專利名稱：鞋式導管在體局部導入基因的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學技術，涉及一種基因導入的方法，特別涉及一種鞋式導管在體局部導入基因的方法。
背景技術：
如何將目的基因藥物定位導入活體動物心血管等靶點部位，從而達到抑制某些基因的表達，這是使用基因藥物防治心血管疾病的關鍵步驟。雖然目前逆轉錄病毒、腺病毒、病毒脂質體等基因轉移方法，在動物實驗中取得可喜的效果[1，2，3]，但由于存在許多不可預料的毒副作用[1]，用于在體導入基因受到很大限制，很難用于臨床，直接外膜在體導入基因藥物，雖然動物實驗可行[4]，但很難用于臨床。用球囊導管向血管局部直接導入目的基因是一種定向、直接、簡易、毒副作用小，且更為實用的方法，但目前這方面的研究鮮見報導，有待進一步研究[1]。鞋式導管是最近研究生產(chǎn)的一種局部給藥導管，已開始用于臨床局部給藥，該導管的特點是有兩個不同的壓力通道，可分別進行血管成形和給藥，經(jīng)外鞘可送入任何型號的標準血管成形導管，球囊擴張和給藥可一次完成。該導管是否可成為局部導入基因藥物的工具目前仍未見報導。如何用此導管導入基因？方法如何？能否達到抑制體內基因的表達等，尚不清楚。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是鞋式導管在體局部導入基因的方法，至少包括以下步驟第一步采用鞋式導管，先經(jīng)鞘管內腔送入標準血管成形導管，在靶點血管處，球囊成形后，松球囊，然后將外鞘尖端給藥區(qū)和PTCA球囊導管一起送至球囊血管成形處，再打起PTCA球囊導管(1.5atm)后，經(jīng)三通聯(lián)接管用壓力泵經(jīng)外鞘局部給藥于損傷處血管壁；經(jīng)血管局部導入同位素锝99測定血管局部濃度，評價局部給藥的可行性；第二步經(jīng)鞋式導管在體導入c-myc反義寡核苷酸1)寡核苷酸的合成核苷酸序列選自人的c-myc基因第二外顯子中(從4521到4536)的15個核苷酸；c-myc正義核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反義核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸鹽修飾核苷酸，PAGE純度(摩爾比)99％；2)用苯巴比妥耳緣靜脈麻醉(30mg/kg)，常規(guī)消毒后，先分離、暴露活體物的右股動脈，作一小切口后，經(jīng)股動脈放入帶有標準血管成形導管(球囊直徑3.0mm)的鞋式導管，將導管送至腹主動脈中、下端時，通過壓力泵使標準血管成形導管的球囊充盈(6atm)后，強行將其緩慢回撤至切口處，如此反復進行3次；每次30-60秒，造成血管壁內膜損傷，然后松球囊，使之退入鞋式導管鞘內，連同鞋式導管的尖端一并送至髂動脈處，打起球囊(1.5ml)，經(jīng)鞘管尖端導入c-myc反義寡核苷酸426umol/L(0.5ml)后，經(jīng)三通開關給生理鹽水1.5ml，給藥時間＜30秒，所用壓力為5atm，給藥后局部做標記，從切口處結扎股動脈，外科縫合，關閉切口；3)經(jīng)鞋式導管局部導入基因藥物c-myc反義寡核苷酸觀察在體表達效應評價是否能導入基因藥物，導入基因藥物是否在體表達。
本發(fā)明的鞋式導管定向在體局部導入基因藥物的方法，其定位準確、直接導向心血管靶點、簡易、無毒副作用，且可用于臨床，該鞋式導管局部導入靶點的藥物濃度，在一定范圍內呈壓力依賴性，且藥物可在局部高濃度持續(xù)存在至少24小時，在體局部導入的基因藥物可抑制體內某些基因的表達，達到防治心血管疾病的作用。采用鞋式導管向損傷的髂動脈壁內定和導入的c-myc反義寡核苷酸可抑制動脈血管壁損傷后c-myc原癌基因的超常表達，抑制血管平滑肌細胞增生和血管狹窄。該鞋式導管定向在體局部導入基因藥物的方法，將基因治療疾病從動物實驗走向臨床應用的重要手段。


圖10是為HE染色顯微鏡下的圖片；其中A.正常兔髂動脈內膜由內皮細胞和內彈力板構成，內無增生；B.球囊損傷后內膜增生的髂動脈，內皮剝脫、VSMC和細胞外基質增生，共同構成新生內膜(NI)；C.球囊損傷后導入c-myc反義寡核苷酸的髂動脈，可見內膜增厚程度明顯低于未給藥段血管(圖B)；圖11是兔髂動脈球囊損傷后40天，Vethoeff彈力纖維染色顯微鏡下的圖片；其中A為損傷未給藥的對照段血管，B為導入c-myc反義寡核苷酸的動脈血管段；二者比較管腔面積(見圖A1、B1)內膜增生厚度(見圖A2與B2)均有顯著差異，圖的放大倍數(shù)為4倍(圖A1、B1)和8倍(圖A2、B2)。
圖12是球囊損傷兔髂動脈后1周，c-myc蛋白免疫組化染色強陽性圖片；陽性顆粒定位于VSMC細胞核內。
