發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的2-伯氨基-4-仲氨基-喹啉衍生物、它們的制備、包含它們的藥物組合物以及它們作為藥劑的用途。本發(fā)明的活性化合物用于治療和預(yù)防增殖性腫瘤和非腫瘤性疾病。發(fā)明背景新抗癌藥的藥物發(fā)現(xiàn)近來已從基于細(xì)胞的測定法發(fā)展到更集于藥物靶標(biāo)蛋白的充分表征的、分離的和轉(zhuǎn)染輔助表達(dá)的蛋白的體外方法。本領(lǐng)域中充分描述了這種蛋白靶向藥物發(fā)現(xiàn)范例，在人類激酶抑制劑的合理設(shè)計的藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域中進(jìn)行了巨大努力，使得能夠探索人類激酶組。實(shí)際上，人類激酶可以突變，且激酶失調(diào)通常發(fā)生在人類癌癥的惡性轉(zhuǎn)化、生長和最終轉(zhuǎn)移進(jìn)化中。在例如白血病、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌中充分確立了這種激酶牽涉癌癥的發(fā)生和增殖。目前，盡管在一些癌癥中靶向人類激酶功能障礙進(jìn)行了這種巨大努力，但是在抗癌療法中使用激酶抑制劑的臨床突破顯然并不伴隨治愈或緩解，并且?guī)追N癌癥對激酶抑制劑的臨床應(yīng)用似乎仍然是天然抵抗(例如肝細(xì)胞癌)。此外，激酶抑制劑可以選擇體內(nèi)一些突變和抗性株或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以同樣找到補(bǔ)償?shù)耐緩?。在這種情況下，我們決定考慮整個細(xì)胞小室和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，開發(fā)無偏表型細(xì)胞篩選試驗(yàn)。此外，細(xì)胞轉(zhuǎn)化、癌癥生長和轉(zhuǎn)移進(jìn)化的分子理解和分子描述仍然在不斷發(fā)展，例如最近描述癌干細(xì)胞(cscs)概念或腫瘤起始細(xì)胞(tic)。細(xì)胞篩選中的預(yù)料不到的效果可能暗示用于發(fā)現(xiàn)新的可成藥靶標(biāo)的其它靶標(biāo)或特異性相互作用。因此，新抗癌藥的開發(fā)仍然是具有不可預(yù)期的結(jié)果的獨(dú)特挑戰(zhàn)和用于發(fā)現(xiàn)新穎和創(chuàng)新化合物的地方。本發(fā)明人已制備了一系列新的多樣性定向的2-氨基-2-仲氨基-芳基喹啉化合物庫，針對一組人類癌細(xì)胞系(molm14、kg-1、mv4-11、a375、hct116、hepg2、huh-7、mda-mb-231、caki-1、786-o)和從患者中得到的癌癥初級細(xì)胞篩選了該庫，使得能夠發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥。此外，這類化合物對人類癌干細(xì)胞(cscs)同樣表現(xiàn)出額外的活性，所述癌干細(xì)胞被廣泛認(rèn)為是抗癌療法后癌癥復(fù)發(fā)和再發(fā)的原因。在本領(lǐng)域中充分描述的aldh測定法用作描述針對cscs的活性的癌干細(xì)胞功能標(biāo)記(greve，b.等人cytometrya2012(81)284-293，liu，s.等人plosone2013(25)e81050，ran，d.等人exp.hematol.2009(37)1423-1434，cheung，a.m.等人leukemia2007(21)1423-1430，pearce，d.j.等人stemcells2005(23)752-760)。因此，本發(fā)明的目的在于提供用于預(yù)防或抑制多種多樣生物體中細(xì)胞增殖的活性劑，并提供它們的合成的方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的活性劑(單獨(dú)或與其它活性劑組合)以及藥學(xué)上可接受的助劑、稀釋劑或載體。本發(fā)明的另一個目的在于提供用于療法中的活性劑。本發(fā)明的另一個目的在于提供用于治療和/或預(yù)防增殖性和/或腫瘤生成性疾病的方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供抑制癌干細(xì)胞(csc)、腫瘤起始細(xì)胞、與癌癥相關(guān)的間充質(zhì)樣細(xì)胞、間充質(zhì)癌細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的生長或分化的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供式(i)的化合物，及其任意藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體混合物、溶劑合物或前藥，其中·r1可以選自被r9取代或未被取代的c6-c10芳基；被r9取代或未被取代的包含1、2或3個選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳基環(huán)；被r9取代或未被取代的如所定義的包含8－13個原子(包括1、2、3、4個選自o、n和s的雜原子且包含至少2個碳原子)的稠合雜芳基；·lw可以選自任選被取代的(c1-c10)烷基；被r4取代的直鏈或支鏈(c1-c10)烷基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c3-c10)烯基；任選被取代的(c3-c10)炔基；c＝o；so；so2；(c＝o)-nr8；(c＝o)-o；(c＝o)-o-(c1-c4)烷基；so2-nr8；nr8；其中r4可以選自h；任選被取代的(c1-c10)烷基；任選被取代的(c3-c10)烯基；任選被取代的(c3-c10)炔基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c8-c10)環(huán)炔基；任選被取代的(c6-c10)芳基；被一個或多個取代基取代或未被取代的如所定義的包含8－13個原子(包括1、2、3、4個選自o、n和s的雜原子且包含至少2個碳原子)的5－8元雜芳基環(huán)或稠合雜芳基，所述取代基獨(dú)立地選自氫、鹵素原子、被一個或多個鹵素原子取代的(c1-c10)烷基、(c1-c10)烷氧基、羥基、氰基、硝基、羧基、nr8r8’、包含1、2或直至3個獨(dú)立地選自o、n和s的雜原子的4－9元飽和或不飽和環(huán)；·r2選自nr5r6；·r3可以選自氫原子；鹵素原子；被一個或多個鹵素原子、羥基、烷氧基、-nr5r6取代或未被取代的直鏈或支鏈(c1-c10)烷基；(c2-c10)烯基；(c2-c10)炔基；(c3-c10)環(huán)烷基；(c5-c10)環(huán)烯基；(c8-c10)環(huán)炔基；(c1-c10)烷氧基；羥基；硝基；氰基；nr5r6；o-(r7)；(co)-r7；(co)-o-r7；(co)-nr5r6；o-(co)-r7；o-(co)-nr5r6；nr5-(co)-r7；nr5-(co)-or7；nr5-(co)-nr5r6；-(o-ch2ch2-)m-or11；-(o-ch2ch2-)m-nr11r11’；so2-r7；nr5-so2-r7；so2-nr5r6；nr5-(c2-c6)-烷基-nr5r6；任選被取代的芳基；任選被取代的芐基；任選被取代的包含1、2或3個選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳基環(huán)；任選被取代的如所定義的包含8－13個原子(包括1、2、3、4個選自o、n和s的雜原子且包含至少2個碳原子)的稠合雜芳基；任選被取代的包含1、2或直至3個獨(dú)立地選自o、n和s的雜原子的4－9元雜環(huán)基環(huán)；·r5和r6可以獨(dú)立地選自氫；任選被取代的(c1-c10)烷基；任選被取代的(c3-c10)烯基；任選被取代的(c3-c10)炔基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c8-c10)環(huán)炔基；(co)-r7；(co)-o-r7；(co)-nr8r8’；so2-r7；so2-nr8r8’；被nr8r8’取代的(c1-c10)烷基；被nr8r8’取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的芳基；任選被取代的芐基；任選被取代的包含1、2或直至3個選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳基環(huán)；任選被取代的包含1、2或3個獨(dú)立地選自o、n和s的雜原子的飽和或不飽和4－9元雜環(huán)基環(huán)；或r5和r6可以與它們所共價連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，其構(gòu)成可以包含另外1、2或3個選自o、n和s的雜原子的4－9元環(huán)；·r7和r7’可以獨(dú)立地選自氫；任選被取代的(c1-c10)烷基；任選被取代的(c3-c10)烯基；任選被取代的(c3-c10)炔基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c8-c10)環(huán)炔基；被nr8r8’取代的直鏈或支鏈c1-c10烷基；任選被取代的(c6-c10)芳基、任選被取代的芐基、任選被取代的包含1、2或3個獨(dú)立地選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳族環(huán)；·r8和r8’可以獨(dú)立地選自氫；任選被取代的(c1-c10)烷基；任選被取代的(c3-c10)烯基；任選被取代的(c3-c10)炔基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c8-c10)環(huán)炔基；或r8和r8’可以與它們所共價連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，其構(gòu)成可以包含另外1、2或3個選自o、n和s的雜原子的4－9元環(huán)；·r9可以獨(dú)立地選自氫；鹵素原子；任選被取代的(c1-c10)烷基；被一個或多個鹵素原子、羥基、烷氧基取代的直鏈或支鏈(c1-c10)烷基；任選被取代的(c2-c10)烯基；任選被取代的(c2-c10)炔基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c8-c10)環(huán)炔基；任選被取代的(c1-c10)烷氧基；羥基；硝基；氰基；nr5r6；(co)-r7；(co)-o-r7；(co)-nr5r6；o-(co)-r7；o-(co)-nr5r6；nr5-(co)-r7；nr5-(co)-or7；nr5-(co)-nr5r6；so2-r7；nr5-so2-r7；so2-nr5r6；被nr5r6取代的(c1-c10)烷基；nr5-(c2-c10)-烷基-nr5r6；-(o-ch2ch2-)m-or11；-(o-ch2ch2-)m-nr11r11’；任選被取代的(c6-c10)芳基；任選被取代的芐基；任選被取代的包含1、2或3個選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳基環(huán)；任選被取代的雜環(huán)基，其構(gòu)成可以包含1、2或3個選自o、n和s的雜原子的4－9元環(huán)；-nr5r10；-o-r10；·r10可以獨(dú)立地選自氫；被r12取代或未被取代的(c6-c12)-芳基；被r12取代或未被取代的芐基；被r12取代或未被取代的包含1、2或3個選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳基環(huán)；被r12取代或未被取代的如所定義的包含8－13個原子(包括1、2、3、4個選自o、n和s的雜原子且包含至少2個碳原子)的