吡啶、聚氧化乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯例如聚氧化乙烯脫水山梨醇一油酸酯(吐溫80)和脫水山梨醇脂肪酸酯例如脫水山梨醇一油酸酯(司盤80)。
當使用易于被二肽肽酶IV(DPP-IV)分解的酸性生物活性多肽例如GLP-1時，藥物組合物中優(yōu)選含有DPP-IV抑制劑。
DPP-IV抑制劑的實例包括diprotin A、桿菌肽和isoleucinethiazolidide。雖然DPP-IV抑制劑的加入量可隨每種抑制劑的抑制活性而變，但是其加到藥物組合物中的量可以是生物活性多肽或活性組分的重量的約1-10,000倍。
在本發(fā)明組合物的生產中，生物活性多肽的量優(yōu)選為0.005-50％，更優(yōu)選為0.01-20％，仍然更優(yōu)選為0.1-10.0％，按制劑的重量為100％計。本發(fā)明組合物中載體的量可以為適于臨床使用的任何量，例如為70-99.995％，優(yōu)選為80-99.99％，更優(yōu)選為90-99.9％，按制劑的重量為100％計。當載體的量在這些范圍內時，可獲得更好的鼻吸收。添加劑在本發(fā)明組合物中的量為例如0.005-50％，優(yōu)選為0.01-20％，更優(yōu)選為0.05％-10.0％，按制劑的重量為100％計。
本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物可通過將不溶于水或者在水中的溶解度很小的多價金屬化合物載體、生物活性多肽和添加劑混合來制得。在一個實例中，將作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與玉米淀粉充分混合。然后將該混合物置于容器中，向其中逐漸加入碳酸鈣和少量純化水以形成漿液。把漿液在干燥器中減壓干燥過夜。將干燥的產物經由篩過濾，并且如果需要的話，混合入適當量的硬脂酸鈣。即制得了本發(fā)明藥物組合物。
本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物還可以這樣制得，首先用玉米淀粉與加入的碳酸鈣和少量純化水形成漿液。然后將該混合物置于容器中，向其中逐漸加入GLP-1(7-36)NH2粉末，用含有苯扎氯銨的水捏合。將該混合物過濾和干燥，混合入適當量的硬脂酸鈣。這也制得了本發(fā)明藥物組合物。
將適當量的所得經鼻吸收用藥物組合物填充到由羥丙基甲基纖維素(HPMC)、淀粉或明膠制成的膠囊中，將膠囊適當包裝，優(yōu)選以密封方式包裝。優(yōu)選的密封包裝是壓泡包裝與鋁包裝的組合。如果需要的話，可在鋁袋中放置干燥劑。整個操作適合在60％或更低的濕度下進行。
實施例下面通過實施例來進一步詳細地描述本發(fā)明，這些實施例不是為了以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除另有說明，實施例中使用下面描述的試驗方法和設備。
在本說明書中使用主要縮寫具有下列含義Fmoc； 芴基甲氧基羰基Boc； 叔丁氧基羰基Trt； 三苯甲基(trytyl)Pmc； 五甲基苯并二氫吡喃磺?；鵇CC； 二環(huán)己基碳二亞胺HOBt； N-羥基苯并三唑TFA； 三氟乙酸DIPEA； 二異丙基乙胺
DMF； 二甲基甲酰胺NMP； N-甲基吡咯烷酮TFE； 三氟乙醇1.通過HPLC分析肽使用下列設備和條件來進行反相HPLC，以測定制劑中的肽含量和在穩(wěn)定試驗中進行肽分析。
儀器 SHIMADZU LC-9A系統(tǒng)柱YMC-PROTEIN-PR(4.6mmΦ×150mm)柱溫 40℃洗脫劑在0.1％三氟乙酸中的乙腈，其中乙腈的濃度在10分鐘內線性改變流速 1ml/min檢測 UV(214nm)進樣體積 50μL2.質譜分析使用下列設備和條件來測定肽的質量。
儀器 Finnigan MAT TSQMS離子源ESI離子檢測模式 正噴霧電壓 4.5kV毛細管溫度250℃流動相0.2％乙酸/甲醇混合物(1∶1)流速 0.2ml/分鐘掃描范圍m/z 550-8503.分析氨基酸序列使用下述設備來分析肽的氨基酸序列儀器Perkin Elmer 477A序列分析儀4.分析氨基酸組成使用下述設備來分析肽的氨基酸組成儀器Hitachi L-8500氨基酸分析儀5.樣本保存(穩(wěn)定性試驗)
將樣本在下述恒溫箱中于下述溫度條件下貯存儀器Nagano Science LH-30-14溫度設定40±2℃，25±1℃6.冷凍干燥儀器使用LABCONCO Corp.的FZ-6。
7.測定在血漿中的濃度施用藥物組合物后，通過放射免疫分析(RIA)或酶免疫分析(ELISA)測定GLP-1(7-36)NH2在血漿中的濃度。
7-1.放射免疫分析(RIA)用GLP-1(7-36)NH2與牛甲狀腺球蛋白的復合佐劑將兔子致敏，以獲得抗血清(IgG組分)。將血漿與得自抗血清的抗-GLP-1(7-36)NH2-兔子抗體一起加到試管中，讓該混合物在4℃靜置過夜。然后加入125I-GLP-1(7-36)NH2，讓該混合物在4℃靜置過夜。然后加入抗-兔子IgG山羊血清，將該混合物離心，通過γ計數(shù)器測定沉淀的放射性(γ射線)。
7-2.酶免疫測定(ELISA)將抗-GLP-1(7-36)NH2抗體(兔子多克隆抗體)固定到96-孔平板中。將血漿加到平板中，讓反應進行2小時。洗滌平板后，加入用辣根過氧化物酶標記的抗-GLP-1(7-36)NH2抗體(鼠多克隆抗體)，讓該反應在室溫進行1小時。將平板洗滌后，加入四甲基聯(lián)苯胺來進行反應。測定在450nm的吸收度。
8.計算生物活性多肽的等電點(pI)使用ExPASy(Expert Protein Analysis System)MolecularBiology Server，Swiss Institute of Bioinformatics。為了計算C-末端酰胺，將序列中的一個Asp或Glu殘基用Asn或Gln置換。
9.合成肽(腸降血糖素肽)使用433A合成儀(ABI公司)，依據(jù)ABI標準的FastFmoc(0.25mmol)合成保留的肽樹脂。
10.粒徑分布(測定碳酸鈣和淀粉的粒徑)儀器使用激光衍射分析儀(RODOS SR)，SYMPATEC HELOS&RODOSCorp.。
參考實施例1制備GLP-1(7-36)NH2
制備用于表達由大腸桿菌β-半乳糖苷酶衍生物(β-gal 97)、長為25個氨基酸的連接物和GLP-1(7-37)組成的融和蛋白的表達質粒pG97ompPR(國際專利出版物WO 99/38984)。表達的融和蛋白的連接物區(qū)域包括ompT蛋白酶的裂解基序(Arg-Arg)和Kex2蛋白酶的裂解基序(Pro-Arg)，并且在各自的裂解位點被蛋白酶裂解。
為了獲得融和蛋白，向從W3110菌株傳代下來的大腸桿菌菌株內引入pG97ompPR。在300L培養(yǎng)器中，將所得轉化體在含有酵母提取物、無機鹽和葡萄糖的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細胞培養(yǎng)直至細菌的濃度達到OD660＝18O。在高壓勻化器中加工所得培養(yǎng)物溶液以破壞細胞體，然后離心以收集包含體。將含有包含體的沉淀重懸在去離子水中，離心以洗滌包含體，然后重懸在去離子水中以獲得OD660等于1000的包含體的濃縮物(約30L)。
向3.9L包含體濃縮物中加入1L具有未調節(jié)的pH的1M Tris-HCl和10L 8M尿素。然后加入去離子水直至終體積為20L。用5N鹽酸將所得溶液的pH調節(jié)至6.5，把所得溶液在37℃保持2小時以讓包含體中存在的大腸桿菌OmpT蛋白酶作用于融和蛋白，以由此裂解下來具有13個加到其N-末端上的氨基酸的GLP-1(7-37)(在下文中稱為RHHGP[G])。反應完全后，向該反應混合物中加入尿素粉末至濃度為7M，用5N NaOH將pH調節(jié)至8.0。然后將該反應混合物在壓力下過濾，獲得了30L上清液。把上清液加到用5M尿素/20mM Tris-HCl(pH8.0)/0.1％吐溫80溶液平衡的SP-Sepharose Big Beads柱(140mmID×160mm，Amersham Pharmacia Biotechnology)上，然后用0.2M NaCl/20mM Tris-HCl(pH8.0)/0.1％吐溫80溶液洗滌。之后用0.5M NaCl/20mM Tris-HCl(pH8.0)/0.1％吐溫80溶液將RHHGP[G]洗脫下來，結果獲得了含有約100g RHHGP[G]的級份(約20L)。
使用純化水(UF水)將所得RHHGP[G]級份調節(jié)至5.0mg/mL。向該溶液中加入20mM乙酸鈉(pH5.2)、5.0μM硫酸銅、0.5g/L抗壞血酸、lmg/L過氧化氫酶、0.1％吐溫80和1500個單位/mL酰胺化酶。然后讓該反應在32℃進行80分鐘，同時向該溶液中鼓入氧氣以將溶解氧濃度保持在100％。結果RHHGP[G]的C-末端被酰胺化以形成酰胺形式(RHHGP-1)。向該溶液中加入Tris-HCl(pH8.0)、吐溫80、氯化鈣和Kex2蛋白酶至終濃度分別為20mM、0.1％、1mM和8,000U/mL，讓該反應在32℃進行2.5小時。
將13個氨基酸從RHHGP-1的N-末端上除去以形成游離GLP-1(7-36)NH2。將一份約為10L(3.4g/L)的上述溶液用0.3％吐溫80/20mMBriton Robinson(下文中稱為BR)緩沖液(pH4.5)稀釋(至26L)，并加到用20mM NaCl/0.3％吐溫80/20mM BR緩沖液(pH 4.5)平衡的陽離子交換色譜柱(90mmID×400mm，MacroPrep High-S，Biorad)上。用相同溶液洗滌后，用溶液A(20mM BR緩沖液(pH6.0)/20mM NaCl/0.3％吐溫80)和溶液B(20mM BR緩沖液(pH7.5)/20mM NaCl/0.3％吐溫80)洗脫GLP-1(7-36)NH2，同時溶液B在洗脫劑中的比例以線性方式從50％改變到100％以形成線性梯度。
將純度為98％或更高的所得級份用UF水稀釋至GLP-1(7-36)NH2濃度為6mg/mL，加到用20mM乙酸鈉(pH4.5)平衡的Prep C18柱(90mmID×240mm)(Waters)上。用含有20mM乙酸鈉(pH4.5)和0.2％乙酸的10％乙腈溶液洗滌后，用含有2％乙酸的30％乙腈溶液洗脫GLP-1(7-36)NH2，獲得了含有27g GLP-1(7-36)NH2的溶液(2.5L)。使用蒸發(fā)儀將乙腈從洗脫液中除去，用注射用水把GLP-1(7-36)NH2的濃度調節(jié)至10mg/mL。然后將該溶液在RL-903BS冷凍干燥器(KyowaVacuum Engineering Co.，Ltd)中冷凍干燥，獲得了22g凍干的GLP-1(7-36)NH2。
