專利名稱：二異丙氧基磷?；募柞ゼ捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二異丙氧基磷酰化二肽甲酯及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及二異丙氧基磷酰化二肽甲酯及其制備方法和以其為活性成分的藥物。
背景技術(shù)：
細胞凋亡，也叫程序性細胞死亡，是由發(fā)育生物學(xué)家Lockshin和Williams在1965年首先提出的，它是指多細胞有機體為調(diào)控有機體發(fā)育，維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動死亡過程。作為一種生理性細胞消亡方式，凋亡普遍存在于生物界。癌癥的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡失衡有密切關(guān)系，它不僅是細胞增殖失控和細胞分化異常的結(jié)果，同時也與腫瘤細胞凋亡失衡有關(guān)，已有證據(jù)表明細胞凋亡受阻可能是癌癥發(fā)病機制之一。隨著凋亡研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)目前使用的化療藥物除了通過作用于核酸、微管蛋白和其他靶點來殺傷腫瘤細胞外，也可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞，特異性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可能是癌癥治療中最具有廣闊前景的嘗試。近年來，腫瘤細胞凋亡誘導(dǎo)劑已成為癌癥研究領(lǐng)域的熱點，有報道二肽甲酯類化合物可以誘導(dǎo)人類U937細胞、HL60，THP-1脊髓瘤等細胞系的凋亡，但機理尚不十分明確。
磷?；且环N具有較高生物活性的基團，在肽類原有的結(jié)構(gòu)上引入磷酰基可能會出現(xiàn)新的生物活性或者是使原有的生物活性提高。N-磷酰肽具有重要的生物活性和藥用價值。但是到目前為止，尚沒有關(guān)于其能夠抑制癌癥細胞增殖的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的腫瘤細胞凋亡誘導(dǎo)劑二異丙氧基磷?；募柞ァ?br> 本發(fā)明所提供的二異丙氧基磷?；募柞ビ赏ㄊ?I)所示的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成。
其中aa1，aa2既可為L-氨基酸，也可為D-氨基酸。
例如，當aa1為L-Val，aa2為L-Phe，本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)式為
本發(fā)明的第二個目的是提供一種合成二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔锏姆椒?。
一種制備二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔锏姆椒?，是將二異丙基亞磷酸酯(DIPPH)-氨基酸和氨基酸甲酯鹽酸鹽反應(yīng)生成二異丙氧基磷酰化二肽甲酯類化合物。
所述二異丙基亞磷酸酯-氨基酸和氨基酸甲酯鹽酸鹽的反應(yīng)步驟是向4mmol L-氨基酸甲酯鹽酸鹽、4mmol NMM和10ml四氫呋喃的混合物中加入4.2mmol N-磷酰氨基酸和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC與5ml四氫呋喃的混合溶液，反應(yīng)后過濾，殘余物用THF洗滌，除去溶劑，殘余物加飽和NaHCO3溶液，攪拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌，干燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，殘余物用硅膠柱層析或重結(jié)晶方法純化，得到所需產(chǎn)物。具體說是在50ml燒瓶中加入4mmol L-氨基酸甲酯鹽酸鹽、4mmol NMM和10ml干燥的四氫呋喃，攪拌下加入4.2mmol N-磷酰氨基酸和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC與5ml干燥的四氫呋喃的混合溶液，室溫反應(yīng)過夜后過濾，殘余物用THF洗滌三次，合并濾液和洗液，旋蒸除去溶劑，殘余物加飽和NaHCO3溶液，充分攪拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌三次，無水Na2SO4干燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，殘余物用硅膠柱層析或重結(jié)晶方法純化，得到所需產(chǎn)物。
所述二異丙基亞磷酸酯-氨基酸的合成包括以下步驟1)酸堿中和法合成二異丙基亞磷酸酯；2)合成二異丙基亞磷酸酯-氨基酸。