稠合雜芳基；被r12取代或未被取代的雜環(huán)基，其構(gòu)成可以包含0、1、2或3個選自o、n和s的雜原子的4－9元環(huán)；·r11和r11’可以獨(dú)立地選自氫原子；任選被取代的(c2-c10)烷基；任選被取代的(c3-c10)烯基；任選被取代的(c3-c10)炔基；任選被取代的(c3-c10)環(huán)烷基；任選被取代的(c5-c10)環(huán)烯基；任選被取代的(c8-c10)環(huán)炔基；被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的直鏈或支鏈(c2-c10)烷基；或r11和r11’可以與它們所共價連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，其構(gòu)成可以包含另外1、2或3個選自o、n和s的雜原子的飽和或不飽和4－9元環(huán)；·r12可以選自氫原子；鹵素原子；被一個或多個鹵素原子、羥基、烷氧基、nr11r11’取代或未被取代的直鏈或支鏈(c1-c10)烷基；(c2-c10)烯基；(c2-c10)炔基；(c3-c10)環(huán)烷基；(c5-c10)環(huán)烯基；(c8-c10)環(huán)炔基；(cl-c10)烷氧基；羥基；硝基；氰基；nr11r11’；o-(r7)；(co)-r7；(co)-o-r7；(co)-nr11r11’；o-(co)-r7；o-(co)-nr11r11’；nr11-(co)-r7；nr11-(co)-or11’；nr11-(co)-nr11r11’；-(o-ch2ch2-)m-or11；-(o-ch2ch2-)m-nr11r11’；so2-r7；nr5-so2-r7；so2-nr11r11’；nr11-(c2-c6)-烷基-nr11r11’；任選被取代的芳基；任選被取代的芐基；任選被取代的包含1、2或3個選自o、n和s的雜原子的5－8元雜芳基環(huán)；任選被取代的如所定義的包含8－13個原子(包括1、2、3、4個選自o、n和s的雜原子且包含至少2個碳原子)的稠合雜芳基；任選被取代的包含1、2或直至3個獨(dú)立地選自o、n和s的雜原子的飽和或不飽和4－9元雜環(huán)基環(huán)；·n可以表示相等的整數(shù)，其可以具有數(shù)值0、1、2、3或4的任意一個；·m可以表示相等的整數(shù)，其可以具有數(shù)值1、2或3的任意一個；·w可以表示相等的整數(shù)，其可以具有數(shù)值0或1的任意一個；其中術(shù)語“任選被取代的”意指任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨(dú)立地選自鹵素原子、被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的直鏈或支鏈(c1-c10)烷基、被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的直鏈或支鏈(c2-c10)烯基、被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的直鏈或支鏈(c2-c10)炔基、被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的(c3-c10)環(huán)烷基、被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的(c5-c10)環(huán)烯基、被一個或多個鹵素原子取代或未被取代的(c8-c10)環(huán)炔基、(c1-c10)烷氧基、羥基、氰基、硝基、nr8r8’(其中r8和r8’如上文所定義)。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自如下的化合物：式(ia)的2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(1-5)式(ib)的2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(2-2)式(ic)的2-[3-甲基-4-(嘧啶-2-基氨基)苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(3-4)式(id)的2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(4-2)或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或前藥。在其它一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(1-6)、2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(2-3)、2-[3-甲基-4-(嘧啶-2-基氨基)苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(3-5)、2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(4-3)的化合物。在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其可以包含治療有效量的上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或前藥，以及藥學(xué)上可接受的助劑、稀釋劑或載體。在一些特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一種或多種抗腫瘤藥。在一些特定實(shí)施方案中，上述藥物組合物可以包含治療有效量的本發(fā)明的化合物，其可以被配制或共同配制在納米粒中。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米?？梢园|(zhì)體(lisosomal)可被生物降解的組合物。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米粒可以包含生物相容聚合物或共聚物。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米?？梢耘c聚乙二醇(peg)共價或非共價結(jié)合。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米?？梢跃哂屑s80－約600納米的平均粒徑。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米?？梢允呛行盘柲ｓw的靶向納米粒。在一些具體實(shí)施方案中，所述納米?？梢园酆衔锟杀簧锝到獾慕M合物。在一些特別具體的實(shí)施方案中，所述聚合物可以基于聚(dl-乳酸-共-乙醇酸)，其可以具有7－240kda的分子量；或聚乳酸(pla)和聚乙醇酸(pga)的共聚物，其中分子比可以在95:5－50:50之間。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米粒可以包含選自plga納米粒、plga-peg納米粒(嵌段類型ab、ba、aba或bab，其中a＝plga和b＝peg)和靶向納米粒的項(xiàng)目。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述納米粒可以包含選自脂質(zhì)體的項(xiàng)目。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以適合于緩慢釋放或持續(xù)釋放。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以適合于經(jīng)口給藥、腸胃外給藥、眼給藥、透皮給藥、鼻給藥或用于吸入。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的活性化合物可以與至少一種治療活性抗癌藥結(jié)合。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的本發(fā)明的化合物與治療有效量的一種或多種抗腫瘤藥的組合，其中構(gòu)成該組合的成分可以同時、單獨(dú)或依次用于癌癥療法中。在本發(fā)明藥物組合物的一些具體實(shí)施方案中，所述抗腫瘤藥可以選自由以下藥物組成的組：依維莫司、氯喹、羥氯喹、曲貝替定、abraxane、tlk286、av-299、dn-101、帕唑帕尼、gsk690693、rta744、on0910.na、azd6244(arry-142886)、amn-107、tki-258、gsk461364、azd1152、恩扎啕林、凡德他尼、arq-197、mk-0457、mln8054、pha-739358、r-763、at-9263、培美曲塞、厄洛替尼、達(dá)沙替尼(dasatanib)、尼洛替尼、decatanib、帕木單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、巴他布林、奧法木單抗、扎木單抗、艾特咔林、粉防己堿(tetrandrme)、蘆比替康、替米利芬、奧利美生、替西木單抗(ticilimumab)、伊匹木單抗、棉酚、bio111、131-i-tm-601、alt-110、bio140、cc8490、西侖吉肽、吉馬替康、il13-pe38qqr、tno1001、ipdrlkrx-0402、硫蒽酮、ly317615、碘[131i]抗肌腱蛋白單抗、維特斯朋(vitespan)、rta744、sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、xr311、羅米地新、ads-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏林司他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、伊立替康、多柔比星脂質(zhì)體、5'-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、zk-304709、塞利西利、pd0325901、azd-6244、卡培他濱、l-谷氨酸、n-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氫-4-氧代-1h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲?；鵠-二鈉鹽七水合物、喜樹堿、peg-標(biāo)記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸托瑞米芬、阿那曲唑(anastrazole)、依西美坦、來曲唑、des(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合雌激素、貝伐珠單抗、imc-1c11、chir-258、3-[5-(甲基磺?；哙ぜ谆?