專利名稱：松果提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及松果提取物的制備，松果提取物自身及其應(yīng)用，特別是作為佐劑在脊椎動(dòng)物的接種或治療中的應(yīng)用，以及作為促進(jìn)血細(xì)胞分化的活性劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著研究人員對(duì)于脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的了解不斷增多，人們正在不斷地尋找用以利用和具體采用免疫系統(tǒng)來(lái)預(yù)防和對(duì)抗疾病的方法。由于免疫系統(tǒng)超常的易變性，這類方法原則上提供了對(duì)于具有足夠大小的任何物質(zhì)起反應(yīng)的可能性。因此，已作了很多嘗試來(lái)建立癌癥、細(xì)菌和病毒感染的接種和/或免疫治療方法。
這樣的治療或接種方法通常是把欲治療的生物體暴露于(體內(nèi)治療)抗原性物質(zhì)的疫苗制劑，以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。特別是，使用抗原性物質(zhì)(抗原)來(lái)引發(fā)能夠探測(cè)到抗原性物質(zhì)自身或其部分(表位)的免疫球蛋白和/或細(xì)胞毒性噬吞細(xì)胞的產(chǎn)生，由此它們變得可迅速被免疫系統(tǒng)識(shí)別。具有如此性質(zhì)的抗原變得可被迅速識(shí)別，并且可以被滅活或破壞，例如被攝入到T細(xì)胞內(nèi)，之后被分解，或者被包含抗原的細(xì)胞破壞。
類似的接種或治療方法是從欲治療的生物體中提取淋巴細(xì)胞，特別是淋巴干細(xì)胞，把提取的細(xì)胞暴露于抗原，由此誘導(dǎo)能夠探測(cè)到抗原的免疫球蛋白的產(chǎn)生，然后把能產(chǎn)生免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞再輸入到欲治療的生物內(nèi)(體外治療)。
術(shù)語(yǔ)“接種”是指通過(guò)產(chǎn)生、提高或維持免疫系統(tǒng)對(duì)與疾病或疾患有關(guān)的抗原起反應(yīng)的能力，來(lái)治療脊椎動(dòng)物，以主要是預(yù)防疾病或病患。術(shù)語(yǔ)“治療”是指在疾病或病患的首次發(fā)作之后，產(chǎn)生、提高或維持免疫系統(tǒng)對(duì)與疾病或疾患有關(guān)的抗原起反應(yīng)的能力，因此在性質(zhì)上是治療的。接種治療中的活性組分稱為“疫苗”，而治療性治療中的活性組分稱為“藥物”。術(shù)語(yǔ)“接種”和“治療”可互換使用，術(shù)語(yǔ)“疫苗”和“藥物”亦是如此。
過(guò)去十年當(dāng)中最重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一是確定了被人T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。關(guān)于其綜述可參見(jiàn)例如Robbins和Kawakami“被T細(xì)胞識(shí)別的人腫瘤抗原”，Current 0pinion in Immunology 1996，8628-636；Rosenberg SA，“基于編碼癌抗原的基因的癌癥免疫治療的新紀(jì)元”，Immunity 1999，10281-287；Van den Eynde BJ和van der Bruggen P，“T細(xì)胞確定的腫瘤抗原”，Current Opinion inImmunology 1997，9684-693。廣泛認(rèn)為T(mén)AA的鑒定和分子特征確定能夠提供產(chǎn)生癌疫苗的手段。
目前在發(fā)明這類疫苗方面的努力是基于核酸介導(dǎo)的免疫技術(shù)，即將一個(gè)或多個(gè)抗原編碼序列(例如TAA編碼序列)插入到合適的表達(dá)(宿主)載體中，這樣的載體能夠引起抗原編碼序列直接在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)。在下文中，術(shù)語(yǔ)“序列”是指特征在于其核苷酸序列的核酸，其中核酸是包含一個(gè)或多個(gè)選自下列的核苷酸的任何分子腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或其功能同等物例如肌苷和次黃嘌呤，其中每個(gè)核堿基連接在包含戊糖例如核糖和/或脫氧核糖，其它糖或氨基酸的骨架上，并且其中各個(gè)骨架通過(guò)例如磷酸二酯鍵、肽鍵或其它合適的連接/連結(jié)手段彼此連接/連結(jié)在一起。核酸的實(shí)例是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。常用的宿主載體是細(xì)菌和病毒或者細(xì)菌和病毒基因組。最近的研究已經(jīng)表明，對(duì)于疫苗制劑，并不總是需要細(xì)胞或包囊的載體。用“裸”質(zhì)粒DNA和/或用RNA，即用沒(méi)有任何其它結(jié)構(gòu)組分例如蛋白、脂質(zhì)或糖類的核酸進(jìn)行免疫接種，可引起強(qiáng)有力的細(xì)胞和抗體反應(yīng)。因此，也稱為重組疫苗的核酸疫苗是這樣的疫苗，其中宿主載體的基因組整合—經(jīng)常是異源的—編碼免疫原(抗原)的核酸序列、與基于細(xì)胞的疫苗或細(xì)胞裂解物相比，重組疫苗具有很多優(yōu)點(diǎn)，最顯著的優(yōu)點(diǎn)可能是，它們可使免疫反應(yīng)集中于抗單一、特異性抗原例如TAA，由此限制了釋放出對(duì)抗存在于正常組織和腫瘤細(xì)胞中的迄今為止仍未知的抗原的失控自身免疫攻擊的可能性。
目前接種和治療成功在不同疾患之間，甚至對(duì)于相同疾患，在所治療的患者之間具有很大差異。此外，接種不能總是長(zhǎng)時(shí)間令人滿意，但是可能在數(shù)周內(nèi)逐漸減弱。對(duì)于可特別包括施用活體或滅活疫苗的多種其它接種方法，也存在這些缺陷。疫苗通常不能總是通過(guò)自身來(lái)產(chǎn)生合適且有效的免疫反應(yīng)。
當(dāng)與特異抗原一起施用時(shí)，一些物質(zhì)將提高對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。滅活或純化的抗原疫苗中通常包括這樣的物質(zhì)(佐劑)。常用佐劑的實(shí)例有鋁鹽、脂質(zhì)體和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、完全和不完全弗氏佐劑、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子例如白介素(IL)2、IL-12和干擾素(IFN)γ。
雖然某些佐劑非常適于與特異抗原或疫苗聯(lián)合使用，但是它們可能在其它組合中不起作用，或者它們自身對(duì)于脊椎動(dòng)物例如人可能有毒性，促進(jìn)不良的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，不穩(wěn)定，或者很昂貴和/或制備復(fù)雜。
因此，用于接種和治療脊椎動(dòng)物疾病和疾患的改進(jìn)的方法將非常有用。
另一個(gè)方面是，對(duì)于科學(xué)目的，經(jīng)常需要產(chǎn)生特定細(xì)胞類型，以例如用于組織培養(yǎng)。在研究所需的細(xì)胞類型當(dāng)中，有樹(shù)狀細(xì)胞和最近發(fā)現(xiàn)的纖維細(xì)胞。
