專利名稱：生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，公開了一種利用商陸毛狀根及其培養(yǎng)液進(jìn)行商陸皂甙藥用活性成分的生產(chǎn)方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)、生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
商陸(Phytolacca acinosa Roxb)為商陸科植物，其根為重要的中藥，我國大部分地區(qū)均產(chǎn)。商陸始載于“神農(nóng)本草經(jīng)”，因其有毒被列為下品。臨床多用于水腫脹滿、二便不通，外治痛腫瘡毒。現(xiàn)代藥理研究表明商陸皂甙具有激活核苷酸還原酶的活性，商陸總皂甙可誘生R干擾素，糖蛋白對骨髓瘤細(xì)胞的DNA合成有抑制作用，商陸多糖I(PEP-1)能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2(IL-2)以及增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
發(fā)根農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌，感染植物后可將其Ri質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)化并整合到植物基因組，表達(dá)產(chǎn)生毛狀根，毛狀根生長快速，能合成植物根中特有的次生代謝產(chǎn)物。近年來，利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的毛狀根建立離體培養(yǎng)系統(tǒng)，實現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)以解決中藥資源的短缺問題也越來越受到人們的重視。相對于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長快速、不需外源植物激素、合成次生代謝物質(zhì)能力強而且穩(wěn)定、向培養(yǎng)液釋放部分代謝產(chǎn)物等優(yōu)點。通過改變培養(yǎng)條件，毛狀根甚至可以合成比原來植物中高出數(shù)倍的活性物質(zhì)。目前，商陸皂甙、商陸多糖為主要成分的新藥均已被開發(fā)出來供應(yīng)市場，因此對商陸藥材的需求日益增多。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)孫敏等作者在西南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002，27(4)549-552發(fā)表“長春花轉(zhuǎn)化毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化”一文，文中描述了采用A4和R1000兩種發(fā)根農(nóng)桿菌分別感染長春花的愈傷組織、葉片、葉柄及根，誘導(dǎo)出了毛狀根，并考察了不同種類的培養(yǎng)基、碳源、氮源等因素對毛狀根生長的影響，得到了毛狀根生長的較佳條件。但該方法在誘導(dǎo)效率、除菌方法等方面存在著若干不足之處，并且未考察毛狀根中活性成分的含量及未篩選高含量活性成分的株系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法。使用活化了的A4、R1000和C58C1三種發(fā)根農(nóng)桿菌分別感染商陸的萌發(fā)7天的子葉及胚軸，誘導(dǎo)出了毛狀根，并根據(jù)不同種類的培養(yǎng)基、碳源、氮源等因素對毛狀根生長的影響，得到了毛狀根生長的較佳條件，本發(fā)明開辟了一個再生商陸資源的新途徑，為工廠化生產(chǎn)商陸皂甙等藥用活性成分奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明經(jīng)篩選得到的優(yōu)質(zhì)株系生長速度快，24天培養(yǎng)干重增長23倍，商陸皂甙含量0.56％，商陸多糖含量12.7％。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的方法如下1、以萌發(fā)7天的葉片、子葉、胚軸及根和愈傷組織作誘導(dǎo)材料，子葉和胚軸的誘導(dǎo)效果較好，葉片的誘導(dǎo)率很低，而根和愈傷組織不能誘導(dǎo)出毛狀根；2、外植體在菌液中浸染并用無菌水洗滌后轉(zhuǎn)入暗處共培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)化效率較高，而在光照的條件下不能誘導(dǎo)出毛狀根；3、利用在含頭孢噻肟鈉的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)除菌的方法除菌的方法，不過周期太長，至少要繼代5次以上才能將農(nóng)桿菌除凈，或者采用高溫除菌法，即將毛狀根轉(zhuǎn)至39.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h，大大加快了進(jìn)程；4、將毛狀根逐一分開，在1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行大量培養(yǎng)，生產(chǎn)商陸皂甙和商陸多糖。