所獲得的產物具有下列分子量和氨基酸組成，因此是GLP-1(7-36)NH2。ESI-MS3297.4(理論值3297.68)。用6N鹽酸水解后的Leu標準氨基酸組成Asp 1.0；(1)，Thr；2.0(2)，Ser；2.7(3)，Glu；4.0(4)，Gly；3.0(3)，Ala；4.1(4)，Val；2.0(2)，Ile；1.0(1)，Leu；2.0，Tyr；1.0(1)，Phe；2.1(2)，Lys；2.0(2)，His；1.0(1)，Arg；1.0(1).
參考實施例2使用大鼠測試GLP-1(7-36)NH2藥物組合物溶液的鼻吸收將約10mg在參考實施例1中獲得的GLP-1(7-36)NH2、180mg蔗糖、8mg無水檸檬酸和0.2mg苯扎氯銨溶解在2mL水中，以形成通過反相HPLC測定的濃度為5mg/mL的樣本溶液。將7-9周大、重約250g的雄性SD大鼠(CrjCD，Charles River Japan Inc.，)在金屬籠子中保持12小時的白晝/黑夜循環(huán)，同時維持22±5℃的溫度和30-70％的濕度。讓大鼠自由獲取固體食物和自來水，在測試前禁食24小時(每組3只動物)。
對于經鼻給藥，在戊巴比妥麻醉下將套管放在股動脈內，用精密吸移管將5μL樣本溶液在左鼻腔中給藥(約100μg/kg)。在給藥后0、5、10、15、20、30、60和90分鐘，采集血液置于含有抗凝血劑和酶抑制劑的管中，并離心以獲得血漿。使用抗-GLP-1(7-36)NH2抗體通過RIA測定血漿中GLP-1(7-36)NH2的濃度。對于皮下給藥，使用注射器以1mL/kg的劑量將皮下給藥用的樣本溶液(約15μg/mL)皮下注射到大鼠的背部。按照與經鼻給藥相同的方式測定血漿中GLP-1(7-36)NH2的濃度。結果如下表1中所示。
表1GLP-1(7-36)NH2藥物組合物溶液的鼻吸收(在大鼠中)
平均值±SD(n＝3)從上述結果中可以看出，生物利用度為11.2±6.5％(平均值±SD，n＝3)，這表明GLP-1(7-36)NH2有效從鼻粘膜中吸收。
參考實施例3GLP-1(7-36)NH2藥物組合物溶液的穩(wěn)定性將在參考實施例2中制備的GLP-1(7-36)NH2樣本溶液在25℃和40℃貯存。
結果如表2所示。從這些結果中可以看出，在每一溫度條件下保持1周后，形成了小的顆粒。
表2GLP-1(7-36)NH2水溶液在0.4％乙酸中的穩(wěn)定性
肽濃度5mg/mL0.4％無水檸檬酸9％蔗糖0.01％苯扎氯銨雖然參考實施例2的結果表明該含有GLP-1(7-36)NH2的藥物組合物溶液能夠在大鼠中經鼻吸收，但是當該溶液的pH在2.7附近時，該溶液的物化穩(wěn)定性很低。因此，當具有這樣的pH時，該藥物組合物的溶液是不適宜的。
參考實施例4GLP-1(7-36)NH2溶液的穩(wěn)定性通過將蒸餾水加到3.92g磷酸、2.40g乙酸、14.91g氯化鉀和2.47g硼酸的混合物中來制備1000mL溶液A，通過將水加到8.0g氫氧化鈉中來制備1000mL溶液B。將溶液B滴加到溶液A中，以形成pH值分別為pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0和pH9.0的100mL緩沖液(Britton Robinson(BR)緩沖液)。
同時，將約300mg在參考實施例1中制備的GLP-1(7-36)NH2溶解在30mL蒸餾水中。將該溶液(10mg/mL)分成2.0mL的等份試樣，向等份試樣中各自加入BR緩沖液和0.1M鹽酸以形成20mL樣本溶液。然后將樣本在恒溫箱中于40℃貯存1、4和7天，觀察樣本的外觀，并測定GLP-1(7-36)NH2的剩余比例。結果如下表3所示。
表3GLP-1(7-36)NH2水溶液在不同pH的穩(wěn)定性
C.C.澄清且無色P.P.部分沉淀肽濃度1mg/mL溫度40℃pH1.20.1M鹽酸pH2.0～pH9.0Briton-Robinson緩沖液(μ＝0.2)剩余比例在上清液中收集的比例如表3所示，1天后，在具有pH1.2、pH2.0、pH3.0、pH6.0和pH7.0的樣本中形成了沉淀，4天后，在具有pH5.0的樣本中出現(xiàn)沉淀，7天后，在具有pH4.0的樣本中形成了沉淀。在具有pH9.0的樣本中沒有形成沉淀，7天后，GLP-1(7-36)NH2的剩余比例降至75.6％。因此，這證明了GLP-1(7-36)NH2在任何酸性、中性或堿性溶液中表現(xiàn)出較低的穩(wěn)定性，從而不適于在藥物組合物溶液中使用。
由于這個觀點，測試經鼻給藥用組合物的粉末制劑—該藥物組合物溶液的替代物—的吸收性。
實施例1使用狗測試經鼻給藥用粉末制劑的吸收性通過將如下面的制備實施例1-9所述的不同添加劑加到在參考實施例1中獲得的GLP-1(7-36)NH2與平均粒徑為50μm的起載體作用的碳酸鈣細粉末的混合物中來制備經鼻吸收用組合物。
作為對照，制備一種不含添加劑的經鼻給藥用組合物樣本。
使用分別重約10kg的3只beagle狗，用粉末噴霧器將如在制備實施例1-9中描述的經鼻吸收用藥物組合物經鼻給藥。在給藥后0、5、10、20、30、45、60、90和120分鐘測定血漿中GLP-1(7-36)NH2的濃度。作為對照，給藥使用碳酸鈣載體的不含添加劑的GLP-1(7-36)NH2細粉末。使用抗-GLP-1(7-36)NH2抗體通過RIA測定血漿中GLP-1(7-36)NH2的濃度。通過比較經鼻給藥后的曲線下面積(AUC)與皮下施用在鹽水中的GLP-1(7-36)NH2后的AUC來計算生物利用度。結果如下表4所示。
表4在狗中評價經鼻給藥用制劑
1)碳酸鈣載體平均值±SD(n＝3)從上面的結果中可以看出，不含添加劑的藥物組合物的生物利用度約為4％，而施用本發(fā)明藥物組合物改善了GLP-1(7-36)NH2的吸收，并使得生物利用度提高了約6％-14％。
制備實施例1制備含有Domyo-ji粉(1.0％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與31mg Domyo-ji粉混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.92g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(29mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.83g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有690μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約226mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例2制備含有玉米淀粉(0.1％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與3.5mg玉米淀粉(日本藥典平均粒徑＝13.3μm)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.96g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(28mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.75g粉末樣本。將含有約1000μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約297mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例3制備含有玉米淀粉(1.0％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與32mg玉米淀粉(日本藥典平均粒徑＝13.3μm)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.93g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(29mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.89g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有678μgGLP-1(7-36)NH2的一定量(約213mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例4制備含有非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉(0.1％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與3.2mg非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉(AMYCOL HF，NIPPON STARCH CHEMICAL Co.，Ltd.)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.96g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(28mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.75g粉末樣本。將含有約1000μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約297mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例5制備含有非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉(1.0％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與30mg非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉(AMYCOL HF，NIPPON STARCH CHEMICAL Co.，Ltd.)