專利名稱：雙鏈核糖核酸用于治療正(+)鏈rna病毒感染的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用雙鏈核糖核酸治療正(+)鏈RNA病毒感染的用途，和利用該核糖核酸制備藥物的用途，抑制正(+)鏈RNA病毒復(fù)制的藥物和方法。
從DE 101 00 586 C1中獲知一種抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，其中具有雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核糖核苷酸被引入細(xì)胞。該雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈在此與靶基因互補(bǔ)。
作為遺傳信息的載體，正(+)鏈RNA病毒具有RNA，蛋白質(zhì)合成可直接發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的RNA處。這使得轉(zhuǎn)錄成為不是必要的。除了不翻譯的3’-和5’-區(qū)域，病毒基因組的全長被翻譯成多蛋白。個別的，通過切割，可從多蛋白得到功能活性結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒基因組中，非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)序列位于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)序列之后。非結(jié)構(gòu)的NS3蛋白質(zhì)是帶有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域并顯示NTP酶和解旋酶活性的多功能酶。以前用于治療正(+)鏈RNA病毒感染的手段很少成功，并且多數(shù)感染患者的疾病狀態(tài)并不能得到持續(xù)的改善。
本發(fā)明的任務(wù)是克服現(xiàn)有技術(shù)中的這些缺陷。特別的，得到治療正(+)鏈RNA病毒感染的有效方法。進(jìn)一步的，得到用于治療正(+)鏈RNA病毒感染的藥物以及制備該藥物的用途。進(jìn)一步的，得到抑制正(+)鏈RNA病毒復(fù)制的方法。
該任務(wù)通過權(quán)利要求1，2，16，30和41中的特征描述而解決。優(yōu)選的實施方式得自權(quán)利要求3-15，17-29，31-40和42-53的特征描述。
根據(jù)本發(fā)明的目的是利用雙鏈核糖核酸(dsRNA)治療正(+)鏈RNA病毒感染，其中dsRNA的S1鏈顯示至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及利用該dsRNA制備治療正(+)鏈RNA病毒感染的藥物。
哪些是病毒基因組可翻譯區(qū)的部分并不重要。令人驚奇的，盡管病毒基因組編碼眾多蛋白質(zhì)，當(dāng)使用帶有與病毒基因組可翻譯區(qū)的任意區(qū)段互補(bǔ)的S1鏈的dsRNA時，足夠抑制正(+)鏈RNA病毒的復(fù)制。這種dsRNA可通過RNA干擾的方式永久破壞病毒RNA基因組的完整性。因此，它是理想的適合于治療該病毒感染的。該治療導(dǎo)致疾病狀態(tài)的持續(xù)改善。
正(+)鏈RNA病毒可以是丙型肝炎病毒(HCV)。該領(lǐng)域中的有效治療將是特別重要的，因為目前為止還不可能生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒的有效疫苗。在人類，HCV-感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，特別是經(jīng)慢性肝炎轉(zhuǎn)成肝硬化和肝癌。
在感染的細(xì)胞中，dsRNA促使正(+)鏈RNA病毒的正(+)鏈RNA在上述的區(qū)段的區(qū)域中被酶切割。在切割位點前的沿病毒RNA閱讀方向的區(qū)域仍然能夠翻譯，并且至少部分地能夠?qū)е鹿δ艿鞍踪|(zhì)的產(chǎn)生。這些蛋白的表達(dá)不必受到抑制。在該方法的有利實施方案中，dsRNA能夠抑制編碼自病毒基因組的多蛋白的表達(dá)。隨后也可以發(fā)生部分抑制，即，使得全部多蛋白中只有部分被表達(dá)，或使得表達(dá)的多蛋白的總量減少。
DsRNA優(yōu)選能夠抑制編碼自病毒基因組的功能蛋白酶或解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的表達(dá)。因此，與dsRNA的S1鏈互補(bǔ)的片段可按病毒RNA的閱讀方向置于病毒基因組中編碼解旋酶的區(qū)域中或之前。令人驚奇的，病毒解旋酶表達(dá)的抑制是特別有利的。本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病毒解旋酶的存在減少了dsRNA的復(fù)制抑制作用。由于解旋酶表達(dá)的抑制，dsRNA的作用強(qiáng)于在其他病毒蛋白質(zhì)表達(dá)受抑制的情況中的作用。