以下對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明1、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化將三種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4，R1600，C58C1于-20℃保存在滅菌甘油中，臨用前于YEB固體培養(yǎng)基、25℃活化3次，然后轉(zhuǎn)至YEB培養(yǎng)液(培養(yǎng)液中加入200mg/L卡那霉素)于黑暗、25℃、100r/min振蕩培養(yǎng)，約12h后測定菌液在600nm的吸光度(OD600值)，當(dāng)OD600值為0.8時，用于感染外植體。
2、植物材料取商陸種子，用濃硫酸浸泡2小時后用清水洗凈，在75％乙醇中浸泡1min，用清水沖凈乙醇，再用0.1％HgCl2消毒15min，無菌水沖洗5次，置于MS培養(yǎng)基上，25℃，光照12h/d，光強度2000lx，15d后萌發(fā)。取生長7d左右的無菌苗的子葉和胚軸作為外植體，于MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)化。
3、外植體的轉(zhuǎn)化將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入OD600值為0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌A4，R1600，C58C1菌液中，在黑暗條件下120r/min振搖10min，取出，用無菌濾紙吸干多余的菌液，在暗處、MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)24h后移至含300 mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25℃，光照12h/d，光強度2000lx，并以未經(jīng)感染的子葉和胚軸作對照。
4、毛狀根的除菌將感染后長出的毛狀根剪下移到新的含300mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7d轉(zhuǎn)接1次，轉(zhuǎn)接4次以后，將毛狀根轉(zhuǎn)至39.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h，隨后轉(zhuǎn)入不含抗生素的MS培養(yǎng)基上。
5、毛狀根優(yōu)質(zhì)株系的篩選將MS培養(yǎng)基上的毛狀根逐一分開，挑取2cm左右者移入1/2MS培養(yǎng)液中，35ml培養(yǎng)液/50ml三角錐瓶，每瓶一根，20d后觀察生長情況，挑選生長迅速的進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
6、PCR及高壓紙電泳檢測PCR法按SDS法提取毛狀根的DNA。rolB及rolC基因是發(fā)根農(nóng)桿菌中與轉(zhuǎn)化有關(guān)的關(guān)鍵基因，分別設(shè)計合成這兩個基因的引物。
rolB基因的引物為5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’，預(yù)期產(chǎn)物長度為423bp，rolC基因的引物為5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’，預(yù)期產(chǎn)物長度為626bp。
PCR反應(yīng)體系為25μl(50ng基因組DNA，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1.25單位Taq DNA聚合酶，25pmol引物)。反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘，35個循環(huán)(94℃變性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分鐘)，最后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳(80V電壓，40分鐘)后，在UVP成像系統(tǒng)上觀察DNA條帶并拍照。以相應(yīng)的農(nóng)桿菌菌株為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化的商陸根為陰性對照。
高壓紙電泳法分別取3種農(nóng)桿菌感染獲得的毛狀根各100mg置于1mlEppendorf管，加入0.1mol/L HCl 100μl，搗成勻漿，4℃浸提2h，1.5 10r/m離心5min，取上清液10μl點樣于Whatman 3MM濾紙上進(jìn)行高壓紙電泳(400V，30mA)，電泳緩沖液為HCOOH∶CH3COOH∶H2O(5∶15∶80)。40min后將濾紙取出晾干，均勻浸入堿性硝酸銀溶液(0.625g AgNO3溶于50ml丙酮)中染色1min，晾干后再浸入10ml 20％NaOH+90ml 95％乙醇混合液中顯影5min，最后再經(jīng)5％硫代硫酸鈉溶液中退色20min，晾干后拍照。以試管苗的正常根為陰性對照，甘露堿標(biāo)準(zhǔn)品(1mg/ml)或胭脂堿標(biāo)準(zhǔn)品(1mg/ml)為陽性對照，檢測到的陽性株系即我們所需要的毛狀根。
7、毛狀根生長曲線的測定取毛狀根的優(yōu)質(zhì)株系在1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行測定，35ml培養(yǎng)液/50ml三角錐瓶，共50瓶，每4d測1次干質(zhì)量，每次測5瓶，以平均干質(zhì)量為指標(biāo)繪制生長曲線。干質(zhì)量系60℃烘24h至恒重后測得。1.8毛狀根生長條件的優(yōu)化分別配制以蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖(濃度均為30g/L)為碳源的1/2MS培養(yǎng)液和以NH4NO3(1/2MS濃度)和牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨和水解酪蛋白(濃度均為1g/L)為氮源的1/2MS培養(yǎng)液，按上述條件培養(yǎng)毛狀根，24天后測定干質(zhì)量。
