專利名稱：人單核吞噬白細胞的制備方法
技術領域：
和發(fā)明背景本發(fā)明涉及一種制備人單核吞噬白細胞的方法、由此獲得的細胞培養(yǎng)物及其應用。
受傷組織愈合是基于許多分子和生理因子間同步相互作用的復雜自然過程。有效的炎癥反應是誘導受傷組織再生和修復的主要因素之一。這是組織再生能力的最早最重要的反應之一。募集并進一步在原位活化的巨噬細胞是有效炎癥反應初期的關鍵因子。炎癥反應是體內(nèi)所有組織傷口愈合的組成部分。
在軸突損傷后，哺乳動物周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)元比中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)在軸突再生方面具有更大能力，已表明巨噬細胞在PNS軸突再生中起到關鍵作用(Schwartz等，1989，F(xiàn)ASEB J.，32371-2378)。
哺乳動物的CNS顯示出在軸突損傷后軸突再生能力差。CNS軸突再生和PNS軸突再生間的差異似乎主要是因為神經(jīng)元的細胞環(huán)境，而不是神經(jīng)元本身。在神經(jīng)元損傷后，圍繞著PNS神經(jīng)元的神經(jīng)膜細胞受到調(diào)節(jié)，從而變成容許或支持軸突再生，而圍繞著CNS神經(jīng)元的星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞不顯示出這樣的調(diào)節(jié)并保持不支持或抑制軸突再生。
損傷后炎癥反應的差異與這種調(diào)節(jié)缺乏相關。特別是，與響應PNS的損傷相比，響應CNS損傷的單核吞噬細胞的積累被延遲并受到限制。
在CNS中，炎癥反應的降低，至少部分是由于居留的組織巨噬細胞(小膠質(zhì)細胞)的相對無效性所致。血源性單核細胞不能進入CNS，不能象它們在任何其它受損傷的需要傷口愈合的組織中那樣發(fā)揮正常作用，這進一步強化了這種不足。
在美國專利第5,800,812號、第6,117,424號和第6,267,955號中，已公開了使用同種異體單核吞噬細胞以促使哺乳動物的CNS中軸突再生的方法和組合物，所有這些專利全都屬于本申請的同一申請人，其每個及所有這些專利都通過引用結(jié)合到本文中，視同全部在此公開。這些專利描述了從成年Sprague-Dawley大鼠外周血中分離和培養(yǎng)單核細胞的方法，以及經(jīng)與同系大鼠坐骨神經(jīng)或視神經(jīng)段共培養(yǎng)、或在適合同系大鼠坐骨神經(jīng)或視神經(jīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而刺激分離的單核細胞的方法。然后分析受刺激的單核細胞的吞噬活性和/或一氧化氮產(chǎn)量，并且在經(jīng)受視神經(jīng)橫切的大鼠的傷口上或傷口附近給予受刺激的單核細胞。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種用于制備人單核吞噬白細胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于制備這樣的表達傷口愈合表型的人單核吞噬白細胞的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于制備這樣的表達傷口愈合表型并適合于促進軸突再生(例如在脊髓損傷的病例中)的人單核吞噬白細胞的方法。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種用于制備這樣的表達傷口愈合表型并適合于皮膚傷口(特別是慢性皮膚潰瘍)愈合的人單核吞噬白細胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于制備這樣的表達傷口愈合表型并適合于減少壞死組織的體積(例如在心肌梗塞的病例中)的人單核吞噬白細胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種描述通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的這樣的表達傷口愈合表型的人單核吞噬白細胞的特征的方法。
本發(fā)明的這些和其它目的由以下方法提供其中從個體血液中分離出單核細胞，將其懸浮于適合于培養(yǎng)單核細胞的培養(yǎng)基中，然后與組織工程皮膚或與從同一個體切取的皮膚組織(優(yōu)選真皮)一起培養(yǎng)，然后去除所述皮膚組織，洗滌巨噬細胞，然后將所得活化單核吞噬白細胞重懸于與前述相同的合適培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述人單核吞噬白細胞是自體的，也就是說，從個體外周血液單核細胞制備它們并與同一個體的皮膚組織一起活化，然后給予所述同一個體。
本發(fā)明還提供用于促進CNS中軸突再生(特別是CNS損傷后)、傷口愈合和減少心肌梗塞壞死組織的細胞治療制劑。
附圖簡述

圖1A-1B分別是非顆粒型單核細胞(培養(yǎng)前)和顆粒型單核吞噬白細胞(培養(yǎng)后)的照片。
發(fā)明詳述吞噬細胞定義為能夠攝取顆粒物質(zhì)如微生物和其它調(diào)理顆?？乖募毎ㄖT如巨噬細胞和單核細胞的細胞。
單核細胞是單核吞噬白細胞。單核細胞是從骨髓造血細胞的幼單核細胞形成，進入血液，循環(huán)至多72小時，隨后進入組織例如肺、肝、和患病組織例如惡性腫瘤和動脈粥樣斑塊，在此它們變?yōu)榫奘杉毎?。單核細胞分化為巨噬細胞涉及許多變化形態(tài)學變化，體積增大，吞噬活性增加、表達細胞標記，分解酶水平更高和分泌多種可溶性因子。
巨噬細胞分散在全身。有些居留在特定組織，變?yōu)楣潭ň奘杉毎?，而另一些保持游動，被稱為游離巨噬細胞。
雖然正常時處于靜止狀態(tài)，但巨噬細胞被多種刺激以免疫應答程序激活。顆粒抗原的吞噬作用是原始激活刺激。然而，由活化T輔助(TH)細胞分泌的細胞因子(例如干擾素-γ)、炎癥反應介質(zhì)和細菌細胞壁產(chǎn)物都可進一步增強巨噬細胞活性。
單核細胞是參與炎性過程的第一類細胞。它們有大量任務，其活性程度可能使它們行使其職責。單核細胞活化過程不是一個全或無現(xiàn)象，而是漸進的刺激物特異性效應。
單核細胞/巨噬細胞的許多功能與其活化程度直接相關，包括免疫功能、分泌功能、吞噬功能和其它功能。按照其活化程度，通常將巨噬細胞定義為以下三個不同的組(i)傷口愈合巨噬細胞，其主要功能是作為炎癥反應的第一崗哨；(ii)抗微生物和細胞毒性巨噬細胞，其主要功能是作為抵抗致病生物和惡性腫瘤細胞的體內(nèi)防御機制；和(iii)抗原呈遞巨噬細胞，特別是TH細胞，在其功能中，它們幫助細胞參與任何炎癥反應。