-吲哚基]-喹諾酮、伐拉尼布、ag-013736、ave-0005、[d-ser(but)6,azgly10](pyro-glu-his-trp-ser-tyr-d-ser(but)-leu-arg-pro-azgly-nh2的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、cp-724714；tak-165、hki-272、厄洛替尼、拉帕替尼(lapatanib)、卡紐替尼、abx-egf抗體、愛必妥、ekb-569、pki-166、gw-572016、洛那法尼(lonafamib)、bms-214662、替匹法尼；氨磷汀、nvp-laq824、辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanalidehydroxamicacid)、丙戊酸、制滴菌素a、fk-228、su11248、索拉非尼、krn951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、l-天冬酰胺酶、卡介苗(bcg)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、氯屈膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達(dá)拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛(wèi)、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法侖、6-巰嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉑、帕米膦酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、卟菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈脲霉素、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、噻替派、維甲酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-巰嘌呤、脫氧考福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、托泊替康、雷佐生、馬立馬司他、col-3、新伐司他、bms-275291、角鯊胺、內(nèi)皮抑素、su5416、su6668、emd121974、白細(xì)胞介素-12、1m862、血管抑素、αvβ3人源化抗單抗、屈昔洛芬、艾多昔芬、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素2、吉非替尼、bortezimib、紫杉醇、伊立替康、托泊替康、多柔比星、多西他賽、長春瑞濱、貝伐單抗(單克隆抗體)和愛必妥、無乳浮紫杉醇、epithiloneb、bms-247550、bms-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、era-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、tse-424、hmr-3339、zk186619、ptk787/zk222584、vx-745、pd184352、雷帕霉素、40-o-(2-羥乙基)-雷帕霉素、坦羅莫司、ap-23573、rad001、abt-578、bc-210、ly294002、ly292223、ly292696、ly293684、ly293646、渥曼青霉素、zm336372、l-779,450、peg-非格司亭、達(dá)貝泊汀、紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來膦酸鹽(zolendronate)、潑尼松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、聚乙二醇化干擾素α-2a、干擾素α-2a、聚乙二醇化干擾素α-2b、干擾素α-2b、阿扎胞苷、pegl-天冬酰胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白細(xì)胞介素-11、右丙亞胺、阿侖珠單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白細(xì)胞介素-2、甲地孕酮、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗(ibritgumomabtiuxetan)、雄激素、地西他濱、六甲蜜胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、羥乙膦酸鈉(editronate)、米托坦、環(huán)孢菌素、脂質(zhì)體柔紅霉素、edwina天冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、nk-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、培非司亭、依伯汀α和達(dá)貝泊汀α、伊匹木單抗(ipilumumab)、威羅菲尼(vemurafenib)、flt-3抑制劑、vegfr抑制劑、egfrtk抑制劑、aurora激酶抑制劑、pik-1調(diào)節(jié)劑、bcl-2抑制劑、hdac抑制劑、c-met抑制劑、parp抑制劑、cdk抑制劑、egfrtk抑制劑、igfr-tk抑制劑、抗hgf抗體、pi3激酶抑制劑、mtor抑制劑、akt抑制劑、jak/stat抑制劑、限制點(diǎn)1或限制點(diǎn)2抑制劑、黏著斑激酶抑制劑、map激酶激酶(mek)抑制劑、vegf俘獲抗體以及它們的混合物。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防增殖性疾病和/或腫瘤性疾病的方法，它包括對有此需要的人或動物施用治療有效量的本發(fā)明的化合物或包含它們的藥物組合物的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供用于抑制癌干細(xì)胞(csc)、腫瘤起始細(xì)胞、與癌癥相關(guān)的間充質(zhì)樣細(xì)胞、間充質(zhì)癌細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的生長或分化的方法，它包括對有此需要的人或動物施用治療有效量的本發(fā)明的化合物或包含它們項(xiàng)的藥物組合物的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防增殖性疾病和/或腫瘤性疾病的化合物。在另一方面，本發(fā)明提供用于抑制癌干細(xì)胞(csc)、腫瘤起始細(xì)胞、與癌癥相關(guān)的間充質(zhì)樣細(xì)胞、間充質(zhì)癌細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的生長或分化的化合物。附圖簡述通過下列實(shí)施例并且參考附圖，本發(fā)明的上述和其它特征和優(yōu)勢將更容易地明顯，其中：圖1顯示當(dāng)被用化合物2-3處理時crc患者來源的細(xì)胞(cpp19、cpp30和cpp45)中aldh+群體細(xì)胞的減少(aldefluortm測定法)；圖2顯示化合物2-3對肝轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(crc)患者來源的細(xì)胞的腫瘤球體(tumorosphere)形成的抑制；圖3顯示化合物1-6在dmso-d6中的1hnmr光譜；圖4顯示化合物2-3在dmso-d6中的1hnmr光譜；圖5顯示化合物3-5在dmso-d6中的1hnmr光譜；圖6顯示化合物4-3在dmso-d6中的1hnmr光譜。詳細(xì)描述在本說明書中，術(shù)語“烷基”，單獨(dú)地或與其它基團(tuán)組合，是指1至20個碳原子，優(yōu)選1至16個碳原子，更優(yōu)選1至10個碳原子的支鏈或直鏈一價飽和脂族烴基團(tuán)。術(shù)語“低級烷基”，單獨(dú)或組合，表示1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基(“c1-c6-烷基”)，優(yōu)選1至5個碳原子的直鏈或支鏈烷基(“c1-c5-烷基”)，特別優(yōu)選的是1至3個碳原子的直鏈或支鏈烷基(“c1-c3-烷基”)。直鏈和支鏈低級烷基的實(shí)例是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、異構(gòu)戊基、異構(gòu)己基，優(yōu)選甲基和乙基和丙基和異丙基，最優(yōu)選甲基。術(shù)語“低級烷氧基”是指基團(tuán)r'-o-，其中r'是低級烷基，且術(shù)語“低級烷基”具有上文給出的含義。低級烷氧基的實(shí)例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基，優(yōu)選甲氧基和乙氧基和異丙氧基和叔丁氧基，最優(yōu)選甲氧基和乙氧基。術(shù)語“低級烯基”表示包含烯鍵和2至6個碳原子的直鏈或支鏈烴殘基(“c2-c6-烯基”)，優(yōu)選2至5個碳原子(“c2-c5-烯基”)，特別優(yōu)選2至4個碳原子(“c2-c4-烯基”)。低級烯基的實(shí)例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、異戊烯基。優(yōu)選的實(shí)例是2-丙烯基、2-丁烯基和異戊烯基。術(shù)語“低級炔基”表示包含炔鍵和2至6個碳原子的直鏈或支鏈烴殘基(“c2-c6-炔基”)，優(yōu)選2至5個碳原子(“c2-c5-炔基”)，特別優(yōu)選2至4個碳原子(“c2-c4-炔基”)。炔基的實(shí)例是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、3-丁炔基、4-丁炔基、1-丁-2-炔、1-戊炔基、戊-2-炔-1-基、戊-3-炔-1-基、戊-4-炔-1-基、戊-2-炔-3-基。優(yōu)選的實(shí)例是丙炔-1-基、丙炔-3-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基、丁炔-2-炔-1-基。術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴和碘，優(yōu)選氟、氯和溴。術(shù)語“環(huán)烷基”表示包含3至7個碳原子的飽和碳環(huán)基團(tuán)(“c3-c7-環(huán)烷基”)，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基。優(yōu)選的環(huán)烷基是環(huán)丙基、環(huán)戊基和環(huán)己基。術(shù)語“雜環(huán)基團(tuán)”表示完全飽和或不飽和但不是完全不飽和的例如3至7元單環(huán)基團(tuán)或7至11元稠合雙環(huán)環(huán)系，其具有至少一個選自氧原子、氮原子或硫原子的雜原子。雜環(huán)基團(tuán)的每個環(huán)可以具有至少一個選自氮原子、氧原子和/或硫原子的雜原子。優(yōu)選的雜環(huán)基團(tuán)是吡咯烷、哌啶、哌嗪、四氫呋喃、雙-四氫呋喃和嗎啉。術(shù)語“羧基”意指基團(tuán)-cooh。術(shù)語“雜芳基”通常是指芳族5元或11元環(huán)，其包含至少一個雜原子并且可以另外包含1、2、3或4個選自氮、氧和/或硫的原子，例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、2-氧代-1,2-二氫吡啶基、二唑基、異唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、唑基、異噻唑基和噻唑基。