專利名稱：血卟啉單甲醚在治療眼科疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地涉及利用血卟啉單甲醚，通過對(duì)眼施加光動(dòng)力治療(PDT)而治療眼科疾病的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
視力喪失是與衰老和各種眼病相伴隨的常見問題。衰老和其他病因往往引起角膜、虹膜、視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜上有害的新血管形成的發(fā)生，造成視力下降乃至視力喪失。在很多已知的眼病，包括黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視和炎癥性疾病中，脈絡(luò)膜新血管形成導(dǎo)致出血和纖維化，最終伴有視力喪失。
與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)是老年人視力下降的主要原因，其中10％的AMD病人伴隨脈絡(luò)膜新血管形成，導(dǎo)致急劇的視力喪失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AMD造成老年人新失明中的80％是由脈絡(luò)膜新血管形成引起的。
目前對(duì)AMD引起的脈絡(luò)膜新血管形成，主要采用激光光凝(固)法治療，該方法可以封閉新生血管，延緩視力喪失。但激光光凝的同時(shí)也破壞了新生血管周圍的正常脈絡(luò)膜組織以及內(nèi)層的視網(wǎng)膜組織，導(dǎo)致視力下降，患者往往留有萎縮性性瘢痕和視覺盲點(diǎn)。激光光凝法的另一個(gè)問題是大部分病人因?yàn)樾律軓浬?、邊界不清而不適合用激光光凝法治療，或療效不佳，復(fù)發(fā)率高。
光動(dòng)力療法是給患者施以光活性化合物，光敏劑在新生血管部位富集，再以低強(qiáng)度激光照射，激發(fā)光敏劑使之產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，選擇性的封閉新生血管。這一方法選擇性更強(qiáng)，激光強(qiáng)度低，對(duì)周圍正常組織損傷小，有望成為治療AMD的有效手段。
用于光動(dòng)力治療的光敏劑有血卟啉衍生物(HPD)、苯并卟啉衍生物(BPD)、二氫卟吩e6單天冬氨酸酰胺(Npe6)、磺酸鋁酞菁(CASPc)、中介四(間羥基苯基)-二氫卟吩(mTIIPC)、錫乙基初紫紅素(SnEt2)、5-氨基乙酰丙酸(ALA)等，用于腫瘤、皮膚病的光動(dòng)力治療。然而，這些用于腫瘤、皮膚病的光動(dòng)力治療的光敏劑并不十分適合用于治療眼科疾病。
美國(guó)專利5798349以及相應(yīng)的中國(guó)專利97192957公開了綠卟啉(greenporphyrins)在光動(dòng)力治療AMD及其他脈絡(luò)膜新血管形成上的應(yīng)用。然而其治療效果仍然不令人滿意。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的治療劑和治療方法，以便有效治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種眼科疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的治療劑和治療方法，它們可有效治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種眼科疾病。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種血卟啉單甲醚的用途，它被用于制備治療眼科疾病的藥物。
在另一優(yōu)選例中，所述眼科疾病是因有害的新生血管形成而導(dǎo)致的疾病。
在另一優(yōu)選例中，所述的新生血管形成發(fā)生在角膜、虹膜、視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜。更佳地，所述的新生血管形成發(fā)生在脈絡(luò)膜上。
在另一優(yōu)選例中，所述的眼科疾病選自下組黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視、或炎癥性疾病。
在另一優(yōu)選例中，所述的血卟啉單甲醚為如下結(jié)構(gòu)式的化合物 式中，R1為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基；R2為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥劑量為0.1-100mg/kg體重，按血卟啉單甲醚計(jì)算。
在另一優(yōu)選例中，所述的治療是光動(dòng)力治療。
在另一優(yōu)選例中，所述光動(dòng)力治療條件是照射的光通量為50-200焦耳/cm2，光照度為50-800mW/cm2，波長(zhǎng)為630±20nm。