本申請所用的術語“單核吞噬白細胞”、“單核白細胞”、“單核吞噬細胞”和“巨噬細胞”可互換使用，是指用本發(fā)明方法制備的細胞。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備人單核吞噬白細胞的方法，所述方法包括(i)從個體血樣中分離單核細胞，然后將所述單核細胞懸浮于合適培養(yǎng)基(在本文稱為“培養(yǎng)基”)中；(ii)處理來自同一個體的皮膚組織，去除表皮，將真皮部分在含有抗生素的培養(yǎng)基中進行超聲處理，將經(jīng)超聲處理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基中，然后用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基沖洗；(iii)將步驟(i)的單核細胞與沖洗的步驟(ii)的真皮部分共培養(yǎng)；(iv)去除所述培養(yǎng)混合物中的真皮部分，通過離心沉淀所得活化單核吞噬白細胞；(v)洗滌所述活化單核吞噬白細胞并重懸于所述培養(yǎng)基中；和
(vi)評價所述培養(yǎng)物對人體給藥的適應性。
在步驟(i)中，所述人單核細胞可通過任何常規(guī)方法從血樣中分離出來。在一個實施方案中，單核細胞的分離方法包括下述步驟(a)稀釋血液；(b)通過將步驟(a)稀釋的血液鋪在菲可(Ficoll)上再通過離心分離所述單核細胞部分；(c)洗滌步驟(b)分離的細胞并通過在珀可(Percoll)上進行密度梯度離心而進一步分離；和(d)洗滌步驟(c)的分離的富含單核細胞的部分并將所述細胞懸浮于合適培養(yǎng)基中。
可用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進行上述步驟(a)的全血稀釋和步驟(c)和步驟(d)的細胞洗滌，然后可將上述步驟(d)的富含單核細胞的部分懸浮于合適培養(yǎng)基中。
本文所用的術語“合適培養(yǎng)基”是指適合于培養(yǎng)單核細胞的培養(yǎng)基，例如但不限于Iscove氏改良Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)和RPMI1640。對所述單核細胞和所述皮膚組織的處理均在該同一合適培養(yǎng)基中進行。
在人單核吞噬白細胞制備方法的步驟(ii)中，可以通過下述步驟來處理人皮膚組織將來自同一個體的皮膚組織進行冷凍，解凍后將所述皮膚組織浸泡在由合適培養(yǎng)基(如IMDM或RPMI 1640)和抗生素組成的洗滌液中，然后在去除表皮之前切成小塊，從而獲得約0.1-5cm2、優(yōu)選約0.5-2.0cm2或甚至更小的真皮塊。然后將該真皮塊置于無菌塑料容器中，其中將它們浸漬在相同的含抗生素的合適培養(yǎng)基中，所述抗生素例如但不限于氧氟沙星、萬古霉素和慶大霉素，將所述容器放在裝有去離子水的超聲浴中并進行超聲處理。然后將所述超聲處理的真皮塊浸泡在新鮮的含同樣抗生素的合適培養(yǎng)基中，然后用新鮮的不含所述抗生素的培養(yǎng)基沖洗。所述真皮塊可在例如超聲浴中以35-40kHz的頻率進行超聲處理。
在培養(yǎng)步驟(iii)中，所述真皮塊在超聲處理后，浸泡在新鮮的含抗生素的合適培養(yǎng)基中并用不含抗生素的同樣培養(yǎng)基沖洗，然后與單核細胞一起在5％CO2的大氣壓下于約36-38℃培養(yǎng)至多38小時。然后去除培養(yǎng)混合物中的真皮塊，通過離心、洗滌和重懸于新鮮的合適培養(yǎng)基(優(yōu)選IMDM)中，回收所述活化細胞。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，分離單核細胞的血樣以及用于活化單核細胞的皮膚組織都是自體的，即它們是從將要接受所述活化單核吞噬白細胞的病人中獲得的。然而，本發(fā)明也設想了同種異體單核細胞和皮膚組織的應用，但優(yōu)選它們來自同一個體。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，步驟(ii)的皮膚組織可以用組織工程皮膚替代。任何可利用的組織工程皮膚或組織工程皮膚等同物如人工皮膚，無論它們是否含有活細胞，都可按本發(fā)明來使用。如果組織工程皮膚沒有活細胞，就不進行抗生素處理步驟。
在步驟(vi)中，為了了解適用于人體給藥的所述細胞的特征，對一批獲取的活化單核吞噬白細胞的樣品進行一些或所有以下試驗(a)無菌檢查—所述細胞應該沒有細菌、酵母和真菌污染。為了進行無菌檢查，按照21 CFR section 610.12，過濾所述細胞，并檢查細菌和真菌污染情況；(b)細胞活力檢查—培養(yǎng)物活力優(yōu)選采用熟知的錐蟲藍染色排除法進行檢查；(c)細菌內(nèi)毒素試驗—按照現(xiàn)行美國藥典，采用鱟變形細胞溶解物(LAL)試驗，定量測定細胞培養(yǎng)物中的革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素含量；(d)革蘭氏染色—通過革蘭氏染色技術檢查細菌的存在與否；(e)通過相差顯微鏡術并比較單核細胞與真皮塊培養(yǎng)前的形態(tài)測量學分析/細胞質(zhì)顆粒計數(shù)—在相差顯微鏡下，進行所述細胞的形態(tài)測量學分析和細胞質(zhì)顆粒計數(shù)是所述活化巨噬細胞的非常重要試驗；(f)采用單克隆抗體通過流式細胞儀分析所述細胞群體的純度，所述單克隆抗體是用來檢測所述單核細胞CD14細胞膜標記的；(g)白介素-1β(IL-1β)測定，IL-1β由活化巨噬細胞高水平分泌的；(h)采用抗甘露糖受體的單克隆抗體、通過流式細胞儀測定培養(yǎng)后細胞表達甘露糖受體并與培養(yǎng)前的細胞相比，所述甘露糖受體被活化巨噬細胞高水平表達；(i)采用抗CD54抗體標記(ICAM-1)的單克隆抗體，通過流式細胞儀測定細胞膜上表達的ICAM-1，所述ICAM-1在活化后在細胞膜上高水平表達；(j)對由所述活化巨噬細胞分泌的腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的測定；和(k)對由所述活化巨噬細胞分泌的IL-6的測定。
如結(jié)果滿意的話，那么整批細胞都可用于所述個體的細胞治療。
當進行本發(fā)明方法的步驟(ii)時，發(fā)現(xiàn)在上述條件下超聲處理所述皮膚組織時也導致所述皮膚組織的凈化。因此，另一方面，本發(fā)明提供一種用于凈化皮膚組織的方法，所述皮膚組織優(yōu)選人皮膚組織，更優(yōu)選人真皮組織，其中包括在含有抗生素的合適培養(yǎng)基中超聲處理的皮膚組織。
