專利名稱：熊果酸在制備抗癌藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及熊果酸制備抗癌藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
熊果酸(Ursolic acid)是山茱萸、夏枯草、山楂等中藥材的鑒別成份，亦是六味地黃丸、七味都?xì)馔?、山楂化滯丸等中成藥的有效成份之?中國(guó)藥典2000年版一部)。
祖國(guó)醫(yī)藥早已證實(shí)熊果酸有抗菌、消炎、調(diào)節(jié)免疫、降低血清轉(zhuǎn)氨酶等藥理活性，近年日、美、法、英、韓等國(guó)還發(fā)現(xiàn)熊果酸對(duì)腎癌、黑色素瘤(Z.Naturforsch，56(1-2)45-8，2001)，結(jié)腸癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、人非小細(xì)胞肺癌(Planta Med，66(5)485-6，2000)，人表皮樣瘤(Anticancer Res.20(6B)4563-70，2000)、人肝癌、卵巢癌(ArchPharm Res，23(2)155-8，2000)，人急性早幼粒細(xì)胞白血病(PharmacolToxicol，86(2)53-8，2000)及畸胎瘤(Planta Med，64(5)468-70，1998)等癌細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究熊果酸在制備抗癌藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明用MTT法亦證明熊果酸對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人乳腺癌細(xì)胞(ZR-75-30)、人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)、人慢性髓性白血病細(xì)胞(K-562)、人淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat)、人成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(Molt-4)和人急性成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)都有細(xì)胞毒效應(yīng)。
MTT法是現(xiàn)代檢測(cè)細(xì)胞存活率最經(jīng)典的基本方法。該法利用活細(xì)胞具酶活性而死細(xì)胞無(wú)酶活性的原理設(shè)計(jì)。由于黃色的四氮唑[MTT，3-(4.5-dimethylthiazol-2-y’)-2.5-diphenyltetrazolium bromide]能接受脫氫酶給予的氫原子而轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色的甲次(formazan)；活細(xì)胞因具脫氫酶，故能被染成藍(lán)紫色。死細(xì)胞無(wú)活性脫氫酶，故不呈藍(lán)紫色。
進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入二甲亞砜(DMSO)，可使藍(lán)紫色的甲次溶出。培養(yǎng)液中活細(xì)胞越多，藍(lán)紫色越深，在一定波長(zhǎng)(595nm)下用酶標(biāo)儀可測(cè)得其光密度值(A值)，根據(jù)其與對(duì)照組A值相比，可定量折算相對(duì)抑瘤率 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熊果酸即使在微量濃度下(10-40μM)對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人乳腺癌細(xì)胞(ZR-75-30)、人淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat)及人急性成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)、人成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(Molt-4)、人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)及人慢性髓性白血病細(xì)胞(K562)等都有一定的抑制效應(yīng)，且抑制強(qiáng)弱與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。即熊果酸濃度越高，藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越高。熊果酸在20μM濃度下，作用1天，其對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)的抑制率為42％；作用3天，抑制率上升到78％；熊果酸濃度升至40-80μm時(shí)，作用1天，抑制率為85-95％，作用3天，熊果酸對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率上升到99-100％(表1)；又如人乳腺癌細(xì)胞當(dāng)在含40μM濃度的熊果酸的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)1天時(shí)，細(xì)胞成活率為43％，培養(yǎng)3天時(shí)成活率下降到16％；熊果酸濃度提高到60μM時(shí)，培養(yǎng)1天成活率為15％，培養(yǎng)3天時(shí)成活率降至5.8％，即94％以上細(xì)胞被熊果酸所抑制。
本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 熊果酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的毒殺效果1.細(xì)胞培養(yǎng)取人乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-30(ductal carcinoma，CRL-1504)接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL公司產(chǎn)品)中，每3天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底壁后倒去培養(yǎng)基，用37℃無(wú)菌的磷酸緩沖液(pH7.2)涮洗，再加0.25％胰蛋白酶，37℃酶解使細(xì)胞脫壁，取1/3的細(xì)胞用于傳代，實(shí)驗(yàn)前共傳代4次。
2.接種及加藥將酶解后單個(gè)懸浮的ZR-75-30細(xì)胞用相應(yīng)的完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，然后接種于96孔板中。每孔接種50μl(5×103/孔)每塊板上留3孔加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基(50μL/孔)作為空白對(duì)照。接種后，96孔板置于37℃，含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入不同濃度的熊果酸(用DMSO溶解)，每孔50μL。繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)1至5天。每個(gè)濃度用3孔作為平行對(duì)照。另用含相同濃度的DMSO作為無(wú)藥對(duì)照。
3.MTT法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)在實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)，加入每孔10μL MTT的PBS溶液(5mg/ml)，并繼續(xù)在37℃，5％CO2的條件下孵育至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。然后，每孔加入100μL DMSO，終止反應(yīng)，然后在酶標(biāo)儀(BIO-RADMicroplate Reader，Model 550)上以655nm作為參考波長(zhǎng)，在595nm下讀出A值，扣除無(wú)細(xì)胞孔的空白對(duì)照值，即為測(cè)定值。
4.細(xì)胞存活率和相對(duì)抑制率以無(wú)細(xì)胞的孔讀數(shù)作為無(wú)細(xì)胞存活，未加熊果酸的細(xì)胞培養(yǎng)孔讀數(shù)作100％細(xì)胞存活，從加藥孔的A值計(jì)算其細(xì)胞存活率或用下述公式計(jì)算相對(duì)抑制率。
細(xì)胞存活率％＝樣品孔平均A值÷空白對(duì)照孔平均A值×100％結(jié)果熊果酸能使培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞成活數(shù)明顯減少，其減少數(shù)與藥物濃度及藥物作用時(shí)間相關(guān)，即藥物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞成活數(shù)越少。如人乳腺癌細(xì)胞在含熊果酸20、40、60、80μM培養(yǎng)液中培養(yǎng)1天，其成活率分別為96.0、43.7、15.2、8.5和5.1％，即熊果酸在20、40、60、80μM濃度下對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的相對(duì)抑制率分別為4.0、56.3、84.8和91.5％。在相同藥物濃度下凡細(xì)胞接觸藥物時(shí)間越長(zhǎng)，其活細(xì)胞數(shù)亦越少。人乳腺癌細(xì)胞在40μM熊果酸濃度下培養(yǎng)1天細(xì)胞存活率為43.2％，培養(yǎng)2天為18.6％，培養(yǎng)3天活細(xì)胞僅為16.1％，其它濃度亦類似(表1)表1 熊果酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的毒殺效果(MTT法)