其中所述酸堿中和法合成二異丙基亞磷酸酯是向230ml異丙醇及100ml CCl4混合液中滴加87ml PCl3，反應(yīng)后調(diào)pH至6～7，分液，萃取水相，合并有機相，收集80℃/10mmHg餾分。具體的說是在1000ml三頸瓶中加入3mol異丙醇(230ml)及100mlCCl4，裝上回流冷凝管和配有干燥管的氣體吸收裝置，室溫下不斷攪拌，中速滴加1molPCl3(87ml)，約需1小時，加入過程中自動放熱使CCl4回流，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至6～7，分液，用100ml CCl4萃取水相，合并有機相，無水MgSO4干燥，旋去低沸物，減壓蒸餾，收集80℃/10mmHg餾分。所述合成二異丙基亞磷酸酯-氨基酸是將10mmol二異丙基亞磷酸酯與5ml CCl4的混合液滴入由10mmol氨基酸、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺組成的混合液中，反應(yīng)后除去有機溶劑，加入10ml水，用有機溶劑洗滌，棄去有機相，將水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，除去有機溶劑，得到產(chǎn)品，具體步驟的說是在冰鹽浴及攪拌下，將10mmol DIPPH與5ml CCl4的混合液滴入由10mmol氨基酸、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺組成的混合液中，約10分鐘滴完，繼續(xù)于冰浴下攪拌反應(yīng)30分鐘，室溫下反應(yīng)20分鐘，在35℃旋蒸除去有機溶劑，然后加入10ml水，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯各洗滌兩次，棄去有機相。冰鹽浴下用1N HCl將水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌2次，無水硫酸鎂干燥，于35℃旋蒸除去有機溶劑，再用油泵抽干得到產(chǎn)品。若產(chǎn)品不純，固體可用乙酸乙酯～石油醚(30～60℃)重結(jié)晶，油狀液體可用柱層析純化。
所述氨基酸甲酯鹽酸鹽的合成方法有兩種，一種是50mmol氨基酸和50ml甲醇，攪拌下通入HCl氣體直至固體全部溶解，反應(yīng)后減壓濃縮至干，殘余物用甲醇-乙醚重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。另一種是向-10℃的50ml甲醇中滴加二氯亞砜13ml，攪拌加入50mmol L-氨基酸，室溫下攪拌反應(yīng)，減壓旋蒸至干，殘余物用甲醇-乙醚重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。這兩種方法具體的說，第一種為在100ml燒瓶中加入50mmol L-氨基酸和50ml干燥甲醇，攪拌下通入干燥HCl氣體直至固體全部溶解，室溫放置過夜。減壓濃縮至干，再加入適量甲醇，反復(fù)濃縮三次以除去HCl，殘余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品；第二種為在100ml燒瓶中加入干燥甲醇50ml，冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜13ml。滴加過程中維持溫度在0℃以下，繼續(xù)攪拌10分鐘，加入50mmol L-氨基酸。半小時后撤去冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)，用TLC(硅膠GF254，展開劑叔丁醇∶乙醇∶25％氨水∶水＝5∶6∶1∶3)跟蹤監(jiān)測，直至原料點消失。減壓旋蒸至干，再加入適量甲醇，反復(fù)濃縮三次以除去HCl，殘余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種治療癌癥的藥物。
本發(fā)明提供的治療癌癥的藥物，其活性成分是二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔铩?br> 需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明藥物的用量一般為20-50mg/kg體重。
二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔锟梢酝ㄟ^誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，達到抑制腫瘤細胞增殖，治療癌癥的目的。實驗表明，二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔锞哂屑毎鲋骋种苹钚?，例如，(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3、DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3、DIPP-L-Leu-L-Phe-OCH3、DIPP-L-Ile-L-Phe-OCH3、DIPP-L-Phe-L-Leu-OCH3、(DIPP-L-Phe)2-L-Lys-OCH3、DIPP-L-Phe-L-Phe-OCH3作用24小時后，對K562細胞系增殖抑制活性的半數(shù)有效濃度(IC50)分別為16.2μg/ml、34.68μg/ml、43.54μg/ml、43.77μg/ml、71.40μg/ml、32.69μg/ml以及73.02μg/ml。本發(fā)明從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)兩個方面研究二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔飳562細胞凋亡的影響。利用Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察到二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔镒饔煤蟮腒562細胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征；其總DNA在瓊脂糖凝膠電泳顯示出明顯的“梯狀”條帶；Annexin v-FITC和PI雙染利用流式細胞儀檢測到早期的凋亡細胞。證實二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔锞哂姓T導(dǎo)K562細胞凋亡的活性。