按照本方法，可以處理人皮膚組織，再通過去除表皮，在含有抗生素的合適培養(yǎng)基(在本文稱為“培養(yǎng)基”)中超聲處理真皮部分，將經(jīng)超聲處理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基中，然后用新鮮的不含抗生素的培養(yǎng)基沖洗。人皮膚組織的處理可以通過下述步驟進行將皮膚組織進行冷凍，解凍后將所述皮膚組織浸泡在由合適培養(yǎng)基(優(yōu)選IMDM)和抗生素組成的洗滌液，然后在去除表皮之前切成小塊，從而獲得約0.1-5cm2的真皮塊，優(yōu)選0.5-2.0cm2或或更小的真皮塊。為了進行超聲處理，可將所述真皮塊置于無菌塑料容器中，其中將它們浸泡在含有抗生素的合適培養(yǎng)基(優(yōu)選IMDM)中，所述抗生素例如但不限于氧氟沙星、萬古霉素和慶大霉素，將所述容器放在裝有去離子水的超聲浴中并進行超聲處理，然后將經(jīng)超聲處理的真皮塊浸泡在含同樣抗生素的新鮮培養(yǎng)基(優(yōu)選IMDM)中并用不含所述抗生素的新鮮培養(yǎng)基沖洗。所述真皮塊可在例如超聲浴中以35-40kHz的頻率進行超聲處理。
表征了按本發(fā)明方法獲得的人單核吞噬白細胞，它們代表新的細胞群體，因此構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
按照本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)了用本發(fā)明方法所獲得的活化人單核吞噬白細胞的最重要特征是細胞質(zhì)顆粒的數(shù)量。在相差顯微鏡下，這些顆粒呈高折光球體并呈淺藍色，可容易地對其進行計數(shù)，如圖1B所示。
因此，另一方面，本發(fā)明提供人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，在相差顯微鏡下，至少25％最多顆粒的細胞中顯示出每個細胞內(nèi)至少4個顆粒。在一個實施方案中，優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選60％或更多的細胞為CD14+。在另一個實施方案中，所述細胞產(chǎn)生的IL-1β水平至少為17pg/106CD14+細胞。
在再一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的活化人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物具有下列特征a-k中的至少特征a-g(a)14天無菌；(b)采用錐蟲藍染色排除法，至少80％培養(yǎng)物有活力；(c)細菌內(nèi)毒素試驗，小于200Eu/ml的產(chǎn)品合規(guī)范；(d)革蘭氏染色，無細菌證據(jù)；(e)形態(tài)測量學分析方面，至少25％最多顆粒的細胞中顯示出每細胞內(nèi)至少4個顆粒；(f)至少40％、優(yōu)選60％或60％以上的細胞為CD14陽性(CD14+)；
(g)細胞產(chǎn)生的IL-1β水平至少是17pg/106CD14+細胞；(h)與其所來源的非活化單核細胞相比，所述活化細胞在甘露糖受體表達方面呈統(tǒng)計學顯著性增加；(i)所述細胞表達ICAM-1受體的幾何平均熒光值約200或更高；(j)所述細胞分泌BDNF的水平高于10pg/106CD14+細胞；和(k)所述活化細胞與其所來源的非活化單核細胞相比，分泌的IL-6約為后者的4-15倍。
在本發(fā)明的另一方面，制備包含人活化單核吞噬白細胞的細胞治療制品，所述人活化單核吞噬白細胞與皮膚(或僅真皮)部分一起培養(yǎng)至多5天，優(yōu)選至多38小時，更優(yōu)選至多24小時。在一個優(yōu)選實施方案中，所述起始單核細胞和所述真皮是自體的，并且是從將要接受所述終制品的病人中收集的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，準備用作終制品的所述細胞培養(yǎng)物由包含人活化單核吞噬白細胞，所述人活化單核吞噬白細胞至少40％、一般超過50％是巨噬細胞。從病人外周血中分離單核細胞，隨后與從所述受傷病人收獲的自體皮膚(從全厚度皮膚組織制備的真皮)一起培養(yǎng)。所述細胞治療終制品包含懸浮于藥學上可接受的載體(例如磷酸緩沖鹽溶液(PBS))、或者優(yōu)選懸浮于培養(yǎng)基(例如IMDM)或任何其它合適的細胞培養(yǎng)基(例如RPMI 1640)中的1-1000萬個巨噬細胞，而其它合適的藥學上可接受的載體是本領域技術人員熟知的。
本發(fā)明活化人單核吞噬白細胞表達傷口愈合表型，因而在治療人類的以下病癥方面是有益的(i)在CNS任何部位的損傷或疾病而導致或伴隨軸突損傷(例如但不限于腦損傷、脊髓損傷或視神經(jīng)損傷)后，促使軸突再生長。這樣的損傷包括脊髓損傷、創(chuàng)傷包括鈍器創(chuàng)傷、穿透性創(chuàng)傷、腦外傷或?qū)?cè)外傷、神經(jīng)外科手術或其它手術創(chuàng)傷、以及中風包括出血性中風或局部缺血性中風。
(ii)慢性皮膚潰瘍愈合。在創(chuàng)傷組織居留的巨噬細胞在潰瘍邊緣沒有被皮膚充分激活，并且與正常皮膚組織相比，缺乏激活炎性細胞的能力。將所述活化巨噬細胞應用于所述傷口，將會提高愈合的機會。
(iii)減少心肌梗塞病例的壞死組織體積。預期表達傷口愈合表型的本發(fā)明活化巨噬細胞對減少心肌梗塞病例的壞死組織體積是有益的。延遲停止或顯著降低血液流向心肌導致心肌細胞死亡。心肌死亡導致心功能降低。因為肌細胞不能再生，所以死亡的心肌組織被無功能的瘢痕組織取代。從再生方面看，肌細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的再生能力的缺乏非常相似。如上所示的CNS中的軸突，例如在美國專利第6,117,424號中，也設想了心肌細胞不能再生的原因不在于所述細胞本身，而在于在局部缺血后適當時間內(nèi)發(fā)生在梗塞部位的延遲和無效的炎癥反應，這是因為數(shù)量不足的巨噬細胞作用緩慢。在梗塞過程相對早期時，在原位給予本發(fā)明活化巨噬細胞，可將壞死體積減至最小，因此挽救心功能。
所述活化巨噬細胞可在創(chuàng)傷或梗塞部位或在CNS損傷部位或其附近原位給藥，但是任何其它合適的給藥方式，特別是靜脈內(nèi)給藥，也是本發(fā)明所預期的。
因此，本發(fā)明還提供一種用于促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)軸突再生的方法，所述方法包括在導致或伴隨軸突損傷的CNS損傷部位或其附近給予有需要的病人有效量的本發(fā)明的人單核吞噬白細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述活化單核吞噬白細胞是自體的，所述損傷是脊髓損傷，治療是在手術中進行，而且包括在脊髓實質(zhì)的損傷部位給予所述病人的所述細胞。
本發(fā)明也提供一種用于傷口愈合(特別是慢性皮膚潰瘍例如糖尿病性傷口潰瘍和慢性腿部潰瘍)的方法，所述方法包括在創(chuàng)傷部位給予有需要的病人有效量的本發(fā)明的單核吞噬白細胞。
本發(fā)明還提供一種用于減小心肌梗塞病例的壞死組織體積的方法，所述方法包括在心肌原位、優(yōu)選在梗塞發(fā)生的相對早期給予有需要的病人有效量的本發(fā)明的單核吞噬白細胞。