DsRNA的互補(bǔ)區(qū)可按照遞升的優(yōu)選順序具有少于25、19-24、20-24、21-23個和特別是具有22或23個核苷酸。具有該結(jié)構(gòu)的dsRNA在治療病毒感染尤其在抑制病毒復(fù)制中特別有效。DsRNA的S1鏈可按照遞升的優(yōu)選順序具有少于30、少于25、21-24和特別是具有23個核苷酸。這些核苷酸的數(shù)目也是dsRNA中可能的堿基對的最大數(shù)目。這種dsRNA在細(xì)胞中是特別穩(wěn)定的。
DsRNA優(yōu)選在dsRNA的至少一個末端具有由1-4，優(yōu)選2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。單鏈突出端降低dsRNA在血液、血清和細(xì)胞中的穩(wěn)定性，同時增加dsRNA的復(fù)制抑制作用。當(dāng)dsRNA只在一個末端，特別是在顯示S1鏈的3’-端的末端具有突出端時，是特別有利的。當(dāng)具有兩個末端的dsRNA的一端是突出端時，則另一個末端是平末端，即缺少突出端。令人驚奇的，已經(jīng)顯示出為了增加dsRNA對復(fù)制的抑制作用，dsRNA的一個末端的突出端已經(jīng)足夠，且不會把穩(wěn)定性降低到兩個突出端所降低的程度。只帶有一個突出端的dsRNA已顯示出其在多種細(xì)胞培養(yǎng)基以及血液、血清和細(xì)胞中的足夠的穩(wěn)定性和特別的有效性。當(dāng)突出端定位在S1鏈的3’-末端時，對病毒復(fù)制的抑制是特別有效的。
優(yōu)選的，dsRNA除了具有S1鏈外還具有S2鏈，即包含兩個單獨的鏈。當(dāng)S1鏈(反義鏈)是23個核苷酸長，S2鏈?zhǔn)?1個核苷酸長，且S1鏈的3’-末端具有由2個核苷酸組成的單鏈突出端時，dsRNA是特別有效的。在此，定位于S1鏈的5’-末端的dsRNA末端是平末端。
dsRNA可以存在于適于口服，或通過吸入、注入或注射，特別是靜脈或腹膜內(nèi)注入或注射方式給藥的制劑中。該制劑可由特別是只由dsRNA和生理可耐受的溶劑，優(yōu)選生理鹽水溶液或生理可耐受的緩沖液組成。該生理上可耐受的緩沖液可以是磷酸鹽緩沖的鹽水溶液。令人驚奇的，已經(jīng)顯示出在這種溶劑或這種緩沖液中簡單溶解并且服用的dsRNA不必被包裝在特殊載體中即能夠被細(xì)胞吸收并且抑制靶基因的表達(dá)或病毒的復(fù)制。
優(yōu)選的，dsRNA存在于生理上可耐受的溶液中，特別是生理上可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，或被膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體、病毒衣殼、類衣殼體或聚合物納膠囊或微膠囊包裹，或與聚合物納膠囊或微膠囊結(jié)合。該生理上可耐受的緩沖液可以是磷酸鹽緩沖的鹽水溶液。膠束結(jié)構(gòu)，病毒衣殼、類衣殼體或聚合物納膠囊或微膠囊能夠促進(jìn)感染細(xì)胞中dsRNA的吸收。聚合物納膠囊或微膠囊由至少一種生物可降解的聚合物如聚丁基氰基丙烯酸酯組成。聚合物納膠囊或微膠囊可將其中含有或與之結(jié)合的dsRNA轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放到機(jī)體內(nèi)。DsRNA可口服或通過吸入、注入或注射，特別是靜脈或腹膜內(nèi)注入或注射的方式服用。
優(yōu)選的，dsRNA以每天每kg體重-按照遞升的優(yōu)選順序排列的-最大5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μg和最適最大25μg的劑量使用。已顯示即使是這種劑量的dsRNA在正(+)鏈RNA病毒感染的治療中仍顯示突出的有效性。
進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及治療正(+)鏈RNA病毒感染的藥物，其中該藥物包含雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中dsRNA的S1鏈具有至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。優(yōu)選的，該藥物以包含至少一個含有一定量的dsRNA的劑量存在，使得按照遞升的優(yōu)選順序排列的最大劑量可以為5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μg和最適為25μg。該劑量單位可以被配制成用于每日服用或攝取一劑。在這種情況下，全部的每日劑量包含在一個單獨的劑量單位內(nèi)。如果該劑量單位被配制成每日服用或攝取幾次，則每劑中含有的dsRNA的量相應(yīng)地減小以達(dá)到每日的總劑量。該劑量單位也可以被配制成為幾天服用或攝取一次的例如使得dsRNA在幾天里被釋放。該劑量單位則相應(yīng)地含有多倍的每日劑量。
進(jìn)一步的，本發(fā)明的目的是一種抑制細(xì)胞中正(+)鏈RNA病毒復(fù)制的方法，其中至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)被引入細(xì)胞，并且其中dsRNA的S1鏈具有至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。本發(fā)明進(jìn)一步涉及dsRNA，其中dsRNA的S1鏈具有與正(+)鏈RNA病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的藥物、方法和dsRNA的進(jìn)一步有利的實施方案，可參見前面的評述。隨后，將利用圖解對本發(fā)明作示范性說明。