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.92g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(27mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.77g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有661μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約217mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例6制備含有聚維酮(1.0％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與32mg聚維酮K30(日本標準藥物添加劑)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.93g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(29mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.84g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有642μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約211mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例7制備含有果膠(1.0％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與31mg果膠(USP)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.93g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(29mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.88g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有644μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約210mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例8制備含有非粘性稻米型預膠化玉米淀粉(1.0％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與31mg非粘性稻米型預膠化玉米淀粉(PCS，ASAHI KASEI Co.，Ltd.)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入2.92g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(28mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.88g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有646μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約211mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例9制備不含添加劑的藥物組合物將相當于30mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末置于燒杯中，逐漸加入8.88g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(87mg)的硬脂酸鈣，獲得了8.76g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有937μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約300mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
實施例2使用cynomolgus猴子測試經鼻給藥用粉末組合物的吸收性(測試-1)使用在參考實施例1中獲得的GLP-1(7-36)NH2作為生物活性多肽，使用平均粒徑為51.9μm的碳酸鈣或蔗糖硫酸鋁鹽(硫糖鋁)細粉末作為載體。依據(jù)在制備實施例10-18中描述的方法，制備包含由載體攜帶的不同添加劑的不同經鼻吸收用藥物組合物。調節(jié)GLP-1(7-36)NH2的劑量，使得每次給每只動物施用約100μg GLP-1(7-36)NH2。每一種添加劑以占制劑總重量0.5％、1.0％、10％和50％的量加到藥物組合物中。制備兩種不含添加劑的制劑作為對照，一種含有碳酸鈣和GLP-1(7-36)NH2，另一種含有硫糖鋁和GLP-1(7-36)NH2。
使用由UNISIA JECS Co.Ltd.生產的鼻用噴霧器，將制備實施例10-18的組合物獨立地施用到分別重3kg的cynomolgus猴子的鼻腔中，在給藥后0、5、10、20、30、45、60、90和120分鐘，通過RIA和部分通過ELISA測定血漿中GLP-1(7-36)NH2的濃度。通過比較經鼻給藥后的AUC與皮下給藥后的AUC來確定生物利用度。
附圖1、2和3分別給出了皮下施用在鹽水中的GLP-1(7-36)NH2后以及經鼻給藥兩種不含添加劑的制劑后的GLP-1(7-36)NH2的血漿濃度-時間曲線。附圖4給出了經鼻給藥含有1％Domyo-ji粉、0.5％玉米淀粉或0.5％非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉的各種經鼻用制劑后的GLP-1(7-36)NH2的血漿濃度-時間曲線。
通過RIA和部分通過ELISA測定而獲得的血漿GLP-1(7-36)NH2濃度的評估結果分別如表5和6所示。
表5在cynomolgus猴子中評估GLP-1(7-36)NH2經鼻給藥用制劑(RIA)
平均值±SD(n＝3)1)碳酸鈣(制備實施例10)2)硫糖鋁(制備實施例11)3)用水捏合(制備實施例16)
4)“-”是指血漿濃度太低而不能計算。
表6在cynomolgus猴子中評估GLP-1(7-36)NH2經鼻給藥用制劑(ELISA)
3)用水捏合(制備實施例16)5)粉末混合物(制備實施例15)6)用乙醇捏合(制備實施例17)7)用水捏合(制備實施例18)從上表5和6中可以看出，兩種不含添加劑的制劑分別表現(xiàn)出約0.3-3.1％的低的GLP-1(7-36)NH2經鼻吸收，而每一種本發(fā)明藥物組合物顯著提高了鼻粘膜對GLP-1(7-36)NH2的吸收。
制備實施例10制備不含添加劑的藥物組合物將相當于30mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末置于燒杯中，逐漸加入8.87g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約84mg)的硬脂酸鈣，獲得了8.20g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μgGLP-1(7-36)NH2的一定量(約30mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例11制備不含添加劑的藥物組合物將相當于30mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末置于燒杯中，逐漸加入8.87g硫糖鋁。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(84mg)的硬脂酸鈣，獲得了8.03g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約30mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例12制備含有Domyo-ji粉(1.0％)的藥物組合物將相當于30mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與89mg Domyo-ji粉混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入8.78g碳酸鈣。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(84mg)的硬脂酸鈣，獲得了8.11g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約30mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例13制備含有玉米淀粉(0.5％)的藥物組合物將相當于30mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與45mg玉米淀粉(日本藥典平均粒徑＝13.3μm)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入8.83g碳酸鈣(平均粒徑＝50μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(88mg)的硬脂酸鈣，獲得了8.46g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有98μgGLP-1(7-36)NH2的一定量(約30mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例14制備含有非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉(0.5％)的藥物組合物將相當于30mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與45mg非粘性稻米型預膠化馬鈴薯淀粉(AMYCOL HF，NIPPON STARCH CHEMICAL Co.，Ltd.)混合。將該粉末混合物置于燒杯中，逐漸加入8.83g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)。將該混合物充分混合后，加入純化水，把該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(89mg)的硬脂酸鈣，獲得了8.47g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有101μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約30mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例15制備含有羥丙基纖維素(HPC，10％)的藥物組合物(粉末混合物)將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與300mg HPC(日本藥典)一起研磨，獲得了粉末混合物。