專利名稱：脂質(zhì)體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有重量比水平較高的脂類物質(zhì)包裹的水溶性化合物的脂質(zhì)體組合物。具體說，本發(fā)明涉及可注射的脂質(zhì)體疫苗，該疫苗的多層脂質(zhì)體載體中有效而穩(wěn)定地包裹了大量親水性免疫原，因而具有有效的免疫原性及很低的組織反應(yīng)原性。本發(fā)明也涉及制造該脂質(zhì)體疫苗組合物的方法。
背景技術(shù)：
可通過抗激素或抗激素受體的疫苗，利用其對(duì)激素和它們生理效應(yīng)的免疫中和作用或抑制作用，來治療激素依賴性疾病和疾患。例如已為大家所接受的是，生殖性激素和其它激素可起著生長(zhǎng)因子作用，刺激腫瘤包括乳腺、胰腺、肺、胃和直結(jié)腸系統(tǒng)癌的生長(zhǎng)。已發(fā)現(xiàn)某些正常時(shí)不表達(dá)的且在健康器官中無功能的激素是促發(fā)惡變的活躍參與者。
雖然這些激素作為自身抗原不顯示固有的免疫原性，但可通過給這類患者或動(dòng)物免疫接種綴合了自身最小免疫原性靶肽的免疫原性載體，來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗激素或抗激素受體的抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)這類疾病或疾患的治療。例如美國(guó)專利5,023,077；5,468,494；5,688,506和6,132,720公開了用于中和胃泌素或促性腺素釋放激素活性的免疫原和免疫原性組合物。
仍需要增強(qiáng)這類綴合物的免疫原性以使它們可用于臨床。一種方法是將它們與油性載體一起配制形成緩釋乳液。水溶性疫苗包含抗激素或抗激素受體的靶免疫原?？勺⑸湫悦庖咴ǔＲ杂桶橐盒问捷斔?。這些疫苗乳液由于其固有的、引起免疫接種后注射部位炎癥的組織反應(yīng)原性，受到可給予劑量的限制。因此這種引起局部反應(yīng)的傾向?qū)е履承┎±荒芙o予亞適水平的免疫原。
油包水乳液由分散在連續(xù)油相(礦物油、鯊烯或鯊?fù)?中的細(xì)小水滴組成?？纱x性油如鯊烯或鯊?fù)榫哂欣硐氲陌踩?，它們比人類治療不可接受的弗氏佐劑更為患者樂意接受。將上述免疫原組合物，即胃泌素或促性腺素釋放激素(GnRH)配制成油包水乳液顯著增強(qiáng)了免疫應(yīng)答反應(yīng)。然而采用乳液疫苗制劑可能引起注射部位反應(yīng)，這在治療威脅生命的疾病時(shí)可能被接受，但在其它疾病中引起的不適是不利的或甚至不能接受。因此，探索了輸送抗原的其它方式。例如，授于Kedar等的美國(guó)專利5,919,480中公開了脂質(zhì)體流感疫苗，其采用脂質(zhì)體包裹流感亞單位抗原，作為小泡類型輸送載體。
雖然脂質(zhì)體具有良好的靶向潛能，為加入親水性和親脂性免疫調(diào)節(jié)劑提供了基礎(chǔ)劑型，但它們配制困難不能充分包裹大量免疫原，常需要可溶性免疫調(diào)節(jié)劑的幫助才有效。J.C.Cox等，“佐劑-分類和它們的作用模式綜述”Vaccine.1997.15(13)248-256。
脂質(zhì)體制劑的蛋白運(yùn)載能力有一定限制。例如，脂質(zhì)體小室中的蛋白比率越大，脂質(zhì)體制劑的粘性越高。此種粘性可升高到防礙其用作可注射疫苗的屏障水平。事實(shí)上脂質(zhì)體作為可注射制劑迄今可達(dá)到的最高包裹水平為大約30％。G.GregoriadisX編著Liposome Technology，第一卷第二版CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L.1993，527-616。然而，由于脂質(zhì)體中親水性分子的包裹水平特別低，因而脂質(zhì)體制劑通常更適合于兩性免疫原。
還發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體作為低免疫原性親水抗原的疫苗輸送載體時(shí)，要求較大量的疫苗劑量才有效。迄今沿不能達(dá)到所需的脂質(zhì)體包裹的免疫原劑量，這部分是由于可注射體積有限。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可輸送大量水溶性物質(zhì)的可注射的脂質(zhì)體組合物。該組合物含有脂質(zhì)與包裹的水溶性物質(zhì)重量高比率(分布在眾多脂質(zhì)載體中)的眾多脂質(zhì)體載體。脂質(zhì)與包裹物質(zhì)的重量比范圍約為50比1000。此種安排的優(yōu)點(diǎn)是能達(dá)到高效包裹，例如50％以上，某些實(shí)施例中達(dá)到80％以上。