樹(shù)狀細(xì)胞是有效的抗原呈遞細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，它們還起混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的刺激劑的作用，經(jīng)由組織選擇性地遷移，攝取、加工和呈遞抗原，以及作為信使細(xì)胞引起移植組織的排斥反應(yīng)。關(guān)于綜述參見(jiàn)例如Hart DNJ“樹(shù)狀細(xì)胞控制初次免疫反應(yīng)的獨(dú)特白細(xì)胞群體”，Blood，1997，903245-3287。顯然，在希望正確識(shí)別抗原和產(chǎn)生免疫反應(yīng)的任何領(lǐng)域，樹(shù)狀細(xì)胞的研究提供了可能的應(yīng)用。這樣的領(lǐng)域是例如移植用藥物，接種，癌癥以及與抗原呈遞有關(guān)的其它疾病的治療，自身免疫性疾病的預(yù)防和治療等，參見(jiàn)例如Dallal RM和Lotze MT，“樹(shù)狀細(xì)胞和人癌癥疫苗”，Current Opinion in Immunology，2000，12583-588。然而，對(duì)樹(shù)狀細(xì)胞及其分化的了解尚不充分。因此希望有能制備樹(shù)狀細(xì)胞的方法。
目前生成樹(shù)狀細(xì)胞的方法依賴于從外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞、骨髓細(xì)胞或其它CD34+細(xì)胞分化，這是通過(guò)將這樣的細(xì)胞暴露于包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、腫瘤壞死因子α(TNFa)、腫瘤生長(zhǎng)因子β(TGFβ)和IL-4的多種細(xì)胞因子組合而實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于綜述可參見(jiàn)例如Strunk D等人，“從循環(huán)CD34+造血祖細(xì)胞生成人樹(shù)狀細(xì)胞/朗氏細(xì)胞”，Blood，1996，871292-1302和SoligoD等人，“在靜態(tài)和連續(xù)灌注培養(yǎng)物中擴(kuò)展衍生自人CD34+細(xì)胞的樹(shù)狀細(xì)胞”，British Journal of Hematology，1998，101352-363。同樣，已經(jīng)從CD14+血液?jiǎn)魏思?xì)胞中制備了樹(shù)狀細(xì)胞，并描述了不同的成熟階段。關(guān)于綜述參見(jiàn)Winzler C等人，“在依賴于生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)期培養(yǎng)基中鼠樹(shù)狀細(xì)胞的成熟階段”，Journal of Experimental Medicine，1997，185317-328以及Crawford和Chester的US專利US6,194,204 B1。仍然，目前的方法依賴于昂貴且不穩(wěn)定的細(xì)胞因子培養(yǎng)基組分。另外，目前制備樹(shù)狀細(xì)胞的方法的收率通常非常低而不能令人滿意。
纖維細(xì)胞是最近描述的特征在于其不同表型(膠原+，CD34+)的細(xì)胞類型，其通常也是波形蛋白+(vimetin+)、CD13+和CD45+。據(jù)報(bào)道，它們迅速?gòu)难褐羞M(jìn)入皮下移植的傷口室中。它們通常還存在于結(jié)締組織疤痕中，并且可能在傷口修復(fù)和病理性纖維變性反應(yīng)中起重要作用。關(guān)于綜述可參見(jiàn)例如Bucala R等人，“循環(huán)的纖維細(xì)胞限定可介導(dǎo)組織修復(fù)的新的白細(xì)胞子群體”，Mol.Med.1994，171-81，以及ChesneyJ和Bucala R，“外周血液纖維細(xì)胞呈遞抗原和介導(dǎo)組織修復(fù)的新的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞”，Biochemical SocietyTransactions，1997，25520-4。象樹(shù)狀細(xì)胞一樣，制備纖維細(xì)胞的方法依賴于昂貴且不穩(wěn)定的細(xì)胞因子培養(yǎng)基組分，并且提供通常令人不滿意的低收率。因此可以理解，一直存在著這樣的需要，即治療脊椎動(dòng)物疾病和疾患的新方法，這樣的治療可利用和采用脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)來(lái)預(yù)防和對(duì)抗現(xiàn)有技術(shù)不能解決的疾病和疾患。此外，還需要產(chǎn)生科學(xué)使用所需的特定細(xì)胞類型。在這方面，本發(fā)明滿足了該需要。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供用于接種和/或治療，特別是改善和提高核酸疫苗和藥物的效果的新方法和物質(zhì)。本發(fā)明提供的方法和物質(zhì)應(yīng)當(dāng)適用于廣譜接種和治療目的。對(duì)于接受治療的脊椎動(dòng)物或健康細(xì)胞，這樣的脊椎動(dòng)物的組織和器官，依據(jù)該本發(fā)明目的的物質(zhì)和方法應(yīng)當(dāng)具有低的毒性或沒(méi)有毒性。本發(fā)明物質(zhì)應(yīng)當(dāng)易于制備、穩(wěn)定且成本低。本發(fā)明接種和/或治療方法還應(yīng)當(dāng)易于進(jìn)行和不需要昂貴的額外設(shè)備。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于制備具有樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞樣表型的細(xì)胞的物質(zhì)和方法。本發(fā)明物質(zhì)應(yīng)當(dāng)易于制備、穩(wěn)定且成本低。本發(fā)明方法應(yīng)當(dāng)以高收率獲得至少一種這些細(xì)胞類型。它們還應(yīng)當(dāng)易于進(jìn)行和不需要昂貴的額外設(shè)備。
本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與免疫治療用疫苗或藥物聯(lián)合使用時(shí)，松果提取物具有優(yōu)良的佐劑特性。本發(fā)明者們還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，松果提取物可誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型分化成具有不成熟和/或成熟樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞表型的細(xì)胞。本發(fā)明者們還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，松果提取物的級(jí)份可特別用于實(shí)現(xiàn)上述目的。
本發(fā)明的目的是提供用于制備松果提取物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)該方法制備的松果提取物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于脊椎動(dòng)物接種和/或治療的系統(tǒng)，其中包括具有疫苗與佐劑或者藥物與佐劑的藥盒；和提供用于給脊椎動(dòng)物施以疫苗接種和/或治療的方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于制備表型不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞的方法。