以類似方式將該粉末混合物與2.69g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)一起研磨直至均勻。然后將該混合物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(28mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.76g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約30mg)粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例16制備含有HPC(10％)的藥物組合物(用水捏合的混合物)將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與300mg HPC(日本藥典)一起研磨，獲得了粉末混合物。以類似方式將該粉末混合物與2.69g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)一起研磨直至均勻。向該混合物中加入純化水以將混合物形成糊狀物。將該糊狀物充分混合，在干燥器中減壓干燥過夜。將該干燥的混合物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(28mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.70g粉末樣本。測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μg GLP-1(7-36)NH2的約30mg粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例17制備含有HPC(10％)的藥物組合物(用乙醇捏合的混合物)將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與300mg HPC(日本藥典)一起研磨，獲得了粉末混合物。以類似方式將該粉末混合物與2.69g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)一起研磨直至均勻。向該混合物中加入乙醇以將混合物形成糊狀物。將該糊狀物捏合，在干燥器中減壓干燥過夜。將該干燥的混合物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(28mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.73g粉末樣本。測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μgGLP-1(7-36)NH2的約30mg粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例18制備含有HPC(50％)的藥物組合物將相當于10mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約12mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與1.5g HPC(日本藥典)一起研磨，獲得了粉末混合物。以類似方式將該粉末混合物與1.49g碳酸鈣(平均粒徑＝51.9μm)一起研磨直至均勻。向該混合物中加入純化水以將混合物形成糊狀物。將該糊狀物捏合，在干燥器中減壓干燥過夜。將所得粉末過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(27mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.54g粉末樣本。測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，將含有100μg GLP-1(7-36)NH2的約30mg粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
實施例3使用cynomolgus猴子測試經鼻給藥用粉末制劑的吸收性(測試-2)在本實施例中，我們測定了含有部分預膠化淀粉、羥丙基纖維素-SSL(HPC-SSL)、部分預膠化淀粉/HPC-SSL混合物或玉米淀粉(含量為1.0-10％)作為添加劑的組合物在給藥后的鼻吸收性。
使用由UNISIA JECS Co.Ltd.生產的鼻用噴霧器，將制備實施例19-27的組合物獨立地施用到分別重2-4kg的cynomolgus猴子的鼻腔中，在給藥后0、5、10、15、30、60、90和120分鐘，測定血漿中GLP-1(7-36)NH2的濃度。通過比較經鼻給藥后的AUC與皮下給藥后的AUC來確定生物利用度。
結果如下表7所示。從表7可以看出，與不含添加劑的制劑相比，含有玉米淀粉(其含量在1.0-10％的寬范圍內)的制劑表現(xiàn)出有效的促進GLP-1(7-36)NH2經鼻吸收的效果。此外，含有保持部分水不溶性的部分預膠化玉米淀粉的制劑也表現(xiàn)出有效的GLP-1(7-36)NH2的經鼻吸收。通過在藥物組合物中使用難溶于水的HPC-SSL作為添加劑，觀察到了一定的促進GLP-1(7-36)NH2吸收的效果。雖然沒有觀察到聯(lián)合使用HPC-SSL與部分預膠化淀粉的吸收增強作用，但是與不含添加劑的制劑相比，GLP-1(7-36)NH2的經鼻吸收也提高了。
表7在cynomolgus猴子中評估GLP-1(7-36)NH2經鼻給藥用制劑(RIA)
制備實施例19制備含有苯扎氯銨(0.01％)的不含添加劑的藥物組合物將相當于30.6mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與2.93g碳酸鈣(平均粒徑＝53.6μm)逐漸混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約30mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.95g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有311μgGLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例20制備含有玉米淀粉(1.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物將約2.91g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約29mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)混合。將該混合物充分混合后，加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于29.9mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約29mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.88g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有312μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例21制備含有玉米淀粉(5.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物將約2.78g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約150mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)混合。將該混合物充分混合后，加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于29.6mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約35mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約30mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.89g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有307μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例22制備含有玉米淀粉(10.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物將約2.63g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約301mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)混合。將該混合物充分混合后，加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于30.6mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約27mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.69g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有341μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例23制備含有HPC-SSL(0.1％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物向約2.93g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入含有約3mgHPC-SSL的溶液，然后加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于30.4mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約30mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.94g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有310μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例24制備含有HPC-SSL(0.5％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物向約2.92g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入含有約15mgHPC-SSL的溶液，然后加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于30.5mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約30mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.93g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有312μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例25制備含有HPC-SSL(1.