專利名稱：糖肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由糖苷與肽所組成的糖肽組合物及其作為生物材料的應(yīng)用。本發(fā)明的特殊實施方案是針對以幾丁聚糖為基礎(chǔ)所形成的糖肽所作的描述，而更多的特殊實施方案則是關(guān)于幾丁聚糖與聚氨基酸形成糖肽的描述。
背景技術(shù)：
在生物系統(tǒng)中，不同的醫(yī)療用途對于生物材料都有持續(xù)性的需求，例如人類及其它哺乳類。這些醫(yī)療用途遍及目前所有可能的治療。舉例來說某些生物材料可用于醫(yī)療器材或植入人體以作為結(jié)構(gòu)或生化目的之用。此外，也可作為藥劑載具(drug delivery vehicle)或直接作為藥物。
生物材料的預(yù)期用途經(jīng)常會影響其材料的選擇，但一般大多會選擇使用具有生物可降解性或生物可清除性的材料。簡單來說，即使以具有某種程度的毒性或危害的材料來制造生物材料也是可被接受的，但仍大多會選擇不具毒性的材料。
由于生物材料具有廣泛的用途以及所需要的特性，因此，目前持續(xù)需要一種新的生物材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及由至少一個糖苷與至少一個肽所共價結(jié)合的糖肽。雖然糖苷與肽及鍵結(jié)其上的藥劑在本發(fā)明的描述中都是指單體，但根據(jù)本發(fā)明的聚合物特性，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都應(yīng)能了解糖肽的性質(zhì)比單一糖苷與肽的性質(zhì)要來得復(fù)雜。進(jìn)一步而言，由于糖肽具有多個結(jié)合位，因此，不同的藥劑可結(jié)合到單一個糖肽。而控制糖肽單體相對數(shù)目的方法以及聚合物上各種藥劑的取代度已屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)，故在本發(fā)明的通常實驗中即可加以應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，即包含一個糖肽，其是具有至少一個糖苷基團藉由酰胺鍵與至少一個肽產(chǎn)生共價鍵結(jié)，并且，有一診斷劑或一治療劑共軛結(jié)合至糖苷或肽基團之一。
即，本發(fā)明的糖肽包含至少兩基團，包含一糖苷；一肽；其中所述糖苷是藉由酰胺鍵共價鍵結(jié)至所述肽；一診斷劑或一治療劑共軛結(jié)合至糖苷或肽基團。
再者，金屬也可共軛結(jié)合至無診斷劑或治療劑鍵結(jié)的基團。
所述診斷劑或治療劑可通過羧酸經(jīng)由肽鍵與糖苷共軛鍵結(jié)；而金屬則可螯合至肽；或者，也可通過氨基并經(jīng)由肽鍵與肽共軛鍵結(jié)；而金屬則可螯合至糖苷。而所述糖肽的分子量大約可為5,000-30,000道爾頓。
所述糖苷可包含至少兩個共價結(jié)合的單體單元，進(jìn)一步來說，此類糖苷可包含胺糖(aminated sugar)。更具體地說，所述糖苷可以是幾丁聚糖、膠原蛋白、軟骨素、hyauraniate、肝素及其任何組合物；且所述糖苷可選自能以血管內(nèi)皮細(xì)胞(如血管組織)為作用標(biāo)的的物質(zhì)，包括血管組織胞外蛋白，如整合素(integrin)。而糖苷的分子量約3,000-10,000道爾頓。
所述肽可包含聚氨基酸或肽或標(biāo)的序列，而在某些實施方案中，會傾向采用主要由酸性氨基酸所組成的聚氨基酸。所述聚氨基酸可包含聚谷氨酸或聚天門冬氨酸及其任何組合物；所述糖肽包含約5％-50％重量的肽，進(jìn)一步來說，所述肽的分子量為750-3,000道爾頓，是以癌細(xì)胞為其作用標(biāo)的。
所述診斷劑或治療劑構(gòu)成糖肽重量的約10-60％，并且，任何可共軛鍵結(jié)于糖肽的都可用于本發(fā)明。在某些實施方案中，所述診斷劑或治療劑可為抗癌藥物、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物、抗凝血劑、抗血管增生藥物、細(xì)胞凋亡藥物、骨質(zhì)疏松藥物、類固醇及抗發(fā)炎藥物或其任何組合物。舉例來說，該診斷劑或治療劑可包含甲氨蝶呤或帕米磷酸鹽。