8、商陸皂甙(esculentoside)的含量測定(硫酸-香草醛比色法)精密稱取干燥至衡重的商陸皂甙甲標(biāo)準(zhǔn)品5mg置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，置具塞試管中，加水定容為1ml，加8％香草醛乙醇液2.0ml，77％硫酸溶液5.0ml，混勻置60℃10分鐘后立即置冰上15分鐘，以1.0ml水同法操作作為空白，在450nm處測光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將干藥材和干燥的毛狀根搗成粉末，過40目篩，60℃烘2小時后，精密稱取2克，置索氏提取器中以甲醇回流至無皂甙反應(yīng)，減壓回收甲醇，用適量水溶解殘渣，過濾，濾液用水飽和正丁醇萃取3次，減壓回收正丁醇，殘渣用少量甲醇溶解，過濾后定容至10ml，取50ul加水至0.5ml，按上述方法處理，測定450nm處的光密度，求出商陸皂甙的含量。
9、商陸多糖(polysaccharides)的含量測定(濃硫酸-苯酚法)精密稱取干燥至衡重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2g，置于1000ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容。分別量取0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35ml置具塞試管中，加水補至2.0ml，再加1.0ml苯酚，5.0ml濃硫酸，振搖后放置5分鐘，在沸水浴中加熱15分鐘，以蒸餾水同法操作作為對照，冷卻后在490nm處測定光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將藥材和毛狀根的粉末以適量蒸餾水回流提取3次，合并提取液，過濾后轉(zhuǎn)至500ml容量瓶并加水稀釋至刻度，取0.2ml置具塞試管中，按上述方法處理，測定490nm處的光密度，求出商陸多糖的含量。
本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進(jìn)步，本發(fā)明提供了一種利用工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)的方法生產(chǎn)商陸毛狀根及商陸皂甙、商陸多糖等藥用成份的方法，所獲得的商陸毛狀根中含有與藥材商陸中更高含量的商陸皂甙和相近含量的商陸多糖，可以將商陸毛狀根代替商陸藥材或從毛狀根中提純商陸皂甙供應(yīng)市場。優(yōu)點是產(chǎn)量高，含量穩(wěn)定，且不受氣候、土地等自然條件的限制，對解決中藥商陸的資源緊缺、滿足醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)需要具有重要意義。測定了毛狀根中藥用活性成分商陸皂甙和商陸多糖的含量，商陸皂甙含量0.56％，比藥材商陸中含量(0.38％)更高，商陸多糖含量12.7％，與藥材商陸中含量相近，因此可以將商陸毛狀根代替商陸藥材或從毛狀根中提純商陸皂甙供應(yīng)市場。
具體實施例方式
實施例一商陸毛狀根的獲得1.1發(fā)根農(nóng)桿菌的活化，將三種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4，R1600，C58C1于-20℃保存在滅菌甘油中，臨用前于YEB固體培養(yǎng)基、25℃活化3次，然后轉(zhuǎn)至YEB培養(yǎng)液(培養(yǎng)液中加入200mg/L卡那霉素)于黑暗、25℃、100r/min振蕩培養(yǎng)，約12h后測定菌液在600nm的吸光度(OD600值)，當(dāng)OD600值為0.8時，用于感染外植體。
1.2植物材料，取商陸種子，用濃硫酸浸泡2小時后用清水洗凈，在75％乙醇中浸泡1min，用清水沖凈乙醇，再用0.1％HgCl2消毒15min，無菌水沖洗5次，置于MS培養(yǎng)基上，25℃，光照12h/d，光強度2000lx，15d后萌發(fā)。取生長7d左右的無菌苗的子葉和胚軸作為外植體，于MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)化。
1.3外植體的轉(zhuǎn)化，將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入OD600值為0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌A4，R1600，C58C1菌液中，在黑暗條件下120r/min振搖10min，取出，用無菌濾紙吸干多余的菌液，在暗處、MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)24h后移至含300mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25℃，光照12h/d，光強度2000lx，并以未經(jīng)感染的子葉和胚軸作對照。
1.4商陸毛狀根具體生物學(xué)特征，具白色根毛，分支多，向上、貼瓶壁向上或沿培養(yǎng)基平長，失去向地性。