圖13是術后2周，球囊損傷兔髂動脈段血管c-myc蛋白免疫組化染色陽性圖片；其中(a)陽性圖片，而給藥段血管呈陰性(b)，放大倍數(shù)為40倍。
圖14是球囊損傷兔髂動脈后40天的顯微鏡下的圖片；其中圖A為c-myc蛋白免疫組化染色陽性，圖B為而經(jīng)鞋式導管導入c-myc反義寡核苷酸的動脈血管段呈陰性，放大倍數(shù)為40倍。
圖15是兔正常髂動脈和球囊損傷兔髂動脈3天電鏡觀察結果圖；其中A.是兔正常髂動脈顯示，VSMC內充滿大量成束肌絲，只在核周圍有少量粗面內質網(wǎng)，游離核體及線粒體致密體和致密斑清晰可見，此為典型的收縮型VSMC；圖B、C、D為球囊損傷兔髂動脈3天觀察結果，圖C所示中層VSMC穿越內彈力膜小窗，向內膜遷移；圖B顯示收縮型VSMC向分泌型，VSMC過渡，胞漿中仍可見少量肌絲和密體，但已可見大量游離核糖體和粗面內質網(wǎng)；圖D顯示的未見致密斑及密體，但高爾基體十分發(fā)達，粗面內質網(wǎng)、游離核糖體及線粒體非常豐富，呈典型狀的分泌型VSMC。
圖16是6atm組TMII在不同組織中的分布及隨時間的變化圖(占1ml TMII給藥量的百分比值)；圖17是兩組靶點/血液放射性計數(shù)比值的比較圖；圖18是兩組靶點/遠端血管放射性計數(shù)比值的比較圖；圖19是兩組靶點血管/1ml TMII放射性計數(shù)比值的比較圖；圖20是球囊損傷2周后增生內膜面積比較圖；圖21是球囊損傷2周內膜平均厚度比較圖；圖22是球囊損傷2周后內膜/中膜面積比較圖；圖23是球囊損傷2周最大內膜厚度比較圖；圖24是球囊損傷40天內膜面積比較圖；圖25是球囊損傷40天內膜/中膜面積比較圖；
圖26是球囊損傷40天最大內膜厚度比較圖；圖27是球囊損傷40天平均內膜厚度比較圖；圖28是球囊損傷后內膜平均厚度的變化圖；圖29是球囊損傷后內膜/中膜面積的變化圖；圖30是6atm組TMII在不同組織中的分布圖。
取材和測量術后30min處死9只動物、6h處死兩只、24h處死兩只。分別取靶點血管(腹主動脈下端)、心、肝、肺、骨髂肌、小腸、血液、非靶點血管(腹主動脈下端)、心、肝、肺、骨骼肌、小腸、血液、非靶點血管(肺動脈)組織，分別將其用生理鹽水沖洗并稱其重量，并用γ計數(shù)儀計數(shù)，同時對體外1ml TMII用γ計數(shù)儀計數(shù)。
經(jīng)鞋式導管在體導入c-myc反義寡核苷酸。
1)寡核苷酸的合成核苷酸序列選自人的c-myc基因第二外顯子中(從4521到4536)的15個核苷酸。由上海生工生物工程有限公司——加拿大SANGON上海分公司合成。
c-myc正義核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反義核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸鹽修飾核苷酸，PAGE純度(摩爾比)99％。
2)動物模型的建立和經(jīng)鞋式導管在體導入c-myc反義寡核苷酸取21只家兔，體重2.5kg-3.5kg，雌雄各半，對照組6只，反義寡核苷酸組15只。再按觀察時間不同分為3天、7天、14天和40天5個觀察組，其中40天給藥組和對照組各為6只兔子，其它三組均為3只。再狹窄模型的建立參考Schwartz和Takanobu的方法，即用苯巴比妥耳緣靜脈麻醉(30mg/kg)，常規(guī)消毒后，先分離、暴露兔子的右股動脈，作一小切口后，經(jīng)股動脈放入帶有標準血管成形導管(球囊直徑3.0mm)的鞋式導管，將導管送至腹主動脈中、下端時，通過壓力泵使標準血管成形導管的球囊充盈(6atm)后，強行將其緩慢回撤至切口處，如此反復進行3次。每次30-60秒，造成血管壁內膜損傷[34、35]，然后松球囊，使之退入鞋式導管鞘內，連同鞋式導管的尖端一并送至髂動脈處，打起球囊(1.5ml)，經(jīng)鞘管尖端導入c-myc反義寡核苷酸426umol/L(0.5ml)后，經(jīng)三通開關給生理鹽水1.5ml，給藥時間＜30秒，所用壓力為5atm，對照組給生理鹽水。給藥后局部做標記，從切口處結扎股動脈，外科縫合，關閉切口。術中靜脈滴注生理鹽水250ml，術中青霉素80萬單位靜脈注射，術后青霉素80萬單位靜脈注射，一天一次，共三天。在指定的時間處死動物。5.2.評價鞋式導管導入c-myc反義寡核苷酸的方法
1)髂動脈血管造影用美國通用電氣公司生產(chǎn)的advantx數(shù)字減影機(DSA)和日本島津公司生產(chǎn)的HD150B700mA血管造影機行血管造影，在指定處死動物的時間對術后14天組和術后40天組動物行髂動脈血造影。切開腹腔，經(jīng)腹主動脈上端插入5F鞘管，X線下注射76％的泛影普胺，同時錄相，并拍照。
