專利名稱：從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命醫(yī)學(xué)中的提取技術(shù)，具體地說，涉及一種從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法。
背景技術(shù)：
對抗微生物肽的研究、開發(fā)利用已引起了國際生物醫(yī)學(xué)界的極大興趣。由于當(dāng)今微生物對傳統(tǒng)抗生素廣泛耐藥這一事實(shí)，而內(nèi)源性抗微生物肽經(jīng)過了幾百萬年的進(jìn)化歷程仍保留了強(qiáng)大的抗菌效力，所以，在發(fā)展抗感染新戰(zhàn)略上，內(nèi)源性抗菌肽格外引人關(guān)注，誘導(dǎo)內(nèi)源性抗菌肽在機(jī)體抗感染的關(guān)鍵部位高濃度表達(dá)，可能是發(fā)展新抗微生物戰(zhàn)略的最有前途的選擇。研究上皮細(xì)胞抗微生物肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)及其機(jī)制，不僅具有重要的理論意義，而且可為發(fā)展新抗感染藥理學(xué)概念或措施，作出重要貢獻(xiàn)。
圓小囊淋巴組織中的DNES細(xì)胞可產(chǎn)生P物質(zhì)、血管活性腸肽、促胰液素等10多種生物活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在圓小囊淋巴組織中不僅存在著大量的產(chǎn)溶菌酶細(xì)胞，還存在有大量的產(chǎn)抗菌肽細(xì)胞，并已初步證明產(chǎn)溶菌酶細(xì)胞及產(chǎn)抗菌肽細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及分布部位與圓小囊中的DNES細(xì)胞一致。通過對圓小囊組織浸出液的初步分離純化所得的低分子粗提物，對致病性大腸桿菌具有很強(qiáng)的抑菌作用。
兔小囊肽對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等常見的致病菌有明顯的抑制作用。同時，還初步進(jìn)行了兔小囊肽對雞的免疫功能影響的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此抗菌肽類物質(zhì)能顯著提高雞的血清抗體IgG水平和黏膜分泌型抗體IgA水平，黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞也顯著高于對照組，這說明小囊肽可提高雞體的體液免疫和黏膜免疫力。
在《中國免疫學(xué)》1993年第9卷第2期上吳琦等發(fā)表了一篇名為“人中性粒細(xì)胞防御素的分離純化”的文章，其中提出了一種對人中性粒細(xì)胞抗菌肽進(jìn)行了分離純化的方法，將獲得人中性粒細(xì)胞胞漿顆粒，以5％乙酸提取酸溶性組分，然后進(jìn)行SephadexG100和Bio-gel P10過濾，獲得純化的抗菌肽。由于腸道組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雜蛋白種類繁多，因而采用該分離純化的方法需要進(jìn)行多次才能達(dá)到較為滿意的純化效果。
國內(nèi)外還未見有從兔圓小囊組織中分離提取抗菌肽的文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，本發(fā)明簡化了純化步驟，又能提高純化效率。
本發(fā)明所述從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，包括如下步驟步驟一，取圓小囊，清洗、破碎；步驟二，將破碎的圓小囊組織進(jìn)行沸水浴處理將組織勻漿液用乙酸浸提；步驟三，離心，保留上清液；步驟四，將離心后的沉淀再次浸提，再次按照步驟三進(jìn)行離心，保留上清液后，繼續(xù)下一步；步驟五，合并兩次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液調(diào)pH至7.0，離心，棄掉沉淀，收集上清液；步驟六，將上清液過SephadexG100分離柱和分子篩，紫外線監(jiān)測，收集峰值樣品；如上所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，還包括測定所收集到的物質(zhì)的抗菌活性與分子量，將具有抗菌活性且分子量在7kD以下的物質(zhì)即兔小囊肽，凍干保存。
本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有技術(shù)比較，可以去除大多雜蛋白，采用分離柱層析，一次即可使兔小囊肽得以純化，而且節(jié)省試劑和時間，適合于較大量的分離純化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過改進(jìn)以往的提純方法，既簡化了純化步驟，又能提高純化效率，建立了一套從兔圓小囊組織中分離提取抗菌肽的方法。在吳琦的提取方法中，第一步柱層析不能將溶菌酶和抗菌肽分開，本發(fā)明對該方法進(jìn)行了改進(jìn)，根據(jù)抗菌肽具有耐高溫的特性，首先將組織勻漿液進(jìn)行沸水浴處理，然后將酸溶性組分進(jìn)行pH值調(diào)整，這樣處理，既可以除去大分子溶菌酶，又可以避免乙酸帶來的對抗菌作用的干擾。從抗菌肽粗提物的電泳結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，粗提物的蛋白帶分子量大都在20000Da以下。