該脂質(zhì)體載體可以是多室載體(MLV)。該脂質(zhì)體含有的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)具有一親水性尾，和一極性或化學(xué)反應(yīng)部分，該部分含有酸、醇、醛、胺或酯。該脂質(zhì)體的另一特征是具有烴鏈或類固醇尾基團(tuán)和一極性頭部基團(tuán)。形成脂質(zhì)體的脂包括磷脂。合適的磷脂例子包括但不限于磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
水溶性物質(zhì)廣義包括蛋白質(zhì)、蛋白聚糖和碳水化合物。一些實(shí)施例中，水溶性物質(zhì)包括一種以上的化合物。
待包裹的水溶性物質(zhì)也可以是疫苗，包括但不限于抗激素或激素相關(guān)受體的疫苗。本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該疫苗包含綴合于一種親水性免疫原性載體蛋白的至少一種激素-免疫模擬肽(immunomimic peptide)、或激素受體-免疫模擬肽。例如，所述免疫模擬肽選自以下的合成序列胃泌素G-17、胃泌素G-34、GnRH和hcG。具體說，合成的胃泌素G-17序列是SEQ NO1或其片段(SEQ ID NO3-8)。合成的G34肽序列是SEQ ID NO12。合成的GnRH免疫模擬肽是SEQ ID NO15。合成的hCG免疫原性肽序列是SEQ ID NO16。接頭肽是SEQ NO9，10T和11。
本發(fā)明的某些實(shí)施例中，脂質(zhì)體分開包裹或一起包裹水溶性免疫原和水溶性高分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)或低分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。高分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)可以包括細(xì)胞因子。低分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的例子包括但不限于MDP、蘇氨酰MDP、莫拉丁酯，N-乙酰葡糖胺酰-MDP和murametide。
本發(fā)明還涉及含本文和權(quán)利要求書所述的低粘度脂質(zhì)體組合物及藥學(xué)上可接受載體的藥物制劑。本發(fā)明的藥物制劑可給予需要的患者作為治療疾病或疾患治療方案的組成部分。
這種藥物制劑的一個(gè)例子是含有本文和權(quán)利要求書所述的低粘度脂質(zhì)體組合物的可注射水性懸浮液的滅菌組合物。由于脂質(zhì)體中包裹了大量蛋白質(zhì)，輸送大量蛋白質(zhì)可提供更高的免疫原劑量，同時(shí)保持了適合于注射的粘度和維持了可接受的劑量體積。這樣，本發(fā)明提供了有效的免疫接種，而無須加入有潛在毒性的佐劑和免疫調(diào)節(jié)添加劑。因此，組織反應(yīng)原性得以有效降低。
本發(fā)明還涉及制備脂質(zhì)體疫苗的方法，該方法包括制備磷脂多室載體和包裹水溶性免疫原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的步驟，從而使脂質(zhì)體含有高的脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是脂質(zhì)體DMPC+G17DT綴合組合物的電鏡圖，其中脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例為500∶1。
圖2是脂質(zhì)體DMPC+G17DT綴合組合物和非-MDP添加劑的電鏡圖，其中脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例為500∶1。
圖3是脂質(zhì)體DMPC/DMPG+G17DT綴合組合物的電鏡圖，其中脂質(zhì)/蛋白質(zhì)比例為500∶1。
圖4是脂質(zhì)體DMPC/DMPG+G17DT+非-MDP的電鏡圖，其中脂質(zhì)/蛋白質(zhì)比例為500∶1。