現(xiàn)在，將通過以下非限制性實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例實施例1.病人組織標本的采集大約在給予細胞治療終制品的前1天，采集病人血液和皮膚標本。采集約200-250ml血液，裝入到含抗凝劑的采血袋中。從同一病人獲取約15cm2全厚度皮膚(表皮和真皮)，轉(zhuǎn)移到含IMDM和抗生素(16μg/ml氧氟沙星、20μg/ml萬古霉素和50μg/ml慶大霉素)的“洗滌液”的容器中。將所述血液和皮膚標本從獨立的隔熱裝置(所述裝置的內(nèi)部溫度對于血液1-10℃，對于皮膚至多38℃)轉(zhuǎn)移到細胞處理中心，并在專用無菌室設施中進行處理(所有步驟均在100級/ISO 5級(聯(lián)邦標準209E/ISO 14644-1)的生物安全工作櫥中進行，所述生物安全工作櫥放在10,000級/ISO 7級無菌室中)。
實施例2.單核細胞的分離全血用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋。將所述稀釋血液鋪在裝有Ficoll-Paque_PLUS(Amersham-Pharmacia Biotech，瑞典)(密度20℃時為1.076-1.078g/ml)的離心管中并進行離心，以獲得所述單核細胞部分。然后將所述單核細胞用PBS洗滌3次。從第2次PBS洗滌取出含上清液和105細胞的等份樣品，然后進行無菌檢查。將所述洗滌的細胞部分鋪在事先已通過離心制備好的珀可(Percoll_)梯度上。通過珀可梯度離心所述細胞，獲得富含單核細胞的部分。該部分用PBS洗滌，然后重懸于IMDM中，直到進行培養(yǎng)步驟。取出經(jīng)PBS洗滌的含上清液和105細胞的部分進行無菌檢查。除了無菌檢查外，還進行包括活細胞計數(shù)(錐蟲藍染料排除)及以下基礎試驗在內(nèi)的質(zhì)量控制試驗來監(jiān)控所述單核細胞分離過程培養(yǎng)物純度(％CD14+細胞)、細胞膜上甘露糖受體(MR)表達、IL-1β表達、ICAM-1表達(所有這三種試驗都用流式細胞儀進行)和形態(tài)學觀察/細胞質(zhì)顆粒計數(shù)。
實施例3.對皮膚組織的處理一到達細胞處理中心，立即將含有全厚度皮膚組織標本的皮膚容器放入冷柜(-18℃)至少1小時。然后將所述皮膚容器放入溫箱(36-38℃)解凍，使得更加容易地消除紅細胞。解凍后，將所述皮膚容器轉(zhuǎn)移到100級生物安全工作櫥中。將所述皮膚標本從開始的容器中取出，然后在盛有新鮮洗滌液(含有IMDM和抗生素，參見以上的實施例1)的容器中浸泡一會兒。用新的洗滌液容器重復浸泡。然后將所述皮膚切成小塊，并去除表皮和取樣進行微生物鑒別(參見下面)。將一塊真皮切成兩個約2mm2的切片，進行無菌檢查。將所述真皮塊浸泡在含新鮮洗滌液的容器中，并放置在超聲浴的容器中以35-40kHz的頻率超聲處理約30-60分鐘。然后將所述真皮組織轉(zhuǎn)移到用新鮮洗滌液的新的無菌容器中并于36-38℃浸泡至少4.5小時。該步驟的主要目的是將與所述單核細胞培養(yǎng)期間的微生物污染危險性降至最低。在與所述單核細胞共培養(yǎng)前，將所述真皮塊用新鮮培養(yǎng)基(不含抗生素)洗滌2次。取出2塊約2mm2的切片進行無菌檢查。
實施例4.將分離的單核細胞與真皮組織一起培養(yǎng)將以上實施例2富含單核細胞的部分加入到盛有IMDM的無菌50ml培養(yǎng)管或組織培養(yǎng)瓶(每容器9-100×106個細胞)中。向各管中加入2決真皮。準備一支裝有4.5-5.5×106細胞和一塊真皮的“平行培養(yǎng)”管。所有管在5％CO2靜態(tài)濕潤培養(yǎng)箱中于36-38℃培養(yǎng)至多38小時，優(yōu)選培養(yǎng)至多24小時(將所述“平行培養(yǎng)”管培養(yǎng)16.5-17.5小時)。約培養(yǎng)17小時后，第1次評價培養(yǎng)物的生長情況。從培養(yǎng)箱中移出帶“平行培養(yǎng)”標記的含培養(yǎng)的巨噬細胞和真皮的管并停止培養(yǎng)。棄去真皮，然后評價所述細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)物純度(在流式細胞儀上的CD14+細胞百分率)和活力(采用錐蟲藍染料排除法)。在培養(yǎng)20.5-21.5小時后，結(jié)束所述含主要培養(yǎng)物的管的培養(yǎng)周期。
在培養(yǎng)結(jié)束時，用無菌鑷子將所述真皮塊從所述主要培養(yǎng)管中取出并棄去。通過離心沉淀所述培養(yǎng)細胞，測定培養(yǎng)上清液樣品中的內(nèi)毒素含量，并進行革蘭氏染色以進行細菌檢查。將所述細胞沉淀合并，洗滌，并重懸于IMDM中。進行細胞計數(shù)和質(zhì)量控制試驗例如活力、顯微鏡形態(tài)學、培養(yǎng)物純度(CD14+細胞百分率)、甘露糖受體表達、ICAM-1表達、細胞因子分泌和顆粒形態(tài)測量學分析/計數(shù)。將含105個培養(yǎng)細胞的部分加入到所述培養(yǎng)上清液樣品中，進行無菌檢查。將含上清液和5×105個細胞的樣品送檢支原體。收到所述細胞培養(yǎng)物純度報告后，對所述細胞進行計數(shù)，隨后用無酚紅的IMDM洗滌。然后用無酚紅的IMDM將所述細胞沉淀重新懸浮至所述細胞制劑的終體積。即將給予所述病人的所述細胞終制品的質(zhì)量鑒定是基于質(zhì)量控制試驗結(jié)果符合預先制定的規(guī)范。
實施例5.最終的細胞治療制品的制備所述細胞治療終制品含有懸浮于無酚紅的IMDM的細胞，其濃度約為15,000-75,000個巨噬細胞/μl，優(yōu)選30,000-40,000個巨噬細胞/μl。所述終劑量含有1-1000萬個巨噬細胞、優(yōu)選5-700萬個巨噬細胞，并裝入一個注射器中。
實施例6.質(zhì)量控制程序和檢測6a.原料和包裝成分用于所述細胞生產(chǎn)的原料和包裝成分，在接收它們用于所述制備過程之前，必須按照書面的標準操作程序(SOP)進行合適的質(zhì)量控制評價。
6b.程序控制—生物學活性和安全性試驗本實施例回顧了所述培養(yǎng)人巨噬細胞培養(yǎng)物的主要的生物學和安全特征。本文提出的所述細胞終制品規(guī)范是基于采用來源于健康人的同種異體和自體血液和皮膚組織以及來源于迄今為止所治療的病人的自體組織，而獲得的這些特征的檢測結(jié)果。眾所周知，巨噬細胞是多功能性的，但它們的活性不太可能依賴于與特異性抗原的相互作用，而且它們在傷口愈合中執(zhí)行其功能與損傷原因無關。
建立了“工藝控制計劃”以控制生產(chǎn)過程并保證所述細胞治療終制品的完整性。在生產(chǎn)過程的不同階段對所述細胞培養(yǎng)物進行取樣并檢查細菌和真菌污染。這些試驗評價了所述細胞治療制品的無菌和內(nèi)毒素水平。另外，對所述細胞的形態(tài)學特征和活力進行監(jiān)控。對所述細胞培養(yǎng)物取樣以評價免疫學特征、培養(yǎng)物純度和生物學活性。也被監(jiān)控和記錄所述生產(chǎn)過程的產(chǎn)量。