而在某些實施方案中，所述糖肽也可額外包含金屬類診斷劑或治療劑。更明確地說，該金屬可藉由螯合劑，如二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid，DTPA)共軛鍵結(jié)于糖肽。所述金屬可為放射性核素，例如Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62Cu-67、In-111、T1-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212及Bi-213或其任何組合物，而放射性核素金屬可同時作為診斷及治療之用。
診斷劑可使許多診療步驟易于進(jìn)行，包括增強放射性核素顯像的清晰度。在某些實施方案中，糖肽可結(jié)合其診斷與治療的功能而作為測量劑量之用；并且，也可與放射性核素結(jié)合，除了能夠增強放射性核素影像的清晰度外，也可作為抗癌劑?；蛘撸ㄟ^糖肽與金屬及治療劑的結(jié)合，可用以測量治療劑輸送到目標(biāo)區(qū)域的量。在其它的選擇上，兩種不同的糖肽可合并使用。首先，可針對個體施予治療性糖肽，再測量其到達(dá)目標(biāo)區(qū)域的作用量；再者，藉由診斷性糖肽到達(dá)目標(biāo)區(qū)域的作用量的估算，可修正治療性糖肽的劑量。
本發(fā)明的其它實施例是關(guān)于一包含由幾丁聚糖藉由酰胺鍵與聚氨基酸共價鍵結(jié)而組成的糖肽。所述幾丁聚糖可為未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾的，例如烷基硫酸鹽幾丁聚糖。同樣地，聚氨基酸也可為任何型態(tài)，不過，在許多實施方案中，是使用酸性氨基酸，如聚谷氨酸或聚天門冬氨酸。
本發(fā)明中由幾丁聚糖所形成的糖肽，也可使用于如本發(fā)明所述的糖肽的相同方式。例如幾丁聚糖所形成的糖肽可結(jié)合診斷劑或治療劑，包括金屬，也可共軛結(jié)合于其上。
至于本發(fā)明的其它實施方案中關(guān)于制造糖肽的方法則同上所述。具體而言，該類方法是藉由在碳二亞胺與酸基活化劑存在下所形成的酰胺鍵來結(jié)合糖苷與肽。而所述糖苷可進(jìn)一步反應(yīng)，以形成糖苷或肽及診斷劑或治療劑間的酰胺鍵或酯鍵。此外，也可藉由螯合劑將金屬共軛結(jié)合至糖苷或肽。


圖1A、圖1B、圖1C、圖1D為說明糖肽的四種組合方案的示意圖。其中，G-(G)n-G幾丁聚糖，A-(A)n-A聚谷氨酸。
圖2A與圖2B分別為說明形成糖肽及糖肽結(jié)合物的合成反應(yīng)示意圖。其中，A-(A)n-A聚谷氨酸，EDCN-(3-二甲胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺，Sulfo-NHSN-羥基硫代琥珀硫亞胺。
圖3A與圖3B分別說明兩種不同的同時具有金屬及不同藥劑鍵結(jié)于糖肽之上糖肽結(jié)合物。
圖4A、圖4B、圖4C、圖4D說明糖肽及幾丁聚糖的結(jié)構(gòu)對腫瘤與骨骼的定位能力。
圖5顯示乳腺腫瘤細(xì)胞在體外攝取99mTc-GP(99mTc所標(biāo)定的糖)、99mTc-PGA(99mTc所標(biāo)定的聚谷氨酸)及99mTc-CH(99mTc所標(biāo)定的幾定聚糖)(100％)的情形。
圖6A與圖6B揭示體內(nèi)乳癌細(xì)胞(13762細(xì)胞系)攝取放射線的檢測結(jié)果。在注射99mTc-CH-10(50％)、99mTc-CH-10(100％)、99mTc-PGA(750)及99mTc-G-P(1∶2)120分鐘后，利用平面造影術(shù)(planar scintography)觀察乳癌細(xì)胞系及具有發(fā)炎癥狀的老鼠(280～300Ci/rat，i.v.injection，acquired 500,000count)的腫瘤影像，圖中顯示了腫瘤對肌肉及腫瘤對發(fā)炎的比例(T＝腫瘤，M＝肌肉，I＝發(fā)炎)。
圖7揭示體內(nèi)骨骼細(xì)胞攝取放射性核素的檢測結(jié)果。在注射99mTc-帕米磷酸鹽(P)、99mTc-糖肽(GP)、99mTc-帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物(GPP)120分鐘后(300μCi/rat，i.v.injection，acquired 500,000count)，利用平面造影術(shù)(planar scintography)觀察影像。