2)電鏡分析對3天組動物行電鏡分析。固定兔子，切開腹腔后立即分離髂動脈，0.1IMPBS沖洗后，迅速用剃須刀片將損傷段血管壁切開，切成1mm3大小。25％戊二醛固定液(2ml)4℃固定，0.1M磷酸緩沖液浸洗30秒，1％四氧化鋨固定，0.1M磷酸緩沖液浸洗，然后用30％、50％、70％、90％、100％乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon812包埋(環(huán)氧樹脂)。瑞典的LKBV型超薄切片機切片，切片厚度50nm～70nm。鉛、鈾染色，日本產(chǎn)H-600透射電子顯微鏡觀察，拍照。
3)光鏡分析切開腹腔，分離出腹主動脈，先將5F鞘管插入兔子腹主動脈上端，經(jīng)此鞘管注入4％多聚甲醛液行活體灌注60分鐘，拍照后取材雙側髂動脈的給藥段和非給藥段血管，及相對應的正常段血管。組織塊浸泡于4％多聚甲醛中，浸泡固定24小時以上，逐級酒精脫水，二甲苯透明，56℃浸蠟兩次，石蠟包埋，5um厚連續(xù)切片，脫蠟，水化后，分別行蘇木素伊紅(HE)常規(guī)染色及Verhoeff氏彈力纖維特殊染色。
HE染色步聚將固定切片浸入蘇木精液10分鐘→梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片。
Verhoeff法切片脫蠟，從酒精至水。Verhoeff染液(蘇木素1g，無水酒精20mg，10％氧化鐵水溶液8ml)內分化10min-20min，然后在2％氧化鐵溶液內液化，經(jīng)水洗、95％酒精內沖洗、再水洗，后在0.5％伊紅5min后，進行脫水、透明、封固。
在光鏡下觀察并拍照。用CMIAS真彩色醫(yī)學圖像分析儀，以內彈力膜為界測量內膜面積、最大內膜增生厚度，平均內膜增生厚度(從多個方位取15-16個點進行測量)，以內、外彈力膜為界測量血管中層面積。
4)c-myc蛋白免疫組織化學染色①載玻片選擇APES(丙酮稀釋)，防止脫片。撈片后置烤箱58℃-60℃，30min，以使切片緊密粘附。
②切片脫蠟水化。
③蒸餾水新鮮配置3％H2O2，室溫10min，以滅活內源性酶。蒸餾水洗2min×3次。
④微波修復抗原將切片浸入0.01M，PH6.0檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐加熱至96℃-100℃，持續(xù)20min-30min。冷卻后進行下一步。
⑤滴加1∶50正常血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體。
⑥滴加鼠源性c-myc單克隆抗體(1∶50C)，4℃過夜。0.1M PBS洗2min×3次。
⑦滴加1∶100 PBS稀釋生物素化山羊抗小鼠IgG，溫度20℃-37℃，30min。0.014M PBS洗2min×3次。
⑧臨用前配置SABC工作液取1mlPBS分別加入試劑A和試劑B各式各10ul。滴加試劑SABC，20℃-37℃，30min。0.01M PBS洗5min×4次。
⑨DAB顯色使用DAB顯色試劑盒(ED1022)。取1ml蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間。蒸餾水洗滌。
⑩脫水，透明，封片。顯微鏡觀察，并拍照。5.3.統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)表達用X±SD，配對t檢驗，P≤0.05為顯著性水平。
結果1)鞋式導管局部導入同位素锝99標記的甲氧異腈注射液的結果(見表1和表2)表1 6atm組同位素锝99標記的甲氧異腈注射液在不同組織中的分布及隨時間的變化(占1ml同位素锝99標記的甲氧異腈注射液給藥量的百分比值％/g)組織器官 30min 6h24h靶點血管 49.25±19 0.343±0.05 0.255±0.16非靶點血管0.75±0.4 0.02±0.009 0.02±0.02心臟 8.03±7 0.1±0.01 0.055±0.06肝臟 17.61±7.90.024±0.0010.039±0.04小腸0.027±0.0010.009骨胳肌 0.008±00.012血液 2.123 0.008±0.0010.008±0.008表1顯示鞋式導管局部給藥后，靶點血管放射強度最大，靶點血管在給藥后30min局部放射強度占所給同位素锝[99MTC]甲氧異腈注射液放射強度的49％/g，6h后為0.343％/g，24h后為0.255％/g。藥物在局部持續(xù)存在至少24h。
表2 二種給藥壓力的比較(給同位素锝99標記的甲氧異腈注射液后30min放射性計數(shù)比值)分組靶點血管/1ml 同 靶點血管/血 靶點血管/非靶點血位素锝[99MTC]甲 液管氧異腈注射液6atm組 0.49±0.1945±2370±232atm組 0.22±0.038±5 12±5P值 ＜0.05＜0.05＜0.05此結果顯示給藥壓力提高，局部放射強度增加。6atm組和2atm組比較有顯著差異(P＜0.05)。同時顯示靶點血管的放射性強度是血液的8～45(2atm組和6atm組)倍，是非靶點血管的12～70(2atm組和6atm組)倍。