作為本公開(kāi)內(nèi)容一部分的權(quán)利要求書(shū)指出了本發(fā)明的這些和其它目的，以及表明本發(fā)明新穎性的各種特征。為了更好地理解本發(fā)明、其使用優(yōu)點(diǎn)以及通過(guò)其使用而達(dá)到的特定目的，應(yīng)參見(jiàn)實(shí)施例和實(shí)質(zhì)描述，它們舉例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)述當(dāng)考慮下列詳細(xì)描述時(shí)，本發(fā)明可得到更好的理解，并且除了上述目的之外的目的將變得顯而易見(jiàn)。附圖表示附

圖1方法1的松果提取物的快速蛋白液相色譜法(FPLC)的圖譜；附圖2方法1的松果提取物的吸收光譜；附圖3暴露于不同濃度的方法1的松果提取物的PBMC的相差顯微鏡檢查；附圖4暴露于細(xì)胞因子和方法1的松果提取物的PBMC的相差顯微鏡檢查；附圖5在源自兩個(gè)不同血液供體的PBMC的培養(yǎng)物中，松果提取物引起的細(xì)胞因子生成；附圖6通過(guò)將同種和自身CD3+細(xì)胞與已暴露于方法1松果提取物的不同濃度的CD14+細(xì)胞一起培養(yǎng)而生成的干擾素γ；和附圖7和7a松果提取物對(duì)用DNA疫苗接種的動(dòng)物的CD8+和CD4+脾細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)IFN-γ生成的佐劑影響。
發(fā)明詳述植物作為藥物化合物的主要來(lái)源已有數(shù)千年歷史。已源自植物材料的化學(xué)組分和類似物現(xiàn)在構(gòu)成了臨床應(yīng)用藥物的主要部分。一個(gè)這樣的植物產(chǎn)物源自不同松樹(shù)的松果。
松果提取物以前是已知的。Sakagami H等人在“松果提取物的抗腫瘤、抗病毒和免疫增強(qiáng)活性天然和合成木質(zhì)素相關(guān)材料的可能醫(yī)藥療效”，Anticancer Research，1991，112881-2888中報(bào)道，松果的水粗提物包含能夠誘導(dǎo)人成髓細(xì)胞白血病ML-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，該誘導(dǎo)分化的物質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上非?？焖俚剡w移，并且不能以有用量收集。
除了基于水的粗提取物以外，Sakagami等人在相同出版物中描述了制備和分離松果提取物的方法。松果提取物是通過(guò)用熱水反復(fù)提取Pinus parviflora Sieb.et Zucc的松果，然后用乙醇沉淀來(lái)獲得的。他們還報(bào)道了由此制得的松果提取物的一些級(jí)份可延長(zhǎng)用腹水肉瘤-180細(xì)胞移植的小鼠和用腹水Meth A纖維肉瘤移植的BALB/c小鼠的存活。Sakagami等人還報(bào)道了松果提取物的活性組分是木質(zhì)素。此外，它們推斷天然的和合成的木質(zhì)素可具有免疫增強(qiáng)能力。Sakagami等人還提出，該免疫增強(qiáng)能力至少部分是經(jīng)由T-細(xì)胞激活介導(dǎo)的，雖然也提及了除T-細(xì)胞之外的其它細(xì)胞群體的激活以及隨后的T-細(xì)胞激活也是可能的激活途徑。
美國(guó)專利US 4,985,249(Sakagami，Konno和Nonoyama)公開(kāi)了松果提取物作為抗HIV劑的應(yīng)用。中國(guó)專利摘要CN 1279107(XinYaolu)公開(kāi)了由蓖麻、商陸根、甘草根和松果制得的用于治療AIDS和癌癥的藥物，該藥物是通過(guò)提取商陸毒素、商陸多糖、蓖麻毒蛋白、注射用甘草酸和松果酸性多糖，并將它們制成注射劑和緩釋膠囊來(lái)獲得的。中國(guó)專利摘要CN 1122206(Xiyun Sun和Yinglong Wang)公開(kāi)了通過(guò)固態(tài)發(fā)酵制得的低鹽醬油，其特征是將松仁制劑和香菇提取物制劑作為補(bǔ)充劑加到醬油中。據(jù)其中描述，這樣制得的醬油具有一些癌癥預(yù)防和保健作用。
上述參考文獻(xiàn)沒(méi)有公開(kāi)松果提取物的免疫刺激作用，也沒(méi)有公開(kāi)制備不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞的方法。本發(fā)明的價(jià)值是確立了松果提取物在這樣的應(yīng)用中的實(shí)用性。
本發(fā)明所涉及的松果可以是任何種類和松屬變種，尤其是表1中列出的那些，但不限制該表分類的正確性。優(yōu)選的松果是火炬松(P.taeda)(火炬松)、濕地松(P.elliottii)(沼澤松)和長(zhǎng)葉松(P.palustris)(長(zhǎng)葉松)的松果。本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一般的松果和優(yōu)選種類的松果特別含有可用于接種和/或治療方法的物質(zhì)和組成(活性組分)，同樣也包含可用于制備樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞的物質(zhì)和組成。它們還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與Sakagami等人(上文)的意見(jiàn)相反，對(duì)于松果提取物的令人滿意的佐劑特性，特別是在核酸接種和/或治療方法中，松果提取物的木質(zhì)素級(jí)份是必需的，但是不足夠。
表1產(chǎn)生可用于制備松果提取物的松果的松樹(shù)
本發(fā)明一個(gè)方面提供了制備松果提取物的方法。該方法可分成兩個(gè)階段，下文中稱為方法1和方法2。
方法1需要用含有氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料進(jìn)行熱提取。一旦萃取了松果材料，即除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物。獲取所得水溶液(上清液)，將其pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0，以獲得方法1的提取物。
方法2使用通過(guò)方法1獲得的提取物(上清液)。在方法2中，將方法1的提取物(溶液)施以進(jìn)一步過(guò)濾，以獲得保留級(jí)份。通過(guò)離心過(guò)濾操作，除去了小于30kDa的顆粒物。保留在濾器上面的是大于30kDa的顆粒物，該保留級(jí)份是優(yōu)選方法(方法2)的松果提取物。
對(duì)于上述方法的目的，松果可以呈松果材料碎片的形式。這樣的松果材料是優(yōu)選的，因?yàn)橛兄陔S后的提取。其還可以商購(gòu)獲得，并在幾批中保持足夠穩(wěn)定和一致的組成。
在使用上述本發(fā)明方法之前，可將松果洗凈。這可優(yōu)選通過(guò)用去離子水洗滌松果(或松果材料)來(lái)進(jìn)行。
在水提取之前將松果(或松果材料)脫脂。脫脂優(yōu)選通過(guò)用乙醇洗滌松果，然后將洗滌的松果或碎片干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)。可將脫脂的松果在封閉的容器中于室溫貯藏。
在提取步驟之前，優(yōu)選將脫脂的松果研磨成小顆粒。該處理有助于釋放出活性組分。粒徑優(yōu)選應(yīng)當(dāng)為80-120目。
用于熱提取松果的溶劑是包含氫氧化鉀(KOH)的水溶液。該溶液包含至少0.25％w/w氫氧化鉀，優(yōu)選包含0.5-2％w/w氫氧化鉀，更優(yōu)選包含1％w/w氫氧化鉀。本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，采用這些濃度的氫氧化鉀，可獲得特別有效的提取物。溶劑的pH優(yōu)選為至少8，更優(yōu)選為至少10，最優(yōu)選為11-13。