圖8揭示體內(nèi)骨骼細(xì)胞攝取放射性核素的檢測結(jié)果，該圖是在注射99mTc-帕米磷酸鹽(P)、99mTc-糖肽(GP)、99mTc-帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物(GPP)120分鐘后(300μCi/rat，i.v.injection，acquired 500,000count)的線掃瞄圖。
具體實施例方式
為對本發(fā)明的實施方案及其優(yōu)點有更完整而透徹的了解，現(xiàn)通過下列文字并結(jié)合附圖進(jìn)行描述。
本發(fā)明涉及包含一糖苷與一肽所組成的糖肽組合物，其可作為生物材料。在某些實施方案中，這類生物材料可以滅菌粉末的形式提供使用。而治療劑或診斷劑則可共軛結(jié)合至糖肽。
在特殊的實施方案中，糖苷與肽可藉由酰胺鍵相互結(jié)合，其中，所述糖苷可為一胺糖。所述糖肽可包含約5％-50％重量的肽，但若含過量肽，將導(dǎo)致糖肽間形成不被接受的交聯(lián)層。而所述糖苷的分子量為3,000-10,000道爾頓，肽的分子量為750-3,000道爾頓，糖肽的分子量為5,000-30,000道爾頓。
在更特殊的實施方案中，糖肽可由幾丁聚糖及聚氨基酸所組成，尤其是聚谷氨酸。這種糖肽不需添加標(biāo)靶藥物(targeting agent)進(jìn)行修飾，本身即具有腫瘤標(biāo)定的能力(tumor targeting capacity)。幾丁聚糖(CH)屬于一種氨基多糖類(polyaminosaccharide)，可多方面應(yīng)用。如同其它多種氨基多糖類，幾丁聚糖可自許多天然物質(zhì)中快速取得。而且，幾丁聚糖雖然也可獲自蟹或其它甲殼動物或昆蟲的殼或真菌類植物，但目前其主要的來源為龍蝦、淡水螯蝦或小蝦脫掉的殼。正常情況下，幾丁聚糖不具毒性，且能與許多生命系統(tǒng)兼容，如人體組織。然而，如同其它多種多糖類，幾丁聚糖在水中僅具有有限的溶解度。為了改善其溶解度，可使用烷基硫酸鹽幾丁聚糖，例如，在美國專利申請第10/871,890號(申請日06/18/2004)中即對此有所描述。
至于其它適當(dāng)糖苷包含膠原蛋白、軟骨素、hyauraniate及肝素。
聚谷氨酸(PGA)也可立即從市面上購得(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)或利用各種方法加以合成。由于聚谷氨酸在生理環(huán)境下帶正電荷且為生物所能分解，故具有廣泛的生物用途。
而其它種類的肽則可用于本發(fā)明的其它實施方案。這些肽可包含其它同樣具有特殊序列或特殊氨基酸組成的聚氨基酸。在某些實施例中，肽可具有標(biāo)定(targeting)的功能；而在特殊的實施方案中，可利用聚天門冬氨酸執(zhí)行這一功能。但由于腫瘤細(xì)胞無法自行制造天門冬氨酸，大部分需要由外界獲取，故腫瘤細(xì)胞對聚天門冬氨酸的攝取會因此提高。因為聚氨基酸具有酸基，可使糖肽與不同的藥劑結(jié)合或可形成鹽類，以改善幾丁聚糖的溶解度。
本發(fā)明的糖肽是由糖苷及肽利用多種排列方式所組成，而幾丁聚糖與聚谷氨酸的四種排列方式如圖1A-圖1D所示。在本發(fā)明的多個實施方案中，不同排列方式的糖肽可混合使用，或者分別使用一種或多種排列方式的糖肽。至于要何種排列方式則需要考量多種因素，包括糖肽的最終用途或共軛結(jié)合于糖肽之物為何等等。在大多數(shù)的合成方法中，圖1A所示的糖肽結(jié)構(gòu)是可能的主要排列方式。
而本發(fā)明合成糖肽的另一方法如圖2A與圖2B所示，但其它的方法也可行，例如可設(shè)計有利于形成某種糖肽結(jié)構(gòu)的合成反應(yīng)。特別的實施方案如圖2A與圖2B所示，糖苷與肽是藉由碳二亞胺作為偶合劑而相互結(jié)合。同時，圖2A與圖2B也揭示N-羥基硫代琥珀硫亞氨(sulfo-NHS)可作為酸基活化劑，以促進(jìn)糖肽的形成；而且，在本發(fā)明中，其它酸基活化劑也可用于形成糖肽。