術(shù)語“雜芳基”還指包含兩個5元或6元環(huán)的雙環(huán)芳族或部分不飽和基團(tuán)，其中一個或兩個環(huán)可以包含1、2、3或4個選自氮、氧或硫的原子，例如喹啉基、異喹啉基、噌啉基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、唑基、異噻唑基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、喹喔林基、喹唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、1h-苯并[d]咪唑、苯并[d]異唑基、苯并[d]異噻唑基、苯并[c]異唑基、苯并[c]異噻唑基、吲哚基、異二氫吲哚基、6,7-二氫-5h-吡咯并[3,4-b]吡啶基、2,3-二氫-lh-吡咯并[3,4-c]吡啶基、6,7-二氫-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶基、嘌呤基、吲唑基、吲嗪基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡嗪基、咪唑并[1,2-a]吡嗪基、1h-咪唑并[4,5-b]吡嗪基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吡咯并[l,2-a]嘧啶基、吡咯并[1,2-a]吡嗪基、吡咯并[1,2-c]嘧啶基、唑并[4,5-b]吡啶基、唑并[4,5-c]吡啶基、唑并[5,4-c]吡啶基、唑并[5,4-b]吡啶基、噻唑并[4,5-b]吡啶基、噻唑并[4,5-c]吡啶基、噻唑并[5,4-c]吡啶基、噻唑并[5,4-b]吡啶基、唑并[5,4-d]嘧啶基、唑并[4,5-d]嘧啶基、噻唑并[5,4-d]嘧啶基、噻唑并[4,5-d]嘧啶基、唑并[4,5-b]吡嗪基、噻唑并[4,5-b]吡嗪基、異唑并[4,5-b]吡嗪基、異噻唑并[4,5-b]吡嗪基、異唑并[4,5-d]嘧啶基、異噻唑并[4,5-d]嘧啶基、異唑并[5,4-d]嘧啶基、異噻唑并[5,4-d]嘧啶基、異唑并[5,4-b]吡啶基、異噻唑并[5,4-c]嘧啶基、異唑并[5,4-c]吡啶基、異噻唑并[4,5-c]吡啶基、異唑并[4,5-c]吡啶基、異唑并[4,5-b]吡啶基、異唑并[4,3-d]嘧啶基、異噻唑并[4,3-d]嘧啶基、異唑并[3,4-d]嘧啶基、異噻唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶基、[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶基、3h-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶基。優(yōu)選的雜芳基是吡啶基、噻唑基、異噻唑基、唑基、異唑基、喹唑啉基(quinozolinyl)和吡嗪基。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指保留游離堿或游離酸的生物有效性和特性的那些鹽，它們不是在生物學(xué)或其它方面不合乎需要的。所述鹽是與無機(jī)酸和有機(jī)酸形成的，所述無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，優(yōu)選鹽酸；所述無機(jī)酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、水楊酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、戊二酸、肉桂酸、扁桃酸、蘋果酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、n-乙酰半胱氨酸等。此外，可以通過向游離酸中添加無機(jī)堿或有機(jī)堿制備這些鹽。衍生自無機(jī)堿的鹽包括，但不限于鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂鹽等。衍生自有機(jī)堿的鹽包括，但不限于伯胺、仲胺和叔胺類的鹽、取代的胺類(包括天然存在的取代的胺類)的鹽、環(huán)胺類的鹽和堿性離子交換樹脂的鹽，例如異丙基胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、賴氨酸、精氨酸、n-乙基哌啶、哌啶、聚胺樹脂等。式i的化合物還可以以兩性離子的形式存在。式i的化合物的特別優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的鹽是鹽酸鹽。式i的化合物還可以被溶劑化，例如水化。溶劑化可以在制備過程中進(jìn)行或可以作為式i或ii的最初無水化合物的吸濕特性的結(jié)果發(fā)生(水合)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”還包括生理學(xué)上可接受的溶劑合物?！爱悩?gòu)體”是具有相同分子式但性質(zhì)或它們的原子鍵合順序或它們的原子空間排列不同的化合物。它們的原子空間排列不同的異構(gòu)體稱作“立體異構(gòu)體”。彼此不是鏡像的立體異構(gòu)體稱作“非對映異構(gòu)體”，是不能重疊的鏡像的立體異構(gòu)體稱作“對映體”，或有時稱作光學(xué)異構(gòu)體。如本申請中所使用的，術(shù)語“受試者”或“患者”互換使用。如本申請中所使用的，術(shù)語“受試者”是指動物(例如禽類、爬行動物和哺乳動物)，優(yōu)選哺乳動物，包括非靈長類(例如駱駝、驢、斑馬、牛、豬、馬、山羊、綿羊、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長類(例如猴子、黑猩猩和人類)，最優(yōu)選人類。如本申請中所使用的，術(shù)語“療法”可以指可以用于預(yù)防、治療、管理或改善疾病的任意方案、方法、組合物、制劑和/或物質(zhì)，所述疾病包括病毒感染或細(xì)菌感染或與之相關(guān)的癥狀、癌癥等。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“療法”是指生物療法、支持療法和/或其它療法，它們可用于治療、管理、預(yù)防或改善本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同疾病。術(shù)語化合物的“治療有效量”意指有效預(yù)防、緩解或改善疾病癥狀或延長被治療的受試者的存活的化合物的量。治療有效量的確定在本領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。本發(fā)明化合物的治療有效量或劑量可在寬的界限內(nèi)改變，并且可以按照本領(lǐng)域中已知的方式確定。在每種特定情況中這類劑量可以根據(jù)個體需求進(jìn)行調(diào)整，包括被施用的具體化合物、施用途徑、被治療的病癥以及被治療的患者。通常，在對體重約為70千克的成年人進(jìn)行口服或胃腸外施用的情況中，0.1毫克至5克，優(yōu)選約0.1毫克至1克，更優(yōu)選0.5毫克至500毫克，最優(yōu)選約1毫克至300毫克的日劑量應(yīng)當(dāng)是適合的，不過，如果有需要，則可以超出上限?？梢詫⑷談┝孔鳛閱蝿┝炕蚍謩┝渴┯茫?yàn)榱诉M(jìn)行胃腸外施用，可以將其作為連續(xù)輸注給予。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意欲包括任意和所有與藥物施用相容的物質(zhì)，包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑以及其它與藥物施用相容的物質(zhì)和化合物。任意常用介質(zhì)或物質(zhì)除了與活性化合物不相容的以外，它們在本發(fā)明的組合物中的應(yīng)用被考慮。還可以將補(bǔ)充的活性化合物摻入組合物?？梢酝ㄟ^應(yīng)用本領(lǐng)域中的已知技術(shù)制備這些組合物，所述已知技術(shù)如以下文獻(xiàn)中所述的技術(shù)：ansel’spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(第10版)2014，loydallen編輯，howardc.ansel，wolterskluwerhealth出版和remington:thescienceandpraticeofpharmacy(第22版)2012，loydv.allen編輯，pharmaceuticalpress出版，通過參考將上述文獻(xiàn)各自并入本申請。如本申請中所使用的，術(shù)語“治療”在對受試者施用療法以治療病毒感染的上下文中是指因施用療法或療法的組合導(dǎo)致的如下作用的一、二、三、四、五或更多種：(i)疾病和/或與之相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性減輕或改善；(ii)疾病和/或與之相關(guān)的癥狀的持續(xù)時間縮短；(iii)疾病和/或與之相關(guān)的癥狀消退；(iv)病原體滴度降低；(v)與疾病相關(guān)的器官衰竭減輕；(vi)受試者住院減少；(vii)住院時間減少；(viii)受試者的存活提高；(ix)感染消除；(x)感染和/或與之相關(guān)的癥狀的進(jìn)展的抑制；(xi)病毒從一種細(xì)胞、組織或受試者擴(kuò)散至另一種細(xì)胞、組織或受試者的預(yù)防；和/或(xii)另一種療法的治療作用增強(qiáng)或改善?！扒八帯币庵冈谏锵到y(tǒng)內(nèi)轉(zhuǎn)化成本發(fā)明化合物的化合物。前藥是無活性或活性低于藥物自身的化學(xué)衍生物。在施用和在體內(nèi)擴(kuò)散后，前藥衍生物經(jīng)歷釋放活性藥物的一個或多個代謝過程。前藥轉(zhuǎn)化成藥物通常在酶促過程的控制下(通常通過代謝方式，例如水解、還原或氧化)進(jìn)行，較不常通過其在體內(nèi)擴(kuò)散過程中的傳統(tǒng)化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。載體與藥物之間的鍵可以是，但不限于酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、亞胺、縮醛、醚(例如糖綴合)、可氧化的官能和分子系統(tǒng)、可還原的官能和可還原的分子系統(tǒng)、光敏化官能和光敏化分子系統(tǒng)。例如，包含羥基的化合物的酯前藥可以通過體內(nèi)水解轉(zhuǎn)化成母體分子。本發(fā)明包含羥基的化合物的適合的酯類是，例如乙酸酯類、檸檬酸酯、乳酸酯類、酒石酸酯類、丙二酸酯類、草酸酯類、水楊酸酯類、丙酸酯類、琥珀酸酯類、富馬酸酯類、馬來酸酯類、亞甲基-雙-β-羥基萘甲酸酯類、龍膽酸酯類(gestisates)、羥乙基磺酸酯類、二-對甲苯酰酒石酸酯類、甲磺酸酯類、乙磺酸酯類、苯磺酸酯類、對甲苯磺酸酯類、環(huán)己基氨基磺酸酯類和奎尼酸酯類(quinates)。作為另一個實(shí)例，本發(fā)明包含羧基的化合物的酯前藥可以通過在體內(nèi)水解轉(zhuǎn)化成母體分子(酯前藥的實(shí)例由f.j.leinweber，drugmetab.res.1987，(18)pp379描述，通過參考將其并入本申請)。類似地，本發(fā)明包含氨基的化合物的?；八幙梢酝ㄟ^在體內(nèi)水解轉(zhuǎn)化成母體分子(這些和其它官能團(tuán)(包括胺、醇)的前藥的實(shí)例描述在prodrugs:challengesandrewards(第1和2部分)；edv.stella，r.borchardt等人，springer，2007，以及prodrugsandtargeteddelivery:towardsbetteradmepropertiesed.j.rautio，seiesed.r.mannhold，h.kubinyl，g.folkers.wiley-vch2011中，通過參考將上述文獻(xiàn)各自并入本申請)。通常使用前藥載體系統(tǒng)以便增加水溶性或脂溶性、降低毒性、增加敏感性化合物的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性、增加體內(nèi)的循環(huán)時間(t1/2)、增加總藥物暴露(auc)和器官分布(pk-pd分布)和位置特異性靶向。涉及實(shí)施例1、2、3和4的材料和方法試劑和溶劑從商品供應(yīng)商獲得并且是在沒有進(jìn)一步純化的情況下使用的。將二氯甲烷干燥并且在cacl2上蒸餾，在氬氣氣氛中分子篩上儲存。四氫呋喃在氬氣氣氛中用鈉/二苯酮ketyl進(jìn)行干燥并且在使用前蒸餾。用merck硅膠(40-63μμ或15-40μμ)作為固定相進(jìn)行急驟色譜法純化。在brukeravance300mhz上記錄nmr光譜。分析型超高液相色譜法-質(zhì)量分析(uhplc-ms):uplcwatersacquity，uvdad，與質(zhì)譜儀串聯(lián)四極watersquattropremierxe偶聯(lián)。柱acquityuplcbehc18(2.1x50mm)1.7μm，流動相:ah2o+0.1％tfa，b:mecn+0.1％tfa。