松果材料的提取是這樣進(jìn)行的將溶劑加到松果中，將該混合物加熱，優(yōu)選加熱至80℃(176°F)或以上的溫度。本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)讓溶劑沸騰時(shí)，提取可適宜地快速并以足夠的提取速度來(lái)進(jìn)行。特別優(yōu)選通過(guò)高壓釜法，即在121℃提取松樹(shù)材料。這樣可實(shí)現(xiàn)特別迅速、溫和和完全的活性組分提取。
提取后，方便起見(jiàn)，讓該混合物冷卻至，優(yōu)選冷卻至室溫。如果需要的話，在進(jìn)一步加工之前，可將該混合物在冰箱中貯藏12小時(shí)。
然后將平均粒徑大于0.20μm的顆粒物從混合物中除去。這可通過(guò)任何顆粒分離方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別適宜和有效的方法是兩步法，其中在第一個(gè)步驟中通過(guò)過(guò)濾除去粗顆粒物，然后通過(guò)離心，優(yōu)選在4℃±2℃離心來(lái)除去剩余的不需要的顆粒物。
然后處理所得除去顆粒的混合物，以將pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0。這優(yōu)選通過(guò)用1N HCl滴定直至混合物的pH為7.0來(lái)進(jìn)行。然后可將該混合物分配到包裝裝置內(nèi)。
調(diào)節(jié)pH后，可將該混合物滅菌。優(yōu)選通過(guò)在121℃以液相循環(huán)高壓釜處理20分鐘來(lái)進(jìn)行。還可以施用其它滅菌技術(shù)例如輻射等。
調(diào)節(jié)pH和任選滅菌后，可將該混合物(方法1的PCE)貯藏。通過(guò)在低溫貯藏，優(yōu)選在4℃或以下溫度貯藏，甚至更優(yōu)選以冷凍狀態(tài)貯藏，最優(yōu)選在-20℃貯藏，可最好地保證長(zhǎng)期貯藏穩(wěn)定性。然而，優(yōu)選根本不貯藏該混合物，而是立即使用。
調(diào)節(jié)pH和任選滅菌后，使用Millipore Ultrafree Centrifugal濃縮器(Ultrafree-15，30,000mw截止分子量)對(duì)上述提取物施以進(jìn)一步的過(guò)濾，以除去小于30kDa的物質(zhì)。優(yōu)選將其以2000×g離心60分鐘以過(guò)濾溶液，并收集平均分子量不小于30kDa的保留級(jí)份。
然后使用pH為6.0-8.0的10mM氫氧化鉀水溶液，將含有平均分子量大于30kDa的物質(zhì)的保留級(jí)份調(diào)至其初始體積。特別優(yōu)選在pH為7.0的10mM氫氧化鉀水溶液中將保留級(jí)份調(diào)至其初始體積?？筛鶕?jù)所需的保留級(jí)份的濃度來(lái)調(diào)節(jié)氫氧化鉀溶液的體積。
最后可將溶液滅菌，優(yōu)選通過(guò)經(jīng)由0.2μm濾器過(guò)濾來(lái)滅菌。同樣可施用其它滅菌技術(shù)。
經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的過(guò)濾和任選滅菌濃縮后，所得方法2的松果提取物就可以使用了。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于接種和/或治療的系統(tǒng)。適于治療或接種的脊椎動(dòng)物是任何脊椎動(dòng)物。優(yōu)選的脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，包括人、猿、狗、貓、兔子、山羊、豚鼠、倉(cāng)鼠、牛、馬、綿羊、小鼠和大鼠。這些脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的一般特性足夠類似，這樣在一個(gè)物種中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以以合理的可信度推到其它物種。
用于接種和/或治療的系統(tǒng)包括組合物或藥盒，所述組合物或藥盒包含a)疫苗或藥物，和b)佐劑，其中所述佐劑包含松果提取物。
在認(rèn)識(shí)到松果提取物作為佐劑的用途后，本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，松果提取物的有益佐劑效果不依賴于同時(shí)施用疫苗和松果提取物?？稍谑┯靡呙缁蛩幬镏啊⑵陂g、同時(shí)或之后，將松果提取物施用給脊椎動(dòng)物。因此，本發(fā)明用于接種和/或治療的系統(tǒng)不限于包含疫苗和松果提取物的組合物，還可以是這樣的藥盒，其包含作為分隔實(shí)體的疫苗—任選地還包含松果提取物—與松果提取物。包含疫苗和/或藥物與松果提取物的組合物可特別用于將這兩種組分同時(shí)施用給欲治療的脊椎動(dòng)物。藥盒容許獨(dú)立地施用疫苗(或藥物)和松果提取物。因此，如果在施用疫苗之前將松果提取物施用給脊椎動(dòng)物，藥盒是特別合適的。
疫苗或藥物優(yōu)選是核酸疫苗或藥物。本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，松果提取物在核酸接種或治療方法中是特別有效的佐劑。當(dāng)把核酸疫苗和/或藥物與松果提取物佐劑一起使用時(shí)，可實(shí)現(xiàn)特別高程度的免疫系統(tǒng)的激活免疫。
在另一個(gè)優(yōu)選的本發(fā)明方法中，松果提取物包括通過(guò)方法1(上文)制備的松果提取物，即這樣制得的松果提取物用含有氫氧化鉀的水性溶劑將脫脂研磨的松果材料進(jìn)行熱提取，然后除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，最后將所得溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0。
以該方法制備的松果提取物在接種和治療應(yīng)用中具有特別強(qiáng)的作用。優(yōu)選將這些松果提取物在佐劑中與核酸疫苗或藥物一起使用，這樣松果提取物可提供強(qiáng)的免疫激活性質(zhì)，和提供增強(qiáng)疫苗或藥物所致的免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。制備這樣的松果提取物的優(yōu)選方式見(jiàn)上文。
本發(fā)明藥盒或組合物的特別優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的，其中松果提取物包括通過(guò)方法2制備的松果提取物。結(jié)果是，這樣的松果提取物實(shí)際上是通過(guò)方法1獲得的松果提取物的具30kDa或更大的分子的級(jí)份，其包含刺激免疫系統(tǒng)所需的基本上所有免疫活性組分，或者在體外或體內(nèi)應(yīng)用中，介導(dǎo)對(duì)疫苗或藥物的抗原的免疫反應(yīng)所需的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了接種或治療脊椎動(dòng)物的方法，其中是給脊椎動(dòng)物施用疫苗或藥物。在施用疫苗或藥物后，給脊椎動(dòng)物施用松果提取物。
這樣的方法提供了如上所述的在接種和/或治療上施用松果提取物的優(yōu)點(diǎn)。