圖5是比較以下疫苗接種所誘導(dǎo)的抗胃泌素抗體平均滴度隨時(shí)間變化圖對(duì)照單用100μg G17DT；或脂質(zhì)體包裹的100μg G17DT注射用乳劑和1.5mg或3mg G17DT(0cu IL-12)；和溶于PBS中的1.5mg或3mg G17DT；脂質(zhì)體包裹的1.5mg或3mg G17DT加1000cu IL-12-100,000cu IL-12。
圖6是用上述組合物疫苗接種所誘導(dǎo)的抗胃泌素抗體滴度中位數(shù)隨時(shí)間變化圖。
圖7是用以下疫苗接種所誘導(dǎo)的抗-GnRH抗體平均滴度隨時(shí)間變化圖對(duì)照為100μg GnRHDT綴合物或乳劑和脂質(zhì)體包裹的1.5mg或3mg GnRH-DT(0cu IL-12)；和溶于PBS溶液中的1.5mg或3mg GnRHDY；與脂質(zhì)體包裹的1.5mg或3mg GnRHDT加1000cu IL-12-100,000cu IL-12。
圖8是用上述免疫原疫苗接種所誘導(dǎo)的抗-GnRH抗體滴度中位數(shù)隨時(shí)間變化圖。
圖9是對(duì)高劑量含5％EtOH或水的G17DT脂質(zhì)體反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的抗-G17兔抗體平均滴度圖。
圖10是對(duì)高劑量含5％EtOH或水的G17DT脂質(zhì)體反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的抗-G17兔抗體滴度中位數(shù)圖。
發(fā)明詳述描述以下術(shù)語的含義并用于本說明書中。
能形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)或形成小泡的脂質(zhì)，指以具有疏水性極性頭部基團(tuán)為特征的兩親性脂質(zhì)，其可自發(fā)形成含水雙層小泡。具體說，將形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)穩(wěn)定摻入脂質(zhì)雙層中，使其疏水部分與囊膜的內(nèi)部區(qū)域接觸，而其極性頭部基團(tuán)朝向囊膜的外部極性表面。
專用術(shù)語“分開包裹”指脂質(zhì)體包裹的成分，例如抗原和細(xì)胞因子分開被包裹在不同的脂質(zhì)體制劑中。
相反，“共同包裹的”成分，應(yīng)理解為脂質(zhì)體制劑含有一種以上抗原或產(chǎn)品，如抗原和免疫刺激劑的組合。
如上所述，本發(fā)明的脂質(zhì)體適合包裹水溶性物質(zhì)，如親水性蛋白質(zhì)和低分子量化合物，從而使大量物質(zhì)分散在眾多脂質(zhì)載體中，其大小范圍0.1-10μm。
更具體說，脂質(zhì)體包裹的水溶性化合物可以是含有最小免疫原性分子的疫苗構(gòu)建物。該構(gòu)建物可含有免疫原性載體蛋白與作為靶子的免疫模擬肽的綴合物。該載體蛋白可包括其免疫原性片段作為載體。
術(shù)語“可注射組合物”定義為粘度足夠低而得以通過例如皮下針頭作胃腸外注射的脂質(zhì)體組合物。
脂質(zhì)體制劑一般認(rèn)為最適合包裹兩親性物質(zhì)。出乎意料的是本發(fā)明制備的脂質(zhì)體具有高的脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)重量比，能包裹大量，例如可將至少50％的水溶性物質(zhì)分布在眾多的脂質(zhì)載體中。因此，本發(fā)明脂質(zhì)體的高脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例能顯著降低或甚至消除反應(yīng)原性，同時(shí)通過大大提高脂質(zhì)體包裹的免疫原劑量提高其免疫原性到臨床有效水平。本發(fā)明的脂質(zhì)體比常規(guī)油包水乳劑的耐受性好得多，同時(shí)仍能在體內(nèi)獲得有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
脂質(zhì)體制劑的高脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例降低了抗激素疫苗的反應(yīng)原性，而當(dāng)脂質(zhì)體與常用低劑量乳化免疫原一起配制時(shí)，抗自身激素的多室脂質(zhì)體疫苗不會(huì)誘導(dǎo)足夠的抗體滴度。事實(shí)上，其他人曾經(jīng)試圖提高脂質(zhì)體中親水性免疫原的含量但未能成功，因?yàn)橹|(zhì)體包裹親水分子的效果通常很差。