洗脫條件包含線性梯度(分鐘/％b):0/5％b，4/98％b，流速0.4ml/min。1.實(shí)施例1：2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(1-6)的制備中間體4-叔丁基氨基哌啶(1-2)的制備：1.1.1-芐基-4-叔丁基氨基哌啶(1-1)的合成在t<15℃向n-芐基-4-哌啶酮(60.0g，314mmol)在500ml無水甲苯和叔丁基胺(135ml，1280mmol)中的溶液中滴加四氯化鈦(23.0ml，210mmol)在250ml無水甲苯中的溶液。將得到的混合物在室溫攪拌20小時期間，然后通過墊過濾。將甲苯溶液轉(zhuǎn)入高壓氫化反應(yīng)器，加入催化劑二氧化鉑(160mg，0.70mmol)。在5巴壓力下將氫氣導(dǎo)入反應(yīng)器，使反應(yīng)在rt進(jìn)行2天。然后用2mnaoh水溶液(400ml)稀釋得到的混合物，通過墊過濾。分離各層，用甲苯萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，減壓濃縮，得到68.05g(收率88％)橙色油狀物，對應(yīng)于1-芐基-4-叔丁基氨基哌啶。質(zhì)量:(es+)c16h26n2理論值246；測定值247[m+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)1.2.4-叔丁基氨基哌啶(1-2)的合成在氫氣化學(xué)反應(yīng)器中，在氮?dú)鈿夥罩邢虻獨(dú)饷摎獾?-芐基-4-叔丁基氨基哌啶(68.05g，276mmol)在700ml甲醇中的溶液中加入披鈀碳粉末10wt％，50％濕(29.40g，13.81mmol，5mol％)。在3巴的壓力下將氫氣導(dǎo)入反應(yīng)器，使反應(yīng)在rt進(jìn)行2天。然后通過墊過濾得到的混合物，減壓濃縮濾液，得到38.86g(收率90％)的黃色固體，對應(yīng)于4-叔丁基氨基哌啶。質(zhì)量:(es+)c9h20n2理論值156；測定值157[m+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)1.3.2,4-二氯喹啉(1-3)的合成在0℃向喹啉-2,4-二醇(50.0g，310mmol)中滴加磷酰氯(250ml，2682mmol)。攪拌得到的混合物，回流加熱過夜。然后冷卻該混合物，減壓濃縮，與500ml甲苯共蒸發(fā)2次。然后用dcm(500ml)溶解殘余物，用冷水洗滌。用dcm萃取水層，合并合并的有機(jī)層，用mgso4干燥，過濾，減壓濃縮，得到棕色固體(57.0g，收率93％)，對應(yīng)于2,4-二氯喹啉。質(zhì)量:(es+)c9h5cl2n理論值197；測定值198[m+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)1.4.2-(4-氯苯基氨基)-4-氯喹啉(1-4)的合成在氮?dú)鈿夥罩?，?,4-二氯喹啉(2.00g，10.1mmol)在無水thf(20ml)中的溶液中加入4-氯苯胺(1.45g，11.1mmol)和k2co3(3.91g，28.3mmol)。用氮?dú)饨o得到的混合物脫氣5分鐘，然后加入xantphos(590mg，1.01mmol)和pd(oac)2(120mg，0.5mmol)，將該反應(yīng)混合物回流加熱2小時。然后將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓濃縮。使殘余物分配在水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮，得到黃色油狀物。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為7/3至0/10的環(huán)己烷/acoet)，得到2.13g(收率73％)的黃色固體，對應(yīng)于2-(4-氯苯基氨基)-4-氯喹啉。質(zhì)量:(es+)c15h10cl2n2理論值288；測定值289[m+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)1.5.2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(1-5)的合成向2-(4-氯苯基氨基)-4-氯喹啉(1.00g，3.46mmol)和4-(叔丁基氨基)-哌啶(684mg，4.38mmol)在5mlnmp中的溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.947ml，5.47mmol)，將該混合物在140℃加熱24小時。然后冷卻該反應(yīng)混合物，用1nnaoh水溶液稀釋，用acoet萃取得到的混合物。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮，得到棕色液體。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為8/2至2/8的環(huán)己烷/acoet)，得到淡黃色固體。使該固體從mecn中重結(jié)晶，得到1.19g(收率84％)的白色固體，對應(yīng)于2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉。hplc-ms:tr＝1.24分鐘，(es+)c24h29cln4理論值408；測定值409[m+h]，353[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)1.6.2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(1-6)的合成向2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(440mg，1.1mmol)在4mletoh中的混懸液中滴加371μl7.25mhcl的etoh溶液。固體溶解，將該混合物在室溫攪拌20分鐘。然后將得到的溶液減壓濃縮至一半體積，加入6ml乙醚。將得到的混合物在室溫攪拌1小時，得到白色固體，將其濾出，用乙醚沖洗，在45℃真空干燥，得到401mg(收率85％)的白色固體，對應(yīng)于2-(4-氯苯基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽。hplc-ms:tr＝1.21分鐘，(es+)c24h29cln4理論值408；測定值409[m+h]353[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，cd3od)13cnmr(75mhz，cd3od)2.實(shí)施例2:2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(2-3)的制備2.1.2-(4-氯芐基氨基)-4-氯喹啉(2-1)的合成在氮?dú)鈿夥罩邢?,4-二氯喹啉(1.00g，5.05mmol)在無水thf(10ml)中的溶液中加入4-氯芐基胺(1.46g，10.1mmol)和t-buona(1.36g，14.1mmol)。用氮?dú)饨o得到的混合物脫氣5分鐘，然后加入xantphos(295mg，0.51mmol)和pd(oac)2(58mg，0.25mmol)，將該反應(yīng)混合物回流加熱2小時。然后將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓濃縮。使殘余物分配在鹽水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮，得到棕色油狀物。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為5/5至0/10的環(huán)己烷/dcm)，得到897mg(收率59％)棕色固體，對應(yīng)于2-(4-氯芐基氨基)-4-氯喹啉。質(zhì)量:(es+)c16h12cl2n2理論值302；測定值303[m+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)2.2.2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(2-2)的合成向2-(4-氯芐基氨基)-4-氯喹啉(1.05g，3.46mmol)和4-(叔丁基氨基)-哌啶(0.684g，4.38mmol)在5mlnmp中的溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.947ml，5.47mmol)，將該混合物在140℃加熱22小時。然后冷卻該反應(yīng)混合物，用1nnaoh水溶液稀釋，用acoet萃取得到的混合物。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮，得到黃色油狀物。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為8/2至0/10的環(huán)己烷/acoet)，得到黃色固體。使該固體從mecn中重結(jié)晶，得到904mg(收率62％)的白色固體，對應(yīng)于2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉。hplc-ms:tr＝1.30分鐘，(es+)c25h31cln4理論值422；測定值423[m+h]，368[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，cdcl3)2.3.2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(2-3)的合成向2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(450mg，1.06mmol)在2.5mletoh中的混懸液中滴加400μl7mhcl的etoh溶液。固體溶解，將該混合物在室溫攪拌3小時。然后將得到的溶液減壓濃縮，添加乙醚。攪拌得到的混合物，在室溫下研磨，得到淡黃色固體，將其濾出，用乙醚沖洗，真空干燥。將淡黃色固體溶于純水，然后冷凍干燥，得到401mg(收率94％)的白色固體，對應(yīng)于2-(4-氯芐基氨基)-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽。hplc-ms:tr＝1.31分鐘，(es+)c25h31cln4理論值422；測定值423[m+h]，369[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，dmso-d6)3.實(shí)施例3:2-[3-甲基-4-(嘧啶-2-基氨基)苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(3-5)的制備3.1.2-甲基-n1-(嘧啶-2-基)-n4-(叔丁基氧基羰基)-苯-1,4-二胺(3-1)的合成用氮?dú)饨o2-甲基-n4-(叔丁基氧基羰基)-苯-1,4-二胺(2.40g，10.8mmol)、2-氯嘧啶(0.78g，6.5mmol)和k2co3(2.24g，16.2mmol)在無水thf(48ml)中的溶液脫氣，歷時15分鐘。然后加入pd(oac)2(58mg，0.26mmol)和binap配體(320mg，0.52mmol)，第二次給該反應(yīng)混合物脫氣，歷時20分鐘。最終將該反應(yīng)混合物回流加熱1小時。然后將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓濃縮。使殘余物分配在水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為10/0至7/3的環(huán)己烷/acoet)，得到650mg(收率33％)的棕色固體，對應(yīng)于2-甲基-n1-(嘧啶-2-基)-n4-(叔丁基氧基羰基)-苯-1,4-二胺。