疫苗和松果提取物的給藥可通過(guò)多種方法來(lái)進(jìn)行。這些方法當(dāng)中有經(jīng)口和經(jīng)肛門(mén)給藥、經(jīng)皮涂敷、皮下注射、肌內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射。注射可用注射器系統(tǒng)或通常稱為“粒子槍”的裝置來(lái)進(jìn)行。根據(jù)疫苗或藥物的性質(zhì)來(lái)選擇疫苗或藥物的給藥方式。雖然某些疫苗通過(guò)肌內(nèi)注射來(lái)實(shí)現(xiàn)高度免疫，但是其它疫苗優(yōu)選經(jīng)口給藥。
優(yōu)選經(jīng)口或通過(guò)肌內(nèi)注射來(lái)施用松果提取物。這兩種給藥方式都提供了松果提取物的特別顯著的免疫刺激作用，增強(qiáng)了其佐劑性質(zhì)。
出于上述原因，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗或藥物包括核酸疫苗或藥物。
此外，與疫苗或藥物一起施用給脊椎動(dòng)物的松果提取物優(yōu)選為通過(guò)方法1獲得的松果提取物。
這樣的給藥，特別是與核酸疫苗或藥物聯(lián)合給藥有效地利用了上述特定松果提取物的優(yōu)點(diǎn)。
松果提取物特別優(yōu)選包括通過(guò)方法2獲得的松果提取物。上文已描述了這種松果提取物的優(yōu)點(diǎn)。在與核酸疫苗和/或藥物聯(lián)合使用時(shí)，這樣的松果提取物可提供特別長(zhǎng)期的、持續(xù)的、強(qiáng)的接種和/或快速或迅速的疾病/疾患緩解。
依據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于制備表型不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞的方法，所述方法包括將選自下列的細(xì)胞暴露于有效量的松果提取物血液?jiǎn)魏思?xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、CD34+-細(xì)胞、CD14+-細(xì)胞或其混合物。
本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，松果提取物對(duì)于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的分化過(guò)程具有顯著影響。特別是，它們確立了松果提取物可誘導(dǎo)分化成表型不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞。本發(fā)明使得能夠以特別高的收率讓細(xì)胞分化成不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞。以前通過(guò)常用的分化誘導(dǎo)方法例如施用細(xì)胞因子不能實(shí)現(xiàn)這樣的高收率。
通過(guò)將所選細(xì)胞或所選混合物進(jìn)一步暴露于CD3+細(xì)胞，可有利地提高分化。
用于以高收率獲得不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞的松果提取物優(yōu)選為通過(guò)方法1制得的松果提取物。這樣的松果提取物在誘導(dǎo)所希望的分化成表型不成熟或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞方面特別有效。有利地是，可將該分化方法與暴露于CD3+-細(xì)胞聯(lián)合使用來(lái)實(shí)現(xiàn)和保持高的分化收率。
松果提取物特別優(yōu)選為通過(guò)方法2獲得的松果提取物。這樣的方法發(fā)揮了如上所述的松果提取物的固有優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例1制備依據(jù)方法1的松果提取物該實(shí)施例舉例說(shuō)明了依據(jù)方法1的松果提取物(PCE)的制備。
使用購(gòu)自International Forest Company的松果材料碎片例如火炬松(loblolly pine)、濕地松(slash pine)和長(zhǎng)葉松(long leafpine)的松果材料碎片。將5kg松果材料碎片在約10L去離子水中洗滌2次。然后將洗滌的松果材料在10L 95％乙醇中于攪拌下短暫洗滌以脫脂。將松果材料風(fēng)干過(guò)夜，并且如果不立即使用的話，可以在室溫(18-25℃)貯藏。
在混合機(jī)中將洗滌和脫脂的松果材料研磨至粒徑為約80-120目。將600g該研磨的材料置于20L旋轉(zhuǎn)燒瓶中。加入4.5L 1％w/w氫氧化鉀水溶液。用包裹著干酪包布的棉球?qū)康拈_(kāi)口塞住。然后將燒瓶在液相循環(huán)條件下于121℃高壓釜處理(緩慢地排氣)1小時(shí)。高壓釜處理后，讓燒瓶冷卻。如果其中的內(nèi)容物不立即進(jìn)一步加工，可將燒瓶在冰箱中于4℃貯藏。
用在與吸濾瓶(其上施以真空)連接的布氏漏斗上的尼龍網(wǎng)濾器將大顆粒從高壓釜處理的懸浮液中過(guò)濾出來(lái)。通過(guò)在使用JA-10轉(zhuǎn)鼓和相應(yīng)瓶的Beckman中速離心機(jī)中將濾液以8000rpm于4℃離心10分鐘來(lái)除去細(xì)小顆粒。取出上清液并進(jìn)一步加工。
通過(guò)加入1N鹽酸水溶液將離心上清液(提取物)的pH調(diào)節(jié)至7.0。保存10ml該中和的上清液的對(duì)照樣本。
將該中和的提取物分配到500ml玻璃瓶(約400ml/瓶)中。如果不立即使用，將提取物在冰箱中保存。通過(guò)在液相循環(huán)條件下于121℃高壓釜處理20分鐘來(lái)將提取物滅菌。冷卻后，該高壓釜處理的提取物(依據(jù)方法1的提取物)可以使用了?？蓪⑵湓诒渲匈A藏。
實(shí)施例2由實(shí)施例1的松果提取物制備依據(jù)方法2的松果提取物該實(shí)施例舉例說(shuō)明了依據(jù)方法2的松果提取物的制備。
將15ml實(shí)施例1的松果提取物置于無(wú)菌50ml聚丙烯錐形離心瓶(Millipore Ultrafree-15離心濃縮器，F(xiàn)isher cat.no.UFV2 BTK10)中，以2000×g(Eppendorf型5810R離心機(jī))(室溫-4℃)離心1小時(shí)。取出保留級(jí)份并保存。將含有小于30kDa的分子的濾液棄去。
將保留級(jí)份懸浮在pH7.0的10mM氫氧化鉀水溶液緩沖液中，至最終的提取物體積為15ml。
通過(guò)用0.2μm濾器(Nalgene PES membrane，cat.no.124-0020)真空過(guò)濾來(lái)將懸浮的保留級(jí)份(方法2的提取物)滅菌。
滅菌的方法2的松果提取物可以使用了?？蓪⑵湓诒渲匈A藏。
實(shí)施例3實(shí)施例1和2的松果提取物的性質(zhì)該實(shí)施例舉例說(shuō)明了依據(jù)方法1和2的松果提取物的性質(zhì)。
方法1和2的松果提取物是棕色液體。它們可以與水、水和乙醇的混合物以及與丙酮混溶。它們包含多糖和polyphenylpropenoids。主要組分的分子量如表2所示。方法1的松果提取物的快速蛋白液相色譜法(FPLC)的圖譜如附圖1所示。方法1的松果提取物的UV/VIS吸收光譜如附圖2所示。
表2松果提取物主要組分的分子量
實(shí)施例4制備外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞該實(shí)施例舉例說(shuō)明了外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)的制備。