本發(fā)明將揭示多種糖肽的生物學(xué)特性，包括可使多種藥劑結(jié)合于其上。相關(guān)的藥劑有標(biāo)定劑、顯影劑及治療劑。而多種藥劑或不同型態(tài)的藥劑都可與相同的糖肽分子在同一時間結(jié)合。在特殊的實施方案中，所述的藥劑可構(gòu)成糖肽結(jié)合物(glycopeptide conjugate)重量的約10-60％。
雖然糖肽對于腫瘤組織具有與生俱來的標(biāo)定腫瘤組織的能力，但加入藥劑更能促進(jìn)對腫瘤的標(biāo)記或?qū)τ谀[瘤的標(biāo)記更具特異性。當(dāng)然，標(biāo)記其它組織的藥劑，如標(biāo)記骨骼的帕米磷酸(pamidronate)及標(biāo)記葉酸受器的甲氨蝶呤(methotrexate)也可與糖肽共軛結(jié)合。而許多顯影劑所含的金屬離子，則是利用螯合劑與顯影劑結(jié)合，如DPTA。而可用以螯合價金屬離子(valent metal ion)的放射線核素包括99mTc、60Cu、61Cu、62Cu、67Cu、111In、201T1、67Ga、68Ga、72As、186Re、188Re、166Ho、90Y、153Sm、89Sr、157Gd、212Bi及213Bi，藉由這些金屬螯合物，可反映出疾病所造成的損害程度。在某些實施方案中，糖肽本身所具有的羧基及胺基即足以螯合金屬離子。
治療劑對于被標(biāo)定的組織大多具有特異性，如化療藥物或及其它抗癌藥物對于被標(biāo)定的腫瘤所具有的特異性。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物、抗凝血劑、抗血管增生藥物、細(xì)胞凋亡藥物、類固醇、抗發(fā)炎藥物及骨質(zhì)疏松藥物也可與糖肽共軛結(jié)合。
在許多實施例中，除了藉由生物可變性的鍵結(jié)(如酰胺鍵或酯鍵)，治療劑可以任何可接受的方式與糖肽共軛結(jié)合。圖2B即在說明骨質(zhì)疏松藥物及帕米磷酸鹽與糖肽共軛結(jié)合的方法，而相同或近似的方法也可用于其它藥劑的結(jié)合。此外，藉由藥劑上的羧酸或胺基，也可與糖肽相結(jié)合，尤其當(dāng)糖肽與不溶于水的藥劑結(jié)合時，會加入二甲基亞酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO)參與反應(yīng)。
在特殊的實施方案中，顯影性及治療性結(jié)合物兩者都可提供至標(biāo)的物。其中，可藉由在標(biāo)定區(qū)域中，顯影復(fù)合物量的多寡來決定未經(jīng)標(biāo)定的治療性復(fù)合物的最佳或建議劑量。
某些顯影復(fù)合物可使用具有放射療效的小的金屬離子，通過這些復(fù)合物的顯影，可直接決定個體需接受放射治療的劑量。
同樣地，若放射治療劑或其它顯影劑并入相同的復(fù)合物中作為治療劑，則個體內(nèi)治療劑的劑量也可直接加以測量。上述的復(fù)合物如圖3A與圖3B所示。
藥劑與糖肽的結(jié)合尤其可維持藥劑的釋放，尤其是在生物系統(tǒng)中，如哺乳類。同時，結(jié)合物也可增加藥劑在水中的溶解度及低水溶性藥劑的療效指數(shù)(therapeutic index)。
腫瘤相關(guān)應(yīng)用本發(fā)明的實施方案可用于腫瘤的治療，尤其是藉由細(xì)胞毒劑(cytotoxic agent)的傳輸。相對于加入細(xì)胞生長抑制劑(cytostaticagent)，細(xì)胞毒劑的傳輸更能改善先前治療上的問題。雖然在本發(fā)明中，糖肽是用以傳輸細(xì)胞生長抑制劑，但其傳輸細(xì)胞毒劑的能力更能增添其做為治療工具的價值。
在特殊的實施方案中，糖肽的組成是使用包含幾丁聚糖及聚谷氨酸或聚天門冬氨酸。因為在腫瘤組織中，血管增生的速率極為快速，因此，在實施方案中標(biāo)定腫瘤組織的方法，多是藉由血管增生的過程而加以實施。而位于血管細(xì)胞上的整合素分子將被多糖類所標(biāo)定，例如膠原蛋白、軟骨素、hyauraniate、幾丁聚糖。由于這種血管標(biāo)定的方式并未直接標(biāo)定腫瘤組織，故可防止腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性。此外，腫瘤組織對于氨基酸的需求增加，且大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的表面皆具有某種氨基酸受器，(如谷氨酸及天門冬氨酸)，因此，聚氨基酸也具有標(biāo)定的功能。更明確地說，聚氨基酸可能被腫瘤細(xì)胞所攝取。