下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的作用濃度與K562細胞增殖抑制率關(guān)系曲線。
圖2為熒光顯微鏡下(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用后的K562細胞核。
圖3為(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3誘導(dǎo)的K562細胞DNA在核小體間斷裂的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為PI單染檢測K562細胞早期凋亡。
圖5為AnnexinV-FITC和PI雙染檢測K562細胞早期凋亡。
具體實施例方式
實施例1、(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的合成1.酸堿中和法合成二異丙基亞磷酸酯(DIPPH)1000ml三頸瓶中加入3mol異丙醇(230ml)及100ml CCl4，裝上回流冷凝管和配有干燥管的氣體吸收裝置，室溫下不斷攪拌，中速滴加1mol PCl3(87ml)，約需1小時，加入過程中自動放熱使CCl4回流，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至6～7，分液，用100ml CCl4萃取水相，合并有機相，無水MgSO4干燥，旋去低沸物，減壓蒸餾，收集80℃/10mmHg餾分。
產(chǎn)率72％。
結(jié)構(gòu)鑒定31P NMR(ppm)4.9(s)。
1H-NMRδ1.3～1.6(d，12H，OCH3×4)，4.5～5.2(m，2H，OCH×2)，6.9(d，1H，PH)ppmESI-MS(m/z)167[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
2.DIPP-L-Leu的合成在冰鹽浴及攪拌下，將10mmol DIPPH與5ml CCl4的混合液滴入由10mmol L-Leu、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺組成的混合液中，約10分鐘滴完，繼續(xù)于冰浴下攪拌反應(yīng)30分鐘，室溫下反應(yīng)20分鐘，在35℃旋蒸除去有機溶劑，然后加入10ml水，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯各洗滌兩次，棄去有機相。冰鹽浴下用稀HCl將水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌2次，無水硫酸鎂干燥，于35℃旋蒸除去有機溶劑，再用油泵抽干得到產(chǎn)品。
產(chǎn)率85％結(jié)構(gòu)鑒定31P NMR(ppm)4.9(s)ESI-MS(m/z)167[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
3.L-Lys-OCH3的合成在100ml燒瓶中加入干燥甲醇50ml，冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜13ml。滴加過程中維持溫度在0℃以下，繼續(xù)攪拌10分鐘，加入50mmol L-Lys。半小時后撤去冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)，用TLC(硅膠GF254，展開劑叔丁醇∶乙醇∶25％氨水∶水＝5∶6∶1∶3)跟蹤監(jiān)測，直至原料點消失。減壓旋蒸至干，再加入適量甲醇，反復(fù)濃縮三次以除去HCl，殘余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。
產(chǎn)率79％結(jié)構(gòu)鑒定ESI-MS(m/z)161.2[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
4.(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的合成在50ml燒瓶中加入4mmol L-Lys-OCH3、8mmol NMM和10ml干燥的四氫呋喃，攪拌下加入8.4mmol DIPP-Leu和8.4mmol HOBt，冰水浴下滴加8.4mmol DCC與10ml干燥的四氫呋喃的混合溶液，室溫反應(yīng)過夜后過濾，殘余物用THF洗滌三次，合并濾液和洗液，旋蒸除去溶劑，殘余物加飽和NaHCO3溶液，充分攪拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌三次，無水Na2SO4干燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，用硅膠柱層析得到產(chǎn)品。