從血沉棕黃層分離外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞。血沉棕黃層是將所獻(xiàn)血單位的全血離心后獲得的白細(xì)胞層。經(jīng)密度梯度收獲PBMC(Histopaque1.077，Sigma Chemical Company)。從該梯度收集PBMC，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，參見(jiàn)Sambrook JC等人，“Molecular CloningALaboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)，pH7.4洗滌。洗滌后，將細(xì)胞懸浮在增強(qiáng)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有如在Moore，GE，Gerner，RE，和Franklin，HA(1967)A.M.A.Vol.199，p.519中所定義的標(biāo)準(zhǔn)RPMI 1640培養(yǎng)基，并且還含有10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和50μM 2-巰基乙醇。將最終的細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2×106個(gè)細(xì)胞/ml。依據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用CD14或CD3微珠(Miltenyi Biotech，Auburn，California)從這些細(xì)胞中分別分離出CD14+和CD3+細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光染色法測(cè)定分離出的細(xì)胞中分別含有95％以上的CD14+和CD3+。
實(shí)施例5將PBMC暴露于松果提取物該實(shí)施例舉例說(shuō)明了通過(guò)將PBMC暴露于松果提取物而引起的形態(tài)改變。
將在增強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基(培養(yǎng)基定義如實(shí)施例4所述)中的細(xì)胞濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml的實(shí)施例4的PBMC以每個(gè)孔100μl細(xì)胞懸浮液的量分配到96孔平底微量滴定板(Nunc)的孔中。將方法1和2的松果提取物(分別是實(shí)施例1和2的松果提取物)加到各孔中，至最終的濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100和300μg/ml。
將細(xì)胞在包含5％CO2的氣氛下于37℃培養(yǎng)最長(zhǎng)達(dá)8天。附圖3顯示了暴露于不同濃度的方法1的松果提取物的PMBC的典型相差顯微鏡照片?？汕宄乜匆?jiàn)與松果提取物濃度大約成正比的細(xì)胞數(shù)目的顯著增加。此外，暴露于松果提取物后，細(xì)胞形態(tài)從圓盤(pán)形狀的PBMC形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闃?shù)狀細(xì)胞形態(tài)；在較高濃度(12.5-100μg/ml)和8天的暴露時(shí)間該作用最明顯，但是以這些濃度在第2天就已經(jīng)可以看見(jiàn)。在暴露于方法1的松果提取物的PBMC與暴露于方法2的松果提取物的PBMC(照片未顯示)之間沒(méi)有明顯不同。
實(shí)施例6細(xì)胞因子與松果提取物對(duì)PBMC的影響該實(shí)施例舉例說(shuō)明了暴露于細(xì)胞因子和松果提取物對(duì)PBMC的影響。
將500μl實(shí)施例4的PBMC(細(xì)胞濃度2×106個(gè)細(xì)胞/ml)分配到第一個(gè)24孔組織培養(yǎng)平板(Nunc)中。然后向每個(gè)孔中加入500μl增強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基(見(jiàn)實(shí)施例4)，其中所加入的培養(yǎng)基樣本包含(＝在所加入的培養(yǎng)基中的濃度而不是終濃度！)無(wú)額外物質(zhì)、200μg/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4、20ng/ml TNFα或200μg/ml方法1的PCE。72小時(shí)(初始培養(yǎng))后，收獲非粘著細(xì)胞，置于第二個(gè)24孔平板中。向這些孔中加入500μl增強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基(見(jiàn)實(shí)施例4)，該培養(yǎng)基中含有濃度為200μg/ml PCE(終濃度100μg/ml PCE)的方法1松果提取物。培養(yǎng)48小時(shí)(第二次培養(yǎng))后，除去非粘著細(xì)胞。將粘著細(xì)胞用PBS(見(jiàn)實(shí)施例4)洗滌，在相差顯微鏡下拍照。
附圖4顯示了暴露于細(xì)胞因子和方法1的松果提取物的PBMC的相差顯微鏡照片。A欄照片表示的是暴露于細(xì)胞因子或PCE 72小時(shí)后的粘著細(xì)胞。B欄照片表示的是通過(guò)第二次培養(yǎng)由初始培養(yǎng)后獲得的非粘著細(xì)胞級(jí)份產(chǎn)生的粘著細(xì)胞。這些照片表明，將PBMC暴露于任一種所試驗(yàn)的細(xì)胞因子后，通過(guò)暴露于PCE，粘著細(xì)胞仍然能夠顯著增加。它們還表明，將PBMC暴露于松果提取物的影響與將PBMC暴露于已知能誘導(dǎo)分化成樹(shù)狀細(xì)胞的細(xì)胞因子組合的影響類似。在方法1的松果提取物與方法2的松果提取物的作用之間沒(méi)有觀察到任何不同。
實(shí)施例7通過(guò)常規(guī)方法產(chǎn)生樹(shù)狀細(xì)胞該實(shí)施例舉例說(shuō)明了通過(guò)暴露于細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)PBMC分化成樹(shù)狀細(xì)胞的常規(guī)方法。
將實(shí)施例4的PBMC在加入下列組分的增強(qiáng)的RMPI 1640培養(yǎng)基(培養(yǎng)基定義如實(shí)施例4所述)中培養(yǎng)5天100ng/ml人GM-CSF(R&DSystems，Minneapolis，cat.no.215 GM-005)和10ng/ml IL-4(R&D Systems，Minneapolis，cat.no.204-IL-005)。然后將細(xì)胞在加入10ng/ml TNFα(R&D Systems，Minneapolis，cat.no.210-TA-010)的如上所述的RMPI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少3天。
實(shí)施例8測(cè)定通過(guò)將PBMC暴露于松果提取物的細(xì)胞因子生成該實(shí)施例舉例說(shuō)明了通過(guò)將PBMC暴露于方法1的松果提取物而引起的細(xì)胞因子生成的改變。