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物向約2.90g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入含有約30mgHPC-SSL的溶液，然后加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于30.6mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約28mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.85g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有322μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例26制備含有部分預膠化玉米淀粉(1.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物向約2.90g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入含有約30mg部分預膠化玉米淀粉的溶液，然后加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于30.8mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約37mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約29mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.90g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有319μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
制備實施例27制備含有玉米淀粉(5.0％)、HPC-SSL(0.1％)和苯扎氯銨(0.01％)的藥物組合物將約2.78g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約151mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)混合，將該混合物充分混合。然后加入含有約3mgHPC-SSL的溶液，之后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于30.3mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約36mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約30mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.93g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有310μg GLP-1(7-36)NH2的30mg粉末樣本。
實施例4加入淀粉對腸降血糖素多肽的經鼻吸收的影響本實施例測試了加入淀粉是否能夠提高除GLP-1(7-36)NH2以外的酸性腸降血糖素激素的經鼻吸收，其中是用大鼠中的血糖水平下降作用作為指數(shù)。
用戊巴比妥將重約300g的雄性CD(SD)大鼠麻醉。向吸移管(GPS-250，RAININ)的尖端前邊緣中填充3mg通過下文描述的制備實施例制得的藥物組合物(含有約100μg多肽)，將尖端放在注射器中，然后將組合物與1ml空氣一起在大鼠鼻腔中噴霧。在組合物經鼻給藥后5分鐘，在大鼠的尾部靜脈內注射0.5g/kg葡萄糖。在組合物經鼻給藥后15分鐘(施用葡萄糖后10分鐘)，從主動脈采集血樣。使用血糖水平測定儀器(FREESTYLE-KISSEI；Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)測定血糖水平。
結果如下表8所示。從這些結果中可以看出，沒有施用腸降血糖素激素的對照組的血糖水平為196mg/dl(3只大鼠的平均值)。對于含有腸降血糖素激素的組合物，與對照組相比，血糖水平下降了。此外，對于腸降血糖素激素，當組合物含有5％玉米淀粉時，與未加入5％玉米淀粉相比，血糖水平下降了。
這些結果清楚地表明，本發(fā)明藥物組合物可使得更多的腸降血糖素激素被吸收，并且當本發(fā)明組合物使用淀粉作為添加劑時，腸降血糖素激素的吸收性得到了提高。
表8施用腸降血糖素激素降低血糖水平的效果
參考實施例5合成{Lys-26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)向含有二氯甲烷(30mL)的5mg(6.9mmol)膨脹C1-Trt(2-C1)樹脂中加入Fmoc-Glu-OtBu(5.8g，13.7mmol)與DIPEA(1.5g，11.8mmol)的二氯甲烷溶液，將該混合物輕微攪拌30分鐘。通過過濾收集樹脂，依次用二氯甲烷、異丙醇和二氯甲烷洗滌。然后將20％哌啶/DMF的混合溶液(30mL)加到所得樹脂中，將該混合物輕微攪拌20分鐘。通過過濾收集樹脂、依次用DMF、異丙醇和二氯甲烷洗滌，干燥。將所得H-G1u(α-OtBu)-Trt(2-C1)樹脂(6.1g，6.9mmol)懸浮在N-甲基吡咯烷酮(NMP)/二氯甲烷(1∶1，30ml)的混合溶液中，向該混合物中加入3當量的棕櫚酸(5.3g，20.7mmol)、HOBt(2.8g，20.7mmol)和水溶性二環(huán)己基碳二亞胺(DCC4.0g，20.7mmol)，然后將該混合物輕微攪拌過夜。將所得樹脂依次用二氯甲烷、NMP和二氯甲烷洗滌，并干燥。向所得棕櫚?；?Glu(α-OtBu)-Trt(2-C1)樹脂(8g，6.9mmol)中加入乙酸/TFE/二氯甲烷(1∶2∶7，20ml)的混合溶液，將該混合物輕微攪拌20分鐘。將樹脂過濾，用10ml TFE洗滌，將濾液濃縮。用己烷處理所得殘余物以獲得沉淀。將所得沉淀從二氯甲烷/己烷中重結晶，獲得了2.0g(產率66％)用以在26位引入Lys側鏈的谷氨酸衍生物，即棕櫚?；?Glu(α-OtBu)。ESI-MS[M+H]442.3；M+Na]462.4(理論值441.3[M])。
然后，使用自動肽合成儀433A(ABI Co.，Ltd.)，通過Fmoc方法(0.25mmol方案)構建Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Sln(Trt)-Ala-Ala-Lys(4-甲基三苯甲基)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pmc)-Gly-Arg(Pmc)-Gly-Wang樹脂。將所得樹脂用1％TFA/5％TIPS/二氯甲烷混合溶液(30ml)處理30分鐘以將4-甲基三苯甲基從在26位的Lys側鏈上除去。將所得樹脂用5％DIPEA/二氯甲烷混合溶液中和，用二氯甲烷洗滌，用NMP(30ml)膨脹。然后將膨脹的樹脂與棕櫚?；?Glu(α-OtBu)(441mg，1mmol)在HOBt(135mg，1mmol)和DCC(260mg，1mmol)存在下反應3小時。將所得肽樹脂用20％哌啶處理以除去Fmoc，然后用88％TFA/2％TIPS/5％水/5％苯酚的混合溶液(20ml)處理1小時。將樹脂過濾，將樹脂用10ml TFA洗滌，將合并的濾液濃縮。用乙醚處理所得殘余物，獲得了沉淀(720mg)。將500mg所得肽粗產物溶解在飽和尿素溶液(200ml)中，使用C4(YMC-pack，PROTEIN-RP，2cm×25cm)通過反相HPLC純化，用13％-60％乙腈/0.1％TFA的線性梯度以5-10ml/分鐘的流速洗脫。收集含有目標產物的級份，冷凍干燥，獲得了145mg所需肽。ESI-MS3751(理論值3751.2)。用6N鹽酸水解后的Leu標準氨基酸組成Asx0.97(1)，Thr1.89(2)，Ser2.75(3)，Glx5.08(5)，Gly4.05(4)，Ala4.01(4)，Val1.93(2)，Ile0.99(1)，Leu2，Tyr0.91(1)，Phe1.90(2)，Lys1.10(1)，His0.90(1)，Arg1.92(2).
參考實施例6合成GLP-1(7-37)使用自動肽合成儀433A(ABI Co.，Ltd.)，通過Fmoc方法(0.25mmol方案)由作為原料的Fmoc-Arg(Pmc)-Wang樹脂構建H-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pmc)-Wang樹脂(1.1g)。將600mg所得樹脂用88％TFA/2％TIPS/5％水/5％苯酚的混合溶液(20ml)處理1小時。將樹脂過濾，將濾液濃縮，用乙醚處理所得殘余物，獲得了沉淀(380mg)。將所得肽粗產物溶解在純化水(20ml)中，使用C4(YMC-pack，PROTEIN-RP，2cm×25cm)通過反相HPLC純化，用9％-68％乙腈/0.1％TFA的線性梯度以10ml/分鐘的流速洗脫。收集含有目標產物的級份，冷凍干燥，獲得了53mg所需肽。ESI-MS3355(理論值3355.7)。用6N鹽酸水解后的Leu標準氨基酸組成Asx1.00(1)，Thr1.99(2)，Ser2.79(3)，Glx4.10(4)，Gly4.01(4)，Ala4.02(4)，Val1.92(2)，Ile0.98(1)，Leu2，Tyr0.92(1)，Phe1.92(2)，Lys2.18(2)，His0.96(1)，Arg0.94(1).