所述細胞治療終制品必須通過批合格規(guī)范。每個病人的細胞制品是獨立的批次。所述標準包括如下規(guī)范細胞表面CD14標記(通過流式細胞儀檢驗)、細胞形態(tài)學(在顯微鏡下)和細胞顆粒形態(tài)測量學分析、IL-1β的定量ELISA分析、培養(yǎng)物活力(錐蟲藍染料排除)、內(nèi)毒素和革蘭氏染色。過程中樣品的中間無菌結(jié)果也是合格質(zhì)量控制試驗的一部分。不滿足合格規(guī)范導致該批拒收。還可進行其它檢驗，如通過流式細胞儀檢測甘露糖受體和ICAM-1表達、通過ELISA分析巨噬細胞分泌的白介素-6(IL-6)和支原體檢查。所述合格標準不包括這些參數(shù)的規(guī)范。
為了評價制品無菌，從生產(chǎn)過程的不同階段取樣進行無菌檢查。在無菌檢查培養(yǎng)周期中，每日檢查所述無菌培養(yǎng)基容器的內(nèi)容物，如有任何顯示所述樣品不是無菌的陽性結(jié)果，立即向所述醫(yī)師報告。
在皮膚制備過程中在分離的表皮上進行微生物檢查和鑒別試驗。預期這些培養(yǎng)物含有污染物(可能是正常皮膚菌群)，因此這并不是制品不合格的根據(jù)。分離這些培養(yǎng)物中檢出的微生物，進行鑒定并測試其對抗生素的敏感性。
在以下階段中對組織、上清液和細胞取樣并進行無菌檢查真皮塊(為共培養(yǎng)而制備)；單核細胞分離物(在菲可分離后)上清液和細胞；富含單核細胞的部分分離物(在珀可分離后)上清液和細胞；和培養(yǎng)的巨噬細胞制劑(共培養(yǎng)后)上清液和細胞。除了這些無菌檢查外，還要從所述病人的血液(在分離程序之前)中取樣進行支原體檢查。
實施例7.質(zhì)量控制試驗的描述常規(guī)安全性試驗7a.無菌檢查按照21 CFR 610.12[FDA″General Biological Products Standards″(通用生物制品標準)]，依照樣品的類型，采用直接轉(zhuǎn)移法或者過濾法，對樣品進行無菌檢查。
在所述直接轉(zhuǎn)移法中，將每個樣品分為2份。將每份放入裝有合適培養(yǎng)基(胰酶解豆酪蛋白培養(yǎng)基或巰基乙酸液體培養(yǎng)基)的容器中，將所述容器密封并于合適溫度(對于胰酶解豆酪蛋白，20-25℃；而對于液體巰基乙酸，30-35℃)和時間(14天)進行培養(yǎng)。
在所述過濾法中，將所述樣品通過安裝在罐上的濾器裝置進行過濾。將所述樣品分為2份且每份通過不同的濾器裝置過濾。每個濾器用沖洗液沖洗，然后加入合適培養(yǎng)基(胰酶解豆酪蛋白和液體巰基乙酸)——每罐加一種培養(yǎng)基。將每個罐密封并于合適溫度和時間(如上所述)進行培養(yǎng)。
將用于無菌檢查的本發(fā)明樣品(也稱為“接種物”)接種到含有所述試驗培養(yǎng)基(巰基乙酸或所述胰酶解豆酪蛋白)的容器中，充分混合，然后在合適溫度(巰基乙酸培養(yǎng)在30-35℃，胰酶解豆酪蛋白培養(yǎng)在20-25℃)下培養(yǎng)14天。接種1天后，目測檢查含有所述單核細胞(+105個細胞)的第2次PBS洗滌的樣品(和無菌檢查培養(yǎng)基)的容器、富含單核細胞的部分(+105個細胞)的PBS洗滌液以及在共培養(yǎng)前所述經(jīng)處理的真皮，檢查其中有無生長。在此階段所述試驗培養(yǎng)基中的渾濁或霧狀被認為是微生物污染的證據(jù)，從而導致該產(chǎn)品不合格。
14天培養(yǎng)期間通過每日檢查進一步評價所有所述樣品的無菌。當所述培養(yǎng)物在檢查期間沒有可見的渾濁時，則被認為是無菌的。
僅當沒有鑒定出微生物污染時，才可以將一批制品給予病人。培養(yǎng)后，檢查所述培養(yǎng)物中有無微生物生長。如果發(fā)現(xiàn)菌落，就對它們進行革蘭氏染色，然后采用用于鑒定具體生物類型的不同生化試驗進行檢測。
7b.細菌內(nèi)毒素檢查采用凍干鱟變形細胞溶解物(LAL)(Associates of Cape Cod，目錄號G5003或G2003(PYROTELL))和/或凍干大腸桿菌控制標準內(nèi)毒素(Associates of Cape Cod，目錄號E005)(每批的實際值由其生產(chǎn)商標注)進行細菌內(nèi)毒素檢查。制品合格標準為＜200Eu/ml。
7c.革蘭氏染色僅當革蘭氏染色結(jié)果為陰性時，才可以將一批制品給予病人。
生物學活性試驗7d.活細胞計數(shù)采用錐蟲藍染料染色排除法進行細胞活力檢查。該法是基于活細胞不攝取所述染料而死細胞攝取的原理。染色也使細胞形態(tài)容易觀察。將0.4％(w/v)的錐蟲藍溶液與細胞懸液樣品混合，然后轉(zhuǎn)移到血細胞計數(shù)器中。在顯微鏡下，用400倍放大倍數(shù)對所述細胞進行計數(shù)。如果培養(yǎng)物活力≥80％時，該批制品合格。
7e.細胞形態(tài)學和細胞質(zhì)顆粒計數(shù)采用顯微鏡在400倍放大倍數(shù)下定性分析細胞形態(tài)學。檢查的參數(shù)為大小、培養(yǎng)物中細胞顆粒和不規(guī)則。對珀可分離后和細胞洗滌(0時間)、以及共培養(yǎng)終止后的富含單核細胞的部分的樣品進行顯微鏡檢查。比較細胞在培養(yǎng)前后的差別。培養(yǎng)后，所述細胞應顯示出相對較大、不規(guī)則和顆粒。
觀察到的細胞顆粒是培養(yǎng)物在培養(yǎng)后非常特殊的特征。在相差顯微鏡下，這些顆粒呈高折光球體并呈淺藍色，可以容易地對其進行計數(shù)。在培養(yǎng)前，細胞內(nèi)的顆粒是罕見的，但在培養(yǎng)后卻很普遍，并可能是由所述培養(yǎng)物的培養(yǎng)和處理特異性誘導而來。分析所述顆粒的目的是為了獲得培養(yǎng)后巨噬細胞中細胞質(zhì)顆粒發(fā)生率的數(shù)量測定。所述分析提供很好的結(jié)果，即在需要進行其它質(zhì)量控制試驗以及制品包裝操作的時間內(nèi)剛好可以得到該結(jié)果。
通過分析計算機圖像，對所述顆粒進行計數(shù)。開始，所述顆粒值用所述樣品中每個細胞所含的顆粒平均數(shù)表示。但是，在分析多批制品后，發(fā)現(xiàn)所述顆粒在細胞間并不是正常分布，而且培養(yǎng)物的顆粒最好用在25％最多顆粒細胞(最多的1/4)中每個細胞的顆粒數(shù)目來表示。在考慮到中值和其它四分位數(shù)后，選取了最多的1/4。其中，發(fā)現(xiàn)這樣的最多1/4的顆粒的閾值每批間具有最小變異系數(shù)而且在顯示細胞在培養(yǎng)前后的統(tǒng)計學平均差異中是最靈敏的。其結(jié)果示于表1。
表1-培養(yǎng)前后細胞顆粒計數(shù)
根據(jù)這些結(jié)果，用最多1/4的細胞顆?！?個顆粒/細胞(即在25％最多顆粒細胞中至少4個顆粒)作為所述終制品用于病人的必要參數(shù)。通過這種方法測定的所有臨床批次和大多數(shù)研究批次在最多1/4部分的每個細胞中含有至少4個顆粒。采用至少為60個細胞的樣本量，選擇最多1/4部分的顆粒閾值作為測量參數(shù)以及每個細胞4個顆粒為下限，是基于對所述細胞在培養(yǎng)前后間差異的最大靈敏度的需要。所選擇的參數(shù)是檢查多個批次中最小變異系數(shù)的參數(shù)。這樣使對各樣品間(如培養(yǎng)前后的細胞間)真實差異的靈敏度最大化。