1.5毛狀根的除菌，將感染后長出的毛狀根剪下移到新的含300mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7d轉(zhuǎn)接1次，轉(zhuǎn)接6次以后，移到不含頭孢噻肟鈉的相同培養(yǎng)基上，如3天內(nèi)無菌長出，則表明農(nóng)桿菌已經(jīng)除盡，可以將毛狀根轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；如有菌長出，則繼續(xù)移入含頭孢噻肟鈉300-500mg/L的培養(yǎng)基上除菌，直到除盡為止。
另一種除去農(nóng)桿菌的方法是在含300mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次以后，將毛狀根轉(zhuǎn)至39.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h，隨后轉(zhuǎn)入不含抗生素的MS培養(yǎng)基上，如3天內(nèi)無菌長出，則表明農(nóng)桿菌已經(jīng)除盡。
1.6毛狀根優(yōu)質(zhì)株系的篩選，將MS培養(yǎng)基上的毛狀根逐一分開，挑取2cm左右者移入1/2MS培養(yǎng)液中，35ml培養(yǎng)液/50ml三角錐瓶，每瓶一根，20d后觀察生長情況，挑選生長迅速的進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
1.7培養(yǎng)條件的優(yōu)化四種碳源中，麥芽糖對商陸毛狀根生長最有利(20d干質(zhì)量增長23倍)，其次為蔗糖，葡萄糖和果糖不適合商陸毛狀根的生長。五種氮源中，以水解酪蛋白最好(干質(zhì)量增長22倍)，其次為NH4NO3(1/2MS濃度)和酵母浸膏(二者無統(tǒng)計學(xué)意義上的差別)，蛋白胨效果最差。PH值在5.0-5.8之間較為合適，過高或過低毛狀根生長速度明顯減慢。
1.8生長曲線毛狀根的生長曲線呈“S”型，在培養(yǎng)最初的6d內(nèi)質(zhì)量增加比較緩慢，以后質(zhì)量隨時間的延長而快速增加，20d時質(zhì)量達(dá)到最大，增長23倍，以后由于培養(yǎng)基中的養(yǎng)分已耗盡，生長條件惡化使毛狀根部分死亡、降解導(dǎo)致質(zhì)量逐步下降。如果在20天時更換新的培養(yǎng)基，則毛狀根依然保持快速增長。
實施例二毛狀根的檢測2.1 PCR法用苯酚-氯仿法提取毛狀根的DNA。rolB及rolC基因是發(fā)根農(nóng)桿菌中與轉(zhuǎn)化有關(guān)的關(guān)鍵基因，分別設(shè)計合成這兩個基因的PCR引物。
rolB基因的引物為5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’，預(yù)期產(chǎn)物長度為423bp，
rolC基因的引物為5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’，預(yù)期產(chǎn)物長度為626bp。
PCR反應(yīng)體系為25μl(50ng基因組DNA，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1.25單位Taq DNA聚合酶，25pmol引物)。反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘，35個循環(huán)(94℃變性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分鐘)，最后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳(80V電壓，40分鐘)后，在UVP成像系統(tǒng)上觀察DNA條帶并拍照。以相應(yīng)的農(nóng)桿菌菌株為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化的商陸根為陰性對照，篩選到的PCR結(jié)果為陽性的株系即我們所需要的毛狀根。
2.2高壓紙電泳法分別取3種農(nóng)桿菌感染獲得的毛狀根各100mg置于1ml Eppendorf管，加入0.1mol/L HCl 100μl，搗成勻漿，4℃浸提2h，1.5 10r/m離心5min，取上清液10μl點樣于Whatman 3MM濾紙上進(jìn)行高壓紙電泳(400V，30 mA)，電泳緩沖液為HCOOH∶CH3COOH∶H2O(5∶15∶80)。40 min后將濾紙取出晾干，均勻浸入堿性硝酸銀溶液(0.625g AgNO3溶于50ml丙酮)中染色1min，晾干后再浸入10ml 20％NaOH+90ml 95％乙醇混合液中顯影5min，最后再經(jīng)5％硫代硫酸鈉溶液中退色20min，晾干后拍照。以試管苗的正常根為陰性對照，甘露堿標(biāo)準(zhǔn)品(1mg/ml)或胭脂堿標(biāo)準(zhǔn)品(1mg/ml)為陽性對照，檢測到的陽性株系即我們所需要的毛狀根。
實施例三毛狀根中藥用活性成分的測定3.1商陸皂甙(esculentoside)的含量測定(硫酸-香草醛比色法)精密稱取干燥至衡重的商陸皂甙甲標(biāo)準(zhǔn)品5mg置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，置具塞試管中，加水定容為1ml，加8％香草醛乙醇液2.0ml，77％硫酸溶液5.0ml，混勻置60℃10分鐘后立即置冰上15分鐘，以1.0ml水同法操作作為空白，在450nm處測光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將干藥材和干燥的毛狀根搗成粉末，過40目篩，60℃烘2小時后，精密稱取2克，置索氏提取器中以甲醇回流至無皂甙反應(yīng)，減壓回收甲醇，用適量水溶解殘渣，過濾，濾液用水飽和正丁醇萃取3次，減壓回收正丁醇，殘渣用少量甲醇溶解，過濾后定容至10ml，取50ul加水至0.5ml，按上述方法處理，測定450nm處的光密度，求出商陸皂甙的含量。干燥藥材中含量為0.38％，干燥毛狀根中含量為0.56％，明顯高于干藥材中的含量。同法測定培養(yǎng)20天的培養(yǎng)液中也含有0.22％的商陸皂甙。