2)經(jīng)鞋式導管向兔髂動脈局部導入c-myc反義寡核苷酸ASODN的觀察結果(1)大體形態(tài)觀察結果損傷3天和一周的動脈血管可見管腔內有血栓形成，二組比較無差異。
術后二周和40天的髂動脈損傷段血管壁變粗，血管外經(jīng)增粗(圖2～4)，與正常對照血管比較，髂動脈內腔面粗糙不平，整個血管腔面可見彌漫性隆起于內膜表面的斑塊。
損傷給藥段血管40天組血管外徑無明顯增粗(與正常對照血管比較)(圖2)，管徑無縮小，但部分動脈內腔面粗糙不平。相比之下，術后40天對照組髂動脈增粗(圖3)，動脈管腔更為粗糙不平。
(2)血管造影結果術后二周動脈造影顯示損傷段髂動脈有10％～30％的局限管腔狹窄，而給藥段髂動脈無管腔狹窄(圖5示)。
術后40天動脈造影顯示損傷組動脈管壁不光滑，有50％-80％局限狹窄(圖6、8b、9b)，而給藥組僅有10％-30％局限狹窄(圖7、8a、9a)。
(3)光鏡觀察結果術后3天可見損傷動脈壁內有紅色血栓，術后一周動脈內膜中有炎細胞浸潤，內彈力板不完整，中層VSMCs核排列紊亂，管腔面內皮細胞缺失或減少。術后2周起內膜呈彌漫性增厚，VSMCs穿過內彈力板和細胞外基質形成新的新生內膜。增厚的新生內膜以細胞成分為主，同時可見大量細胞外基質(圖10)。病灶深支的VSMCs大多數(shù)地梭形，淺層者多為短梭形，或圓形。術后40天新生內膜仍有增厚趨勢(圖11)，但細胞減少，細胞外基質顯著增多，有不連續(xù)的內皮細胞(圖11)。
三天組和一周組給藥段髂動脈血管與損傷未給藥段髂動脈光鏡觀察相似，但術后二周和40天時，二組比較內膜增生面積、最大內膜增生厚度、平均內膜增生厚度、內膜/中層面積比值均有顯著差異(P≤0.05)，如表3、表4、圖20～29所示。
表3 血管成形術后二周血管內膜厚度、面積的比較分組內膜增生面 最大內膜厚 平均內膜厚 內/中層面積 度(μm) 度(μm) 積比值(1×105μm2)損傷給藥段 1.09±0.99 105±22 57±80.17±0.1血管(n＝3)損傷對照段 3.72±1.3194±42 118±22.50.61±0.02血管(n＝3)P值0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05表4 管成形術后40天血管內膜厚度，面積的比較分組內膜增生面 最大內膜厚平均內膜厚內/中層面積(×105μ 度(μm) 度(μm) 積比值m2)損傷給藥段 4.04±1.02 211±43 122±14.9 0.53±0.18血管(n＝6)損傷對照段 7.66±3.7 344±96 221.5 ±1.4±0.7血管(n＝6)68.95P值 ＜0.05 ＜0.05＜0.05＜0.05(4)電鏡觀察結果(見圖15A、B、C、D)正常對照血管如圖15A所示，中層VSMCs易識別，分布于內彈力板下，細胞呈長梭形，VSMCs細胞內充滿大量成束肌絲，其走向大致與細胞的長軸一致，只在核周有少量粗面內質網(wǎng)、游離核糖體及線粒體。致密體和致密斑清晰可見。上述特點符合典型的收縮型VSMCs。
損傷和給藥后三天的血管如圖15B、C、D所不。中層VSMCs清晰，細胞呈橢圓形、扁、寬，肌絲、致密斑及致密體不的檢出，但高爾基體下分發(fā)達，粗面內質網(wǎng)、游離核糖體及線粒體非常豐富，充滿胞質，此特點符合典型合成型VSMCs。另外尚可見介于收縮型VSMCs和合成型VSMCs之間的過渡型。此外還可見中層的VSMCs，穿越內彈力膜小窗，向內膜遷移。
(5)免疫組化結果兔髂動脈損傷后一周、二周和40天時，c-myc蛋白免疫組織化學染色陽性，染色陽性顆粒定位于VSMCs細胞核內，而損傷給藥段血管c-myc蛋白免疫組織化學染以顯示陰性或弱陽性。
圖12、13a示術后一周和兩周髂動脈損傷段VSMCs c-myc蛋白免疫組織化學染色陽性。圖13b示損傷給藥段血管c-myc蛋白免疫組織化學染色陰性。
圖14A示術后40天髂動脈損傷段血管內膜增生明顯，且c-myc蛋白免疫組化染色陽性。
圖14B示術后40天，導入c-myc ASODN段血管雖內膜也有增生，但不如圖14A明顯，且c-myc蛋白免疫組化染色為陰性。5.4討論本發(fā)明的實驗結果證實(1)通過昆鞋式導管向兔髂動脈局部入同位素锝標記物TMII，證實鞋式導管可向局部靶點管釋放足量藥物，而很少外流，并且藥物可在局部高濃度滯留至少24小時。提示該導管作為在體局部靶向給藥工具的可行性；(2)經(jīng)鞋式導管向兔損傷的髂動脈局部入c-myc ASODN，抑制VSMCs增生和c-myc蛋白表達，證實鞋式導管可作為局部靶向基因藥物給藥的工具。
