專利名稱：一種可增強基因槍接種dna疫苗誘生細胞免疫應答的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種可增強基因槍接種DNA疫苗誘生的細胞免疫應答的新方法，及其用途。
背景技術：
DNA疫苗(DNA vaccine)又稱基因疫苗(Gene vaccine)，其本質為將外源性蛋白編碼基因片段克隆在真核質粒DNA表達載體上，直接接種后可在細胞內表達外源性蛋白并誘發(fā)機體產生特異性細胞和體液免疫從而達到預防和治療疾病的目的。由于它可克服傳統(tǒng)疫苗的部分缺陷、能同時誘發(fā)機體產生特異性細胞及體液免疫，并具有制備簡單，性質穩(wěn)定等優(yōu)點，因而被認為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程疫苗亞單位疫苗之后的第三代疫苗，為未來疫苗的一個發(fā)展方向，近年來得到了廣泛關注和深入研究。有研究報道，DNA疫苗在不同動物中誘生免疫應答的強度存在明顯的差異，在小鼠模型中效果較為肯定，在大動物(如靈長目動物)和人體中免疫效果則不理想。研究DNA疫苗在不同種動物差異的機制及如何使DNA疫苗在大動物、人體內更有效已成為各國科學家研究的熱點。
已知，增強DNA疫苗免疫效率的策略主要包括篩選高免疫原性表位或使用多價表位，優(yōu)化表達載體、DNA疫苗的靶向導入、使用佐劑、尋找最佳接種方式等。其中DNA疫苗接種的方式對其誘生的免疫應答效果有著重要的影響。DNA疫苗接種方式按途徑可分為肌肉接種，皮膚接種與粘膜接種；按DNA的處理形式可分為包裹金顆粒-基因槍轟擊，鹽水溶解-注射器注射以及減毒沙門/志賀菌或腺病毒等為載體口服或吸入等接種方式。
基因槍接種DNA疫苗是將質粒DNA包裹于金顆粒上，利用高壓惰性氣體的沖擊將金顆粒直接轟入細胞內，因此它比注射器接種法有更高的轉染效率?；驑尳臃N只需注射器接種DNA用量的1/100～1/1000即可誘生相當水平的抗體應答(Fynan EF et al.Proc Natl AcadSci USA，1993；9011478-82)。有鑒于此，一般認為基因槍接種方式能克服肌注接種DNA疫苗在大動物和人體中的低效，目前DNA疫苗在人體中的實驗已采用基因槍接種的方法。
有研究表明基因槍接種DNA疫苗誘生的免疫應答類型以Th2型為主而Th1型免疫應答的水平極弱，而以注射器肌注或皮內注射則主要誘生Th1型免疫應答，(Pertmer TM et al.J Virol 1996；706119-25；Feltquate DM et al.J Immunol，1997；1582278-84)。而Th1型免疫應答在清除病毒持續(xù)性感染、抗胞內菌感染和抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，基因槍接種相應DNA疫苗誘生低水平Th1型免疫應答成為其應用的障礙。
“CpG結構”(CpG motif)為Krieg AM等提出的概念(Krieg AM，et al.Nature.1995，3746522546-549)即一些中間為未甲基化的CpG二核苷酸、兩側分別為兩個嘌呤(5’側)和兩個嘧啶(3’側)的特定寡核苷酸序列，如5’-AACGTT-3’、5’-GACGTC-3’、5’-AGCGCT-3’等。大量體外研究已發(fā)現(xiàn)，該特定結構對哺乳動物棉衣系統(tǒng)具有激活作用，能刺激Mφ，DC，NK，T及B淋巴細胞，并使之分泌IL-2、IL-6、IL-12及IFN-γ等，使免疫反應向Th1型轉變(Stacey KJ，et al.J Immunol.1996，15752116-2122；Sparwasser T，et al.Eur J Immunol.1998，2862045-2054；Yamamoto S，et al.Jpn J Cancer Res.1998，797866-873；Bendigs S，et al.Eur J Immunol.1999，29(4)1209-1218)。