按照實(shí)施例5所述方法，將PBMC暴露于遞增濃度的方法1和松果提取物。然后通過(guò)ELISA分析細(xì)胞因子的生成。使用得自已用遞增劑量的PCE處理的PBMC的48小時(shí)培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行ELISA。依據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明(R&D Systems，Minneapolis，MN)，進(jìn)行檢測(cè)下列細(xì)胞因子的ELISAGM-CSR(cat#DGM00)、IL-1β(cat#DLB50)、IL-6(cat#D6050)和TNFα(cat#DTA50)。具體來(lái)說(shuō)，將100μl培養(yǎng)物上清液加到在ELISA試劑盒中提供的96孔平板的合適的孔中，在室溫培養(yǎng)2小時(shí)。用所提供的洗滌緩沖液將孔洗滌，然后吸干。向孔中加入對(duì)細(xì)胞因子有特異性的生物素化的抗體，在室溫培養(yǎng)2小時(shí)。洗滌這些孔，并吸干。向每個(gè)孔中加入鏈霉抗生物素蛋白綴合的辣根過(guò)氧化物酶，培養(yǎng)20分鐘，然后使用在過(guò)氧化氫中的四甲基聯(lián)苯胺作為底物進(jìn)行檢測(cè)。30分鐘后，通過(guò)加入酸性溶液來(lái)終止該反應(yīng)，使用平板分光光度計(jì)(Molecular Devices，Mountainview，CA)測(cè)定該混合物在450nm的吸收度。
附圖5顯示了在源自兩個(gè)不同血液供體的PBMC的培養(yǎng)物中，松果提取物引起的細(xì)胞因子生成。一個(gè)供體的細(xì)胞因子生成數(shù)據(jù)始終在黑色棒形圖中給出，而其它供體的數(shù)據(jù)在白色棒形圖中給出。這些圖表明了松果誘導(dǎo)產(chǎn)生的GM-CSF(上面左側(cè)圖)、IL-1β(上面右側(cè)圖)、IL-6(下面左側(cè)圖)和TNFα(下面右側(cè)圖)。松果提取物在培養(yǎng)基中的終濃度以μg/ml給出。這些圖表明，在暴露期間，細(xì)胞因于生成的增加與松果提取物濃度大致成正比。本發(fā)明者們不能在培養(yǎng)基中檢測(cè)到IL-4或IL-10(數(shù)據(jù)未顯示)。在暴露于方法1的松果提取物的細(xì)胞與暴露于方法2的松果提取物的細(xì)胞之間，沒(méi)有觀察到細(xì)胞因子表達(dá)的差異。
實(shí)施例9通過(guò)暴露于松果提取物的CD14+細(xì)胞激活原初同種T細(xì)胞該實(shí)施例舉例說(shuō)明了已暴露于方法1的松果提取物的CD14+細(xì)胞激活原初同種CD3+細(xì)胞的能力。
通過(guò)例如依據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，用磁珠(CD14+Miltenyi Biotech，Auburn California，cat# 502-01)從PBMC獲得純的表型樹(shù)狀細(xì)胞群體。
將由此分離的CD14+細(xì)胞分配到6孔組織培養(yǎng)平板(Nunc)的孔中，暴露于含有終濃度為100μg/ml的方法1的松果提取物的如實(shí)施例4所定義的增強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基8天。如實(shí)施例5所述，細(xì)胞分化成表型樹(shù)狀細(xì)胞。
除去剩余的非粘著細(xì)胞。收獲表型樹(shù)狀細(xì)胞(見(jiàn)實(shí)施例5)，轉(zhuǎn)移到新鮮的如實(shí)施例4所定義的增強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，以100μl的體積分配到96孔圓底組織培養(yǎng)板(Nunc)中，使每個(gè)孔中有不同終濃度的表型樹(shù)狀細(xì)胞。
依據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用CD3+微珠(Miltenyi Biotech)獲得原初同種和自身CD3+細(xì)胞。
收獲CD3+細(xì)胞，在如實(shí)施例4所定義的增強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基中以100μl的體積分配到第二個(gè)組織培養(yǎng)板上，使表型樹(shù)狀細(xì)胞的終濃度為每個(gè)孔105個(gè)CD3+細(xì)胞。將混合的細(xì)胞共培養(yǎng)3天。3天后，依據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，通過(guò)ELISA(R&D Systems，Minneapolis，cat.no.DIF50)測(cè)定IFN-γ的濃度。
附圖6顯示了通過(guò)將同種和自身CD3+細(xì)胞共培養(yǎng)而生成的IFN-γ。三角形表示將CD3+細(xì)胞與如實(shí)施例7所述獲得的樹(shù)狀細(xì)胞共培養(yǎng)后的IFN-γ濃度。正方形表示與如上所述的表型樹(shù)狀細(xì)胞(在PCE存在下制得的)共培養(yǎng)后的IFN-γ濃度。菱形表示與僅暴露于培養(yǎng)基的PBMC培養(yǎng)的CD3+細(xì)胞的IFN-γ濃度。通過(guò)實(shí)施例7中描述的方法獲得的樹(shù)狀細(xì)胞在刺激IFN-γ生成方面最有效。通過(guò)上述方法獲得的表型樹(shù)狀細(xì)胞在刺激IFN-γ生成方面比單獨(dú)的培養(yǎng)基顯著更有效，但是不如通過(guò)實(shí)施例7的方法獲得的樹(shù)狀細(xì)胞有效。在使用方法1與2的松果提取物之間沒(méi)有觀察到作用方面的任何顯著不同(數(shù)據(jù)未顯示)。
看上去通過(guò)暴露于松果提取物所獲得的細(xì)胞是表型樹(shù)狀細(xì)胞，不成熟和不完全成熟的樹(shù)狀細(xì)胞。
實(shí)施例10松果提取物在HIV DNA(gag)疫苗模型中的佐劑活性該實(shí)施例舉例說(shuō)明了在DNA接種操作中施用松果提取物的作用。
在各個(gè)四頭肌中給Balb/c小鼠肌內(nèi)注射50μg疫苗DNA，所述疫苗DNA懸浮在50μl PBS中或者懸浮在50μl 40μg/ml方法1的松果提取物組合物中(共注射)。疫苗DNA是表達(dá)HIV gag作為免疫原的質(zhì)粒載體，viz pCIgag。對(duì)照DNA是表達(dá)CAT的質(zhì)粒載體，vizpCICAT。在另一個(gè)治療組中，在實(shí)驗(yàn)期間給Balb/c小鼠在其飲用水中補(bǔ)充200μg/ml松果提取物。還給這些小鼠接種如上所述的質(zhì)粒載體。
接種3周后，給接種的小鼠靜脈內(nèi)注射3×106pfu表達(dá)HIV gag的疫苗表達(dá)載體，注射后3天將小鼠殺死，收獲其脾，通過(guò)常用技術(shù)分離出其脾細(xì)胞，參見(jiàn)Bradley，W.G.，Ogata，N.，Good，R.A.，和N.K.Day；“AlteratiO of in ViVo cytokine gene expressionin mice infected with a molecular clone of the defective MAIDSvirus”，1994，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes.71-9。
將脾細(xì)胞用PBS(見(jiàn)實(shí)施例5)洗滌，通過(guò)低速離心讓其沉淀，然后懸浮在含有2％w/w熱滅活胎牛血清的冰冷的PBS中，在冰上放置15分鐘。將識(shí)別CD4+或CD8+的適當(dāng)抗體和IFN-γ加到細(xì)胞中。將細(xì)胞和抗體在冰上于黑暗中培養(yǎng)30分鐘以標(biāo)記細(xì)胞。然后用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞。將洗滌的細(xì)胞在1ml新制的1％w/w低聚甲醛水溶液中固定。對(duì)于抗原表達(dá)，使用Becton Dickinson FACS Caliber流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析標(biāo)記和固定的細(xì)胞。收集最少10,000個(gè)細(xì)胞用于分析。