在本發(fā)明的第二方面，提供了血卟啉單甲醚的用途，它被用作光動(dòng)力治療眼科疾病的光敏劑。


圖1顯示了血卟啉單甲醚的結(jié)構(gòu)式。
圖2A和2B顯示了血卟啉單甲醚在雞胚尿囊絨膜(CAM)模型上的效果。
圖3顯示了雞胚尿囊絨膜(CAM)模型實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組一級(jí)血管、二級(jí)血管計(jì)數(shù)。
圖4顯示了脈絡(luò)膜新生血管(CNV)模型熒光造影。
圖5顯示了脈絡(luò)膜新生血管(CNV)模型組織切片。
圖6A和6B顯示了血卟啉單甲醚在脈絡(luò)膜新生血管(CNV)模型上的效果。其中圖6A為對(duì)照組組織切片，箭頭所指為脈絡(luò)膜新生血管。圖6B為實(shí)驗(yàn)組組織切片，箭頭所指為脈絡(luò)膜新生血管，血管內(nèi)部已形成血栓。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，篩選了大量化合物，發(fā)現(xiàn)化合物血卟啉單甲醚特別適合用于治療眼科疾病。血卟啉單甲醚的最佳吸收波長(zhǎng)630nm，清除時(shí)間短，光敏感性24小時(shí)可以消退，因此適合作為光動(dòng)力療法治療眼科疾病的光敏劑。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
光活性化合物適合于本發(fā)明的化合物是血卟啉單甲醚。許德余、陳文輝等在《中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志》(1993，23-7)和申請(qǐng)?zhí)枮?1131939的中國(guó)專利中公開了血卟啉單甲醚的理化性質(zhì)、制備方法及其在治療腫瘤中的應(yīng)用；陳文輝、許德余等在《第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》(1990，11118-122)發(fā)表了血卟啉單甲醚在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布顧瑛、劉光凡等在《中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志》(2000，Vol9，1期)發(fā)表了血卟啉單甲醚在在動(dòng)脈組織的吸收和分布特性、血管平滑肌對(duì)血啉甲醚的吸收特性，在《中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志》(2000，Vol9，3期)發(fā)表了血卟啉單甲醚治療鮮紅斑痣的應(yīng)用。在此全部公開作為參考。
具體地，適合于本發(fā)明的光活性化合物具有如下結(jié)構(gòu)式 其中R1為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基；R2為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基。較佳地，當(dāng)R1為1-羥基-乙基時(shí)，R2為1-甲氧基-乙基，；當(dāng)R1為1-甲氧基-乙基時(shí)，R2為1-羥基-乙基。
血卟啉單甲醚也可與其他的光活性化合物聯(lián)合使用；但治療的有效性依賴于光被光活性化合物吸收，因此，如果使用混合物，則以具有相似的最大吸收峰的化合物混合使用為佳。
治療機(jī)理本發(fā)明涉及用光動(dòng)力治療眼科疾病。光動(dòng)力學(xué)治療方案導(dǎo)致有害的新血管形成(特別是脈絡(luò)膜的新血管形成)縮減，從而對(duì)相關(guān)的眼科疾病起到治療作用，改善患者視力。
在本發(fā)明的方法中，給需要治療的患者服用適合的光活性化合物，其量足以使患者眼內(nèi)的光活性化合物達(dá)到有效濃度。服用后經(jīng)過一段時(shí)間，使有效濃度的化合物聚集在眼內(nèi)所需區(qū)域后，用被該光活性化合物吸收的光照射該區(qū)域。光活性化合物被光激發(fā)，產(chǎn)生活性氧和自由基，引起病變區(qū)域細(xì)胞光化學(xué)損傷，封閉病變部位的新生血管，從而治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種眼科疾病，最終改善患者的視力。
給藥和劑量光活性化合物可以各種途徑給藥，如口服、非腸道給藥或直腸給藥，或可將化合物直接放如入眼中。以非腸道給藥為宜，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射。以靜脈注射為最好。