hplc-ms:tr＝2.06分鐘，(es+)c16h20n4o2理論值300；測定值301[m+h]1hnmr(300mhz，cd3od)3.2.2-甲基-n1-(嘧啶-2-基)-苯-1,4-二胺(3-2)的合成在室溫向2-甲基-n1-(嘧啶-2-基)-n4-(叔丁基氧基羰基)-苯-1,4-二胺(1.18g，3.93mmol)中滴加3mhcl的甲醇溶液(15ml)。然后將該反應(yīng)混合物在室溫攪拌，歷時1小時。然后減壓濃縮該反應(yīng)體系，使殘余物分配在dcm與1mnaoh水溶液之間，用dcm萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮，得到787mg(收率98％)的黃色油狀物，對應(yīng)于2-甲基-n1-(嘧啶-2-基)-苯-1,4-二胺。質(zhì)量:(es+)c11h12n4理論值200；測定值201[m+h]1hnmr(300mhz，cd3od)3.3.2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-氯喹啉(3-3)的合成用氮?dú)饨o2-甲基-n1-(嘧啶-2-基)-苯-1,4-二胺(771mg，3.85mmol)、2,4-二氯喹啉(693mg，3.5mmol)和k2co3(1.35g，9.80mmol)在無水thf(7ml)中的溶液脫氣，歷時20分鐘。然后加入pd(oac)2(47mg，0.21mmol)和xantphos配體(61mg，0.10mmol)，第二次給該反應(yīng)混合物脫氣，歷時20分鐘。最終將該反應(yīng)混合物回流加熱4小時。然后將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓濃縮。使殘余物分配在水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為10/0至5/5的環(huán)己烷/acoet)，得到520mg(收率41％)的黃色固體，對應(yīng)于2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-氯喹啉。質(zhì)量:(es+)c20h16cln5理論值361；測定值362[m+h]3.4.2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(3-4)的合成向2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-氯喹啉(350mg，0.97mmol)在nmp(1.5ml)中的溶液中加入4-叔丁基氨基哌啶(760mg，4.80mmol)。將得到的溶液在200℃在實(shí)驗(yàn)室微波爐中加熱30分鐘。然后冷卻得到的混合物，使其分配在水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為10/0至5/5的環(huán)己烷/acoet)，得到75mg(收率16％)的棕色固體，對應(yīng)于2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉。hplc-ms:tr＝1.15分鐘，(es+)c29h35n7理論值481；測定值482[m+h]，426[m-tbu+h]3.5.2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(3-5)的合成將3.0mhcl的etoh溶液(290μl)滴加到2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(75mg，0.16mmol)中。過濾得到的混合物，減壓蒸發(fā)，得到80mg(收率93％)的淡黃色固體，對應(yīng)于2-[4-(2-嘧啶基氨基)-3-甲基-苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽。hplc-ms:tr＝1.15分鐘，(es+)c29h35n7理論值481；測定值482[m+h]，426[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，cd3od+幾滴dmso-d6)4.實(shí)施例4:2-[3-甲基-4-(嘧啶-2-基氨基)苯基氨基]-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(4-3)的制備4.1.2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-氯喹啉(4-1)的合成向2-甲基-n1-[4-(吡啶-3-基)-嘧啶-2-基]苯-1,4-二胺(1.18g，4.26mmol)、2,4-二氯喹啉(767mg，3.87mmol)在無水thf(11.9ml)中的溶液中加入k2co3(2.7g，19.0mmol)，用氮?dú)饨o該反應(yīng)混合物脫氣，歷時15分鐘。然后加入xantphos配體(226mg，0.387mmol)和pd(oac)2(44mg，0.19mmol)，第二次給該反應(yīng)混合物脫氣，歷時15分鐘。最終將該反應(yīng)混合物回流加熱過夜。然后將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓濃縮。使殘余物分配在水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(梯度為10/0至0/10的環(huán)己烷/acoet)，得到1.08g(收率64％)的棕色固體，對應(yīng)于2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-氯喹啉。質(zhì)量:(es+)c25h19cln6理論值438；測定值439[m+h]1hnmr(300mhz，cd3od)4.2.2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉(4-2)的合成向2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-氯喹啉(1.0g，2.28mmol)在nmp(10ml)中的溶液中加入4-叔丁基氨基哌啶(1.8g，11.0mmol)。將得到的溶液在200℃在實(shí)驗(yàn)室微波爐中加熱90分鐘。將得到的混合物分配在水與acoet之間，用acoet萃取水層。用na2so4干燥合并的有機(jī)層，過濾，減壓濃縮。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物(acoet/dcm3/2，然后dcm/meoh9/1)，得到1.01g黃色固體，使其從etoh中重結(jié)晶，得到550mg(收率43％)的白色固體，對應(yīng)于2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉。hplc-ms:tr＝1.20分鐘，(es+)c34h38n8理論值558；測定值559[m+h]，503[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，dmso-d6)4.3.2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽(4-3)的合成向2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉在etoh(5.5ml)中的混懸液中滴加3.0mhcl的etoh溶液(4ml)。過濾出形成的黃色固體，然后與環(huán)己烷一起研磨。過濾出混懸液，得到505mg(收率77％)的白色固體，對應(yīng)于2-{4-[4-(吡啶-3-基)-2-嘧啶氨基]-3-甲基-苯基氨基}-4-(4-叔丁基氨基哌啶-1-基)-喹啉鹽酸鹽。hplc-ms:tr＝1.22分鐘，(es+)c34h38n8理論值558；測定值559[m+h]，503[m-tbu+h]1hnmr(300mhz，cd3od+幾滴dmso-d6)13cnmr(125mhz，cd3od)5.實(shí)施例5：化合物1-6、2-3、3-5和4-3在molm-14、kg-1、mv4-11、a375、hct-116、hepg2、huh-7、mrc-5、mda-mb-231、arpe-19細(xì)胞系和pbmc細(xì)胞中的活性譜細(xì)胞培養(yǎng)：將所有細(xì)胞系維持在包含1％青霉素-鏈霉素(dutscher，p06-07100)和10％胎牛血清(gibco，w3387l)(但是20％用于kg-1細(xì)胞系和pbmc)的培養(yǎng)基中，并在37℃與5％co2下培養(yǎng)。將hepg2、huh7、hct-116、mda-mb-231和a375細(xì)胞系在dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dutscher，l0103)中培養(yǎng)。將kg-1和mv4-11細(xì)胞系維持在iscove改良的dulbecco培養(yǎng)基中(dutscher，l0190)中。將molm-14細(xì)胞系維持在memα培養(yǎng)基(gibco，22561-021)中。將pbmc維持在rpmi1640培養(yǎng)基(dutscher，l0498)中。將mrc-5細(xì)胞系維持在mem(dutscher，l0416)中。將arpe-19細(xì)胞系維持在dmem：f12培養(yǎng)基(dutscher，l0093)中培養(yǎng)。細(xì)胞生存力測定：使用infinitef200pro發(fā)光計(tecan)，使用發(fā)光細(xì)胞生存力測定法，按照制造商(promega，refg7571)所述，測定細(xì)胞生存力。簡言之，對于貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞在96孔板(白色，底部透明)中鋪板，每孔90μl的培養(yǎng)基中，并在測定前使其生長過夜。對于在懸浮液中生長的細(xì)胞，在測定前立即將細(xì)胞在96孔板上鋪板。每孔接種的細(xì)胞數(shù)量如下表1中所示：表1：用于細(xì)胞生存力測定的每孔接種的細(xì)胞數(shù)量項(xiàng)目細(xì)胞系每孔細(xì)胞數(shù)量1hct-1162,0002a3758003huh710,0004hepg27,5005molm-1410,0006kg-120,0007mv4-1120,0008pbmc10,0009mrc-55,00010arpe-195,00011mda-mb-23110,000將化合物以不同濃度加到每個孔中，并將細(xì)胞培養(yǎng)物溫育72小時。使用介質(zhì)(h2o)作為對照，并且以恒定百分比的h2o測試所有化合物。加入100μl后，使用infinitef200pro(tecan)測量發(fā)光。ec50值被確定為將發(fā)光值降低至對于未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物所獲得的信號的50％所需的化合物的劑量。使用計算機(jī)程序graphpadprismv5(graphpadsoftware，inc.lajolla，ca)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)至少按照一式兩份進(jìn)行并且獨(dú)立地重復(fù)兩次。表2：在化合物1-6、2-3、3-5、4-3的存在下molm-14細(xì)胞系的生長抑制測定表3：在化合物2-3的存在下molm-14、kg-1、mv4-11細(xì)胞系和pbmc的生長抑制測定表4：在化合物2-3的存在下a375、hct-116、hepg2和huh-7細(xì)胞系的生長抑制測定細(xì)胞系a375hct-116hepg2huh-7描述惡性黑素瘤結(jié)腸直腸癌肝細(xì)胞癌肝細(xì)胞癌ec50(μm)1.01.60.91.7表5：在化合物2-3的存在下mrc-5、mda-mb-231和arpe-19細(xì)胞系的生長抑制測定細(xì)胞系mrc-5mda-mb-231arpe-19描述人胎兒肺成纖維細(xì)胞乳腺腺癌人視網(wǎng)膜色素化上皮ec50(μm)≈3.42.0≈6.9表6：在化合物4-3的存在下molm-14、a375、hct-116和hepg2細(xì)胞系的生長抑制測定細(xì)胞系molm-14a375hct-116hepg2描述急性髓性白血病惡性黑素瘤結(jié)腸直腸癌肝細(xì)胞癌ec50(μm)2.31.41.86.36.