本發(fā)明的脂質(zhì)體小泡含有脂質(zhì)的疏水性尾部基團(tuán)和極性頭部基團(tuán)排成陣列，與水形成脂質(zhì)雙層膜。疏水的尾部包含飽和的烴鏈和類固醇基團(tuán)，而極性頭部基團(tuán)含有化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，如酸、醇、醛、胺和酯基團(tuán)。本發(fā)明所用的磷脂包括但不限于磷脂酸(PA)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)。
已知包裹的水溶性免疫原含有連接于免疫原性水溶性載體蛋白的靶抗原-免疫模擬肽。由于免疫原性水溶性載體蛋白的親水部分占優(yōu)勢(shì)，它實(shí)質(zhì)性影響到整個(gè)免疫原性構(gòu)建物的總體水溶性特征。
本發(fā)明另一實(shí)施例所含的親水性免疫原性載體蛋白，包括白喉類毒素(DT)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、馬蹄形蟹血蘭蛋白、匙孔戚血蘭蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或多糖葡聚糖；及這些載體各自的免疫活性組分。
本發(fā)明的脂質(zhì)體疫苗組合物含有穩(wěn)定包裹在眾多脂質(zhì)體中的大量水溶性疫苗，脂質(zhì)體則懸浮在水性載體中，各脂質(zhì)體顆粒有免疫原性，能引起持久的有臨床意義的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
該脂質(zhì)體疫苗懸浮液含有針對(duì)自身抗原的免疫原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，適合給予患者治療自身靶抗原相關(guān)疾病或疾患。
該脂質(zhì)體免疫原可通過胃腸外、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)或陰道內(nèi)途徑給予患者進(jìn)行治療。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射。
例如，可注射針對(duì)生殖性激素的脂質(zhì)體疫苗進(jìn)行免疫，以中斷妊娠。另一個(gè)例子是用抗-GnRH或抗-hCG脂質(zhì)體疫苗免疫接種，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答防止妊娠。
脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)重量高比例小泡(HLPR)的可注射懸浮液的優(yōu)選實(shí)施例，在大量大小適當(dāng)?shù)闹|(zhì)小泡中提供了高劑量的包裹有白喉類毒素蛋白質(zhì)(DT)的免疫原性綴合物，其能安全地注射進(jìn)行抗自身抗原的免疫接種。這種自身免疫靶抗原包括正常的激素和類似因子，及它們有關(guān)的參與直接或間接刺激各種胃腸或生殖系統(tǒng)中腫瘤生長(zhǎng)的，或促進(jìn)直結(jié)腸癌、乳腺癌或前列腺癌轉(zhuǎn)移的受體。
因此，本發(fā)明包括包裹有抗胃泌素免疫原構(gòu)建物的脂質(zhì)體小泡可注射水性懸浮液。本發(fā)明的另一實(shí)施例包括包裹有抗GnRH免疫原構(gòu)建物的脂質(zhì)體小泡可注射水性懸浮液。本發(fā)明還提供包裹在HLPR脂質(zhì)體中的人絨毛膜促性腺激素(hCG)免疫避孕疫苗。因此，一實(shí)施例提供的抗-hCG脂質(zhì)體疫苗適合作為避孕所需要的、能降低組織反應(yīng)原性，同時(shí)提供臨床上有效的免疫原劑量。
此外，某些激素或生長(zhǎng)因子只是部分不成熟形式癌癥所具有的，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谀[瘤中顯示出自分泌和/或旁分泌活性。例如，已知胃泌素激素中，雙酰胺化的胃泌-17(G17)，pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(在序列表中是SEQ ID NO1)和前體形式的甘氨酸-延伸的胃泌素-17(GlyG17)，pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(SEQ ID NO2)都能刺激胃腸道(GI)腫瘤和非GI相關(guān)腫瘤如甲狀腺和肺癌的生長(zhǎng)。