本發(fā)明中，是以γ-顯影(gamma imaging)的方式，將經(jīng)99mTc標(biāo)定的幾丁聚糖/聚谷氨酸(99mTc-labeled chitosan/poly(glutamic acid)所形成的糖肽的腫瘤標(biāo)定能力表現(xiàn)出來。經(jīng)99mTc標(biāo)定的幾丁聚糖/聚谷氨酸可用以定量治療所需的劑量，最后，并可以此預(yù)測病人治療后的反應(yīng)，而考慮是否作為治療上的選擇。188Re也可為多種腫瘤進(jìn)行化療的選擇，甚至，不論糖肽是位于脈管(vasculature)系統(tǒng)中或內(nèi)化于腫瘤之中，鍵結(jié)于糖肽之上的188Re是都頗具療效。188Re是一β及γ(15％)輻射體，其半衰期為17小時；其對組織的穿透深度為5-7mm，可同時用以顯影及治療大的腫瘤。
由于腫瘤標(biāo)定能力有助于增加低水溶性化療藥劑的傳輸，因此，也可提高藥劑的療效指數(shù)。此外，由于化療藥劑會逐漸從糖肽釋放，療效指數(shù)增高，故可降低急性系統(tǒng)性毒性。
骨骼相關(guān)應(yīng)用在本發(fā)明的特殊的實施方案中，帕米磷酸鹽可與糖肽相結(jié)合，該方法如圖2A與圖2B所示。帕米磷酸鹽是一破骨細(xì)胞劑(osteoclast agent)，利用幾丁聚糖/聚谷氨酸與帕米磷酸鹽的結(jié)合物，可觀察到帕米磷酸鹽的毒性很低，且由于其腎清除率高，因此，很快能被代謝而排出體外。而從顯影研究上顯示，骨骼為這種組合物的標(biāo)定對象，是用以治療骨骼退化癥，如骨質(zhì)疏松。
以下實施例為對本發(fā)明所選出的實施方案的進(jìn)一步描述。
實施例實施例1糖肽的合成在水解幾丁聚糖過程中，會制備不同分子量及百分比的胺基轉(zhuǎn)換物(amino group conversion)。在此，所述轉(zhuǎn)換物的分子量及比例是以CH[分子量][胺基轉(zhuǎn)換物]％的方式表示。舉例來說，CH10是指將分子量為10,000的幾丁聚糖百分之百水解其乙酰胺基，可形成胺基。
典型的合成過程，是先將幾丁聚糖(CH10，100％)(200mg，MW.10,000-20,000)加入5ml的水?dāng)嚢?，之后，再將N-羥基硫代琥珀硫亞氨(sulfo-NHS)(232.8mg，1.07mmol)、3-乙基碳二亞胺-乙基[3-(二甲胺基]丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(3-ethylcarbodiimide1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide-HCl(EDC))(204.5mg，1.07mmol)(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)加入，之后再加入聚谷氨酸(400mg，MW.750～3,000)。將此混合物在室溫下攪拌24小時后，以截留分子量10,000的Spectra/POR分子多孔薄膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)進(jìn)行48小時的透析，并將透析后的產(chǎn)物過濾后，以冷凍干燥器(Labconco，Kansas City，MO)處理，獲得鹽態(tài)(salt form)的糖肽568.8mg。糖肽組合物的四種型態(tài)則如圖1A-圖1D所示。所述糖肽的混合物可用于本發(fā)明的各個實施例，混合物經(jīng)過分離后，四種型態(tài)的糖肽皆可單獨使用。
實施例2以99mTc對糖肽進(jìn)行放射線標(biāo)定將5mg的糖肽溶于0.2ml的水，再在室溫中加入氯化錫(0.1mg溶于0.1ml的水)，之后，添加5mCi高锝酸鈉(sodium pertechnetate)。而放射化學(xué)純度(Radiochemical purity)是由經(jīng)1∶4的甲醇∶醋酸銨混合液洗提后的TLC(ITLC SG，Gelman Science，Ann Arbor，MI)決定。而通過放射性薄層分析法(Radio-TLC)(Bioscan，Washington，DC)的分析，放射化學(xué)純度超過95％。