圖1顯示在通過NS3-特異性dsRNA的轉(zhuǎn)染，使HCV復(fù)制子模型中HCV-RNA減少的圖解表示。
HCV具有約9600個核苷酸的基因組。它編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)C、E1和E2，以及非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b。由于在細(xì)胞培養(yǎng)物中HCV的分子生物學(xué)分析是很困難的，所以利用非致病取代系統(tǒng)研究了dsRNA對病毒基因序列的作用。為此，新霉素-抗性-介導(dǎo)的新霉素盒取代了編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)C、E1和E2的病毒基因組的一部分。該修飾過的病毒基因組在國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，國家醫(yī)學(xué)圖書館，38A樓，Bethesda，MD 20894，美國，以基因登記號No.AJ242654注冊。將它轉(zhuǎn)染到HuH-7肝細(xì)胞(JCRB0403，日本生物來源細(xì)胞庫研究保存中心，國家健康科學(xué)院，Kamiyoga，1-18-1，Setagaya-ku，東京158，日本)中。它在新霉素類似物G418存在的條件下在細(xì)胞中復(fù)制，而不會形成感染顆粒。使得修飾過的HCV基因組的穩(wěn)定復(fù)制成為可能的該系統(tǒng)(Lohmann等人，科學(xué)Science 285，，第110頁)也被指定為丙型肝炎病毒的“復(fù)制子模型”。
使用的RNA具有被指定為序列表中的序列1至序列4的下列序列dsRNA1相應(yīng)于編碼NS3的區(qū)域的序列
S25’-AGA CAG UCG ACU UCA GCC UGG-3’ (序列1)S13’-GG UCU GUC AGC UGA AGU CGG A-5’(序列2)dsRNA2作為負(fù)調(diào)節(jié)與NS3序列無關(guān)，相應(yīng)于NCBI，登記號No.U55763的pEGFP-C1載體的核苷酸886-909的序列S25’-CUA CGU CCA GGA GCG CAC CA UC-3’ (序列3)S13’-CC GAU GCA GGU CCU CGC GUG GU AG-5’(序列4)在每種情況中，S2代表正義鏈而S1代表反義鏈，即S2鏈的序列與來自HCV的相應(yīng)序列是相同的。
將HuH7細(xì)胞在有1mg/ml的抗生素G418存在下在含有20％胎牛血清的Dulbecco’s修飾過的Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于轉(zhuǎn)染，在六孔板的每孔(3.5cm直徑)中，把80,000個細(xì)胞接種在2ml培養(yǎng)基中。使用“Fugene 6”(目錄號No.1814443)(Roche診斷股份有限公司，Sandhofer Str.116，68305，曼海姆，德國)，根據(jù)附帶的用法說明來輔助轉(zhuǎn)染。為此，把100μl無血清的培養(yǎng)基(SFM)混合到有5μlFugene 6試劑的試劑容器中，并于室溫孵育5分鐘。將3μg dsRNA2(相應(yīng)于約0.1μmol/l終濃度的dsRNA2)，3μg dsRNA1(相應(yīng)于約0.1μmol/l終濃度的dsRNA1)，1.5μg dsRNA1加1.5μg dsRNA2(相應(yīng)于約0.05μmol/l終濃度的dsRNA1)，或300ng dsRNA1加2.7μg dsRNA2(相應(yīng)于約0.01μmol/l終濃度的dsRNA1)每個配備在另外的試劑容器中。在每種情況中，dsRNA1和dsRNA2的貯藏濃度等于20μM(相應(yīng)于約300ng/μl)。將由Fugene 6和SFM組成的混合物逐滴加入至核酸，用移液槍的槍頭小心混合，并于室溫孵育15分鐘。為了轉(zhuǎn)染，將反應(yīng)制備物逐滴加入至細(xì)胞。每個轉(zhuǎn)染至少做兩次，并在至少2個獨立的實驗中證實。
DsRNA對于經(jīng)過修飾的HCV基因組的復(fù)制的作用通過定量PCR的方式得到確定。轉(zhuǎn)染后約36小時，破裂細(xì)胞，對其中含有的RNA根據(jù)生產(chǎn)者的指令用PeqGold RNA純化試劑盒(PEQLAB生物技術(shù)股份有限公司，Carl-Thiersch-Str.2b，91052，Erlangen，德國，訂購號No.30-1010)進(jìn)行分離。