產(chǎn)率67％結(jié)構(gòu)鑒定31P NMR(CHCl3)6.55ppm1H NMR(CDCl3)δ0.95(d，12H，Leucine CH3×4)，1.28(m，24H，i-propyl CH3×8)，1.40～1.95(m，10H，Lysine γ-CH2，δ-CH2，β-CH2，Leucine-CH2)，2.50(m，1H，Leucine γ-CH)，3.24(t，2H，Lysineε-CH2)，3.71(m，2H，Leucine α-CH×2)，3.73(s，3H，0CH3)，4.10(m，2H，Leucine NH×2)，4.57(m，5H，OCH×4and Lysine α-CH)，7.28(s，1H，Lysine ε-NH)，7.40(d，1H，Lysine α-NH)ppmESI-MS(m/z)715.6[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的合成路線如下式所示
實施例2、(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3誘導(dǎo)細胞凋亡的活性研究1.細胞增殖抑制活性IC50K562細胞經(jīng)不同濃度的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用24小時后，細胞增殖受到影響，從表1和圖1中可以看出，細胞增殖抑制活性的半數(shù)有效濃度(IC50)為16.2μg/ml。
表1、(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3對K562細胞的增殖抑制率(IR)
1μg/ml5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml40μg/ml 80μg/mlIR％ 15.76 21.15 33.34 58.79 66.47 72.36注陽性對照順鉑在50μg/ml作用濃度時對K562細胞的體外增殖抑制率為75.54％實施例3、Hoechst33258染色檢測(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3對細胞核的影響取指數(shù)生長期的K562細胞，以2×105個/ml的密度接種于6孔板中，3ml/well，于37℃，5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后加入樣品溶液，設(shè)10μg/ml和40μg/ml兩個濃度(孔中甲醇終濃度為1％)，同時設(shè)陰性對照(僅含1％的甲醇)和陽性對照(50μg/ml的順鉑)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，2000rpm，4℃，離心5分鐘收集細胞，用PBS洗一次。加入0.5％KCl溶液500μl，室溫靜置15分鐘，使細胞溶脹，胞膜通透性增強，有利于染料滲入。離心除去上清，向沉淀的細胞中加入固定液100μl，4℃固定10分鐘。將細胞打勻，約20μl滴于載玻片上，待固定液揮發(fā)干后，加一滴5μg/ml的Hoechst33258染料，蓋上蓋玻片，將熒光顯微鏡的激發(fā)光調(diào)至紫外光，觀察并照相(20×10)。
如圖2所示，K562細胞在10μg/ml的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3處理24小時后，部分細胞核變小、皺縮，可見致密強熒光，反映了凋亡早期染色質(zhì)的變化情況(C)；當(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3濃度為40μg/ml時，部分細胞核熒光呈顆粒狀(D)，與陽性對照相一致(B)；而陰性對照細胞核所發(fā)熒光較弱且均勻(A)。
實施例4、瓊脂糖凝膠電泳檢測(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3對DNA降解的影響取指數(shù)生長期的K562細胞，以2×105個/ml的密度接種于6孔板中，3ml/well，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后加入樣品溶液，設(shè)1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml和40μg/ml四個濃度(孔中甲醇終濃度為1％)，同時設(shè)陰性對照(僅含1％的甲醇)和陽性對照(50μg/ml的順鉑)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，2000rpm，4℃，離心5分鐘收集細胞，用PBS洗一次。向各組細胞沉淀中加200μl細胞裂解液，37℃反應(yīng)過夜，以裂解細胞蛋白。
次日，加入高濃度的NaCl溶液，使之終濃度為1.5mol/L，-20℃放置2個小時后，12000rpm，4℃，離心30分鐘除去蛋白質(zhì)。向上清中加入無水乙醇至終濃度為75％，-20℃放置2個小時使DNA沉淀析出。12000rpm，4℃，離心30分鐘，所得沉淀即為總DNA，在通風(fēng)櫥內(nèi)將乙醇溶液揮干。向DNA沉淀中加入TE緩沖液使之溶解，再加入1mg/ml RNA酶(使其終濃度為200μg/ml)，37℃反應(yīng)2小時以除去RNA。
向上述DNA溶液中加入上樣緩沖液，混勻，取15μl加到2％瓊脂糖凝膠上樣孔中，于1×TBE緩沖液中，恒壓70V，電泳3小時。用5μg/mlEB染色10分鐘，在紫外透射反射儀下檢測，并利用電泳凝膠自動成像系統(tǒng)拍照。