參考實施例7合成[Val8]GLP-1(7-37)使用自動肽合成儀433A(ABI Co.，Ltd.)，通過Fmoc方法(0.25mmol方案)由作為原料的Fmoc-Arg(Pmc)-Wang樹脂構建H-His(Trt)-Va1-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pmc)-Wang樹脂(1.4g)。將0.7g所得樹脂用88％TFA/2％TIPS/5％水/5％苯酚的混合溶液(20ml)處理1小時。將樹脂過濾，將濾液濃縮，用乙醚處理所得殘余物，獲得了沉淀(327mg)。將所得肽粗產物溶解在純化水(5ml)中，使用C4(YMC-pack，PROTEIN-RP，2.5cm×30cm)通過反相HPLC純化，用5％-72％乙腈/0.1％TFA的線性梯度以10ml/分鐘的流速洗脫。收集含有目標產物的級份，冷凍干燥，獲得了75mg所需肽。ESI-MS3383(理論值3383.8)。用6N鹽酸水解后的Leu標準氨基酸組成Asx0.99(1)，Thr1.98(2)，Ser2.80(3)，Glx4.10(4)，Gly4.01(4)，Ala3.03(3)，Val2.86(3)，Ile0.98(1)，Leu2，Tyr0.92(1)，Phe1.92(2)，Lys2.18(2)，His0.92(1)，Arg0.94(1).
參考實施例8合成Extendin-4通過Fmoc方法(0.25mmol方案)由作為原料的Fmoc-Ser(tBu)-Wang樹脂構建H-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pmc)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp-Lue-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Wang樹脂(1.9g)。將1.9g所得樹脂用88％TFA/2％TIPS/5％水/5％苯酚的混合溶液(20ml)處理1小時。將樹脂過濾，將濾液濃縮，用乙醚處理所得殘余物，獲得了沉淀(870mg)。將所得肽粗產物溶解在純化水(80ml)中，使用C4(YMC-pack，PROTEIN-RP，2.5cm×30cm)通過反相HPLC純化，用18％-72％乙腈/0.1％TFA的線性梯度以10ml/分鐘的流速洗脫60分鐘。收集含有目標產物的級份，冷凍干燥，獲得了270mg所需肽。ESI-MS4186(理論值4186.6)。用6N鹽酸水解后的Leu標準氨基酸組成
Asx1.99(2)，Thr1.97(2)，Ser4.77(5)，Glx6.06(6)，Gly4.97(5)，Ala2.02(2)，Val0.94(1)，Met0.68(1)，Ile0.98(1)，Leu3，Phe1.90(2)，Lys2.17(2)，His0.98(1)，Arg0.92(1)，Pro3.96(4).
制備實施例28制備含有玉米淀粉(5％)和苯扎氯銨(0.01％)的GLP-1(7-37)的經鼻吸收用藥物組合物將約269mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約15mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)充分混合。然后向該混合物中加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于9.03mg GLP-1(7-37)的一定量(約10.8mg)的作為肽組分的GLP-1(7-37)粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約2.2mg)的硬脂酸鈣，獲得了約252mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-37)含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有107μgGLP-1(7-37)的3mg粉末樣本。
制備實施例29制備含有苯扎氯銨(0.01％)的GLP-1(7-37)的經鼻吸收用藥物組合物將相當于8.75mg GLP-1(7-37)的一定量(約10.5mg)的作為肽組分的GLP-1(7-37)粉末與約284mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)逐漸混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約2.9mg)的硬脂酸鈣，獲得了約258mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-37)含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有102μg GLP-1(7-37)的3mg粉末樣本。
制備實施例30制備含有玉米淀粉(5.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的[Val8]-GLP-1(7-37)的經鼻吸收用藥物組合物將約269mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約15mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)充分混合。然后向該混合物中加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于9.38mg[Val8]-GLP-1(7-37)的一定量(約13mg)的作為肽組分的[Val8]-GLP-1(7-37)粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約3.1mg)的硬脂酸鈣，獲得了約261mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的[Val8]-GLP-1(7-37)含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有108μg[Val8]-GLP-1(7-37)的3mg粉末樣本。
制備實施例31制備含有苯扎氯銨(0.01％)的[Val8]-GLP-1(7-37)的經鼻吸收用藥物組合物將相當于9.31mg[Val8]-GLP-1(7-37)的一定量(約13mg)的作為肽組分的[Val8]-GLP-1(7-37)粉末與約284mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)逐漸混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約2.6mg)的硬脂酸鈣，獲得了約252mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的[Val8]-GLP-1(7-37)含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有111μg[Val8]-GLP-1(7-37)的3mg粉末樣本。
制備實施例32制備含有玉米淀粉(5.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的Exendin-4的經鼻吸收用藥物組合物將約270mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約15mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)充分混合。然后向該混合物中加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于9.08mg Exendin-4的一定量(約12mg)的作為肽組分的Exendin-4粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約3.0mg)的硬脂酸鈣，獲得了約255mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的Exendin-4含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有107μg Exendin-4的3mg粉末樣本。
制備實施例33制備含有苯扎氯銨(0.01％)的Exendin-4的經鼻吸收用藥物組合物將相當于9.0mg Exendin-4的一定量(約12mg)的作為肽組分的糊精Exendin-4粉末與約285mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)逐漸混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約2.6mg)的硬脂酸鈣，獲得了約260mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的Exendin-4含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有104μg Exendin-4的3mg粉末樣本。
制備實施例34制備含有玉米淀粉(5.0％)和苯扎氯銨(0.01％)的[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚酰基)}]-GLP-1(7-37)的經鼻吸收用藥物組合物將約270mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)與約15mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)充分混合。然后向該混合物中加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于9.23mg[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)的一定量(約12mg)的作為肽組分的[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約2.7mg)的硬脂酸鈣，獲得了約245mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚酰基)}]-GLP-1(7-37)含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有113μg[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)的3mg粉末樣本。