隨后，使用相同量的RNA(100-1000ng)利用Superscript II(Invitrogen股份有限公司，Karlsruhe技術(shù)園，Emmy-Noether-Str.10，76131，Karlsruhe，德國，目錄號18064-014)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。100pmololigo-dT引物或50pmol隨機(jī)引物被用作引物。將10μl RNA(100-1000ng)、0.5μl oligo-dT引物(100pmol)和1μl隨機(jī)引物(50pmol)于70℃孵育10分鐘，再在冰上短時間存放。然后加入7μl逆轉(zhuǎn)錄酶混合物(4μl 5×緩沖液；2μl 0.1mol/l DTT；各1μl每個10mmol/ldNTP)，1μl Superscript II和1μl核糖核酸酶抑制劑RNAsin(Promega股份有限公司，Schildkrotstr.15，68199曼海姆，德國)。將混合物置于25℃10分鐘，42℃1小時，最終70℃15分鐘。
特定的cDNA的量是以按照生產(chǎn)者的指示根據(jù)“TaqMan”方法(PerkinElmer，F(xiàn)redinand-Porsche-Ring 17，63110 Rodgau-Jugesheim，德國)利用光循環(huán)以快速起始DNA模板雜交探針試劑盒(Roche診斷股份有限公司)在“光循環(huán)儀”(Roche診斷股份有限公司)中形成的相同體積的cDNA來進(jìn)行定量的。檢測是通過5’-末端用熒光團(tuán)6’-FAM(羧基熒光素)標(biāo)記和在3’-末端用淬滅劑分子TAMRA(羧基-四-甲基-羅丹明)標(biāo)記的探針進(jìn)行的。熒光團(tuán)受到激發(fā)而將激發(fā)能量傳遞給緊鄰的3’側(cè)的淬滅劑分子。在PCR反應(yīng)的每個延伸期中，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性導(dǎo)致探針的水解，伴隨熒光團(tuán)與淬滅劑分子在空間上的分離。6’-FAM的熒光的淬滅逐漸減少。因此，熒光增加并被定量地測定。
下列是用于HCV NS3-cDNA定量的NS3探針5’-CAT TGT CGT AGC AAC GGA CGC TCT AAT GAC-3’(序列5)NS3引物5’-CCT TGA TGT ATC CGT CAT ACC AAC TAG-3’(序列6)NS3反向引物5’-TGA GTC GAA ATC GCC GGT AA-3’(序列7)進(jìn)一步的，β2-微球蛋白cDNA被定量作為標(biāo)準(zhǔn)。β2微球蛋白(β2-MG)是以穩(wěn)定的量結(jié)構(gòu)表達(dá)的蛋白質(zhì)。下列是用于定量的β2-微球蛋白探針5’-AAC CGT CAC CTG GGA CCG AGA CAT GTA-3’(序列8)β2-微球蛋白引物5’-CCG ATG TAT ATG CTT GCA GAG TTA A-3’(序列9)β2-微球蛋白反向引物5’-CAG ATG ATT CAG AGC TCC ATA GA-3’(序列10)NS3探針和β2-微球蛋白探針分別顯示FAM標(biāo)記于5’-末端和TAMRA標(biāo)記于3’-末端。
HCV NS3 cDNA的量以與β2-MG cDNA的量的比率的形式測定并在圖1中用圖解表示?！皃EGFP”表示通過只用dsRNA2(對照)轉(zhuǎn)染測定的值，“HCV 0.1μmol/l，”“HCV 0.05μmol/l，”和“HCV 0.01μmol/l”表示通過分別用0.1μmol/l、0.05μmol/l和0.01μmol/l的NS3特異的dsRNA1轉(zhuǎn)染確定的值。
在培養(yǎng)基中在0.1μmol/l、0.05μmol/l和0.01μmol/l的終濃度下用dsRNA1轉(zhuǎn)染比用非特異性的對照dsRNA2轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的抑制高大約60倍。
序列表<110>Ribopharma AG<120>雙鏈核糖核酸用于治療正鏈(+)RNA病毒感染的用途<130>422328EH<140>
<141>
<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>1agacagucga cuucagccug g 21<210>2<211>21<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>2aggcugaagu cgacugucug g 21<210>3<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明載體<400>3cuacguccag gagcgcacca uc22
<210>4<211>24<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明載體<400>4gauggugcgc uccuggacgu agcc 24<210>5<211>30<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>5cattgtcgta gcaacggacg ctctaatgac 30<210>6<211>27<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>6ccttgatgta tccgtcatac caactag 27<210>7<211>20<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>7tgagtcgaaa tcgccggtaa 20<210>8<211>27<212>DNA