本發(fā)明抗胃泌素實(shí)施例包括由大量脂質(zhì)-蛋白質(zhì)高比率的脂質(zhì)體小小泡包裹的大量親水性抗胃泌素G17免疫原性構(gòu)建物組成的可注射水性懸浮液，其中的免疫原性構(gòu)建物含有各種長(zhǎng)度的G17-氨基端免疫模擬肽表位，長(zhǎng)度范圍為1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、或1-10個(gè)氨基酸(分別為SEQID NO3、4、5、6、7、或8)，其C-未端通過6個(gè)殘基的接頭肽(SEQ ID NO9)，或7個(gè)殘基的接頭肽(SEQ ID NO10)，或8個(gè)殘基的接頭肽(SEQ ID NO11)與載體蛋白質(zhì)相連。
本發(fā)明另一實(shí)施例提供針對(duì)胃泌素G34(SEQ ID NO12)N-端1-22肽序列的脂質(zhì)體免疫原，其可用于免疫控制或或抑制胃泌素分泌。
本文中，一實(shí)施例提供最小的免疫原性合成肽pGlu-Leu-Gly-Pro-Glu-Gly-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Cys或Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-Leu-Gly-Pro-Glu-Gly(分別為SEQ ID NO13和14)，使G34(1-6aa)片段，在其C-端或N-端與接頭肽如Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO11)相連接，從而使該免疫模擬肽的Cys與適合的免疫原性載體蛋白相綴合。
此外，已知哺乳動(dòng)物生殖激素，促性腺素釋放激素(GnRH)，pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO15)涉及雄性和雌性生殖系統(tǒng)中癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
含有脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比例、包裹有免疫原的小泡型脂質(zhì)體可注射懸浮液的實(shí)施例中，提供的接頭肽將免疫原性載體與模擬激素的免疫原性合成肽連接在一起，例如白喉類毒素與胃泌素-17的肽類似物，或促性腺素釋放激素最小免疫原性類似物或其片段綴合在一起。
按照美國(guó)專利4,767,842(描述了hCG的結(jié)構(gòu)II，其內(nèi)容納入本文作參考)所述方法，選擇適合的序列與白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素綴合。對(duì)于hCG-免疫原性構(gòu)建物，可將模擬hCG的免疫原性合成肽連接于免疫原性載體DT。如上所述的其它免疫原性蛋白質(zhì)也是hCG肽構(gòu)建物的有用載體。
一實(shí)施例中，包含相應(yīng)于hCG的β亞基111-145氨基酸序列(序列表中的SEQ IDNO16)(引自美國(guó)專利4,767,842的“結(jié)構(gòu)II”)部分的hCG片段，不是與LH(黃體生成素)的共同片段，因此它不會(huì)產(chǎn)生LH交叉反應(yīng)性抗體。本發(fā)明另一實(shí)施例提供的hCG最小免疫原性合成肽在hCG-β亞基的N-端含有一個(gè)8間隔肽(SEQ ID NO11)，在hCG的C-未端138-145位(SEQ ID NO17)連接于DT。其它接頭肽(SEQID NO8或9)也可用于抗-hCG免疫原構(gòu)建物。
本發(fā)明的藥物實(shí)例中，提供以脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量高比例的脂質(zhì)體小泡，包裹抗-hCG免疫原性構(gòu)建物和藥學(xué)上可按受載體的可注射懸浮液。
本發(fā)明一實(shí)施例提供制備在大量脂質(zhì)顆粒中包裹有相對(duì)大量疫苗的大量可注射的脂質(zhì)體制品的方法。該方法可包括包裹有針對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)激素及其相關(guān)受體的免疫原的化學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體。