實施例3帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物的合成將帕米磷酸鹽(100mg，0.24mmol)溶于1ml的碳酸氫鈉(1N)、N-羥基硫代琥珀硫亞氨(91.8mg，0.43mmol)、3-乙基碳二亞胺-乙基[3-(二甲胺基]丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(81.2mg，0.43mmol)中，再加入糖肽溶液(糖肽200mg+5ml去離子水)。之后，將上述溶液在室溫下攪拌24小時，經(jīng)透析及冷凍干燥后，可產(chǎn)生250mg的帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物，其合成的流程圖如圖2A、圖2B所示。
實施例4體外細(xì)胞培養(yǎng)分析為了評估糖肽是否具有腫瘤標(biāo)定的能力，選用哺乳類腫瘤細(xì)胞系(13762)進(jìn)行分析。先將細(xì)胞置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為50,000/孔，再加入以99mTc標(biāo)定的糖肽(GP)(劑量4μCi，0.148MBq)、聚谷氨酸(PGA)、幾丁聚糖(CH10，50％)或幾丁聚糖(CH10，100μg/well)一起培養(yǎng)，所述接受測試之物，其結(jié)構(gòu)如圖4A(CH-10(50％))、圖4B(CH-10(G，100％))、圖4C(聚谷氨酸(A))、圖4D(G-P(1∶2))所示。將細(xì)胞與放射性追蹤劑在37℃下培養(yǎng)0.5-2小時之后，以冰的磷酸緩沖液(PhosphateBuffered Saline，PBS)洗滌兩次，再以0.5ml胰蛋白酶的溶液對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化的處理。然后，收集細(xì)胞并以伽瑪計數(shù)器(Gamma-counter)測量細(xì)胞的放射性，取三次測量值的平均值(mean±SD)，以百分比攝取率(percent uptake ratio)表示。而結(jié)果顯示，糖肽與聚谷氨酸具有近似的細(xì)胞攝取率(如圖5所示)，但糖肽可標(biāo)定血管組織及細(xì)胞受器，因此較適用于真實的生物系統(tǒng)，而聚谷氨酸僅可標(biāo)定細(xì)胞。
實施例5腫瘤閃爍造影術(shù)(Scintographic imaging)的研究為了顯示糖肽是否具有標(biāo)定腫瘤組織的特異性，選用一群左腿有或無松節(jié)油所引發(fā)的發(fā)炎癥狀的雌性腫瘤鼠(Fischer 344 tumor-bearing rats，右腿皆有腫瘤組織)注射300μCi經(jīng)99mTc標(biāo)定的糖肽、幾丁聚糖(50％、100％)或聚谷氨酸(PGA)，再以低能量、備有平行孔準(zhǔn)直儀(parallel holecollimator)的γ閃爍攝影機(gamma camera)；于注射后0.5、2及4小時后，進(jìn)行閃爍造影。事實上，每個時間點上都可獲得不錯的顯像，而當(dāng)比較肽及幾丁聚糖后發(fā)現(xiàn)，在注射糖肽后0.5-3小時造影，其腫瘤對肌肉比例(tumor-to-muscle ration)及腫瘤對發(fā)炎比例(tumor-to-inflammation ration)較高(如圖6A與圖6B所示)。
從細(xì)胞攝取檢測中顯示，糖肽及聚谷氨酸的攝取率(0.4-0.5％)高于幾丁聚糖的攝取率(0.2％)。從經(jīng)99mTc標(biāo)定的糖肽在患乳癌鼠的生體分布(biodistribution)可發(fā)現(xiàn)腫瘤對組織計算密度比例(tumor-to-tissuecount density ratio)是一個隨時間變化的函數(shù)，而從平面造影則可清楚看見腫瘤的存在。在2小時時，糖肽、聚谷氨酸及幾丁聚糖的腫瘤/肌肉比例(tumor/muscle ration)各為3.9、3.0及4.89，雖然單獨使用幾丁聚糖的腫瘤/肌肉比例較高，但由于糖肽同時可標(biāo)定細(xì)胞及血管，因此較常被采用。而且，糖肽在組織內(nèi)整體的保留性也較佳。