結(jié)果如圖3所示，其中A為100bpDNA分子量標準，B為未處理的K562細胞，C為陽性對照(50μg/ml的順鉑)，D-G分別為經(jīng)1，5，20，40μg/ml的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3處理24h的K562細胞。結(jié)果表明，K562細胞經(jīng)不同濃度的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用24小時后，其DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示出細胞凋亡時典型的“梯狀”條帶，并且隨著作用濃度的增加，梯狀條帶越明顯。進一步證明了(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3具有誘導(dǎo)K562細胞凋亡的活性。
實施例5、流式細胞儀碘化丙啶單染法檢測(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3對細胞周期的影響取對數(shù)生長期的K562細胞，以2×105個/ml的密度接種于12孔板，1ml/well，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后加入樣品溶液，設(shè)1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml六個濃度(孔中甲醇終濃度為1％)，同時設(shè)陰性對照(僅含1％的甲醇)和陽性對照(50μg/ml的順鉑)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，2000rpm，4℃，離心5分鐘收集細胞，用PBS洗一次，70％的乙醇固定過夜，加入200μl 1mg/ml的RNA酶A，37℃反應(yīng)2小時以除去RNA。5000rpm，4℃，離心5分鐘收集細胞，加入200μl5mg/ml PI染色液，4℃，避光染色30min，加400μl PBS稀釋后，利用流式細胞儀測定細胞內(nèi)DNA分布情況，單光束，激發(fā)波長為488nm。
未處理的細胞經(jīng)碘化丙啶染色后在流式細胞儀直方圖上的2倍體峰、4倍體峰以及介于2倍體和4倍體之間的區(qū)段，分別代表處于細胞周期的G0/G1期、G2/M期和S期；當細胞發(fā)生凋亡時，在流式細胞儀上會出現(xiàn)一群DNA含量少于2倍體的細胞，在流式細胞儀直方圖2倍體峰之前，形成亞二倍體峰，稱為SubG0期細胞。圖4表明，K562細胞經(jīng)不同濃度的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用24小時后，流式細胞儀直方圖上出現(xiàn)亞二倍體峰，并且隨著作用濃度的升高，相應(yīng)的亞二倍體峰也逐漸升高。
實施例5、流式細胞儀異硫氰酸熒光素標記的連接素(AnnexinV-FITC)和碘化丙碇(PI)雙染檢測(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3對細胞膜的影響取對數(shù)生長期的K562細胞，以2×105個/ml的密度接種于12孔板，1ml/well，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后加入樣品溶液，設(shè)10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml四個濃度(孔中甲醇終濃度為1％)，同時設(shè)陰性對照(僅含1％的甲醇)和陽性對照(50μg/ml的順鉑)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，2000rpm，4℃，離心5分鐘收集細胞，用1×binding buffer清洗細胞一次。將細胞重新懸浮于200μl的binding buffer中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，室溫下避光反應(yīng)5～15分鐘，利用流式細胞儀進行分析，單光束，激發(fā)波長為488nm。
正常細胞磷脂在胞膜內(nèi)外表面之間呈不對稱分布，凋亡早期時，細胞膜內(nèi)表面的PS外翻至細胞膜外表面，在Ca2+存在時與外環(huán)境中的AnnexinV-FITC結(jié)合發(fā)出綠色熒光，并且由于此時細胞仍維持其膜的完整性，使變性染色質(zhì)著色的熒光染料PI不能進入細胞；壞死或凋亡晚期繼發(fā)性壞死的細胞由于細胞膜已經(jīng)失去其完整性同時能夠AnnexinV-FITC和PI結(jié)合；機械性損傷的細胞只能與PI結(jié)合，這樣在流式細胞儀直方圖上就會出現(xiàn)四個細胞群體，分別用E1、E2、E3、E4區(qū)代表。在圖5中A為陰性對照(1％的甲醇)；B為陽性對照(50μg/ml的順鉑)；C為10μg/ml(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3；D為20μg/ml(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3；E為40μg/ml(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3；F為80μg/ml(DIPP-L-Leu)x-L-Lys-OCH3E1區(qū)代表機械性損傷的細胞；E2區(qū)代表壞死細胞或晚期凋亡繼發(fā)性壞死細胞；E3區(qū)代表正常活細胞；E4代表早期凋亡細胞。結(jié)果表明，(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用后的K562細胞在流式細胞儀上可以檢測到早期的凋亡細胞(E4區(qū))。從而有力地證明了(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3具有誘導(dǎo)K562細胞凋亡的作用。