本發(fā)明另一實(shí)施例提供制備眾多負(fù)載有大量水溶性免疫原達(dá)到脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量高比例的脂質(zhì)小泡的方法。該方法可包裹和吸附與親水性免疫原性載體蛋白或其片段相綴合的激素如G17或GnRH的免疫模擬肽。
本發(fā)明脂質(zhì)體小泡的大小范圍是0.1μm-10μm。此外，脂質(zhì)體懸液提供的包裹疫苗，載有大約0.5mg-5mg蛋白質(zhì)，脂質(zhì)-蛋白質(zhì)比例約為50∶1-1000∶1。
本發(fā)明的脂質(zhì)體可通過共同包裹或分別包裹至少一種高分子量或低分子量免疫凋節(jié)劑來制備。高分子量免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于分離的細(xì)胞因子，包括白介素如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15或IFN-γ、胞壁酰二肽(MDP)或其親水性衍生物，如去甲MDP、蘇氨酰MDP、莫拉丁酯、N-乙酰葡糖胺-MDP和murametide，以及脂質(zhì)A衍生物4’-單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、三萜皂苷混合物Q521或ISCOPREPTM703(定義見皂苷)、CpG-寡核苷酸和番茄苷(一種葡糖生物堿皂苷，C50H3NO21；Sigma)。脂質(zhì)體體制品共同包裹或分別包裹的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)可包括10c.u-100,000c.u的IL-2。該脂質(zhì)體組合物也提供能增強(qiáng)免疫原性的添加劑組合，如IL-2和非離子嵌段聚合物的組合。
本發(fā)明的組織低反應(yīng)原性免疫方法，包括給予以脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量高比例包裹水溶性化合物的脂質(zhì)體懸浮液。包裹蛋白質(zhì)的脂質(zhì)小泡，含有抗激素免疫原或抗激素受體的免疫原及免疫調(diào)節(jié)性化合物，分別包裹或共同包裹在相同的制品中，可經(jīng)肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或直腸途徑給藥。
不受理論不恰當(dāng)推測(cè)的束縛，目前相信本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)載體中包裹的蛋白質(zhì)位于脂質(zhì)小泡中，因而有二種輸送方式。具體說，其輸送方式包括通過釋放小泡外表面吸附的抗原快速輸送，以及通過各脂質(zhì)小泡的膜系統(tǒng)緩釋完全包裹的抗原組分兩種方式。
本發(fā)明另一方面提供通過有效的緩慢釋放輸送脂質(zhì)體內(nèi)部的免疫原，而無須多次加強(qiáng)免疫接種來延長(zhǎng)免疫避孕的方法。
本發(fā)明還提供含脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比例能包裹較大量水溶性抗原的脂質(zhì)體的生產(chǎn)方法。
按照共屬于美國(guó)專利5,023,077；5,468,494；5,688,506；5,698,201和6,359,114中所述的方法制備免疫原構(gòu)建物。原理上，將免疫原性載體蛋白或其免疫原性片段，通過一合適的無免疫原性間隔肽，與適當(dāng)長(zhǎng)度的能模擬靶激素或其受體分子的免疫原性肽相綴合，以誘生特異性的能中和或抑制該激素生理作用的、抗激素或激素受體的抗體。模擬免疫原的肽與免疫原性載體蛋白的常用摩爾濃度比是1-40摩爾，其中載體單位是105MW。
以下實(shí)施例闡述本發(fā)明的優(yōu)選方面，然而不是限于所述的水溶性化合物，應(yīng)包括肽激素或激素受體作為免疫接種的靶子。美國(guó)專利5,023,077和5,468,494說明了用于中和胃泌素的免疫原，美國(guó)專利5,688,506說明了GnRH在人和其它哺乳動(dòng)物中均有活性，此二專利內(nèi)容納入本文作參考。美國(guó)專利5,698,201說明了人絨毛膜促性腺激素(hCG)免疫原的生產(chǎn)方法，其內(nèi)容納入本文作參考。然而已有人選擇抗-胃泌素免疫原性綴合物作為免疫治療胃腸道惡性腫瘤的候選藥物。(見Watson等，ExpOpin Biol Ther 2001，1(2)309-17).