附圖7和7a顯示了通過(guò)鼠CD8+和CD4+脾細(xì)胞的INF-γ生成來(lái)測(cè)定的施用松果對(duì)疫苗接種作用的影響。HIV的肽部分p7g是T細(xì)胞，具體來(lái)說(shuō)CD8+T細(xì)胞識(shí)別的刺激劑。重組p24＝gag＝完整的gag蛋白是刺激劑，并且被CD4+T細(xì)胞識(shí)別。CD4+T細(xì)胞對(duì)p24的反應(yīng)最佳。數(shù)據(jù)表明，在接種核酸疫苗期間或之后立即口服和肌內(nèi)施用松果提取物都提高了CD8+細(xì)胞的激活(組“pCIGag/PCE fed”和“pCIGag/PCEcoinj”)。該提高的作用顯著強(qiáng)于施用疫苗(pCIGag)但不施用松果提取物佐劑(組“單獨(dú)的pCIGag”)和對(duì)照“接種”DNA(組“pCICAT/PCEfed”)。同樣，在依據(jù)方法1和方法2獲得的松果提取物之間也沒(méi)有觀察到任何顯著不同。
因此，上面僅舉例說(shuō)明了本發(fā)明的原理。這并不是詳盡或?qū)⒈景l(fā)明限制于所公開(kāi)的具體形式。根據(jù)上面的教導(dǎo)，明顯的改變或變型是可能的。當(dāng)依據(jù)所附權(quán)利要求的范圍對(duì)其進(jìn)行公平、合法、公正的解釋時(shí)，所有這樣的改變和變型都在如權(quán)利要求書(shū)所確定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.制備松果提取物的方法，所述方法包括下列步驟a)用包含氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料熱提?。籦)除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，獲得了上清液；c)將所得上清液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0，其特征在于，所述方法還包括下列步驟d)將上清液過(guò)濾以獲得保留級(jí)份；e)排放出保留級(jí)份，除去平均分子量小于30kDa的顆粒；和f)將保留級(jí)份懸浮在pH為6.0-8.0的包含氫氧化鉀的水溶劑中。
2.通過(guò)權(quán)利要求1的方法制備的松果提取物。
3.用于接種和/或治療的系統(tǒng)，其中包括組合物或藥盒，所述組合物或藥盒包含a)疫苗或藥物，和b)佐劑，其中所述佐劑包含松果提取物。
4.權(quán)利要求3的系統(tǒng)，其中所述疫苗或藥物是核酸疫苗或藥物。
5.權(quán)利要求3的系統(tǒng)，其中所述松果提取物包括通過(guò)包括下列步驟的方法制備的松果提取物a)用包含氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料熱提?。籦)除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，獲得了上清液；和c)將所得水溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0。
6.權(quán)利要求5的系統(tǒng)，其中所述松果提取物包括通過(guò)包括下列步驟的方法制備的松果提取物e)用包含氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料熱提取；f)除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，獲得了上清液；g)將所得上清液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0，其特征在于，所述方法還包括下列步驟h)將上清液過(guò)濾以獲得保留級(jí)份；e)排放出保留級(jí)份，除去平均分子量小于30kDa的顆粒；和f)將保留級(jí)份懸浮在pH為6.0-8.0的包含氫氧化鉀的水溶劑中。
7.接種或治療脊椎動(dòng)物的方法，所述方法包括下列步驟a)給脊椎動(dòng)物施用疫苗或藥物；和b)給脊椎動(dòng)物施用松果提取物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述疫苗或藥物包括核酸疫苗或藥物。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述松果提取物包括通過(guò)包括下列步驟的方法制備的松果提取物d)用包含氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料熱提??；e)除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，獲得了上清液；和f)將所得上清液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述松果提取物包括權(quán)利要求2的松果提取物。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述松果提取物是經(jīng)口給藥、通過(guò)肌內(nèi)注射給藥、通過(guò)吸入給藥或通過(guò)施加在皮膚粘膜上來(lái)給藥。
12.權(quán)利要求7的方法，其中接種或治療所述脊椎動(dòng)物以抗癌癥和/或病毒感染。
13.制備不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞的方法，所述方法包括將選自下列的細(xì)胞暴露于有效量的松果提取物血液?jiǎn)魏思?xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、CD34+-細(xì)胞、CD14+-細(xì)胞或其混合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中還進(jìn)一步包括將所選細(xì)胞或所選混合物暴露于CD3+-細(xì)胞。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述松果提取物包括通過(guò)包括下列步驟的方法制備的松果提取物a)用包含氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料熱提??；b)除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，獲得了上清液；c)將所得水溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述松果提取物包括通過(guò)包括下列步驟的方法制備的松果提取物i)用包含氫氧化鉀的水溶劑將脫脂研磨的松果材料熱提??；j)除去平均粒徑大于0.2μm的顆粒物，獲得了上清液；k)將所得上清液的pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0，其特征在于，所述方法還包括下列步驟l)將上清液過(guò)濾以獲得保留級(jí)份；e)排放出保留級(jí)份，除去平均分子量小于30kDa的顆粒；和f)將保留級(jí)份懸浮在pH為6.0-8.0的包含氫氧化鉀的水溶劑中。
全文摘要
制備松果提取物的方法，和通過(guò)所述方法制備的松果提取物，其中所述松果提取物可用于提高核酸疫苗和藥物的作用，并且可用于制備表型不成熟和/或成熟的樹(shù)狀細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1596117SQ02823532
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月26日
發(fā)明者田中昭子, 約翰·杰西普, 威廉·蓋伊·布雷德利 申請(qǐng)人:田中昭子, 約翰·杰西普, 威廉·蓋伊·布雷德利