實(shí)施例6：molm-14細(xì)胞系中的aldh+房室分析在補(bǔ)充有10％v/v胎兒牛血清、1％青霉素-鏈霉素的memα培養(yǎng)基中培養(yǎng)molm-14細(xì)胞系，并維持在37℃與5％co2下。在測定之前，即刻將10,000個細(xì)胞在96孔板上鋪板。將每個化合物以不同濃度(6個濃度的組合)加入每個孔中，并將細(xì)胞培養(yǎng)物溫育72小時。將介質(zhì)(h2o)用作對照，所有化合物以恒定百分比的介質(zhì)進(jìn)行測試。使用centro(berthold，法國)平板讀數(shù)器，應(yīng)用發(fā)光細(xì)胞生存力測定法，按照制造商(promega，refg7571madison，wi，usa)所述，測定細(xì)胞生長暈。在每個實(shí)驗(yàn)中，每個點(diǎn)代表細(xì)胞培養(yǎng)物中一式三份的平均值。使用計算機(jī)程序graphpadprismv5(graphpadsoftware，inc.lajolla，ca)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且將ec50值確定為將吸光度值降低至對于介質(zhì)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物所獲得的信號的50％所需的化合物的劑量。醛脫氫酶(aldh)隔室和醛脫氫酶活性的高活性水平(aldh+)的分析用于檢測腫瘤起始細(xì)胞(癌干細(xì)胞，csc)群體。如在molm-14急性髓性白血病細(xì)胞系群體中那樣，aldefluortm試劑盒測定法(stemcelltechnologies，01700)允許評價藥物對csc細(xì)胞的活性(參考文獻(xiàn)：storms，r.w.，trujillo，a.p.，springer，j.b.，shah，l.，colvin，o.m.，ludeman，s.m.，&smith，c.(1999).isolationofprimitivehumanhematopoieticprogenitorsonthebaseofaldehydedehydeogenaseactivity.proceedingsofthenationalacademyofsciences，96(16)，9118-9123)。根據(jù)制造商描述的方法，使用aldefluortm試劑盒測定法。簡言之，將molm-14細(xì)胞系在補(bǔ)充有10％v/v胎牛血清、1％青霉素-鏈霉素的memα培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并維持在37℃與5％co2下。在該測定中使用5.105個細(xì)胞。每種化合物以不同的濃度加入(見表8)，并將細(xì)胞培養(yǎng)物溫育72小時。將介質(zhì)(h2o)用作對照，所有化合物以恒定百分比的介質(zhì)進(jìn)行測試。將從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞在包含bodipytm-氨基乙醛(熒光aldh醛底物)的aldefluortm緩沖液測定法中在37℃下溫育45分鐘。aldh將熒光底物baaa轉(zhuǎn)化成保留在細(xì)胞中的bodipytm-氨基乙酸(baa)。在aldefluortm測定緩沖液中存在主動外流抑制劑，以避免來自底物產(chǎn)物aldh依賴性轉(zhuǎn)化的baa從細(xì)胞中主動流出。熒光信號與細(xì)胞中的aldh活性成正比，并通過流式細(xì)胞術(shù)測量。陰性對照用于測量背景熒光水平。為此目的，使用4-(n,n-二乙基氨基)-苯甲醛(deab)作為選擇性aldh抑制劑。使用可固定遠(yuǎn)紅死細(xì)胞染色試劑盒(invitrogen)進(jìn)行生存力細(xì)胞計數(shù)。使用計算機(jī)程序graphpadprismv5(graphpadsoftware，inc.lajolla，ca)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且將ec50值確定為將吸光度值降低至對于介質(zhì)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物所獲得的信號的50％所需的化合物的劑量。表7：在阿糖胞苷和化合物2-3的存在下molm-14細(xì)胞系的生長抑制測定化合物阿糖胞苷2-3aec50(μm)0.2902.2a：ec50得自實(shí)施例5中所述的方法，參見表3表8：使用aldefluortm試劑盒測定法化合物2-3導(dǎo)致的molm-14細(xì)胞系中aldh群體減少7.實(shí)施例7：在化合物2-3的存在下hep3b-luc細(xì)胞系的生長抑制測定法(ec50，μm)在化合物處理之前，將化合物溶于h2o中以制成10mm儲備溶液。然后用包含10％胎牛血清(gibco，10099141)的mem培養(yǎng)基(gibco，1128319)制備工作溶液(5倍最終濃度)。當(dāng)進(jìn)行測定法時，多柔比星對bel-7402細(xì)胞系(人原發(fā)性肝細(xì)胞癌)的劑量反應(yīng)試驗(yàn)將用作每個測定板中的內(nèi)部對照用于測定法。補(bǔ)充有5％h2o(5x)的mem培養(yǎng)基將作為陰性對照添加到細(xì)胞中。每個孔中最終的h2o濃度為1％。將hep3b-luc細(xì)胞系(用于原位腫瘤模型的螢光素酶轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系)在補(bǔ)充有10％v/v胎牛血清(fbs)、1％青霉素-鏈霉素的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并維持在37℃與5％co2下。將800個細(xì)胞在384孔平底透明白色板(corning，3707)上鋪板。測定方法：收集對數(shù)期中的細(xì)胞并計數(shù)。將細(xì)胞懸浮液以800個細(xì)胞/孔(總體積40μl)加入到384孔板的每個孔中。邊緣孔填充pbs緩沖液。加入不同濃度的測試化合物，一式兩份(向板中加入10μl5x化合物溶液)。將測定板在37℃/5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。使用發(fā)光細(xì)胞生存力測定法，按照制造商(promega，refg7571)所述，測量細(xì)胞生存力。在加入100μl的反應(yīng)(reactifs)溶液后，使用pherastarplus發(fā)光計測量發(fā)光。數(shù)據(jù)由pherastarplus記錄，使用microsoftexcel程序和graphpadprismv.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。表9：在化合物2-3的存在下hep3b-luc細(xì)胞系的生長抑制測定化合物多柔比星2-3細(xì)胞系bel-7402hep3b-lucec50(μm)0.151.18.實(shí)施例8：在化合物2-3的存在下caki-1和786-o細(xì)胞系的生長抑制測定(ec50，μm)細(xì)胞培養(yǎng)：將caki-1和786-o細(xì)胞系維持在包含1％青霉素-鏈霉素(dutscher，p06-07100)和10％胎牛血清(gibco，w3387l)的rpmi1640培養(yǎng)基(dutscher，l0498)中，并在37℃與5％co2培養(yǎng)。細(xì)胞生存力測定：使用infinitef200pro發(fā)光計(tecan)，使用發(fā)光細(xì)胞生存力測定法，按照制造商(promega，refg7571)所述，測定細(xì)胞生存力。簡言之，將細(xì)胞在96孔板(白色，底部透明)中鋪板，每孔90μl的培養(yǎng)基，并在測定前使其生長過夜。每孔接種的細(xì)胞數(shù)量如下表中所示：表10：用于caki-1和786-o細(xì)胞生存力測定的每孔接種的細(xì)胞數(shù)量每孔細(xì)胞數(shù)量caki-12250786-o1250將化合物2-3和兩種參考化合物(索拉非尼和舒尼替尼)以不同濃度加到每個孔中，并將細(xì)胞培養(yǎng)物溫育72小時。對于化合物2-3分析，使用h2o作為陰性對照(＝未處理)，并以恒定百分比的h2o測試所有濃度。對于索拉非尼和舒尼替尼分析，使用dmso作為陰性對照(＝未處理)，并以恒定百分比的dmso測試所有濃度。溫育化合物后72小時，向每個孔中加入100μl的并使用infinitef200pro(tecan)測量發(fā)光。ec50值被確定為將發(fā)光值降低至對于未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物所獲得的信號的50％所需的化合物的劑量。使用計算機(jī)程序graphpadprismv5(graphpadsoftware，inc.lajolla，ca)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)至少一式三份進(jìn)行，并且重復(fù)至少獨(dú)立的三次。表11：在化合物2-3和作為對照的索拉非尼、舒尼替尼的存在下caki-1細(xì)胞系的生長抑制測定化合物ec50(μm)sd2-31.40.1索拉非尼4.51.5舒尼替尼1.70.7表12：在化合物2-3和作為對照的索拉非尼、舒尼替尼的存在下786-o細(xì)胞系的生長抑制測定化合物ec50(μm)sd2-32.10.2索拉非尼6.81.7舒尼替尼6.01.19.實(shí)施例9：化合物2-3對肝轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞和結(jié)腸癌干細(xì)胞亞群的體外作用本研究的目的在于評價化合物2-3對從患者中新鮮分離的肝轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者來源的細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性，更具體地對cscs亞群的體外細(xì)胞毒活性。目前很少方法可用于體外追蹤cscs。例如，醛脫氫酶(aldh)活性可用作鑒定結(jié)腸癌中的癌性人干細(xì)胞的標(biāo)志物。此外，通過在補(bǔ)充有生長因子的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可以富集csc。在這類條件下，僅cscs生長為被稱作“腫瘤球體”的多細(xì)胞三維克隆。通過利用腫瘤球體形成能力，然后我們可以估計樣品中cscs的量，因此評價給定分子對cscs自我更新能力的影響?；颊邅碓吹哪[瘤細(xì)胞培養(yǎng)將患者來源的肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞(cpp19、30、36和cpp45-臨床描述參見表1)維持在具有10％fbs的完全dmem(gibco)中。在批準(zhǔn)方案內(nèi)，從chu-carémeau(法國)提供的活組織檢材中獲得細(xì)胞。根據(jù)所有倫理道德和法律方面，在采樣前從患者獲得簽名的知情同意書。將腫瘤清洗，切碎成碎片(<2mm3)，并用重懸于accumax(sigma-aldrich)中的釋放酶(liberase)h(0.26u/ml，roche)消化。在37℃下2小時后，將細(xì)胞懸浮液通過40μm篩目過濾，得到單細(xì)胞懸浮液并在補(bǔ)充有fbs、谷氨酰胺、抗生素和非必需氨基酸的dmem培養(yǎng)基中鋪板。