各種免疫原性脂質(zhì)體包含合成的模擬激素免疫原性的肽，如胃泌素G-17(SEQ IDNO7)或人GnRH(SEQ ID NO15)。
模擬胃泌素免疫原性的肽可含有長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)的序列，如C-未端結(jié)合有SSPPPPC臂的各種G-17(SEQ ID NO3，4，5，6，7或8)激素免疫原性構(gòu)建物的N-端的1-5、1-6、1-7、1-8或1-9個(gè)氨基酸序列。
用實(shí)施例1和2所述方法包裹的G17DT構(gòu)建物，是一種由G17最小免疫原性9肽組成的胃泌素免疫原，該9肽衍生自人G17的氨基未端部分(1-9)，在其C-端通過一含有另外7個(gè)氨基酸的接頭而延長(zhǎng)。將產(chǎn)生的16肽pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-pro-Pro-Cys(SEQ ID NO18)通過其未端半胱氨酸殘其上的巰基與異質(zhì)雙功能接頭分子反應(yīng)，共價(jià)連接于運(yùn)載分子白喉類毒素(DT)(連接于該載體蛋白賴氨酸的ε氨基)。
GnRH免疫原選用GnRH的氨基酸序列1-10。該免疫原也可含有接頭肽，可將載體與免疫模擬肽，如國(guó)際氨基酸專門名詞中的RPPPPC(SEQ ID NO9)、SSPPPPC(SEQ IDNO10)相連接，但不限于這些。另一合適的接頭是SPPPPPPC(SEQ ID NO11)?？蓪nRH免疫原性模擬肽通過與接頭肽未端半胱氨酸(C)反應(yīng)形成二硫鍵共價(jià)連接于載體。
實(shí)施例4中所述脂質(zhì)體包裹的GnRH綴合物也稱為“D17DT”，是17肽，Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO19)，含有氨基端GnRH模擬免疫原序列，其C-未端延伸的接頭肽通過異質(zhì)雙功能試劑連接于載體蛋白即DT中的賴氨酸殘基的ε氨基。
構(gòu)建了G17-白喉毒素(G17DT)綴合免疫原來誘導(dǎo)能特異性中和人胃泌素G17(hG17)的抗體。該免疫原可包含攜帶hG17表位的肽，共價(jià)連接于親水性免疫原性載體如白喉類毒素。G17免疫模擬肽含有的片段是G17的N-未端5-12個(gè)氨基酸?？蓪⑦@些G17肽片段任選地連接一接頭肽如SSPPPPC，再經(jīng)其連接于免疫原性親水性載體如DT。類似地，可用G17或G1y-延伸G17的C-未端序列部分的免疫模擬物，構(gòu)建免疫原。設(shè)計(jì)用可溶于水相的該免疫原性綴合物來誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗胃泌素抗體。然而，用實(shí)用的免疫方案來誘導(dǎo)有效水平的抗hG17抗體需要加入免疫增強(qiáng)佐劑以提高該綴合物的免疫原性。
合成的hCG免疫原可包含Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln(138-145位氨基酸C-未端肽序列；SEQ ID NO20)。
本發(fā)明提供生產(chǎn)含有大量免疫原性蛋白質(zhì)的可注射的脂質(zhì)體包裹的疫苗，其能誘導(dǎo)高滴度的抗血清而在脂質(zhì)體注射部位沒有組織反應(yīng)，獲得了高抗體滴度與低的或可忽略的反應(yīng)原性的良好比率。以下的詳細(xì)描述和實(shí)施例，公開了本發(fā)明的多室性脂質(zhì)體小泡的組成，特別是適合包裹親水性免疫原的脂質(zhì)體組合物的生產(chǎn)方法。
如以下實(shí)施例所顯示，已發(fā)現(xiàn)多室性脂質(zhì)體中包裹的免疫原劑量高至1.5或3mg，但其對(duì)局部組織的刺激作用，低于例如油包水乳劑中劑量少得多的100μg免疫原。