為了進行顆粒計數(shù)，從新鮮制備的“富含單核細胞”部分(培養(yǎng)前)取樣以及在一天后從“培養(yǎng)細胞”部分(培養(yǎng)后)取樣。每一部分的新鮮樣品進行顯微鏡檢查。將樣品放在顯微鏡玻片上，隨后放置至少15分鐘使所述細胞沉降，在顯微鏡下調(diào)整焦距。采用顯微鏡在100倍物鏡和相差下檢查所述細胞，并用數(shù)碼相機拍照。在蓋玻片下樣品區(qū)被分為4個象限，系統(tǒng)觀察每個象限以避免對同一細胞觀察兩次。對進入視野的細胞拍照直到每一象限拍照15個細胞。這樣每個樣品便得到60個細胞的照片。在每一拍照視野中，調(diào)節(jié)焦距使能看見的顆粒數(shù)目最大化。將所述數(shù)碼照片轉(zhuǎn)移到計算機中儲存，隨后進行分析。采用圖像分析軟件對細胞照片進行分析并評價顆粒。通過圖像分析的計算機圖像分析對所述顆粒進行計數(shù)。
在所有批次中，所述細胞與真皮培養(yǎng)后顆粒數(shù)有很明顯的增加。結(jié)果表明，在與真皮培養(yǎng)的細胞中平均顆粒增加超過200％。
由此可下的結(jié)論是細胞顆粒是反映所述巨噬細胞在培養(yǎng)中經(jīng)歷的表型變化的一個參數(shù)。
圖1A-1B分別是非顆粒型單核細胞(培養(yǎng)前)和顆粒型單核吞噬白細胞(培養(yǎng)后)的照片。
7f.培養(yǎng)物純度—通過流式細胞儀測定CD14通過流式細胞儀，用針對人CD14(一種已建立好的對人單核細胞/巨噬細胞有特異性的細胞表面標記)的單克隆抗體(mAb)監(jiān)控細胞培養(yǎng)物的純度。通過用市售的熒光色素綴合的mAb攻擊，對所述細胞進行標記，然后用PBS洗滌。對CD14陽性的細胞部分被用來測量培養(yǎng)物純度。分析培養(yǎng)前后所述參數(shù)。所培養(yǎng)的巨噬細胞培養(yǎng)物的純度作為產(chǎn)品合格標準，應為≥40％CD14+細胞，優(yōu)選60％或更高的CD14+細胞。
7g.甘露糖受體表達測定甘露糖受體(MR)是一個參與酵母細胞吞噬作用的碳水化合物綴合的膜蛋白。采用對人甘露糖受體特異性的市售熒光色素綴合的mAb，用流式細胞儀測定細胞表面所述甘露糖受體的存在。將所述細胞與所述mAb一起溫育，并按前述方法洗滌。對甘露糖受體陽性的細胞部分被認為是顯示了潛在的細胞吞噬活性以及細胞成熟。對培養(yǎng)前后的所述細胞都進行這項分析。
為了提高對所述MR表達量小而明顯增加的檢測能力，以三重試驗檢測從所述“富含單核細胞”部分(與真皮共培養(yǎng)前)中獲取的細胞。以雙重試驗檢測從與真皮共培養(yǎng)后獲取的細胞。以此方式，對兩組獨立的三重和雙重測試分別進行統(tǒng)計學分析。
將在21小時(共培養(yǎng)后)的兩組MR表達檢測結(jié)果與在0小時的三組檢測的結(jié)果相比。進行t-檢驗分析并在95-置信水平測定差異(在21小時的增加與在0小時的比較)的顯著性。當與培養(yǎng)前水平相比時，培養(yǎng)后細胞申存在的MR表達的統(tǒng)計學顯著性增加是有意義的，說明所述細胞培養(yǎng)物經(jīng)歷了特異性觸發(fā)需求并將在體內(nèi)持續(xù)發(fā)生神經(jīng)再生表型。
7h.ICAM-1表達測定細胞間相互作用部分是由粘著分子家族介導。胞間粘著分子(ICAM)是免疫球蛋白超基因家族結(jié)構(gòu)上相關的成員并且是白細胞上存在的β2整聯(lián)蛋白分子的配體。ICAM-1在內(nèi)皮細胞和一些淋巴細胞和單核細胞上是組成型表達的。在細胞因子(TNFα、IL-1β和IFN-γ)的存在下其表達顯著增加，因此顯示出與細胞活化的關系。而且，已報道ICAM-1的作用是作為在神經(jīng)損傷后巨噬細胞攝取的髓磷脂的共同刺激信號(Vougioukas等，2000，Involvement of intercellularadhesion molecule-1 in myelin recognition by macrophages(巨噬細胞的髓磷脂識別中涉及胞間粘著分子-1).Acta Neuropathol(Berl)，99673-79)。
采用市售的特異性mAb免疫標記細胞，用流式細胞儀進行分析，以測定CD14+細胞中所述ICAM-1受體的表達。在與皮膚共培養(yǎng)后的細胞中增強了所述ICAM-1受體的表達。
7i.白介素-1β測定IL-1β的產(chǎn)生是所述單核細胞與真皮培養(yǎng)的直接結(jié)果，而且該細胞因子是由終制品中的巨噬細胞分泌的。按照以下程序評價IL-1β水平將1.4×106共培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)移到無菌試管中，離心并重懸于IMDM中。將所述細胞懸液在5％CO2濕潤培養(yǎng)箱中于36-37℃培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)30分鐘后，將所述試管離心，通過ELISA，采用市售試劑盒檢測其IL-1β水平。計算每百萬被測定為CD14+細胞的巨噬細胞的結(jié)果。至少17pg/106CD14+細胞的結(jié)果是可接受的。
7j.BDNF測定通過ELISA，采用市售試劑盒如Human BDNF DuoSet Elisadevelopment System(R&D目錄號DY248)，測定細胞條件培養(yǎng)基中的BDNF水平。
分離人血源單核細胞，按上述方法與真皮一起培養(yǎng)。培養(yǎng)后，通過離心(380xg，10分鐘，10℃)收獲細胞。在1.4ml新鮮的IMDM中重新懸浮1.4×106個收獲細胞以制備適合細胞的培養(yǎng)基，然后在濕潤培養(yǎng)箱(5％CO2)中于37℃培養(yǎng)30分鐘。然后將所述培養(yǎng)基酸化(通過加入56μL 1M HCl)，5分鐘后，用56μL 1M NaOH中和。離心沉淀細胞后收集潷出的條件培養(yǎng)基并于-70℃冷凍直到測定。
采用所述BNDF試劑盒的同一供應商的合適市售ELISA檢測試劑盒，測定這些樣品中的其它神經(jīng)營養(yǎng)因子如NT-3和NT-4。
7k.IL-6測定通過ELISA，采用市售試劑盒，測定培養(yǎng)前所述單核細胞上清液和所獲取的活化巨噬細胞的上清液中的IL-6水平。培養(yǎng)后巨噬細胞分泌的細胞因子IL-6水平是培養(yǎng)前單核細胞的4-15倍。
實施例8.在患有完全脊髓損傷的病人中，活化巨噬細胞促進部分感覺和運動功能恢復。