1)、鞋式導管局部給藥的可行性PTCA術后再狹窄的發(fā)生機制目前認為主要是新生內膜增生和在此基礎上發(fā)生的血管重塑。新生內膜生主要是CAMCs的轉型(由收縮型向分泌型轉化)、增生、遷移及細胞外基質的聚積。血管處重塑是在新生內膜增生的基礎上，壁腔比例和幾何形狀的改變。它包括血管的縮窄和代償性血管增粗病變。在冠狀動脈損傷處植入支架雖可減少血管重塑的發(fā)生，但仍有內膜增生反應，可發(fā)生20％的再狹窄[38-42]。因此近幾年來人們把VSMCs增生作為靶點進行廣泛深入研究，藥物治療包括傳統(tǒng)抑制劑和最近的基因治療已顯示全身給藥后在動物模型上可有效地預防再狹窄發(fā)生，但是這些藥物進入臨床試驗時均告失敗。這其中的一個最重要原因就是臨床用藥劑量偏上，在動物模型的成功治療中，大多數(shù)藥物劑量只有在遠遠超出病人的安全范圍時才有效[26]。在這個觀察基礎上，人們提出了局部給藥的概念[26]，即通過限制治療藥物于損傷靶點，局部高濃度，減少全身毒性。一些動物研究已證實[26]了這種假設，但是將其用于臨床仍有許多障礙，這包括(1)給藥載體能使藥物在局部滯留一段時間，以確保療效；(2)給藥載體能釋放足量的藥物于血管壁靶點而不損傷管壁和很少外流；(3)能將基因藥物轉染于血管壁細胞內。
本發(fā)明采用鞋式導管在體導入同位素锝標記物TMII的結果顯示經(jīng)該導管導入局部靶點血管的TMII放射性強度在給藥后30分鐘是非靶點血管的12～70倍(2atm組和6atm組)，是血液的8～45倍(2atm組和6atm組)。給藥后30minTMII局部放射性強度占1ml給藥總量的49％/g，6h后為0.343％/g，24h后為0.255％/g。這證明(1)鞋式導管作為給藥載體能向局部靶點血管釋放足量藥物，而很少外流；(2)鞋式導管可使藥物在靶點血管局部高濃度滯留至少24h，這提示鞋式導管可以作為局部給藥裝置。
2)、鞋式導管作為基因藥物運載體系的可行性有人預言，21世紀的基因治療將像20世紀的疫苗和抗生素一樣廣泛應用?；蛩幬锓乐卧侏M窄目前正受到世界各國的廣泛重視。目前基因治療面臨的困難一是治療性目的基因的選擇，二是基因轉移的途徑。將外源性目的基因準確、高效地轉導至病變部位是目前國內外研究的熱點之一。選擇適宜的基因運載體系是基因治療成功的關鍵。目前雖然逆轉錄病毒、腺病毒、脂質體等基因轉移方法在動物實驗中獲成功，且轉染率高，但缺乏組織特異性和靶向性，且由于導入病毒，可能會有許多不可預料的毒副作用，故很難用于臨床。理想的基因運載系統(tǒng)必須是高效、安全、穩(wěn)定、特異、可控、價廉且簡單易行。這樣既保證靶點部位的高效轉導，又避免了全身應用的毒副作用。但是迄今為止，尚未見理想的局部血管特異性基因轉導系統(tǒng)。本發(fā)明采用鞋式導管在體導入基因藥物c-myc反義寡核苷酸于損傷的兔髂動脈血管壁，一次給藥使2-4周后的VSMCs增生受到抑制，本實驗的體外研究已證實VSMCs可通過胞飲方式主動將c-myc ASODN攝入胞漿，最后進入細胞核起作用(見1998年申請人的研究生戴強論文)；本實驗中的免疫組化結果表明給藥段血管c-myc蛋白表達受抑制，這些均證明該導管的局部靶向性和c-myc反義寡核苷酸通過干擾c-myc基因的表達而抑制VSMCs增殖。提示鞋式導管可以作為基因藥物的運載工具，用以局部靶向給。本發(fā)明的結果與Shi等用其它類型局部給藥導管在體導入c-myc反義寡核苷酸于豬的損傷冠狀動脈結果類似，進一步從分子生物學角度論證了基因藥物的局部入。
目前局部給藥的球囊導管有多種類型，它們雖然各有其特點，但均存在許多明顯的不足之處，如用雙球囊導管給藥時，需膨脹球囊15min-30min。這就導致了遠端血管缺血及藥物進入分支的丟失。帶孔球囊雖然克服了上述缺點，但在球囊膨脹和去膨脹時易發(fā)生溶質的全身擴散和小孔阻塞后的非均質性溶質釋放及血管損傷。水凝膠導管雖對動脈損傷不嚴重，但水凝膠只能吸收少量藥物，基因轉染能力有限，加之血流沖刷以及為避免血管閉塞性缺血，只能短時間給藥，故使其應用受限制。理想的局部給藥裝置應該是操作簡單，可使藥物在血管壁內最大量的沉積而很少引起局部創(chuàng)傷和遠端組織缺血及藥物向全身擴散。從理論上講，鞋式導管的突出特點是血管成形和局部給藥可一次完成，操作簡單、給藥時間短暫(＜30s)，且可使藥物在管壁最大量的沉積，故可能是一個有前途的局部導入基因藥物的運載體系。值得注意的是目前許多局部給藥裝置還在不斷發(fā)展、完善，究竟那種局部給藥導管導入基因藥物最大為理想，尚有待對大量的局部給藥裝置和載體間進行仔細地利弊比較。