<213>人<400>8aaccgtcacc tgggaccgag acatgta 27<210>9<211>25<212>DNA<213>人<400>9ccgatgtata tgcttgcaga gttaa25<210>10<211>23<212>DNA<213>人<400>10cagatgattc agagctccat aga 2權(quán)利要求
1.雙鏈核糖核酸(dsRNA)用于治療正(+)鏈RNA病毒感染的用途，其中dsRNA的S1鏈具有至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
2.雙鏈核糖核酸(dsRNA)用于制備治療正(+)鏈RNA病毒感染的藥物的用途，其中dsRNA的S1鏈具有至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述正(+)鏈RNA病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述dsRNA能夠抑制病毒基因組編碼的多蛋白的表達(dá)。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述dsRNA能夠抑制病毒基因組編碼的功能性蛋白酶或解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的表達(dá)。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述病毒RNA的沿閱讀方向的區(qū)段被置于編碼解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的病毒基因組的區(qū)域之中或之前。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域按照遞升的優(yōu)選順序具有少于25、19-24、20-24、21-23和特別是具有22或23個核苷酸。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述S1鏈按照遞升的優(yōu)選順序具有少于30、少于25、21-24和特別是具有23個核苷酸。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述dsRNA在dsRNA的至少一個末端具有由1-4，優(yōu)選2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述dsRNA只在一個末端，特別是在S1鏈顯示3’-端的末端處具有突出端。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述dsRNA除了具有S1鏈外還具有S2鏈，并且S1鏈?zhǔn)?3個核苷酸長，S2鏈?zhǔn)?1個核苷酸長，S1鏈的3’-末端具有由2個核苷酸組成的單鏈突出端，同時位于S1鏈的5’-末端的dsRNA末端是平末端。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述dsRNA存在于適于口服，或通過吸入、注入或注射，特別是靜脈或腹膜內(nèi)注入或注射方式給藥的制劑中。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述制劑特別只由dsRNA和生理上可耐受的溶劑，優(yōu)選生理鹽水溶液或生理上可耐受的緩沖液，特別是磷酸鹽緩沖的鹽水溶液組成。
14.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中所述dsRNA存在于生理上可耐受的溶液中，特別是生理上可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，或被膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體、病毒衣殼體、類衣殼體或聚合物納膠囊或微膠囊包圍，或與聚合物納膠囊或微膠囊結(jié)合。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的用途，其中按照遞升的優(yōu)選順序，所述dsRNA的最大使用劑量為每天每kg體重5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μg和最適為25μg。