在I期臨床試驗中，向脊髓損傷部位直接注射4,000,000個自體巨噬細胞(按上述實施例所描述的與真皮培養(yǎng)后)，對8名完全脊髓損傷病人(按照美國脊髓損傷協(xié)會的分類定為ASIA A)進行治療。他們中的3人恢復了運動和感覺功能并被重新歸類于ASIA C。與所述損傷類型有關的人員統(tǒng)計數(shù)據(jù)示于表2。運動和感覺評分、允許(開始)參與研究的病人的ASIA分類和所述病人最后隨訪的ASIA分類示于下表3。以相對于開始檢查的％增加值表示輕觸、針刺(疼痛)和運動的恢復。
按照迄今獲得的臨床發(fā)現(xiàn)，沒有發(fā)生與進行所述療法的相關不良事件。
已觀察到臨床功效的開始跡象。在3個病人發(fā)現(xiàn)明顯的感覺恢復和一些運動恢復，其中1號病人還達到了小便控制。
表2.完全脊髓損傷病人用局部注射自體活化巨噬細胞治療后的特征
表3.病人在允許(開始)參加本研究時和在最后隨訪時的運動和感覺評分和ASIA分類
相對于開始檢查。*手術中目測發(fā)現(xiàn)脊髓嚴重液化。**除了所述脊髓損傷外，這3個病人的運動評分還受到上肢損傷的影響。***這些結(jié)果表明，自體共培養(yǎng)人巨噬細胞經(jīng)體外測定證明顯示創(chuàng)傷-愈合表型。此外，已顯示這些巨噬細胞促進人CNS再生，正如這些細胞能促進其它組織傷口愈合的實施例一樣。
實施例9.給予培養(yǎng)的巨噬細胞作為急性心肌梗塞療法的效果下文用于檢測活化巨噬細胞在兩組Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(體重為300±20g)(Harlan Laboratories，Israel)的效果用含有2.5×106個巨噬細胞和DCCM1培養(yǎng)基的25μl懸液治療A組大鼠(12只大鼠)，而只用25μl DCCM1培養(yǎng)基治療B組大鼠(6只大鼠)。
按照本文描述的程序或按照美國專利第5,800,812號、第6,117,424號和第6,267,955號所描述的程序，生產(chǎn)所述活化大鼠巨噬細胞，給藥前，通過流式細胞儀檢測巨噬細胞培養(yǎng)物的純度和活性。
在SD大鼠中采用冠狀動脈結(jié)扎誘導心肌局部缺血。所導致的壞死組織大小約為50mm3，這樣的大小是我們通常在其它實驗中用懸浮于5μl DCCM1培養(yǎng)基中的約400,000個活化巨噬細胞治療的脊髓殘留部分大小的約6倍。
以盲法方式，由外科醫(yī)生將所述活化巨噬細胞植入到所述SD大鼠體內(nèi)。與用于治療脊髓橫切的大鼠約400,000個細胞的數(shù)量相比，使用約6倍劑量的活化巨噬細胞。因此，將外推的總有效劑量(懸浮于25μl DCCM1培養(yǎng)基的2.5×106個活化巨噬細胞)分為5個劑量，然后在誘導梗死后立即注射到心肌中向梗死中心注射一個劑量，接著在梗死與健康組織的邊緣注射另外4個劑量。使用Hamilton注射器，通過22G針頭進行所述注射。動物放在動物房中恢復，讓它們自由吃喝，并處于12/12小時光/暗周期下。隨后觀察結(jié)果持續(xù)6周。本研究中存活率是關鍵參數(shù)。
所述結(jié)果的評價是以盲法方式進行，采用Masson三色染色片，對左心室(LV)橫切片進行組織學評價，以評價梗塞區(qū)、LV腔直徑和LV質(zhì)量區(qū)。采用TUNEL染色片，評價細胞凋亡。進行巨噬細胞特異性染色，以評價正常心肌、邊緣心肌或梗塞心肌的存在和位置。通過免疫組織化學染色，用針對增殖細胞核抗原(PCNA)特異性單克隆抗體，測定有絲分裂指數(shù)。為了進行數(shù)據(jù)分析，對每個參數(shù)都進行統(tǒng)計學分析。
權(quán)利要求
1.一種制備人單核吞噬白細胞的方法，所述方法包括(i)從個體血樣中分離單核細胞，然后將所述單核細胞懸浮于合適培養(yǎng)基中，所述合適培養(yǎng)基在本文稱為“培養(yǎng)基”；(ii)處理來自同一個體的皮膚組織，去除表皮，將真皮部分在含有抗生素的培養(yǎng)基中進行超聲處理，將所述經(jīng)超聲處理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基中，然后用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基沖洗；(iii)將步驟(i)的單核細胞與步驟(ii)的經(jīng)沖洗的真皮部分共培養(yǎng)；(iv)去除所述培養(yǎng)混合物中的所述真皮部分，然后通過離心使所獲得的活化單核吞噬白細胞沉淀；(v)洗滌所述活化單核吞噬白細胞，然后將其重懸于所述培養(yǎng)基中；和(vi)評價所述培養(yǎng)物對人體給藥的適應性。
2.一種權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(ii)中處理所述人皮膚組織如下進行通過將來自所述個體的皮膚組織進行冷凍，解凍后將所述皮膚組織用由培養(yǎng)基和抗生素組成的洗滌液浸泡，在去除表皮之前切成小塊，從而獲得約0.1-5cm2、優(yōu)選約0.5-2cm2的真皮塊。
3.一種權(quán)利要求2的方法，其中將所述真皮塊轉(zhuǎn)移至無菌容器中并使其浸漬在含有抗生素的培養(yǎng)基中，將所述容器放在裝有去離子水的超聲浴中并進行超聲處理，然后將經(jīng)超聲處理的真皮塊浸泡在含有同樣抗生素的新鮮培養(yǎng)基中，最后用不含所述抗生素的新鮮培養(yǎng)基沖洗。
4.一種權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述培養(yǎng)基是IMDM或RPMI 1640，而所述抗生素是氧氟沙星、萬古霉素和慶大霉素。
5.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述真皮塊在超聲浴中以35-40kHz的頻率進行超聲處理。
6.一種權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(iii)中所述單核細胞與所述真皮塊的培養(yǎng)是在5％CO2的氛圍下于約36-38℃培養(yǎng)至多38小時，更優(yōu)選培養(yǎng)至多24小時。
7.一種權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述單核細胞和所述真皮塊均是自體的。
8.一種權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(ii)中用組織工程皮膚或組織工程皮膚等同物替代人皮膚組織。
9.一種權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中在步驟(vi)中通過至少以下試驗來評價所述活化人單核吞噬白細胞對人體給藥的適應性(a)無菌檢查；(b)細胞活力檢查；(c)細菌內(nèi)毒素試驗；(d)革蘭氏染色；(e)通過形態(tài)測量學分析的細胞質(zhì)顆粒計數(shù)；(f)存在CD14+細胞；和(g)IL-1β的分泌水平。