3)、原癌基因c-myc在血管再狹窄發(fā)生中的作用原癌基因c-myc是一個細胞核內的增殖信號作用下，如球囊機械損傷刺激及損傷后各種細胞因子和生長因子的刺激，c-myc原癌基因表達明顯增加，并且這種表達增加與VSMCs的增生相一致。Bennett等的研究推測鼠VSMCs短時表達人c-myc蛋白時，S期的VSMCs比正常時多，因此假定任何能引起c-myc蛋白增加的因子均可促進CSMCs增生。c-myc蛋白與已知的轉錄調節(jié)因子有很大程度的同源性，在功能上，c-myc蛋白的螺旋結構和亮氨酸鏈區(qū)域與蛋白-蛋白的相互作用有關。因此有人提出c-myc起一個直接轉錄激活劑的作用，刺激DNA復制及調節(jié)轉錄水平以后的基因表達。
因為反義寡核苷酸抑制特異基因的表達，這就提供了一個驗證c-myc原癌基因對在體動脈VSMCs增生作用的一個機會。本發(fā)明的結果表明c-myc反義寡核苷酸在體內環(huán)境下可抑制c-myc原癌基困的蛋白表達，同時抑制動脈VSMCs增生，而對照組無此作用。此結果果與本實驗室的體外實驗結果(見申請人1998年的研究生戴強論文)和Shi等的體內研究結果相一致。證明了c-myc原癌基因表達增加和動脈VSMCs增生之間的因果關系。
眾所周知，神經(jīng)遞質/激素-受體信號通過細胞內第二信使系統(tǒng)可以直接引起一些基因的轉錄，也可以迅速激活某些調節(jié)基因，并表達出調節(jié)蛋白質，再通過這些位于細胞核內的調節(jié)蛋白質選擇性地結合有關DNA(次級靶基因)，引起后者的表達，從而較長時間地產(chǎn)生生物學效應。C-myc等原癌基因可能就屬于這類調節(jié)基因，有人將其稱為早-早期基因或快速反應基因。它們在球囊機械刺激或生長因子、激素等外界刺激傳入的數(shù)分鐘內即可作出反應，進行表達，因此在信息傳遞中起重要作用，也可稱為核內第三信使。故推測c-myc的激活、過度表達可能是各種因子刺激增生的一個共同通路。而本實驗結果間接支持這一假設。
4)、反義寡核苷酸的作用機制本發(fā)明的顯示靶向c-myc基因第二外顯子序列中的c-myc反義寡核苷酸可顯著減少動脈VSMCs中的c-myc蛋白水平，這與其顯著的生長抑制作用相平行。雖然本發(fā)明的實驗未證實c-myc mRNA水平在給藥后降低，但本發(fā)明的實驗室的體外實驗(見1998年申請人的研究生戴強論文)已從mRNA水平顯示錯配和正義c-myc寡核苷酸不抑制c-myc的表達，只有c-myc反義寡核苷酸可抑制c-myc原癌基因的轉錄，這證實了反義寡核苷酸的序列特異效應。這與Schmidt等的研究結果相一致。雖然現(xiàn)在對其序列特異效應的精確機制尚不完全清楚，但目前認為反義寡核苷酸在細胞內減少靶點mRNA和蛋水平的機制有兩個第一，寡核苷酸干撓mRNA與核糖體的結合和翻譯以及剪接。已發(fā)現(xiàn)針對mRNA5’帽的反義核苷酸在抑制兔β血紅蛋白合成方面非常有效，而5’帽恰好是許多起始因子與核糖體結合，解鏈DNA，沿著mRNA核糖體移位的位點。第二，有人提出反義寡核苷酸的許多作用是通過誘導核糖核酸酶H分解mRNA所致。另外，反義寡核苷酸也能夠進入細胞核，在核內它們能抑制剪接，防止mRNA前體或mRNA形成或阻滯mRNA向核外轉移。因此反義寡核苷酸通過介導核糖核酸酶，導致特異的mRNA和蛋白質水平下降或通過分子空間阻礙、干撓特異蛋白合成。
5)、c-myc反義寡核苷酸可用于防治血管再狹窄反義技術戰(zhàn)略靶向VSMCs增生防治再狹窄。細胞增生涉及有絲分裂原與受體的復雜相互作用、細胞內信號傳遞轉換途徑和特定基因表達的變化。有絲分裂原可作用于多個細胞內信號傳遞轉換徑路，這些徑路又有分支，互相連接，互相依賴。這種過多的信號傳遞徑路就使得想通過阻滯單一受體或信號傳遞經(jīng)路來完成抑制細胞增生成為泡影。而相反許多受體、信號放大、與增生相關的基因表達，是必然的最后共同通路。通過這一共同通路所有的信號傳遞轉換徑路集中于一點。在細胞周期中許多基因產(chǎn)物被新合成，并被證實對促進細胞周期至關重要。這些基因產(chǎn)物包括涉及DNA和核苷酸的合成酶(如胸腺嘧啶核苷激酶和DNA多聚酶)、DNA結合的蛋白質和轉錄因子(如c-myc，c-fos，c-jun，c-myb)和細胞周期調節(jié)因子(如cdc-2，cdk-2和周期素cyclins)。從理論上講，這些基因產(chǎn)物均可成為抑制VSMCs增生的最有效的靶點。第二當成為靶點的mRNA不多時，反義核苷酸是非常有效的，NDA復制所需的許多mRNA濃度很低，因此可成為很好的靶點。最后，復制可能是血管成形術后一個早期、短暫的事件。這個觀點是以如下兩點為基礎而提出，即晚期取材的人動脈硬化標本中罕見復制以及對損傷動物模型使用反義核苷酸和傳統(tǒng)藥物阻滯早期DNA復制對抑制內膜增生可見顯著的遠期療效，所有這些因素使增生比其它的再狹窄成因更易成為治療靶點。