3.2商陸多糖(polysaccharides)的含量測定(濃硫酸-苯酚法)精密稱取干燥至衡重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2g，置于1000ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容。分別量取0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35ml置具塞試管中，加水補至2.0ml，再加1.0ml苯酚，5.0ml濃硫酸，振搖后放置5分鐘，在沸水浴中加熱15分鐘，以蒸餾水同法操作作為對照，冷卻后在490nm處測定光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將藥材和毛狀根的粉末以適量蒸餾水回流提取3次，合并提取液，過濾后轉(zhuǎn)至500ml容量瓶并加水稀釋至刻度，取0.2ml置具塞試管中，按上述方法處理，測定490nm處的光密度，求出商陸多糖的含量。干燥藥材中為14.4％，毛狀根中為12.7％略低于干燥藥材中含量。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征在于，方法如下(1)以萌發(fā)7天的子葉和胚軸作誘導(dǎo)材料；(2)外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸染并用無菌水洗滌后轉(zhuǎn)入暗處共培養(yǎng)2天，隨后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)；(3)利用在含頭孢噻肟鈉的培養(yǎng)基上至少要5次以上繼代培養(yǎng)除菌的方法將農(nóng)桿菌除凈，或者采用高溫除菌法，即將毛狀根轉(zhuǎn)至39.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h；(4)將毛狀根逐一分開，在1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行大量培養(yǎng)，生產(chǎn)商陸皂甙和商陸多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，以下對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的限定(1)發(fā)根農(nóng)桿菌的活化-將三種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4，R1600，C58C1于-20℃保存在滅菌甘油中，臨用前于YEB固體培養(yǎng)基、25℃活化3次，然后轉(zhuǎn)至YEB培養(yǎng)液，用于感染外植體，(2)植物材料-取商陸種子，用濃硫酸浸泡2小時后用清水洗凈，取生長7d左右的無菌苗的子葉和胚軸作為外植體，于MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)化，(3)外植體的轉(zhuǎn)化-將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入OD600值為0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌A4，R1600，C58C1菌液中，并以未經(jīng)感染的子葉和胚軸作對照，(4)毛狀根的除菌-將感染后長出的毛狀根剪下移到新的含300mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨后轉(zhuǎn)入不含抗生素的MS培養(yǎng)基上，(5)毛狀根優(yōu)質(zhì)株系的篩選-挑選生長迅速的進(jìn)行繼代培養(yǎng)，(6)PCR及高壓紙電泳檢測，(7)毛狀根生長曲線的測定-取毛狀根的優(yōu)質(zhì)株系在1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行測定，(8)商陸皂甙的含量用硫酸-香草醛比色法測定，(9)商陸多糖的含量用濃硫酸-苯酚法測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，在步驟(1)發(fā)根農(nóng)桿菌的活化中，培養(yǎng)液中加入200mg/L卡那霉素于黑暗、25℃、100r/min振蕩培養(yǎng)，約12h后測定菌液在600nm的吸光度(OD600值)，當(dāng)OD600值為0.8時，用于轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，在步驟(2)植物材料中，用清水洗凈后，進(jìn)一步在75％乙醇中浸泡1min，用清水沖凈乙醇，再用0.1％HgCl2消毒15min，無菌水沖洗5次，然后置于MS培養(yǎng)基上，25℃，光照12h/d，光強度2000lx，15d后萌發(fā)，最后取子葉和胚軸于MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，在步驟(4)毛狀根的除菌中，將毛狀根剪下移到MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，每7d轉(zhuǎn)接1次，轉(zhuǎn)接4次以后，將毛狀根轉(zhuǎn)至39.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h，再轉(zhuǎn)入不含抗生素的MS培養(yǎng)基上。