Sato等(Sato Y，et al.Science.1996，2735273352-354)發(fā)現(xiàn)，卡那霉素抗性基因中不含有在氨芐青霉素抗性基因中存在的CpG結構，相應載體的免疫原性較弱，由此推測載體骨架中的CpG結構的存在與否決定了DNA疫苗的免疫原性。他們進一步在含有卡那抗性基因的載體中插入CpG結構發(fā)現(xiàn)可提高該載體的免疫效果。袁正宏等(中國專利公開號CN 1382492A)公開了在DNA疫苗載體中插入對人免疫系統(tǒng)有特異性刺激活性的CpG motifs能增強其特異性免疫原性。Weeratna等報道了接種蛋白疫苗HBsAg時使用CpG ODN作為佐劑比福氏不完全佐劑(FIA)和Titermax Gold等更強的誘生免疫應答而毒性更小，而且當CpG ODN與TH2型佐劑混合使用時能克服它們的TH2型佐劑的偏向。
基因槍接種DNA用量僅為注射器接種用量的1/100乃至更少，前者含有的CpG motif的量也僅為后者的1/100乃至更少。這可能是導致基因槍接種DNA疫苗免疫應答為Th2型偏向的原因之一。目前尚無增強基因槍接種DNA疫苗佐劑的新方法。
有報道CpG的識別受體Toll樣受體9(TLR9)位于細胞內，CpG-ODN需要入胞才能激活下游信號轉導(Ahmad-Nejad P et al.EurJ Immunol，2002；321958-68)。倘若用注射器于轟擊局部接種CpG-ODN則主要位于細胞外，尚需胞吞/胞飲等過程進入細胞內。在CpG-ODN與質粒DNA混合后用注射器接種的情形中，Weeratna等報道(Weeratna R et al.Antisense Nucleic Acid Drug Dev1998；8351-6)ODN與質粒DNA可能會互相競爭入胞受體，因而既可能導致表達的抗原量減少又可能使CpG作用受到抑制。
另外，CpG-ODN在基因槍接種DNA疫苗中的作用，也會因CpG-ODN與質粒DNA的比例不同而受影響。已有研究使用CpG-ODN與質粒DNA比例為50μg/1μg，但大量的CpG可強烈刺激細胞因子分泌而導致質粒中抗原基因表達受到抑制(Tan Y et al.Hum Gene Ther1999；102153-61)。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可增強基因槍接種DNA疫苗誘生的細胞免疫應答的新方法，一種能增強基因槍接種DNA疫苗誘生Th1免疫應答的方法，及其實際用途。
本發(fā)明是能增強基因槍接種DNA疫苗誘生Th1免疫應答的佐劑策略。
本發(fā)明的技術方案是在基因槍接種質粒DNA疫苗的同時導入一定比例的免疫刺激元件即合成的寡核苷酸CpG DNA(CpG ODN)作為佐劑。將質粒DNA與寡核苷酸CpG DNA共同包裹于金顆粒表面，利用高壓惰性氣體轟擊，將其直接導入表皮層細胞內。
所述的CpG-ODN與質粒DNA比例為1∶1至10∶1。
為評價本發(fā)明即佐劑策略的效果，采用基因槍接種表達HBsAg的質粒DNA疫苗pYQF-2CpG/HBs加CpG ODN和小鼠體內免疫實驗，驗證了加用CpG ODN佐劑后的特異性的體液免疫(檢測血清中抗HBsAg)和細胞免疫(抗原特異性的IFN-γ分泌能力和CTL活性)。結果表明，1)本發(fā)明在基因槍接種DNA疫苗的同時加用CpG ODN增加CpG motif的量能增強其誘生Th1型免疫應答水平。2)將CpG-ODN與質粒DNA共同沉淀在金顆粒上然后以基因槍轟擊導入的方式比基因槍接種質粒DNA的同時局部用注射器接種CpG-ODN的方式或者CpG-ODN與質粒DNA混合后用注射器接種的方式效果好，本發(fā)明方法可使其直接進入細胞內，因而更容易激活下游信號轉導，并避免了ODN與質粒DNA對入胞受體的競爭。
本發(fā)明通過下述方法和步驟實現(xiàn)本發(fā)明采用質粒pYQF/s-2CpG(CN 1382492A)，帶有CMV啟動子，含有BGH轉錄終止信號及卡那霉素抗性基因。在多克隆位點插入HBVs蛋白基因，并在框架上插入了兩個合成的CpG結構(上海生工公司)。質粒用Qiagen Plasmid Maxi Kit大量制備、純化，溶于生理鹽水。所述CpG-ODN序列為5’-TCAAAACGTTGATG-3’，GpC-ODN對照序列為5’-TCAAAAGCTTGATG-3’。