光活性化合物的劑量可以根據(jù)給藥方式、制劑類型、是否偶聯(lián)靶向配體而有很大的變化。一般認(rèn)為，在光活性劑的制劑、給藥方式和劑量水平之間有關(guān)聯(lián)。通常，血卟啉單甲醚的典型劑量范圍為0.1-100mg/kg，較佳的劑量范圍為0.5-50mg/kg，更佳的劑量范圍為1-10mg/kg。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以通過實(shí)驗(yàn)確定合適的劑量。
在本發(fā)明中用于有效、選擇性光動(dòng)力學(xué)治療的各種參數(shù)是相互關(guān)聯(lián)的。因此，可以相對(duì)于其他參數(shù)(例如光動(dòng)力學(xué)治療中所使用的光通量、光照度、持續(xù)時(shí)間和劑量、給藥與光照射之間的時(shí)間間隔等)而調(diào)整劑量。使用這些參數(shù)都應(yīng)調(diào)整到能顯著提高視力而不產(chǎn)生正常眼組織的明顯損害為宜。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過實(shí)驗(yàn)確定合適的參數(shù)。
換言之，當(dāng)光活性化合物的劑量降低時(shí)，封閉脈絡(luò)膜新生血管組織的光通量有增加的趨勢(shì)；反之需要降低光通量，則需要增加光活性化合物的劑量或增加靶向性促進(jìn)增加病變部位光活性化合物的富集程度。
光治療方法光治療參數(shù)有關(guān)的某些術(shù)語在不同的作者和出版物中有所不同。比如光通量，也稱光劑量、光能量密度；光照度，也稱功率強(qiáng)度、功率密度。這些術(shù)語是本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用并理解的，在此加以說明。
在光活性化合物給藥后，將眼的靶組織在被選擇的藥物吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行照射。對(duì)于血卟啉單甲醚，所選的波長(zhǎng)范圍一般在630±20nm左右，更佳地為在630±10nm左右，該范圍波長(zhǎng)在機(jī)體組織內(nèi)的穿透力比較好。
照射的結(jié)果導(dǎo)致光活性化合物處于激發(fā)狀態(tài)，并與其他化合物相互作用，形成單線態(tài)氧(Singlet Oxygen)和其他自由基，引起血管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。單線態(tài)氧和其他自由基主要損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜和核膜。血管上皮細(xì)胞損傷引發(fā)后續(xù)的血小板凝聚、脫顆粒和血栓形成，造成血管的堵塞和封閉。
根據(jù)組織的類型、靶組織深度和其上流體或血液的量，照射的光通量可有很大變動(dòng)。但較佳的為50-200焦耳/cm2。
光照度一般變化于50-800mW/cm2，以約100-600mW/cm2為佳。然而，選擇使用較高的光照度，可以縮短治療時(shí)間而達(dá)到同樣的效果。
光活性化合物給藥后至光治療之間的最適時(shí)間間隔也根據(jù)給藥方式、給藥形式和制劑類型而不同。光敏劑給藥后的時(shí)間間隔從1分鐘到2小時(shí)，較佳的為5-30分鐘，更佳的為10-25分鐘。
可治療的眼科疾病本發(fā)明提供了一種光動(dòng)力治療眼科疾病的方法，包括給需要這種治療的患者服用足以使受治療患者眼中富集足夠量光敏劑的光活性化合物制劑；允許足夠的時(shí)間使有效量的光活性化合物富集于患者眼中；用適合光敏劑吸收的光照射眼睛。
因?yàn)樵诒景l(fā)明的治療方法中，利用血卟啉單甲醚，通過光動(dòng)力療法有效地減少或消除角膜、虹膜、視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜上有害的新血管形成，因此本發(fā)明方法可用于治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種眼科疾病。代表性眼科疾病包括(但并不限于)黃斑變性(與年齡相關(guān)的黃斑變性以及其他黃斑變性)、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視和炎癥性疾病。
治療的評(píng)價(jià)光動(dòng)力治療的效果在動(dòng)物模型上可用組織學(xué)切片觀察內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和脈絡(luò)膜新生血管的封閉情況。典型的，新生血管的破壞表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核皺縮異常，血管腔內(nèi)可見血小板聚集和血凝塊的形成。