具體做法如下取圓小囊，清洗、破碎；收集屠宰場屠宰兔的圓小囊，滅菌生理鹽水沖洗，去漿膜，組織搗碎機(jī)搗碎3次，每次1-2min；將破碎的圓小囊組織進(jìn)行沸水浴處理；將組織充分勻漿，隔水煮沸15min；將組織勻漿液用乙酸浸提；按1∶1(體積比)加入5％乙酸，4℃條件下攪拌、浸提12小時；離心，保留上清液；將混合物于4℃，8000轉(zhuǎn)/min離心30min，取上清液，4℃保存；將沉淀物用等體積5％乙酸混合，再次于4℃攪拌浸提12小時，重復(fù)上述離心過程，取上清液，合并兩次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液調(diào)pH至7.0，離心，棄掉沉淀；將離心后的沉淀再次浸提；調(diào)整pH值，于4℃、8000轉(zhuǎn)/min離心15min，收集上清液；將上清液過分離柱SephadexG100柱和截留量為10kD分子篩，紫外檢測，收集10kD以下的峰值樣品，其中分子量在7kD以下的具有抗菌活性的物質(zhì)即為兔小囊肽，將其凍干保存。
顯然，本發(fā)明的上述做法與現(xiàn)有技術(shù)中吳琦的方法相比較，可以去除大多雜蛋白，用SephadexG100分離柱層析一次即可使兔小囊肽得以純化，而且節(jié)省試劑和時間，適合于較大量的分離純化。
最后所應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取圓小囊，清洗、破碎；步驟二，將破碎的圓小囊組織進(jìn)行沸水浴處理，將組織勻漿液用乙酸浸提；步驟三，離心，保留上清液；步驟四，將離心后的沉淀再次浸提，再次按照步驟三進(jìn)行離心，保留上清液后，繼續(xù)下一步；步驟五，合并兩次上清液，調(diào)pH值，離心，棄掉沉淀，收集上清液；步驟六，將上清液過分離柱和分子篩，紫外線監(jiān)測，收集峰值樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟一具體包括收集屠宰場屠宰兔的圓小囊，滅菌生理鹽水沖洗，去漿膜，組織搗碎機(jī)搗碎3次，每次1-2min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟二中將破碎的圓小囊組織進(jìn)行沸水浴處理，具體包括將破碎的圓小囊組織進(jìn)行沸水浴處理；將組織充分勻漿，沸水浴15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟二中，將組織勻漿液用乙酸浸提具體包括按體積比1∶1加入5％乙酸，4℃條件下攪拌、浸提12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟三中，具體包括將混合物于4℃，8000轉(zhuǎn)/min離心30min，取上清液，在4℃下保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟四具體包括將沉淀物用等體積5％乙酸混合，再次于4℃攪拌浸提12小時，重復(fù)上述離心過程，取上清液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟五收集上清液具體包括在4℃、8000轉(zhuǎn)/min離心15min下，收集上清液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟六采用型號為Sephadex G100分離柱對上清液分離，將上清液過分離柱Sephadex G100柱，用截留量為10kD分子篩收集10kD以下的峰值樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，還包括將分子量在7kD以下的具有抗菌活性的物質(zhì)凍干保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步驟五中調(diào)pH值，是采用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從兔圓小囊中分離提取小囊肽的方法，包括步驟一，取圓小囊，清洗、破碎；步驟二，將破碎的圓小囊組織進(jìn)行沸水浴處理將組織勻漿液用乙酸浸提；步驟三，離心，保留上清液；步驟四，將離心后的沉淀再次浸提，再次按照步驟三進(jìn)行離心，保留上清液后，繼續(xù)下一步；步驟五，合并兩次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液調(diào)pH至7.0，離心，棄掉沉淀，收集上清液；步驟六，將上清液過SephadexG100分離柱和分子篩，紫外線監(jiān)測，收集峰值樣品。本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有技術(shù)比較，可以去除大多數(shù)雜蛋白，采用分離柱層析，一次即可使兔小囊肽得以純化，而且節(jié)省試劑和時間，適合于較大量的分離純化。
文檔編號A61P31/00GK1566153SQ03146358
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者佘銳萍, 王可洲, 馬衛(wèi)明, 李冰玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)