本發(fā)明的實驗結果顯示靶向原癌基因c-myc的反義寡核苷酸向動脈血管壁一次給藥，可在2周和40天后顯著抑制VSMCs的增生及管腔狹窄，這不僅提示抑制早期增生是由于反義寡核苷酸的效應所引起，也提示細胞或早期復制或完全不復制。這就為從分子水平上防治VSMCs增生和血管再狹窄提供了一種新的治療手段。該治療途徑的優(yōu)點如下(1)特定靶向能力。選擇性抑制增生細胞，抑制靶點VSMCs的特定基因產(chǎn)物。核酸間堿基序列雜交是非常特異的；只有互補的堿基才能夠結合。這種特異堿基配對就意味著堿基的反義核苷酸序列只靶向單一的mRNA，而不影響其它基因的mRNA。在Sa鞋式on等的研究中，導向Ha-ras基因點突變的寡核苷酸能選擇性抑制突變基因的表達而不抑制正?；?。這種結合的特異性遠遠大地傳統(tǒng)藥物抑制劑，藥物抑制劑常因蛋白不同而親和力不同。(2)反義寡核苷酸比任何傳統(tǒng)藥物更容易設計和合成。寡核苷酸的結構相對簡單，僅由4個堿基對的聚合物構成。因為已知靶(基因)序列，理論上針對靶點而設計的基因藥物就十分明確了，而不需要象通常的藥物制劑檢測其上千種產(chǎn)物，同時反義核苷酸藥物有持續(xù)改變靶組織的潛力。在靶組織中反義寡核酸RNA的結構表達可通過插入DNA于宿主染色體實現(xiàn)。這在實際應用中，用寡核苷酸通常是作不到的，而只有足夠長度的反義寡核苷酸才可行。(3)如果能恰當給藥，多聚寡核苷酸堿基藥效可高度局限化，核苷酸可被攝入細胞，而成為細胞內的部分。任何仍在細胞外或進入異位細胞的多聚寡核苷酸均可被血清核酸酶迅速分解。這種機制有助于限制反義寡核苷酸于局部釋放，導入靶點，而靶向定位給藥防治再狹窄是非常重要的策略。
但是在體內生物學環(huán)境中，寡核苷酸的不穩(wěn)定性和細胞的緩慢攝取對其在心血管系統(tǒng)中的應用性提出質疑，因為反義寡核苷酸必須在細胞內達到一定濃度才能發(fā)揮其治療效應。本實驗所用反義寡核苷酸為硫代磷酸鹽修飾的核苷酸，其對血清或細胞內存在的脫氧核苷酸酶的降解有較強的抵抗力。相反，未修辭的c-myc反義寡核苷酸盡管濃度很高，但仍不能在體內抑制VSMCs生長，可能就是由于它們的不穩(wěn)定性。已有資料提示寡核苷酸是通過受體介導的吞噬作用主動轉運通過細胞膜的。因為細胞攝取在不同的細胞間差異很大，確定寡核苷酸轉運入動脈VSMCs內是非常重要的。本發(fā)明的用鞋式導管導入動脈壁的同位素锝標記物TMII，可在動脈壁內持續(xù)存在24h以上，且局部靶點血管放射性強度是非靶點血管的70倍(6atm組)，24h后仍持續(xù)存在。TMII的分子量是6002，與15-30個堿基組成的反義寡核苷酸分子量6750(4500-9000)接近，這提示可能鞋式導管入的c-myc反義寡核苷酸在動脈壁內至少高濃度存在24h，有資料顯示未降解的寡核苷酸暴露于人VSMCs后一小時，便可快速畜積于VSMCs內。
6)、再狹窄的動物模型盡管再狹窄的研究進展很多，但其機制依然有爭論，原因之一是尚無滿意的動物模型模擬人類再狹窄的病理過程。目前常用高膽固醇飼養(yǎng)的兔做再狹窄模型，此模型的血清膽固醇較正常水平升高十幾倍，導致大量膽固醇沉積，且內膜含量有大量吞噬細胞(＞50％)，與人類血管成形術后再狹窄病理變化相差很多。本發(fā)明的實驗選用的再狹窄模型，具有以下特點①血管成形術后內膜增生的病理形態(tài)與人在球囊血管成形術后再狹窄的病理過程相似，包括平滑肌細胞增殖、向內膜下遷移和細胞外基質(膠原、彈力纖維)增生；②血管成形術后見內膜撕裂、血小板聚積、夾層形成，類似臨床冠狀動脈成表術的病理變化。因此，本模型能在一定程度上較好地模擬人類動脈血管成形術后再狹窄的病理過程，但病變仍缺乏鈣化、中央脂質池等人類動脈粥樣硬化的典型特點。
7)本發(fā)明的實驗局限性和將來的方向本發(fā)明的實驗結果提示在非動脈粥樣硬化的髂動脈中，新生內膜形成的降低可能是由于抑制細胞增生和細胞外基質合成的結果，因為這兩者在體外均可通過c-myc反義寡核苷酸下調。盡管有上述發(fā)現(xiàn)，A-SODN抑制動脈粥樣硬化病灶處新生內膜的能力仍有待評價。在球囊損傷之前就存在的轉型VSMCs和巨噬細胞可能會改變血管壁對員傷的反應。因此，本發(fā)明提供的原則只能揭示c-myc ASODN在產(chǎn)生動脈粥樣硬化的環(huán)境下對新生內膜的作用(該環(huán)境可反映病人再狹窄的病理機制)。另外，血管壁內容物的不同(如纖維成份和鈣化)可影響靶點損傷處寡核苷酸的生物分布。在本研究中，用較低的壓力注射釋放低容量，這就最大限度的限制了與血管壁注射相關的血管損傷，但是不能完全排除。從局部給藥的觀點來看，確定理想的治療還需要對不同的球下和支架給藥系統(tǒng)，不同體積和性質的聚合物顆粒及其它增加釋放效率的新載體間、及不同基因治療載體間進行仔細地利弊比較?；谶@樣的實事，即全身給藥預防再狹窄失敗絕大多數(shù)情況是由于生物活性藥物局部濃度低，我們相信血管局部給藥系統(tǒng)將會發(fā)展為用于防治再狹窄的重要醫(yī)療設備。無疑這會增加初期介入治療的費用，但是可獲得PTCA遠期的良好結果。5.5結論上述結果顯示(1)鞋式導管可在體定向局部導入反義寡核苷酸基因藥物于動脈損傷的血管壁內，局部導入的藥物濃度呈壓力依賴性，且可在局部高濃度呈壓力依賴性，且可在局部高濃度持續(xù)存在24h。