另一種方法是在治療后特定的時(shí)間用血管造影技術(shù)觀察新血管減少。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1血卟啉單甲醚和治療劑的制備A.血卟啉單甲醚的制備按CN 01131939的中國(guó)專利申請(qǐng)中所述的方法，將20克3，8-二(1-溴乙基)次卟啉IX氫溴酸鹽與3000毫升的甲醇/水混合液攪拌反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)液以10mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至13，攪拌4小時(shí)，再以冰乙酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至4-5，析出沉淀。布氏漏斗濾集析出的沉淀，水洗，干燥，得19.5克粗品。經(jīng)硅膠柱層析分離純化得3.9克血卟啉單甲醚(圖1)。
重復(fù)上述步驟，獲得約20克血卟啉單甲醚。
B.治療劑的制備稱取10克血卟啉單甲醚原料藥，以適量0.2mol/L氫氧化鈉水溶液充分?jǐn)嚢枞芙?，然后?.2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至7-8，加入適量的甘露醇，再以注射用水定容至400毫升；無菌過濾，分裝成每瓶含100毫克，置冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，加塞封口，貼標(biāo)簽。使用時(shí)以生理鹽水復(fù)溶至所需濃度給藥。
實(shí)施例2CAM模型用于光動(dòng)力治療效果體內(nèi)測(cè)定CAM模型的建立采用以下方法37℃孵化箱，氣室向上，每天轉(zhuǎn)動(dòng)3～4次，至孵蛋第9天，消毒種蛋表面后在氣室頂端打1～2mm小孔，在距胎頭前1cm、兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位標(biāo)記1.0cm×1.5cm的長(zhǎng)方形區(qū)域，磨切透卵殼，在卵殼膜上輕輕劃破直徑約1mm的小孔。滴加少許無菌純凈水分離小孔邊緣的卵殼膜，將無菌的直徑為6mm的微孔濾膜載體放在CAM的血管最少處。
然后在載體中央各加入10ul濃度為1mg/ml實(shí)施例1制備的血卟啉單甲醚，對(duì)照組加入10ul生理鹽水。加藥后15分鐘用金蒸汽激光進(jìn)行照光，光斑直徑2000μm，功率密度100mW/cm2，照光時(shí)間200s，能量密度20J/cm2。加藥后，用無菌透明膠封窗，標(biāo)記后再放入37.8℃的孵箱內(nèi)孵育3天。光處理3天后，每蛋注入1∶1的甲醇、丙酮等量混合固定液2.5ml。室溫下固定20分鐘，待CAM上血管內(nèi)的血液凝固后，揭去封窗的透明膜，剪除CAM水平以上的蛋殼，以濾膜載體為中心把CAM剪下，放入盛有少量水并鋪有濾紙的平皿里展開，陰干，連同濾紙保存，如圖2A和2B所示。
解剖顯微鏡下以相同放大倍數(shù)計(jì)數(shù)血管，以實(shí)驗(yàn)部位邊緣(即微孔濾膜載體邊緣)1mm范圍內(nèi)為一級(jí)血管，以實(shí)驗(yàn)部位邊緣5mm處為二級(jí)血管，凡屬趨向性生長(zhǎng)的血管，即以載體為中心發(fā)出，與濾膜半徑的夾角小于45度者均予計(jì)數(shù)；而穿行、繞行的血管則不算在內(nèi)。一、二級(jí)血管分別觀察計(jì)數(shù)。對(duì)照組一級(jí)、二級(jí)血管數(shù)分別為34.7和45.2，實(shí)驗(yàn)組分別為21和32.5，實(shí)驗(yàn)組顯著少于對(duì)照組。結(jié)果如圖3所示。
實(shí)施例3CNV小鼠模型的建立CNV模型按以下方法建立隨機(jī)選取20只成年雄性C57BL-6J小鼠，體重均為25g-26g。腹腔內(nèi)注射0.3％戊巴比妥鈉200μL麻醉小鼠，2％托品卡胺和10％新福林散瞳。經(jīng)裂隙燈及角膜接觸鏡，將激光(波長(zhǎng)810nm、直徑75μm、照射時(shí)間0.1s、功率140mW)導(dǎo)入小鼠眼里。在激光照射后1周進(jìn)行熒光素眼底血管造影(fundus fluorescence angiography，F(xiàn)FA)，選取光凝點(diǎn)無熒光滲漏，光凝點(diǎn)呈乳白色(如圖4)的動(dòng)物9只，進(jìn)行組織切片觀察確證造膜情況或者進(jìn)一步進(jìn)行光動(dòng)力治療試驗(yàn)。
取上述動(dòng)物1只，用過量戊巴比妥鈉處死，摘取眼球，分別在2％戊二醛和4％多聚甲醛中固定，剖切眼球，通過解剖鏡辨別激光點(diǎn)，將組織條塊以1％四氧化鋨固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧乙烷置換，環(huán)氧樹脂包埋，連續(xù)切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡觀察。
光鏡下可見視網(wǎng)膜下形成巨大管腔的新生血管，色素上皮細(xì)胞也異常增殖(圖5)。表明成功建立了CNV小鼠模型。