綜合以上實驗結(jié)果，無論是從形態(tài)學(xué)還是從生物化學(xué)角度的檢測方法，都證實了(DIPP-Leu)2-Lys-OCH3具有誘導(dǎo)K562細胞凋亡的活性?？梢杂糜谝种瓢┌Y細胞增殖，治療癌癥。
實施例6，DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3的合成及細胞凋亡活性研究DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3的合成路線為
具體合成步驟如下所述1.酸堿中和法合成二異丙基亞磷酸酯(DIPPH)1000ml三頸瓶中加入3mol異丙醇(230ml)及100ml CCl4，裝上回流冷凝管和配有干燥管的氣體吸收裝置，室溫下不斷攪拌，中速滴加1mol PCl3(87ml)，約需1小時，加入過程中自動放熱使CCl4回流，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至6～7，分液，用100ml CCl4萃取水相，合并有機相，無水MgSO4干燥，旋去低沸物，減壓蒸餾，收集80℃/10mmHg餾分。
產(chǎn)率72％。
結(jié)構(gòu)鑒定31P NMR(ppm)4.9(s)。
1H-NMRδ1.3～1.6(d，12H，OCH3×4)，4.5～5.2(m，2H，OCH×2)，6.9(d，1H，PH)ppmESI-MS(m/z)167[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
2.DIPP-L-Val的合成在冰鹽浴及攪拌下，將10mmol DIPPH與5ml CCl4的混合液滴入由10mmol L-Val、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺組成的混合液中，約10分鐘滴完，繼續(xù)于冰浴下攪拌反應(yīng)30分鐘，室溫下反應(yīng)20分鐘，在35℃旋蒸除去有機溶劑，然后加入10ml水，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯各洗滌兩次，棄去有機相。冰鹽浴下用稀HCl將水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌2次，無水硫酸鎂干燥，于35℃旋蒸除去有機溶劑，再用油泵抽干得到產(chǎn)品。
產(chǎn)率88％結(jié)構(gòu)鑒定31P NMR(ppm)7.7(s)ESI-MS(m/z)282.2[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
3.L-Phe-OCH3的合成在100ml燒瓶中加入干燥甲醇50ml，冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜13ml。滴加過程中維持溫度在0℃以下，繼續(xù)攪拌10分鐘，加入50mmol L-Phe。半小時后撤去冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)，用TLC(硅膠GF254，展開劑叔丁醇∶乙醇∶25％氨水∶水＝5∶6∶1∶3)跟蹤監(jiān)測，直至原料點消失。減壓旋蒸至干，再加入適量甲醇，反復(fù)濃縮三次以除去HCl，殘余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。
產(chǎn)率85％
結(jié)構(gòu)鑒定ESI-MS(m/z)180.3[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
4.DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3的合成在50ml燒瓶中加入4mmol L-Phe-OCH3、4mmol NMM和10ml干燥的四氫呋喃，攪拌下加入4.2mmol DIPP-Val和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC與10ml干燥的四氫呋喃的混合溶液，室溫反應(yīng)過夜后過濾，殘余物用THF洗滌三次，合并濾液和洗液，旋蒸除去溶劑，殘余物加飽和NaHCO3溶液，充分攪拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌三次，無水Na2SO4干燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，用硅膠柱層析得到產(chǎn)品。