(2)用此方法導入的基因藥物c-myc反義寡核苷酸可抑制動脈血管壁損傷后c-myc原癌基因的超常表達，抑制血管平滑肌細胞增生和血管狹窄。
六、參考文獻[1]Laurent J.Feldman，Gabriel Steg.Optimal techniques forarterial gene transfer.Cardiovascular Research 1997，35391-404. 陳光慧，趙明清，韓啟德等冠狀動脈再狹窄的基因治療。中華心血管病雜志1995；23(3)227. Zhu NL，Wu L，Liu PX，Gordon EM，Anderson WF，Stames VA，HallFl.Downregulation of cyclin G1 expression by retrovirus-mediatedantisense gene transfer inhitits vascular smooth muscle cellproliferation and neointemal formation.Circulation.1997，9628-635. Simons M，Edelman ER，Dekeyser J-L et al.Antisense c-myboligodeoxynucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cellaccumulation in vivo.Nature 1992，35967-80.
權利要求
1.一種鞋式導管在體局部導入基因的方法，其特征在于，至少包括以下步驟第一步采用鞋式導管，先經(jīng)鞘管內腔送入標準血管成形導管，在靶點血管處，球囊成形后，松球囊，然后將外鞘尖端給藥區(qū)和PTCA球囊導管一起送至球囊血管成形處，再打起PTCA球囊導管(1.5atm)后，經(jīng)三通聯(lián)接管用壓力泵經(jīng)外鞘局部給藥于損傷處血管壁；經(jīng)血管局部導入同位素锝99測定血管局部濃度，評價局部給藥的可行性；第二步經(jīng)鞋式導管在體導入c-myc反義寡核苷酸1)寡核苷酸的合成核苷酸序列選自人的c-myc基因第二外顯子中(從4521到4536)的15個核苷酸；c-myc正義核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反義核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸鹽修飾核苷酸，PAGE純度(摩爾比)99％；2)用苯巴比妥耳緣靜脈麻醉(30mg/kg)，常規(guī)消毒后，先分離、暴露活體物的右股動脈，作一小切口后，經(jīng)股動脈放入帶有標準血管成形導管(球囊直徑3.0mm)的鞋式導管，將導管送至腹主動脈中、下端時，通過壓力泵使標準血管成形導管的球囊充盈(6atm)后，強行將其緩慢回撤至切口處，如此反復進行3次；每次30s-60s，造成血管壁內膜損傷，然后松球囊，使之退入鞋式導管鞘內，連同鞋式導管的尖端一并送至髂動脈處，打起球囊(1.5ml)，經(jīng)鞘管尖端導入c-myc反義寡核苷酸426umol/L 0.5ml后，經(jīng)三通開關給生理鹽水1.5ml，給藥時間＜30秒，所用壓力為5atm，給藥后局部做標記，從切口處結扎股動脈，外科縫合，關閉切口；3)經(jīng)鞋式導管局部導入基因藥物c-myc反義寡核苷酸觀察在體表達效應，評價是否能導入基因藥物，導入基因藥物是否在體表達。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用鞋式導管定向在體局部導入基因藥物的方法，其特點為定位準確、直接導向心血管靶點、簡易、無毒副作用，且可用于臨床，該鞋式導管局部導入靶點的藥物濃度，在一定范圍內呈壓力依賴性，且藥物可在局部高濃度持續(xù)存在至少24小時，在體局部導入的基因藥物可抑制體內某些基因的表達，達到防治心血管疾病的作用。如用鞋式導管向損傷的髂動脈壁內定和導入的c－myc反義寡核苷酸可抑制動脈血管壁損傷后c－myc原癌基因的超常表達，抑制血管平滑肌細胞增生和血管狹窄。該鞋式導管定向在體局部導入基因藥物的方法，將基因治療疾病從動物實驗走向臨床應用的重要手段。
文檔編號A61M31/00GK1438047SQ03114560
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權日2003年3月21日
發(fā)明者蘭燕平 申請人:西安交通大學