本發(fā)明基因槍子彈采用亞精胺—氯化鈣包裹法將DNA包裹在直徑為1.0μm的金粉上(購自美國Bio-rad公司)。將質粒DNA與ODN混合，重量比可控制在5-10∶1或1∶1，或者質粒DNA單獨溶于ddH2O，加入到含金顆粒的亞精胺中混勻，再加入CaCl2使DNA沉淀于金顆粒上。乙醇洗滌后，加入無水乙醇混勻，將金顆粒-DNA乙醇溶液吸到基因槍塑料管中，空氣干燥制成子彈。
取6周齡BALB/c雌鼠(購自中國科學院上海實驗動物中心)動物免疫，分組，基因槍接種；肌注接種；皮內接種，初次免疫后4周加強免疫，方法同前。
觀察基因槍轟擊后3小時或轟擊后立即皮膚活檢標本其金顆粒的分布。
檢測免疫后抗HBsAg抗體及亞類，ELISA法檢測靜脈血清其中抗體IgG及亞類IgG1、IgG2a，間接法ELISA檢測IgG總血清滴度。
檢測免疫后細胞免疫功能，采用IFN-γELISA定量檢測試劑盒(購自上海茂元科技有限公司)檢測IFN-γ水平。進行Calcein熒光標記CTL殺傷實驗，熒光測量儀檢測熒光值。按下述公式計算殺傷率和特異性殺傷率，殺傷率＝(試驗組的FI-自發(fā)釋放的FI)/(陽性對照的FI-自發(fā)釋放的FI)×100％。
特異性殺傷率為P815-s的值減去P815的值。
經方差分析和t檢驗統(tǒng)計處理，結果證實本發(fā)明基因槍轟擊可使包裹DNA的金顆粒直接進入上皮層細胞內，在小鼠體內證實基因槍接種質粒DNA疫苗的同時共同導入CpG ODN/質粒DNA比例為5-10/1的CpG ODN的佐劑策略能增強基因槍接種DNA疫苗的Th1型免疫應答水平，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性，抗原特異的IFN-γ產生能力。本發(fā)明方法有利于克服基因槍接種DNA疫苗產生Th1型免疫應答水平低下的缺陷，是一種人體應用基因槍接種DNA疫苗時有潛力的佐劑策略。
圖1為本發(fā)明實施實例所用DNA疫苗pYQF-CpG/HBs質粒載體示意圖及全硫代修飾CpG-ODN與GpC-ODN對照序列。
圖2為基因槍轟擊后金顆粒在皮膚組織的分布其中，a、組織切片H&E染色光鏡觀察(放大240倍)；b、透射電鏡觀察(放大2850倍)。
圖3為基因槍轟擊后金顆粒在細胞的位置
其中，a、放大6500倍；b、放大11000倍。
圖4為免疫接種后抗HBs抗體應答反應其中，a.ELISA檢測免疫后8周血清(1∶100)中IgG、IgG1和IgG2a；b.免疫后小鼠IgG抗體滴度水平。
圖5為免疫接種后HBsAg特異性細胞免疫反應其中，a、加強免疫后四周HBsAg特異性CTL反應。b、免疫接種后小鼠脾細胞經HBsAg體外刺激IFN-γ釋放水平(pg/ml)。
具體實施例方式
實施例1采用亞精胺—氯化鈣包裹法將DNA包裹在直徑為1.0μm的金粉上，制備基因槍子彈。將10μg質粒DNA與100μg或10μg ODN，重量比可控制在5-10∶1或1∶1，混合或者10μg質粒DNA單獨溶于100μl ddH2O，加入到含5mg金顆粒的100μl 0.1M亞精胺中混勻，再加入200μl 2.5M CaCl2使DNA沉淀于金顆粒上。乙醇充分洗滌后，加入100μl無水乙醇混勻，每10μl為一顆子彈。將金顆粒-DNA乙醇溶液吸到基因槍專用塑料管中，空氣干燥后即制成子彈。其中，每顆子彈攜有0.5mg金顆粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)，10μg ODN(2.2×10-3μmol)；或0.5mg金顆粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)，1μg ODN(2.2×10-4μmol)；或0.5mg金顆粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)。