產(chǎn)率75.7％結(jié)構(gòu)鑒定31P NMR(CHCl3)6.68ppm1H NMR(CDCl3)δ0.74～0.94(d×d，6H，Valine CH3×2)，1.26(m，12H，i-PropylCH3×4)，2.16(m，1H，Valine β-CH)3.03～3.12(m，3H，Phenylalanine β-CH2and Valine α-CH)，3.52(d×t，1H，Phenylalanine α-CH)，3.68(s，3H，OCH3)，4.51～4.60(m，2H，OCH)，4.83～4.87(q，1H，Valine NH)，6.86～6.90(d，1H，Phenylalanine NH)，7.12～7.26(m，5H，Ph-H)ppmESI-MS(m/z)443.3[M+H]+證明所得結(jié)果正確。
DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3對K562細胞增殖抑制活性的半數(shù)有效濃度(IC50)為34.68μg/ml。
權(quán)利要求
1.二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔铮赏ㄊ?I)所示的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，其中aa1、aa2為氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于結(jié)構(gòu)單元中aa1，aa2為L-氨基酸。
3.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，是將二異丙基亞磷酸酯-氨基酸和氨基酸甲酯鹽酸鹽反應(yīng)生成二異丙氧基磷酰化二肽甲酯類化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述二異丙基亞磷酸酯-氨基酸和氨基酸甲酯鹽酸鹽的反應(yīng)步驟是向4mmol L-氨基酸甲酯鹽酸鹽、4mmol NMM和10ml四氫呋喃的混合物中加入4.2mmol N-磷酰氨基酸和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC與5ml四氫呋喃的混合溶液，反應(yīng)后過濾，殘余物用THF洗滌，除去溶劑，殘余物加飽和NaHCO3溶液，攪拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌，干燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，殘余物用硅膠柱層析或重結(jié)晶方法純化，得到所需產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的二異丙基亞磷酸酯-氨基酸的合成包括以下步驟1)酸堿中和法合成二異丙基亞磷酸酯；2)合成二異丙基亞磷酸酯-氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述酸堿中和法合成二異丙基亞磷酸酯的具體步驟是向230ml異丙醇及100ml CCl4混合液中滴加87ml PCl3，反應(yīng)后調(diào)pH至6～7，分液，萃取水相，合并有機相，收集80℃/10mmHg餾分；所述合成二異丙基亞磷酸酯-氨基酸的具體步驟是將10mmol二異丙基亞磷酸酯與5ml CCl4的混合液滴入由10mmol氨基酸、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺組成的混合液中，反應(yīng)后除去有機溶劑，加入10ml水，用有機溶劑洗滌，棄去有機相，將水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，除去有機溶劑，得到產(chǎn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述氨基酸甲酯鹽酸鹽的合成方法是50mmol氨基酸和50ml甲醇，攪拌下通入HCl氣體直至固體全部溶解，反應(yīng)后減壓濃縮至干，殘余物用甲醇-乙醚重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述氨基酸甲酯鹽酸鹽的合成方法是向-10℃的50ml甲醇中滴加二氯亞砜13ml，攪拌加入50mmol L-氨基酸，室溫下攪拌反應(yīng)，減壓旋蒸至干，殘余物用甲醇-乙醚重結(jié)晶，得到產(chǎn)品。
9.一種抗癌藥物，其活性成分是二異丙氧基磷?；募柞?。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述藥物中還含有人體可接受的藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了二異丙氧基磷?；募柞ゼ捌渲苽浞椒ê鸵云錇榛钚猿煞值乃幬?。此種藥物的活性成分是二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔铮浣Y(jié)構(gòu)單元為通式(I)的化合物。二異丙氧基磷?；募柞ヮ惢衔锏闹苽浞椒ㄊ菍IPP－L－氨基酸和L－氨基酸甲酯鹽酸鹽作用生成DIPP二肽甲酯。二異丙氧基磷酰化二肽甲酯類化合物的主要用途是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞增殖，治療癌癥等作用。
文檔編號A61P35/00GK1515586SQ0310017
公開日2004年7月28日 申請日期2003年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月8日
發(fā)明者蔣宇揚, 杜偉, 牛艷玲, 曹勝利, 趙玉芬 申請人:清華大學(xué)