16.治療正(+)鏈RNA病毒感染的藥物，其中所述藥物包含雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA的S1鏈具有至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物，其中所述正(+)鏈RNA病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的藥物，其中所述dsRNA能夠抑制病毒基因組編碼的多蛋白的表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18之一的藥物，其中所述dsRNA能夠抑制病毒基因組編碼的功能性蛋白酶或解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19之一的藥物，其中所述病毒RNA的沿閱讀方向的區(qū)段置于編碼解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的病毒基因組的區(qū)域之中或之前。
21.根據(jù)權(quán)利要求16至20之一的藥物，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域按照遞升的優(yōu)選順序具有少于25、19-24、20-24、21-23和特別是具有22或23個核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求16至21之一的藥物，其中所述的S1鏈按照遞升的優(yōu)選順序具有少于30、少于25、21-24和特別是具有23個核苷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求16至22之一的藥物，其中所述dsDNA在dsRNA的至少一個末端具有一個由1-4，優(yōu)選2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的藥物，其中dsRNA只在一個末端，特別是在S1鏈顯示3’-端的末端處具有突出端。
25.根據(jù)權(quán)利要求16至24之一的藥物，其中所述dsRNA除了具有S1鏈外還具有S2鏈，并且S1鏈?zhǔn)?3個核苷酸長，S2鏈?zhǔn)?1個核苷酸長，并且S1鏈的3’-末端具有一個由2個核苷酸組成的單鏈突出端，同時位于S1鏈的5’-末端的dsRNA末端是平末端。
26.根據(jù)權(quán)利要求16至25之一的藥物，其中所述dsRNA是適于口服，或通過吸入、注入或注射，特別是靜脈或腹膜內(nèi)注入或注射的方式給藥的制劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物，其中所述制劑特別是只由dsRNA和生理上可耐受的溶劑，優(yōu)選生理鹽水溶液或生理上可耐受的緩沖液，特別是磷酸鹽緩沖的鹽水溶液組成。
28.根據(jù)權(quán)利要求16至27之一的藥物，其中所述dsRNA存在于藥物的溶液中，特別是生理上可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，或被膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體、病毒衣殼、類衣殼體或聚合物納膠囊或微膠囊包圍，或與聚合物納膠囊或微膠囊結(jié)合。
29.根據(jù)權(quán)利要求16至28之一的藥物，其中所述藥物以至少一個包含一定量的dsDNA的劑量單位存在，使得按照遞升的優(yōu)選順序，最大劑量可以為每天每kg體重5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μg和最適為25μg。
30.抑制細(xì)胞中正(+)鏈RNA病毒復(fù)制的方法，其中將至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)引入細(xì)胞，并且其中dsRNA的S1鏈具有至少部分地與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中正(+)鏈RNA病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中所述病毒基因組編碼的多蛋白的表達(dá)受到抑制。
33.根據(jù)權(quán)利要求30至32之一的方法，其中所述病毒基因組編碼的功能性蛋白酶或解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的表達(dá)受到抑制。
34.根據(jù)權(quán)利要求30至33之一的方法，其中所述病毒RNA的沿閱讀方向的區(qū)段被置于編碼解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的病毒基因組的區(qū)域之中或之前。
35.根據(jù)權(quán)利要求30至34之一的方法，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域按照遞升的優(yōu)選順序具有少于25、19-24、20-24、21-23和特別是具有22或23個核苷酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求30至35之一的方法，其中所述的S1鏈按照遞升的優(yōu)選順序具有少于30、少于25、21-24和特別是具有23個核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求30至36之一的方法，其中所述dsDNA在dsRNA的至少一個末端具有由1-4個，優(yōu)選2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中dsRNA只在一個末端，特別是在S1鏈顯示3’-端的末端處具有突出端。