取6周齡BALB/c雌鼠動物免疫，隨機分為九組，每組6只小鼠。1)基因槍接種腹皮毛剃凈，用基因槍(新芝科技有限公司)以2.5MPa的壓力轟擊將金顆粒-DNA或金顆粒-DNA-CpG ODN導入小鼠腹部皮膚，局部可見2cm2左右的轟擊范圍。2)肌注接種戊巴比妥鈉(75mg/kg)麻醉后，用100u胰島素注射器于雙側脛前肌進針，緩慢注入質粒DNA生理鹽水溶液，每側25μg/50ul。)皮內接種小鼠背尾端皮毛剃凈，戊巴比妥鈉(75mg/kg)麻醉后，用100u胰島素注射器與脊柱平行進針皮膚，皮內可見鼓起皮丘。初次免疫后4周，用上述方法加強免疫，表1為實驗分組、免疫方式與接種材料。
表1組別 接種方靶位接種材料A 基因槍皮內、腹部皮膚1μg質粒+1μg CpG-B 基因槍皮內、腹部皮膚1μg質粒+1μgC 基因槍皮內、腹部皮膚1μg質粒+10μgD 基因槍皮內、腹部皮膚1μg質粒+10μgE 基因槍皮內、腹部皮膚1μg質粒F 注射器肌注小腿脛外側1μg質粒G 注射器肌注小腿脛外側50μg質粒H 注射器皮內、背部皮膚50μg質粒I 注射器肌注小腿脛外側生理鹽水其中，每組6只BALB/c小鼠。質粒DNA為PYQF-2CpG。1μg質粒DNA含8.34×10-7mol分子；50μg質粒DNA含4.17×10-5μmol分子；1μg ODN DNA含2.2×10-4μmol分子；10μg ODN DNA含2.2×10-3μmol分子。
觀察基因槍轟擊后金顆粒的分布轟擊后3小時局部皮膚活檢取材，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，組織切片(6μm)，H&E染色，光鏡放大240倍下拍照?；蜣Z擊后立即活檢取材制備成電鏡標本，超薄切片(70-90nm)，uranyl acetate和lead citrate染色，透射電鏡觀察。
圖2、圖3顯示了基因槍轟擊后包裹DNA的金顆粒在組織細胞中的位置。結果表明，組織切片H&E染色光鏡觀察及透射電鏡顯示金顆粒主要位于上皮層內，少數可深入到真皮的上層。金顆粒位于胞漿或直接進入了胞核，金顆粒周圍無明顯膜樣結構，表明金顆粒是由高壓惰性氣體的轟擊直接進入而非通過胞吞等過程進入到細胞內。
免疫后抗HBsAg抗體及亞類檢測免疫日始每隔2周從小鼠眼眶后眥靜脈叢采血，分離血清，ELISA法檢測其中抗體IgG及亞類IgG1、IgG2a。將每組內各小鼠血清等量混勻，作梯度稀釋，間接法ELISA檢測IgG總血清滴度。圖4顯示了免疫接種后HBsAg特異性體液免疫水平。其中E組為基因槍接種1μg質粒DNA(8.34×10-7μmol)的IgG2a水平為0.396±0.287遠低于注射器肌肉或皮內接種50μg質粒DNA(4.17×10-5μmol)(G組2.915±0.117和H組2.269±0.307)。基因槍接種加入1或10μg對照GpC-ODN并不能增加IgG2a水平(B組0.29±0.153和D組0.354±0.184)。而基因槍接種加入CpG-ODN則能增加抗-HBs IgG2a水平(A組0.541±0.234和C組1.545±0.111)，其中C組為加用10μg CpG-ODN(2.2×10-3μmol)比E組的增高有統(tǒng)計顯著差異(p＜0.01)。加用CpG-ODN后抗-HBsAg總IgG也有所增強。監(jiān)測HBsAg-特異性抗體滴度，加強免疫后，C組IgG應答反應比A組或E組要更快早更強。接種后第14周，A組、C組、E組、G組及H組HBsAg特異性的IgG抗體滴度分別為1∶2400，1∶4800，1∶2400，1∶4800，1∶4800。
檢測免疫后細胞免疫功能每組隨機挑取2只小鼠，處死，無菌取脾臟，制成單細胞懸液。調整濃度為4×106/ml，備檢測細胞因子及CTL活性用。IFN-γ檢測為加HBsAg 10μg/ml，培養(yǎng)48小時收集上清，采用IFN-γ ELISA定量檢測試劑盒(購自上海茂元科技有限公司)檢測IFN-γ水平。Calcein熒光標記CTL殺傷實驗以70 Gy的γ射線滅活對數生長期P815-s細胞制成刺激細胞。在脾細胞中加入刺激細胞，比例為20∶1，培養(yǎng)6天，加mIL-225u/ml維持。用Ficoll分離液純化刺激后效應細胞，以無酚紅培養(yǎng)液重懸。以5~10uMcalcein AM(購自美國Molecular Probe公司)37℃水浴標記對數生長期P815-s，P815細胞，D-Hank’s液洗后以無酚紅培養(yǎng)液重懸制成標記靶細胞。在96孔圓底培養(yǎng)板中按效/靶比例50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀釋效應細胞與標記好的靶細胞。設完全釋放組其中加細胞裂解液，與自發(fā)釋放組其中加無酚紅培養(yǎng)液，孵育4.5小時后離心，將上清移入新板孔中，熒光測量儀檢測熒光值。按下述公式計算殺傷率和特異性殺傷率，