實(shí)施例4血卟啉單甲醚在CNV小鼠模型上的效果試驗(yàn)方法按實(shí)施例3制備的CNV模型小鼠4只，尾靜脈注射劑量為10mg/kg的血啉甲醚凍干制劑。注射后15分鐘用金蒸汽激光進(jìn)行照光，光斑直徑2000μm，功率密度100mW/cm2，照光時(shí)間200s，能量密度20J/cm2。另取實(shí)施例3制備的CNV模型小鼠4只，尾靜脈注射相同劑量的生理鹽水，作為對(duì)照。
結(jié)果判定一周后，用過量戊巴比妥鈉處死小鼠，摘取眼球，分別在2％戊二醛和4％多聚甲醛中固定，剖切眼球，通過解剖鏡辨別激光點(diǎn)，將組織條塊以1％四氧化鋨固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧乙烷置換，環(huán)氧樹脂包埋，連續(xù)切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡觀察。
結(jié)果對(duì)照組可見大量脈絡(luò)膜新血管生成，色素上皮細(xì)胞開始包繞新生血管(如圖6A)。
實(shí)驗(yàn)組可見脈絡(luò)膜毛細(xì)血管血栓形成，視網(wǎng)膜色素上皮層排列失去正常的連貫性，外節(jié)排列紊亂、空泡化，外顆粒層細(xì)胞固縮，視網(wǎng)膜內(nèi)層尚正常(如圖6B)。
實(shí)施例2和4的結(jié)果表明，血卟啉單甲醚可有效抑制有害血管如脈絡(luò)膜新血管生成，從而可有效治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種眼科疾病，如角膜、虹膜、視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜上有害的新血管形成導(dǎo)致的眼病，特別是年齡相關(guān)性黃斑變性。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.血卟啉單甲醚的用途，其特征在于，用于制備治療眼科疾病的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述眼科疾病是因有害的新生血管形成而導(dǎo)致的疾病。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的新生血管形成發(fā)生在角膜、虹膜、視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的新生血管形成發(fā)生在脈絡(luò)膜上。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的眼科疾病選自下組黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視、或炎癥性疾病。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血卟啉單甲醚為如下結(jié)構(gòu)式的化合物 式中，R1為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基；R2為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥劑量為0.1-100mg/kg體重，按血卟啉單甲醚計(jì)算。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治療是光動(dòng)力治療。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述光動(dòng)力治療條件是照射的光通量為50-200焦耳/cm2，光照度為50-800mW/cm2，波長(zhǎng)為630±20nm。
10.血卟啉單甲醚的用途，其特征在于，用作光動(dòng)力治療眼科疾病的光敏劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了血卟啉單甲醚用于制備治療眼科疾病的藥物的新用途。血卟啉單甲醚的最佳吸收波長(zhǎng)630nm，清除時(shí)間短，光敏感性24小時(shí)可以消退，因此特別適合作為光動(dòng)力療法治療眼科疾病的光敏劑。血卟啉單甲醚可有效治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種眼科疾病，如黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視、或炎癥性疾病等。
文檔編號(hào)A61P27/02GK1589791SQ0315055
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者陳文輝, 陶紀(jì)寧, 熊乾斌, 許德余, 李軍, 蘇勇 申請(qǐng)人:上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司