當(dāng)形成患者來源的腫瘤細(xì)胞的單層時，使用胰蛋白酶/edta將細(xì)胞分離并重新懸浮于含有10％fbs的dmem(用于貼壁細(xì)胞)或定義的m11培養(yǎng)基(用于球體形成)中。將細(xì)胞在37℃和5％co2的加濕氣氛中培養(yǎng)。體外毒性測定將細(xì)胞以每孔104個細(xì)胞接種在具有10％fbs的dmem中的p96孔板中。24小時后，用化合物2-3處理細(xì)胞，處理后72小時通過發(fā)光細(xì)胞生存力測定法(promega)評價細(xì)胞生存力。使用graphpadprismsoftwarev6(graphpadsoftware，inclajolla，ca)計算ec50。aldefluortm測定法和熒光激活的細(xì)胞分選(facs)根據(jù)制造商的說明(stemcelltechnologies)進(jìn)行aldefluortm測定法(stemcelltechnologies，01700)。通過比較含有和不含aldh抑制劑二乙基氨基苯甲醛(deab)的相同樣品來鑒定aldh陽性細(xì)胞。在deab存在下，將aldh活性的facs閘門設(shè)置為0.1％。使用macsquant分析細(xì)胞并且使用cyflogic軟件分析數(shù)據(jù)。cpp36細(xì)胞由于它們的高細(xì)胞自體熒光特征而未被用于這些分析中。球體形成測定法在超低附著平板(corning)中，在p96孔中的m11培養(yǎng)基中，在500個細(xì)胞/200μl孔鋪板后，確定細(xì)胞形成球體的評價。m11是dmem/f12(1:1)培養(yǎng)基(gibco)，其中補(bǔ)充有n2、谷氨酰胺3mm、葡萄糖0.6％、胰島素4μg/ml(sigma-aldrich)、hbasic-fgf10ng/ml(r&dsystems)和hegf20ng/ml(r&dsystems)。在10天后計數(shù)尺寸超過50μm的球體，并以每個圖像視野中的球體數(shù)量表示。cpp45細(xì)胞未用于這些分析中，因?yàn)樗鼈儾荒苄纬赡[瘤球體。統(tǒng)計分析對于每個實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)顯示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值s.e.m。graphpadprismsoftwarev6(graphpadsoftware，inclajolla，ca)用于數(shù)據(jù)分析，即斯氏(student)t檢驗(yàn)。表13：結(jié)腸癌患者的臨床特征·化合物2-3對肝轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(crc)患者來源的細(xì)胞的細(xì)胞毒性的體外評價使用發(fā)光細(xì)胞生存力測定法，如制造商(promega，refg7571)所述，測定化合物2-3在肝臟轉(zhuǎn)移crc患者來源的細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。將來自未處理的對照細(xì)胞的細(xì)胞生存力設(shè)定為100％。首先在p96平板中以10.000個細(xì)胞/100μl/孔的密度接種細(xì)胞，并在37℃的5％co2的加濕氣氛中溫育24小時。然后將細(xì)胞與溶劑(0.1％dmso，未處理的對照細(xì)胞)或增加濃度的化合物2-3一起溫育。在0.1至30μm的濃度下溫育72小時后，化合物2-3對建立自新鮮肝轉(zhuǎn)移活組織檢材的4種不同crc患者來源的細(xì)胞表現(xiàn)出劑量響應(yīng)細(xì)胞毒活性(表14)。表14：在化合物2-3的存在下對肝轉(zhuǎn)移crc患者來源的細(xì)胞的生長抑制測定crcidcpp19cpp30cpp36cpp45ec50(μm)1.881.221.451.12·化合物2-3對來自肝轉(zhuǎn)移crc患者來源的細(xì)胞的aldefluortm陽性細(xì)胞的體外評價首先將細(xì)胞在p96平板中以250.000個細(xì)胞/1000μl/孔的密度鋪板，并在37℃與5％co2的加濕氣氛中溫育24小時。然后將細(xì)胞與溶劑(0.1％dmso)或增加濃度的化合物2-3一起溫育72小時。將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，收集和洗滌。使用macsquant流式細(xì)胞儀(miltenyibiotec)，基于低光散射和sytoxblue死細(xì)胞染色陽性(lifetechnologies)排除無細(xì)胞顆粒和死細(xì)胞。然后使用aldefluortm測定法(stemcelltechnologies，01700)對aldh光亮細(xì)胞的百分比進(jìn)行定量。加入aldh抑制劑二乙基氨基苯甲醛(deab)，以確保aldh陽性細(xì)胞的準(zhǔn)確鑒定。當(dāng)應(yīng)用aldh抑制劑deab時，熒光減少(向左移動)，并繪制一個閘門以描繪這些細(xì)胞的上限。該閘門用于選擇aldh高染色亞群。如所示，在1至3μm的濃度下溫育72小時后，在建立自新鮮肝轉(zhuǎn)移活組織檢材的3種不同的crc患者來源的細(xì)胞中化合物2-3證實(shí)對aldefluortm陽性細(xì)胞亞群具有顯著(p<0.001)和劑量響應(yīng)細(xì)胞毒活性(圖1)?！せ衔?-3阻斷肝轉(zhuǎn)移crc患者來源的細(xì)胞的腫瘤球體形成。體外腫瘤球體形成被廣泛用于鑒定實(shí)體瘤或異種細(xì)胞群體中癌干細(xì)胞(cscs)的存在，因?yàn)橹挥羞@些細(xì)胞具有自我更新的能力。我們使用該測定法作為csc頻率和生存力的功能量度，并且檢查了用化合物2-3處理后肝轉(zhuǎn)移患者來源的細(xì)胞形成腫瘤球體的能力。為此目的，首先使細(xì)胞作為單層生長在具有胎牛血清(fbs)的dmem完全培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中，直到它們達(dá)到接近匯合。將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，收集，洗滌以除去fbs并通過40μm網(wǎng)目細(xì)胞過濾器。然后將單細(xì)胞懸浮液與補(bǔ)充有20ng/mlegf、20ng/mlbfgf和n2補(bǔ)充劑的由dmem-f12組成的csc培養(yǎng)基(即，m11培養(yǎng)基)(invitrogen，carlsbad，ca，usa)一起在p96孔超低附著板(corninglifesciences，tewksbury，ma)中培養(yǎng)。將細(xì)胞以500個細(xì)胞/100μl/孔的密度鋪板，并在37℃的5％co2的加濕氣氛中溫育。為了確定化合物2-3對腫瘤球體形成效率和球體尺寸的影響，在以200μl最終體積的m11中鋪板后24小時，以兩種濃度(0.3μm或3μm)加入化合物2-3。10天后，用倒置顯微鏡檢查平板的腫瘤球體形成(>50μm)。取得相對比圖片，并且手動測量球體尺寸和數(shù)量，且使用imagej從圖像中計數(shù)。如圖2中所示，化合物2-3誘導(dǎo)了從肝轉(zhuǎn)移瘤中分離的3種測試的crc患者來源的細(xì)胞(cpp19、cpp30和cpp36)中腫瘤球體形成的顯著和劑量依賴性降低。實(shí)際上，3μm的化合物2-3顯著抑制了腫瘤球體形成效率。與此形成對比的是，除了在3μm對cpp19細(xì)胞(p＝0.02)以外，所述處理沒有統(tǒng)計學(xué)上減小腫瘤球體的尺寸。實(shí)施例10：在化合物2-3的存在下肝細(xì)胞癌(hcc)患者來源的細(xì)胞的生長抑制測定(ec50，μm)在crownbio機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)下，在嚴(yán)格遵照關(guān)于涉及人類受試者的醫(yī)學(xué)研究的赫爾辛基宣言下，在書面知情同意后，獲得了患者來源的肝細(xì)胞癌(hcc)細(xì)胞。將患者來源的肝細(xì)胞癌(hcc)細(xì)胞維持在包含1％青霉素-鏈霉素(lifetechnologies，15070-063)的表15中分別描述的培養(yǎng)基中，其中含有用于原代細(xì)胞培養(yǎng)(pcs)的補(bǔ)充劑，該補(bǔ)充劑包含氫化可的松(50nm)、表皮生長因子(20ng/ml)、β-成纖維細(xì)胞生長因子(10ng/ml)、肝素(2μg/ml)its液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(1x)和非必需氨基酸(neaa，0.01mm，1x)。將初級細(xì)胞在37℃與含有5％co2的加濕氣氛(95％相對濕度)中培養(yǎng)。表15：用于患者來源的肝細(xì)胞癌(hcc)細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件項(xiàng)目初級細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)條件1li0050dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度2li0574dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度3li0612dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度4li0752dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度5li0801dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度6li1005dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度7li1098dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度8li1646dmem/f12+10％fbs+pcs37℃，5％co2，95％相對濕度使用發(fā)光細(xì)胞生存力測定法，按照制造商(promega，refg7571)所述，如上述實(shí)施例5中所述，進(jìn)行細(xì)胞生長抑制測定。表16中描述了每孔接種的細(xì)胞數(shù)(在96孔平底透明黑色聚苯乙烯tc處理的微量培養(yǎng)板中，cat#3340，)。在記錄發(fā)光之前，將背面密封的黑色貼紙(cat#6005189，perkinelmer)放置到每個板的底部。表16：用于hcc患者來源的細(xì)胞生存力測定的每孔接種的細(xì)胞數(shù)量項(xiàng)目hcc患者來源的細(xì)胞每孔細(xì)胞數(shù)量1li00502,5002li05743,0003li06124,0004li07523,5005li08012,5006li10052,5007li109820008li16462000使用計算機(jī)程序graphpadprismv5.0(graphpadsoftware，inc.lajolla，ca)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，ec50值被確定為將吸光度值降低至介質(zhì)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的信號的50％所需的化合物的劑量，并且是至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。培養(yǎng)72小時后，化合物2-3對八種不同hcc患者來源的細(xì)胞顯示了劑量-響應(yīng)細(xì)胞毒活性(參見表17)。表17：在化合物2-3、索拉非尼和順鉑的存在下肝細(xì)胞癌(hcc)患者來源的細(xì)胞的生長抑制測定當(dāng)前第1頁12