10.一種權(quán)利要求9的方法，其中通過一個或多個以下試驗進一步評價所述活化人單核吞噬白細胞對人體給藥的適應性甘露糖受體表達、ICAM-1表達、IL-6和BDNF的分泌。
11.一種權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所產(chǎn)生的活化人單核吞噬白細胞至少表現(xiàn)出下列特征(a)14天無菌；(b)采用錐蟲藍染色排除法，培養(yǎng)物活力至少為80％；(c)細菌內(nèi)毒素試驗，小于200Eu/ml；(d)革蘭氏染色，無細菌證據(jù)；(e)通過形態(tài)測量學分析，至少25％的最多顆粒的細胞中顯示每個細胞內(nèi)至少4個顆粒；(f)至少40％、優(yōu)選60％或60％以上的細胞為CD14陽性(CD14+)；和(g)所述細胞產(chǎn)生的IL-1β水平至少為17pg/106CD14+細胞。
12.一種權(quán)利要求11的方法，其中所產(chǎn)生的活化人單核吞噬白細胞還表現(xiàn)出下列特征中的一個或多個特征(h)所述活化細胞與其所來源的非活化單核細胞相比，在所述甘露糖受體表達方面呈統(tǒng)計學顯著性增加；(i)所述細胞以約200或更高的幾何平均熒光值表達所述ICAM-1受體；(j)所述細胞以高于10pg/106CD14+細胞的水平分泌BDNF；和(k)所述活化細胞與其所來源的非活化單核細胞相比，前者分泌的IL-6約為后者的4-15倍。
13.一種人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，所述人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物只要通過權(quán)利要求1-12中任一項的方法就能獲得。
14.一種人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，在相差顯微鏡下，至少25％的最多顆粒的細胞中顯示每個細胞內(nèi)至少4個顆粒。
15.一種權(quán)利要求14的人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，其中至少40％、優(yōu)選60％或60％以上的細胞為CD14+。
16.一種權(quán)利要求15的培養(yǎng)物，其中所述細胞產(chǎn)生的IL-1β水平至少為17pg/106CD14+細胞。
17.一種權(quán)利要求14的人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物至少表現(xiàn)出下列特征(a)14天無菌；(b)采用錐蟲藍染色排除法，培養(yǎng)物活力至少為80％；(c)細菌內(nèi)毒素試驗，小于200Eu/ml；(d)革蘭氏染色，無細菌證據(jù)；(e)通過形態(tài)測量學分析，至少25％的最多顆粒的細胞中顯示每個細胞內(nèi)至少4個顆粒；(f)至少40％、優(yōu)選60％或60％以上的細胞為CD14陽性(CD14+)；和(g)所述細胞產(chǎn)生的IL-1β水平至少為17pg/106CD14+細胞。
18.一種權(quán)利要求17的人單核吞噬白細胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物還表現(xiàn)出下列特征中的一個或多個特征(h)所述活化細胞與其所來源的非活化單核細胞相比，在所述甘露糖受體表達方面呈統(tǒng)計學顯著性增加；(i)所述細胞以約200或更高的幾何平均熒光值表達所述ICAM-1受體；(j)所述細胞以高于10pg/106CD14+細胞的水平分泌BDNF；和(k)所述活化細胞與其所來源的非活化單核細胞相比，前者分泌的IL-6約為后者的4-15倍。
19.一種細胞治療制劑，所述制劑包含權(quán)利要求13的活化人單核吞噬白細胞和藥學上可接受的載體。
20.一種細胞治療制劑，所述制劑包含權(quán)利要求14-19中任一項的活化人單核吞噬白細胞和藥學上可接受的載體。
21.一種權(quán)利要求19或20的細胞治療制劑，所述制劑用于傷口愈合。
22.一種權(quán)利要求21的細胞治療制劑，所述制劑用于慢性皮膚潰瘍愈合。
23.一種權(quán)利要求19或20的細胞治療制劑，所述制劑用于促進軸突再生。
24.一種權(quán)利要求23的細胞治療制劑，所述制劑在由CNS的軸突損傷引起的或伴有所述損傷的損傷或疾病后促進軸突再生。
25.一種權(quán)利要求24的細胞治療制劑，其中所述損傷位于脊髓。
26.一種權(quán)利要求19或20的細胞治療制劑，所述制劑用于減小心肌梗塞病例的壞死組織體積。
27.一種用于促進個體受傷脊髓的軸突再生的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的一種權(quán)利要求13-18中任一項的自體活化單核吞噬白細胞培養(yǎng)物或一種權(quán)利要求19或20的細胞治療制劑。
28.一種權(quán)利要求27的方法，其中將所述細胞給予脊髓實質(zhì)的損傷部位或其附近，或者靜脈內(nèi)給予所述細胞。
29.一種使傷口愈合的方法，所述方法包括給予有需要的病人有效量的一種權(quán)利要求13-18中任一項的活化單核吞噬白細胞培養(yǎng)物或一種權(quán)利要求19或20的細胞治療制劑，給藥途徑是給藥到所述傷口或者靜脈內(nèi)給藥。
30.一種權(quán)利要求29的方法，所述方法用于使慢性皮膚潰瘍愈合，例如使糖尿病性傷口潰瘍和慢性腿部潰瘍愈合。
31.一種減小心肌梗塞病例的壞死組織體積的方法，所述方法包括給予有需要的病人有效量的權(quán)利要求13-18中任一項的單核吞噬白細胞或一種權(quán)利要求19或20的細胞治療制劑，優(yōu)選在所述梗塞發(fā)生的相對早期給藥，給藥途徑是給藥到心肌原位或者靜脈內(nèi)給藥。
32.一種權(quán)利要求27-31中任一項的方法，其中所述單核吞噬白細胞是自體的。
33.一種凈化皮膚組織的方法，所述方法包括在含有抗生素的合適培養(yǎng)基中超聲處理皮膚組織。
34.一種權(quán)利要求33的方法，其中所述皮膚組織是真皮。
全文摘要
一種制備人單核吞噬白細胞的方法，所述方法包括將從個體血樣中分離的單核細胞與來自同一個體的皮膚組織一起培養(yǎng)，去除所述培養(yǎng)混合物中的真皮部分，通過離心將所獲得的活化單核吞噬白細胞沉淀，洗滌所述活化巨噬白細胞并將其重懸于所述培養(yǎng)基中，然后評價所述培養(yǎng)物對人體給藥的適應性。細胞治療制品用所得培養(yǎng)物進行制備，并且用于促進CNS軸突再生、傷口愈合和治療心肌梗塞。
文檔編號A61K45/00GK1615357SQ02827144
公開日2005年5月11日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者V·富爾加, R·克萊納巴基梅, I·阿什, M·埃申巴奇－施瓦茨 申請人:耶達研究及發(fā)展有限公司