制備實施例35制備含有苯扎氯銨(0.01％)的[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)的經鼻吸收用藥物組合物將相當于9.08mg[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)的一定量(約12mg)的作為肽組分的[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?)]-GLP-1(7-37)粉末與約285mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)逐漸混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.03mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約2.4mg)的硬脂酸鈣，獲得了約265mg粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有103μg[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)的3mg粉末樣本。
實施例5作為添加劑的淀粉對酸性多肽經鼻吸收的提高作用本實施例使用cynomolgus猴子表明了加入淀粉對于人胰島素經鼻吸收的吸收提高效果。使用人胰島素作為不是腸降血糖素激素的酸性多肽的一個實例。
使用平均粒徑為50μm的碳酸鈣或蔗糖硫酸鋁鹽(硫糖鋁)細粉末作為載體。依據(jù)在制備實施例10-18中描述的方法，制備含有Domyo-ji粉(1.0％)的經鼻吸收用藥物組合物。調節(jié)人胰島素的的劑量，使得能施用約25IU(國際單位)/猴子/40mg組合物。制備兩種不含添加劑的制劑作為對照，一種含有碳酸鈣和人胰島素，另一種含有硫糖鋁和人胰島素。
使用由UNISIA JECS Co.Ltd.生產的鼻用噴霧器，將大約40mg制備實施例36-38的組合物獨立地施用到分別重約3kg的cynomo1gus猴子的鼻腔中。在給藥后0、5、15、20、30、45、60、90和120分鐘，用胰島素.RIA珠II(Dinabott Co.，Ltd)和血糖水平測定儀器FREESTYLE-KISSEI；KISSEI Pharmaceutical Co.，Ltd.)測定血漿中的胰島素和葡萄糖濃度。
結果如表9和10所示。從這些結果中可以看出，使用不含添加劑的組合物，觀察到了人胰島素的吸收和血糖水平的下降。然而，當施用含有1.0％Domyo-ji粉(部分預膠化淀粉)的組合物時，觀察到人胰島素吸收性增強，并且在早期觀察到血糖水平的顯著下降。
表9施用含有人胰島素組合物后，人胰島素的血漿濃度
表10施用含有人胰島素組合物后的血糖水平
N.D.沒有檢測制備實施例36制備胰島素/硫糖鋁的藥物組合物向120mg硫糖鋁中加入1ml人胰島素制劑(Humulin RShionogiPharmaceutical Co.，Ltd.)，將該混合物充分混合。然后將該混合物減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約1.2mg)的硬脂酸鈣，獲得了粉末樣本。將含有約25IU人胰島素的40mg粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例37制備胰島素/碳酸鈣的藥物組合物向120mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入1ml人胰島素制劑(Humulin RShionogi Pharmaceutical Co.，Ltd.)，將該混合物充分混合。然后將該混合物減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約1.2mg)的硬脂酸鈣，獲得了粉末樣本。將含有約25IU人胰島素的40mg粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
制備實施例38制備含有Domyo-ji粉(1.0％)的胰島素/碳酸鈣的藥物組合物向120mg碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入1ml人胰島素制劑懸浮液(Humulin RShionogi Pharmaceutical Co.，Ltd.)和1.2mg Domyo-ji粉，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物減壓干燥過夜，讓干燥的產物過180μg的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約1.2mg)的硬脂酸鈣，獲得了粉末樣本。將含有約25IU人胰島素的40mg粉末樣本填充到#2膠囊中以制備經鼻吸收用藥物組合物。
實施例6作為添加劑的淀粉的粒徑對藥物組合物經鼻吸收的影響本實施例測試作為含有GLP-1(7-36)NH2的藥物組合物的添加劑的淀粉的粒徑對經鼻吸收的影響，其中使用大鼠中血糖水平的下降作用作為指數(shù)。使用下列兩種具有不同平均粒徑的細粉淀粉作為本實施例組合物的添加劑。
玉米淀粉平均整體粒徑(d50)13.3μm中央分布14μm分布范圍5.5μm-30μm馬鈴薯淀粉平均整體粒徑(d50)37.7μm
中央分布45μm分布范圍5.5μm-105μm用戊巴比妥將重約300g的雄性CD(SD)大鼠麻醉。向吸移管(GPS-250，RAININ)的尖端前邊緣中填充3mg通過下文描述的制備實施例制得的藥物組合物(含有約90μg多肽)，將尖端放在注射器中，然后將組合物與1ml空氣一起在大鼠鼻腔中噴霧。在組合物經鼻給藥后5分鐘，在大鼠的尾部靜脈內施用0.5g/kg葡萄糖。在組合物經鼻給藥后15分鐘(施用葡萄糖后10分鐘)，從主動脈采集血樣。使用血糖水平測定儀器(FREESTYLE-KISSEI；KISSEI Pharmaceutical Co.，Ltd.)測定血糖水平。
結果如下表1所示。從這些結果中可以看出，沒有施用GLP-1(7-36)NH2的對照組的血糖水平為196mg/dl(3只大鼠的平均值)。施用不含添加劑、含5％玉米淀粉和5％馬鈴薯淀粉的含有GLP-1(7-36)NH2的組合物的組的血糖水平分別為170mg/dl、157mg/dl和182mg/dl。這些血糖水平低于沒有施用GLP-1(7-36)NH2的對照組的血糖水平。
與使用具有較大粒徑的馬鈴薯淀粉的組相比，在使用具有較小粒徑的玉米淀粉的組中觀察到了更好的增強GLP-1(7-36)NH2吸收的效果。
從表11中可清楚地看出，當使用具有較小粒徑的載體時，可獲得優(yōu)良的GLP-1(7-36)NH2的經鼻吸收，而具有較大粒徑的淀粉沒有表現(xiàn)出明顯的吸收增強效果。
表11淀粉粒徑對于GLP-1(7-36)NH2的降低血糖水平活性的影響
制備實施例39制備不含添加劑的藥物組合物將相當于90.2mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約108mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2與2.86g碳酸鈣混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約30mg)的硬脂酸鈣，獲得了2.95g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有92μg GLP-1(7-36)NH2的3mg粉末樣本。
制備實施例40制備含有玉米淀粉(5.0％)的藥物組合物向約2.71g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入約150mg玉米淀粉(平均粒徑13.3μm)并充分混合，然后加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于89.2mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約107mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約29mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.90g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有92μgGLP-1(7-36)NH2的3mg粉末樣本。
制備實施例41制備含有馬鈴薯淀粉(5.0％)的藥物組合物向約2.71g碳酸鈣(平均粒徑53.6μm)中加入約150mg馬鈴薯淀粉(平均粒徑37.7μm)并充分混合，然后加入純化水，將該混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，過180μm的篩，獲得干燥的產物。將相當于89.5mg GLP-1(7-36)NH2的一定量(約107mg)的作為肽組分的GLP-1(7-36)NH2粉末與上面獲得的干燥的產物混合。將該混合物充分混合后，加入含有0.3mg苯扎氯銨的溶液，然后加入純化水，將所得混合物捏合。捏合后，將該混合物在冷凍干燥器中減壓干燥過夜，將該干燥的產物過180μm的篩。向該過篩的混合物中混合入相當于總重量的1.0％的一定量(約29mg)的硬脂酸鈣，獲得了約2.88g粉末樣本。通過反相HPLC測定粉末樣本中的GLP-1(7-36)NH2含量，制得了作為經鼻吸收用藥物組合物的含有93μgGLP-1(7-36)NH2的3mg粉末樣本。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明提供了新型經鼻吸收用藥物組合物，其中含有生物活性多肽，不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和能將多肽均勻分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。本發(fā)明藥物組合物改善了生物活性多肽的吸收性，特別是改善了等電點為7或低于7，由此具有低的溶液穩(wěn)定性，難以通過包括口服給藥在內的任何其它非注射途徑給藥的生物活性多肽的吸收性。