39.根據(jù)權(quán)利要求30至38之一的方法，其中所述dsRNA除了具有S1鏈外還具有S2鏈，并且S1鏈?zhǔn)?3個核苷酸長，S2鏈?zhǔn)?1個核苷酸長，S1鏈的3’-末端具有由2個核苷酸組成的單鏈突出端，同時位于S1鏈的5’-末端的dsRNA末端是平末端。
40.根據(jù)權(quán)利要求30至39之一的方法，其中所述dsRNA存在于溶液中，特別是生理上可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，或被膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體、病毒衣殼、類衣殼體或聚合物納膠囊或微膠囊包圍，或與聚合物納膠囊或微膠囊結(jié)合。
41.雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中dsRNA的S1鏈具有至少部分地與正(+)鏈RNA病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的dsRNA，其中所述正(+)鏈RNA病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的dsRNA，其中所述dsRNA能夠抑制病毒基因組編碼的多蛋白的表達(dá)。
44.根據(jù)權(quán)利要求41至43之一的dsRNA，其中所述dsRNA能夠抑制病毒基因組編碼的功能性蛋白酶或解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的表達(dá)。
45.根據(jù)權(quán)利要求41至44之一的dsRNA，其中所述病毒RNA的沿閱讀方向的區(qū)段被置于編碼解旋酶，特別是HCV-NS3解旋酶的病毒基因組的區(qū)域之中或之前。
46.根據(jù)權(quán)利要求41至45之一的dsRNA，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域按照遞升的優(yōu)選順序具有少于25、19-24、20-24、21-23和特別是具有22或23個核苷酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求41至46之一的dsRNA，其中所述的S1鏈按照遞升的優(yōu)選順序具有少于30、少于25、21-24和特別是具有23個核苷酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求41至47之一的dsRNA，其中所述dsDNA在dsRNA的至少一個末端具有由1-4，優(yōu)選2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的dsRNA，其中所述dsRNA只在一個末端，特別是在S1鏈顯示3’-端的末端具有突出端。
50.根據(jù)權(quán)利要求41至49之一的dsRNA，其中所述dsRNA除了具有S1鏈外還具有S2鏈，并且S1鏈?zhǔn)?3個核苷酸長，S2鏈?zhǔn)?1個核苷酸長，S1鏈的3’-末端具有由2個核苷酸組成的單鏈突出端，同時位于S1鏈的5’-末端的dsRNA末端是平末端。
51.根據(jù)權(quán)利要求41至50之一的dsRNA，其中所述dsRNA存在于適于口服，或通過吸入、注入或注射，特別是靜脈或腹膜內(nèi)注入或注射的方式給藥的制劑中。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的dsRNA，其中所述的制劑特別是只由dsRNA和生理上可耐受的溶劑，優(yōu)選生理鹽水溶液或生理上可耐受的緩沖液，特別是磷酸鹽緩沖的鹽水溶液組成。
53.根據(jù)權(quán)利要求41至52之一的dsRNA，其中所述的dsRNA存在于溶液中，特別是生理上可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，或被膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體、病毒衣殼、類衣殼體或聚合物納膠囊或微膠囊包裹，或與聚合物納膠囊或微膠囊結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用雙鏈核糖核酸(dsRNA)治療正(+)鏈RNA病毒感染的用途，其中dsRNA的S1鏈具有至少部分與病毒基因組的可翻譯區(qū)的區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)域。
文檔編號A61P31/00GK1608133SQ02826181
公開日2005年4月20日 申請日期2002年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月26日
發(fā)明者A·克雷布斯, M·約翰, D·舒潘, S·林默, R·克羅伊策爾 申請人:里伯藥品公司