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，在步驟(6)PCR及高壓紙電泳檢測中，PCR法為按SDS法提取毛狀根的DNA，rolB及rolC基因是發(fā)根農(nóng)桿菌中與轉(zhuǎn)化有關(guān)的關(guān)鍵基因，分別設(shè)計合成這兩個基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即所需要的毛狀根；高壓紙電泳法為分別取3種農(nóng)桿菌感染獲得的毛狀根進(jìn)行高壓紙電泳將濾紙取出晾干，染色，晾干后，顯影，晾干后再拍照，經(jīng)過對照，檢測到的陽性株系即所需要的毛狀根。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，在步驟(7)PCR及高壓紙電泳檢測中，取毛狀根的優(yōu)質(zhì)株系在1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行測定，具體為35ml培養(yǎng)液/50ml三角錐瓶，共50瓶，每4d測1次干質(zhì)量，每次測5瓶，以平均干質(zhì)量為指標(biāo)繪制生長曲線，干質(zhì)量系60℃烘24h至恒重后測得，毛狀根生長條件的優(yōu)化分別配制以蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖，濃度均為30g/L為碳源的1/2MS培養(yǎng)液和以NH4NO31/2MS濃度和牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨和水解酪蛋白濃度均為1g/L為氮源的1/2MS培養(yǎng)液，按上述條件培養(yǎng)毛狀根，24天后測定干質(zhì)量。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，步驟(8)商陸皂甙的含量用硫酸-香草醛比色法測定方法如下精密稱取干燥至衡重的商陸皂甙甲標(biāo)準(zhǔn)品5mg置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，置具塞試管中，加水定容為1ml，加8％香草醛乙醇液2.0ml，77％硫酸溶液5.0ml，混勻置60℃10分鐘后立即置冰上15分鐘，以1.0ml水同法操作作為空白，在450nm處測光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將干藥材和干燥的毛狀根搗成粉末，過40目篩，60℃烘2小時后，精密稱取2克，置索氏提取器中以甲醇回流至無皂甙反應(yīng)，減壓回收甲醇，用適量水溶解殘渣，過濾，濾液用水飽和正丁醇萃取3次，減壓回收正丁醇，殘渣用少量甲醇溶解，過濾后定容至10ml，取50ul加水至0.5ml，按上述方法處理，測定450nm處的光密度，求出商陸皂甙的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法，其特征是，步驟(9)商陸多糖的含量用濃硫酸-苯酚法測定方法如下精密稱取干燥至衡重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2g，置于1000ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，分別量取0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35ml置具塞試管中，加水補至2.0ml，再加1.0ml苯酚，5.0ml濃硫酸，振搖后放置5分鐘，在沸水浴中加熱15分鐘，以蒸餾水同法操作作為對照，冷卻后在490nm處測定光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將藥材和毛狀根的粉末以適量蒸餾水回流提取3次，合并提取液，過濾后轉(zhuǎn)至500ml容量瓶并加水稀釋至刻度，取0.2ml置具塞試管中，按上述方法處理，測定490nm處的光密度，求出商陸多糖的含量。
全文摘要
一種生產(chǎn)商陸皂甙藥用活性成分的方法屬于醫(yī)藥技術(shù)、生物技術(shù)領(lǐng)域。方法如下(1)以萌發(fā)7天的子葉和胚軸作誘導(dǎo)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(2)外植體在菌液中浸染并用無菌水洗滌后轉(zhuǎn)入暗處共培養(yǎng)2天；(3)利用在含頭孢噻肟鈉的培養(yǎng)基上至少要經(jīng)過5次以上繼代培養(yǎng)除菌的方法將農(nóng)桿菌除凈，或者采用高溫除菌法，即將毛狀根轉(zhuǎn)至39.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h；(4)將毛狀根逐一分開，在1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行大量培養(yǎng)，生產(chǎn)商陸皂甙和商陸多糖。本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進(jìn)步，利用本發(fā)明將商陸毛狀根代替商陸藥材或從毛狀根中提純商陸皂甙供應(yīng)市場。優(yōu)點是產(chǎn)量高，含量穩(wěn)定，且不受氣候、土地等自然條件的限制，對解決中藥商陸的資源緊缺、滿足醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)需要具有重要意義。
文檔編號A61P1/10GK1448505SQ0311660
公開日2003年10月15日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月24日
發(fā)明者許鐵峰, 唐克軒, 張漢明, 張磊 申請人:上海交通大學(xué)