因此，本發(fā)明經鼻吸收用藥物組合物使得能夠經鼻施用或經鼻粘膜施用尚待確立可行非注射給藥途徑的粉末組合物形式的胰島素分泌促進性多肽。這樣，本發(fā)明組合物提高了多肽的生物利用度，并因此可用作臨床有效的藥物。所以本發(fā)明藥物組合物具有顯著的醫(yī)藥影響。
權利要求
1.經鼻吸收用藥物組合物，其中包含等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽，不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和用于將多肽分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。
2.權利要求1的經鼻吸收用藥物組合物，其中包含等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽，不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和平均粒徑為1μm-20μm的用于將多肽分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。
3.權利要求1或2的經鼻吸收用藥物組合物，其中包含等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽，不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和不溶于水或者在水中的溶解度很小、平均粒徑為1μm-20μm的用于將多肽分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。
4.權利要求1、2或3的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體是多價金屬化合物。
5.權利要求4的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述多價金屬化合物是鋁化合物、鈣化合物、鎂化合物、硅化合物、鐵化合物或鋅化合物。
6.權利要求5的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述鋁化合物選自干燥的氫氧化鋁凝膠、氯化氫氧化鋁、合成硅酸鋁、輕質氧化鋁、膠態(tài)水合硅酸鋁、氫氧化鎂鋁、氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、硫酸鋁、二羥基乙酸鋁、硬脂酸鋁、天然硅酸鋁、一硬脂酸鋁和硫酸鋁鉀。
7.權利要求5的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述鈣化合物選自磷灰石、羥磷灰石、碳酸鈣、乙二胺四乙酸鈣二鈉、氯化鈣、檸檬酸鈣、甘油磷酸鈣、葡糖酸鈣、硅酸鈣、氧化鈣、氫氧化鈣、硬脂酸鈣、三代磷酸鈣、乳酸鈣。泛酸鈣、油酸鈣、棕櫚酸鈣、D-泛酸鈣、藻酸鈣、無水磷酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣、乙酸鈣、糖酸鈣、硫酸鈣、磷酸一氫鈣、對氨基水楊酸鈣和生物鈣化的化合物。
8.權利要求5的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述鎂化合物選自L-天冬氨酸鎂、氯化鎂、葡糖酸鎂、硅酸鋁鎂、硅酸鎂、氧化鎂、氫氧化鎂、硬脂酸鎂、碳酸鎂、正硅酸鋁鎂、硫酸鎂、硅酸鈉鎂和合成的硅酸鈉鎂。
9.權利要求5的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述硅化合物選自水合二氧化硅、輕質無水硅酸、合成水滑石、硅藻土和二氧化硅。
10.權利要求5的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述鐵化合物是硫酸鐵。
11.權利要求5的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述鋅化合物選自氯化鋅、硬脂酸鋅、氧化鋅和硫酸鋅。
12.權利要求4-11任一項的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述多價金屬化合物的平均粒徑為100μm或更小。
13.權利要求12的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述多價金屬化合物的平均粒徑為20-60μm。
14.權利要求1-13任一項的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述酸性生物活性多肽選自降鈣素、katacalcin、膽囊收縮素-12、膽囊收縮素-8、促腎上腺皮質素-促脂解素前體、促腎上腺皮質素樣中間肽、促脂解素-β、促脂解素-γ、促黑素-β、促腎上腺皮質素釋放素、內皮素-1、內皮素-2、內皮素-3、galanin信使相關肽、胃泌素-71、胃泌素-34、胃泌素-17、胃抑制多肽、腸高血糖素相關多肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-1酰胺、胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺、胰高血糖素樣肽-1(7-37)、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-37)、[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)、胰高血糖素樣肽-1(9-36)酰胺、胰高血糖素樣肽-1(9-37)、胰高血糖素樣肽-2、exendin-3、exendin-4、胰島素β-鏈、胰島素α-鏈、胰島素、原促性腺素釋放素-I、促性腺素釋放素-II、促性腺素釋放素相關肽-I、神經調節(jié)肽C、胰島素樣蛋白(INSL)A-鏈、促胃動素相關肽E、亮氨酸-腦啡肽、蛋氨酸-腦啡肽、leumorphin、催產素、后葉激素運載蛋白-1、后葉激素運載蛋白-2、copeptin、神經調節(jié)肽B、神經調節(jié)肽N、神經肽Y、神經肽AF、PACAP相關肽、胰腺激素、pancreatic icosapeptide、肽YY、tyroliberin、neuroquinine A、urocortin、硬骨魚緊張肽II、腸肽(PHM-27)和腸肽-42。
15.權利要求14的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述酸性生物活性多肽選自胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-1酰胺、胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺、胰高血糖素樣肽-1(7-37)、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-37)、[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?}]-GLP-1(7-37)、胰高血糖素樣肽-1(9-36)酰胺、胰高血糖素樣肽-1(9-37)、胰高血糖素樣肽-2、exendin-3、exendin-4、胰高血糖素、胃抑制肽、胰島素及其衍生物。
16.權利要求1-13任一項的經鼻吸收用藥物組合物，其中包含肽腸降血糖素，不溶于水或者在水中的溶解度很小的載體，和用于將該肽分散和包埋在所述載體表面上的添加劑。
17.權利要求16的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述肽腸降血糖素選自胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-1酰胺、胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺、胰高血糖素樣肽-1(7-37)、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺、[Val8]-胰高血糖素樣肽-1(7-37)、[Lys26，ε-NH{γ-Glu(N-α-棕櫚?；?)]-GLP-1(7-37)、胰高血糖素樣肽-1(9-36)酰胺、胰高血糖素樣肽-1(9-37)、胰高血糖素樣肽-2、exendin-3、exendin-4、胰高血糖素、胃抑制肽、胰島素及其衍生物。
18.權利要求1-17任一項的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述添加劑是選自下列的淀粉支鏈淀粉、直鏈淀粉或含有任何比例的支鏈淀粉和直鏈淀粉的混合物。
19.權利要求1-18任一項的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述添加劑是米粉、稻米淀粉、稻米β-淀粉(非粘性稻米型)、稻米β-淀粉(粘性稻米型)、預膠化稻米淀粉(非粘性稻米型)、預膠化稻米淀粉(粘性稻米型)、玉米淀粉、玉米β-淀粉(非粘性稻米型)、玉米β-淀粉(粘性稻米型)、預膠化玉米淀粉(非粘性稻米型)、預膠化玉米淀粉(粘性稻米型)、馬鈴薯淀粉、馬鈴薯β-淀粉(非粘性稻米型)、預膠化馬鈴薯淀粉(非粘性稻米型)、預膠化小麥淀粉(非粘性稻米型)或它們的部分預膠化淀粉。
20.權利要求1-19任一項的經鼻吸收用藥物組合物，其中所述添加劑是低聚糖、羧基乙烯基聚合物、聚維酮、羥丙基纖維素、黃原膠、果膠、藻酸鈉、阿拉伯膠粉末或明膠。
21.藥物組合物，它含有權利要求1-20任一項的經鼻吸收用藥物組合物，還含有DPP-IV抑制劑。
22.權利要求21的藥物組合物，其中所述DPP-IV抑制劑是diprotin A、桿菌肽或isoleucine thiazolidide。
全文摘要
本發(fā)明提供了經鼻吸收用藥物組合物，當在鼻腔內給藥(經鼻給藥)時，包含在所述組合物中的生物活性多肽具有優(yōu)良的吸收性。更具體來說，經鼻吸收用藥物組合物，其中通過使用添加劑，使得等電點為7或低于7的酸性生物活性多肽被均勻地分散或包埋在不溶于水或難溶于水的多價金屬化合物載體上，例如二價或更高價金屬化合物，例如鋁化合物、鈣化合物、鎂化合物、硅化合物、鐵化合物或鋅化合物，由此多肽可被分散或包埋在載體表面內。
文檔編號A61K38/28GK1596120SQ02823529
公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月26日 優(yōu)先權日2001年11月26日
發(fā)明者南竹義春, 塚田佳夫, 金井靖, 柳川明 申請人:第一三得利制藥株式會社