實施例6腫瘤對于紫杉醇治療的反應(yīng)為了評估“抑制血管增生”治療的反應(yīng)，將老鼠分別施打紫杉醇(paclitaxil)(40mg/kg，iv)，并于第四天利用經(jīng)99mTc標(biāo)定的糖肽(99mTc-糖肽)加以顯影。此外，在紫杉醇治療前后，需進(jìn)行腫瘤攝取(tumor uptake)、原位雜交(in situ hybridization，ISH)及TUNEL Assay。在第四天利用99mTc-糖肽進(jìn)行觀察施打過紫杉醇的老鼠，并未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤進(jìn)程(tumorprogression)，反而可以在治療后觀察到腫瘤壞死的現(xiàn)象。而且，從原位雜交及TUNEL Assay中也顯現(xiàn)出腫瘤對放射線攝取與細(xì)胞標(biāo)定表現(xiàn)間的關(guān)聯(lián)性。
實施例7骨骼閃爍造影術(shù)的研究為了顯示糖肽可標(biāo)定骨骼，在正常雌鼠(Fischer 344 rats，125-175g)體內(nèi)施打經(jīng)99mTc標(biāo)定的帕米磷酸鹽(300μCi)、糖肽及帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物。而結(jié)果顯示，帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物可標(biāo)定骨骼(如圖7、圖8所示)。
實施例8預(yù)防骨質(zhì)流失將不同劑量的帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物、糖肽或帕米磷酸鹽注入已移除卵巢的老鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)切除卵巢與類似骨質(zhì)疏松的骨質(zhì)流失現(xiàn)象有極大的關(guān)聯(lián)。由于帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物具有標(biāo)定骨骼的傾向，因此數(shù)月中持續(xù)觀察其是否可預(yù)防或減輕雌鼠因卵巢切除所導(dǎo)致的骨質(zhì)流失。進(jìn)而，由于帕米磷酸鹽標(biāo)定骨骼的效果不佳，因此應(yīng)可預(yù)期使用帕米磷酸鹽-糖肽結(jié)合物比單獨使用帕米磷酸鹽將有較佳的標(biāo)定效果。
雖然本發(fā)明及其優(yōu)點已詳述如上，但在不背離本發(fā)明的的精神與范圍的情況下，當(dāng)可對本發(fā)明做不同的修改、取代及替換。
權(quán)利要求
1.一種糖肽，包含至少兩基團，包含一糖苷；一肽；其中所述糖苷是藉由酰胺鍵共價鍵結(jié)至所述肽；一診斷劑或一治療劑共軛結(jié)合至糖苷或肽基團。
2.如權(quán)利要求1所述的糖肽，進(jìn)一步包含一金屬共軛結(jié)合至無診斷劑或治療劑結(jié)合的基團。
3.如權(quán)利要求2所述的糖肽，進(jìn)一步包含所述診斷劑或治療劑通過羧酸并經(jīng)由肽鍵與糖苷共軛鍵結(jié)；及金屬螯合至肽。
4.如權(quán)利要求2所述的糖肽，進(jìn)一步包含所述診斷劑或治療劑通過氨基并經(jīng)由肽鍵與肽共軛鍵結(jié)；及金屬螯合至糖苷。
5.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖苷至少包含兩個共價結(jié)合的單體單元，且其中所述肽包含聚氨基酸。
6.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖苷包含胺糖。
7.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖苷包含幾丁聚糖；所述肽包含聚谷氨酸或聚天門冬氨酸。
8.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖肽包含約5％-50％重量的肽。
9.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖苷的分子量約3,000-10,000道爾頓，所述肽的分子量約750-3,000道爾頓。