實(shí)施例二 熊果酸對(duì)人肝癌細(xì)胞的毒殺效果取保存在液氮罐中的肝癌細(xì)胞HepG2(Hepatocellulas carcinoma，HB-8065)解凍后，移入含10％胎牛血清的完全MEM培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium，Gibco BRL公司產(chǎn)品)中，每3天更換培養(yǎng)基，待長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底壁后用37℃無(wú)菌PBS涮洗，然后用少量0.25％胰蛋白酶酶解脫壁，取1/3的細(xì)胞傳代。實(shí)驗(yàn)前共傳代3次。
將上述酶解后單個(gè)懸浮的HepG2細(xì)胞用MEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，然后接種于96孔板中。每孔接種50μL(5×103/孔)。與實(shí)施例一相同，每塊板上留3孔加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基(50μL)作為空白對(duì)照。置96孔板于37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入10-80μM濃度的熊果酸，繼續(xù)培養(yǎng)1至5天。每個(gè)濃度用3孔作為平行對(duì)照。另用含相同濃度的DMSO作為無(wú)藥對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)，每孔加入10μl的MTT溶液，并繼續(xù)在37℃，5％CO2的條件下孵育至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。然后，每孔加入100μl的溶劑(10％SDS，含0.01ml/L的HCL)，37℃孵育過(guò)夜。在595nm下測(cè)各孔A值?？鄢裏o(wú)細(xì)胞孔的空白對(duì)照值后，即得各試驗(yàn)孔的A值。以未接種細(xì)胞的培養(yǎng)孔A值作為無(wú)活細(xì)胞，未加熊果酸的細(xì)胞培養(yǎng)孔A值作為100％存活。從各藥物孔的A值折算成細(xì)胞相對(duì)成活率和抑制率，結(jié)果在20μM-80μM熊果酸濃度下作用24hr，肝癌細(xì)胞的抑制率為42.2～95.4％；作用3天的抑制率為73.7～99.7％；作用5天的抑制率為78.1～100％(表2，