殺傷率＝(試驗組的FI-自發(fā)釋放的FI)/(陽性對照的FI-自發(fā)釋放的FI)×100％。
特異性殺傷率為P815-s的值減去P815的值。
圖5顯示了免疫接種后HBsAg特異性細胞免疫水平。其中注射器肌肉或皮內接種50μg質粒DNA的G組和H組有較高水平的CTL活性，基因槍接種1μg質粒DNA的E組或加入對照GpC-ODN的B組和D組CTL活性都很低。而基因槍接種加用10μg CpG-ODN的C組其CTL活性明顯提高。效/靶比為50/1時，A組、B組、C組、D組、E組、G組、H組和I組分別是7.89％，3.44％，21.84％，4.17％，4.02％，31.47％，33.15％和4.14％。
免疫后8周小鼠脾細胞在HBsAg刺激后IFN-γ的釋放能力檢測結果表明，E組抗原特異性IFN-γ釋放水平僅為236.4pg/ml。而G組和H組分別為2609.1pg/ml和1878.5pg/ml。加用GC-ODN的B組和D組IFN-γ水平沒有增高甚至反而有所下降，分別為95.0pg/ml和159pg/ml。而基因槍接種加用10μg CpG-ODN的C組其IFN-γ水平大大增高，為1046.2pg/ml。但僅加用1ug CpG-ODN的A組其IFN-γ水平為258.1pg/ml，比E組沒有明顯升高。
權利要求
1.一種可增強基因槍接種DNA疫苗誘生細胞免疫應答的方法，其特征是在基因槍接種質粒DNA疫苗的同時，導入免疫刺激元件作為佐劑，其比例為1∶1-10，將質粒DNA與免疫刺激元件包裹于金顆粒表面，用高壓惰性氣體轟擊，直接導入表皮層細胞內。
2.按權利要求1所述的方法，其特征是所述的免疫刺激元件是合成的寡核苷酸CpG-ODN。
3.按權利要求1和2所述的方法，其特征是所述的CpG-ODN與質粒DNA疫苗比例為1∶1。
4.按權利要求1和2所述的方法，其特征是所述的CpG-ODN與質粒DNA疫苗比例為1∶10。
5.按權利要求1和2所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸CpG ODN在用于基因槍接種DNA疫苗時作為佐劑。
6.按權利要求1和2所述的方法，其特征是所述的細胞免疫應答是Th1型免疫應答，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性和抗原特異的IFN-γ產生能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，提供了一種可增強基因槍接種DNA疫苗誘生的Th1型免疫應答的方法，本發(fā)明也涉及制備質粒DNA－CpG寡聚核苷酸包裹金顆粒的方法。本發(fā)明在基因槍接種質粒DNA疫苗的同時共導入一定比例的合成的寡核苷酸CpG DNA(CpG ODN)作為佐劑。動物免疫實驗證實本發(fā)明能增強基因槍接種DNA疫苗的Th1型免疫應答水平，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性，抗原特異的IFN－γ產生能力。本發(fā)明有利于克服基因槍接種DNA疫苗誘生低水平Th1型免疫應答的缺陷，可用于腫瘤及病毒持續(xù)性感染等的治療。
文檔編號A61K48/00GK1513559SQ03142099
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月6日 優(yōu)先權日2003年8月6日
發(fā)明者袁正宏, 周曉輝 申請人:復旦大學, 上海復旦悅達生物技術有限公司