10.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖肽的分子量約5,000-30,000道爾頓。
11.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖苷選自由膠原蛋白、軟骨素、hyauraniate、肝素及其任何組合物所組成的群組；所述肽選自由聚谷氨酸及聚天門冬氨酸及其任何組合物所組成的群組。
12.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述診斷劑或治療劑選自由抗癌藥物、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物、抗凝血劑、抗血管生成藥物、細(xì)胞凋亡藥物、骨質(zhì)疏松藥物、類固醇、抗發(fā)炎藥物及其任何組合物所組成的群組。
13.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述診斷劑或治療劑包含甲氨蝶呤或帕米磷酸鹽。
14.如權(quán)利要求2所述的糖肽，其中所述金屬包含放射性核素。
15.如權(quán)利要求14所述的糖肽，其中所述金屬選自由Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、Tl-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213及其任何組合物所組成的群組。
16.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述診斷劑或治療劑構(gòu)成糖肽重量的約10-60％。
17.如權(quán)利要求1所述的糖肽，其中所述糖苷是以血管內(nèi)皮細(xì)胞為作用標(biāo)的，而所述肽是以癌細(xì)胞為作用標(biāo)的。
18.一種糖肽，包含幾丁聚糖；及一聚氨基酸，其中所述幾丁聚糖及聚氨基酸是藉由酰胺鍵共價鍵結(jié)。
19.如權(quán)利要求18所述的糖肽，其中所述幾丁聚糖包含烷基硫酸鹽幾丁聚糖。
20.如權(quán)利要求18所述的糖肽，其中所述聚氨基酸包含聚谷氨酸或聚天門冬氨酸。
21.如權(quán)利要求18所述的糖肽，進(jìn)一步包含共軛鍵結(jié)至幾丁聚糖或聚氨基酸的診斷劑或治療劑。
22.如權(quán)利要求18所述的糖肽，進(jìn)一步包含共軛鍵結(jié)至幾丁聚糖或聚氨基酸的金屬。
23.一種制造糖肽的方法，包含藉由碳二亞胺與酸基活化劑存在下，于糖苷與肽之間形成酰胺鍵以結(jié)合糖苷與肽。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包含形成結(jié)合糖苷或肽及診斷劑或治療劑間的酰胺鍵或酯鍵。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包含將螯合劑及金屬共軛結(jié)合至糖苷或肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及由糖苷與肽利用酰胺鍵共價鍵結(jié)所形成的糖肽。該糖肽也可包含有診斷劑或治療劑鍵結(jié)于其上。而金屬類，如放射性核素，也可螯合至糖肽。本發(fā)明的特殊實施方案涉及幾丁聚糖共價鍵結(jié)至聚氨基酸，如聚谷氨酸、聚天門冬氨酸而制得的糖肽。當(dāng)診斷劑共軛結(jié)合至糖肽時，可增強放射性核素顯像的清晰度；而特殊治療劑中，可共軛結(jié)合至糖肽的包括抗癌藥物、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物、抗凝血劑、抗血管增生藥物、細(xì)胞凋亡藥物、骨質(zhì)疏松藥物、類固醇及抗發(fā)炎藥物。其中某些藥劑，如放射性核素，同時具有診斷性或治療性功效。而糖苷與肽藉由碳二亞胺與酸基活化劑存在下所形成的酰胺鍵相結(jié)合后，可形成糖肽。
文檔編號A61P19/02GK1827635SQ20061005837
公開日2006年9月6日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日
發(fā)明者魏一健, 楊敬文, 于東防 申請人:聚和國際股份有限公司