圖1)表2 熊果酸對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)的毒殺效應(yīng)(MTT法)

實(shí)施例三 熊果酸對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞及人急性成淋巴細(xì)胞等白血病細(xì)胞的毒殺效應(yīng)1.細(xì)胞株人淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat(TIB-152)，人急性成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株CCRF-CEM(CCL-119)，人急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60(CCL-240)，人成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4(CRL-1582)，人慢性髓性白血病細(xì)胞株K562(CCL-243)，上述細(xì)胞均購(gòu)自ATTC。括號(hào)中為ATCC編號(hào)。
2.細(xì)胞培養(yǎng)將上述懸浮生長(zhǎng)的5株白血病細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10％胎牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)基中，每毫升培養(yǎng)基另加青霉素、鏈霉素各100單位，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天數(shù)取1/3-1/4的細(xì)胞定期傳代以保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)。
3.接種及加藥將懸浮的Jurkat、HL-60、CCRF-CEM、Molt-4及K562細(xì)胞分別用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，然后接種于96孔板中，每孔接種50μl，孵育過(guò)夜。然后加不同濃度的熊果酸(50μl/孔)。繼續(xù)培養(yǎng)1、3、5天。
4.MTT法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)按實(shí)施例一相同方法加MTT，在595nm下測(cè)各孔吸光值(A值)，計(jì)算各自的平均抑制率。按下式求出IC50值。

結(jié)果熊果酸即使在2.5-15μM的低濃度下對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞及幾種急、慢性白血病細(xì)胞都有一定的抑制效應(yīng)。不同類型的白血病細(xì)胞對(duì)熊果酸敏感度略有差異。在15μM濃度下熊果酸對(duì)HL-60、Molt-4和K562的抑制率為38.9、33.2和56.2％，但對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat)和人急性成淋巴細(xì)胞白血病(CCRF-CEM)的抑制率高達(dá)83.9和98.8％(表3)。
表3 熊果酸對(duì)Jurkat等5種白血病細(xì)胞的抑制率

上述試驗(yàn)結(jié)果表明低濃度(15μM)的熊果酸對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人乳腺癌細(xì)胞(ZR-75-30)、人淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat)、人成淋巴細(xì)胞白血病(Molt-4)、人急性成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)、人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)及人慢性髓性白血病細(xì)胞(K562)都有細(xì)胞毒效應(yīng)。熊果酸對(duì)上述癌細(xì)胞的抑制活性可隨藥物濃度和作用時(shí)間增加而加強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種熊果酸在制備抗癌藥中的應(yīng)用
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熊果酸在制備抗癌藥中的應(yīng)用，其特征在于其中所述的熊果酸在15μM低濃度情況下對(duì)人肝癌、乳腺癌、淋巴瘤、成淋巴細(xì)胞白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、急性早幼粒白血病和慢性髓性白血病都有細(xì)胞毒效應(yīng)，并且熊果酸濃度越高，與細(xì)胞作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞毒效果越強(qiáng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了熊果酸在制備抗癌藥中的應(yīng)用。通過(guò)試驗(yàn)表明熊果酸對(duì)人肝癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人淋巴瘤細(xì)胞、人成淋巴細(xì)胞白血病和人急性成淋巴細(xì)胞白血病、人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有細(xì)胞毒效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K31/56GK1589799SQ0315071
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月1日
發(fā)明者楊曉彤 申請(qǐng)人:太平保健藥業(yè)(蛇口)有限公司