可按照本領(lǐng)域熟知的方法用各種脂質(zhì)體小泡形成脂質(zhì)，來制備脂質(zhì)體組合物。脂質(zhì)體小泡制備的有關(guān)方法和材料見美國(guó)專利5,919,480中所述，其內(nèi)容納入本文作參考，下面將作進(jìn)一步描述。本發(fā)明的脂質(zhì)或油性小泡形成物質(zhì)可長(zhǎng)期保存脂質(zhì)體包裹的抗原與佐劑，并在給藥后有效釋放這些成分。代表性的脂質(zhì)包括但不限于雙十四烷酰磷脂酰膽堿(DMPC)、雙十四烷酰磷脂酰甘油(DMPG)、膽固醇、1，2-二硬脂酰-3-三甲基胺丙烷(DSTAP)、1，2-雙十四烷酰-3-三甲基胺丙烷(DMTAP)和它們的組合，如DMPC/膽固醇、DMPC/DMPG、DMPC/DMPG/膽固醇、DMPC/DMTAP和DMPG/DMTAP/膽固醇。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物含有10-100摩爾百分比的DMPC。具體用的組合物是9∶1(摩爾/摩爾)DMPC/DMPG的混合物和單用DMPC。
本發(fā)明的脂質(zhì)體也可包含大的脂質(zhì)小泡，如以下所述，具有約0.25μm-5.0μm的平均直徑。
本發(fā)明提供的免疫反應(yīng)增強(qiáng)化合物可與靶向免疫原性肽共同包裹在脂質(zhì)體中，或者單獨(dú)包裹在適當(dāng)構(gòu)建的多室脂質(zhì)體中，與免疫原分開注射，或注射在非常接近免疫原的同一部位。
該脂質(zhì)體免疫原性組合物也可含有免疫刺激性細(xì)胞因子如白介素。細(xì)胞因子添加劑包括選自白介素的例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，或它們的組合。例如可聯(lián)用免疫調(diào)節(jié)劑IL-2和GM-CSF通過脂質(zhì)體輸送進(jìn)行免疫治療。
細(xì)胞因子可作為高分子量佐劑，以約20KD(KD＝千道爾頓)的糖蛋白加入。細(xì)胞因子具有不同的靶向能力而增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，IL-1能促進(jìn)T和B細(xì)胞成熟，IL-2能促進(jìn)T和B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞上調(diào)，IL-4能促進(jìn)B細(xì)胞上調(diào)，IFN-能促進(jìn)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上調(diào)增加MHC表達(dá)，GM-CSF可向樹突狀細(xì)胞(DCs)提供協(xié)同遷移信號(hào)。
本發(fā)明的脂質(zhì)體疫苗可包含包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的佐劑，其可單獨(dú)給予或與免疫原性綴合物一起給予。例如，免疫調(diào)節(jié)佐劑包括低分子量化合物如去甲胞壁酰二肽(去甲MDP)，劑量應(yīng)是有效和可接受的量，每劑可為1-50μm去甲MDP。
去甲MDP是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-異谷氨酰胺的一種幾乎無毒的親水衍生物，是分枝桿菌肽聚糖提取物中的佐劑活性組分。其它親水性衍生物包括蘇氨酰MDP、莫拉丁酯、N-乙酰葡糖胺-MDP和murametide。去甲MDP有激活Th2淋巴細(xì)胞的傾向。親脂性衍生物MTP-E有激活Th-1淋巴細(xì)胞的傾向。
脂質(zhì)體制劑中可加入各種低分子量免疫調(diào)節(jié)劑的組合，包括MPL、親脂性MDP或親水性去甲MDP、已知的皂苷Q521、ISCOPREPTM703、或QuilA和CpG寡核苷酸。適合于人類疫苗的脂質(zhì)體佐劑還可包括衍生自脂質(zhì)A的4’-單磷脂脂質(zhì)A(MPL)。番茄苷，一種皂苷，是具有免疫增強(qiáng)活性的天然產(chǎn)生的葡糖生物堿(Sigma)。
其它強(qiáng)的免疫刺激佐劑可包括置于標(biāo)準(zhǔn)的油包水乳劑水相中的非離子嵌段聚合物，已發(fā)現(xiàn)它能誘導(dǎo)顯著水平的持續(xù)至少4個(gè)月的免疫力而不會(huì)引起注射部位不可接受水平的局部刺激反應(yīng)?？蓪⒑铣傻木酆衔锶缇劢货ス簿垡医货?PLG)、鈣鹽、膠原、透明質(zhì)酸鈣或鈉、聚乙二醇(PEG)或其它凝膠形成物質(zhì)以微球形式加入，其降解可產(chǎn)生免疫原和免疫刺激佐劑的脈沖式輸送。這類控釋方法可延長(zhǎng)免疫效果幾個(gè)月。
脂質(zhì)體和脂質(zhì)體組合物的制備以下敘述制備本發(fā)明含有水溶性包裹制劑的脂質(zhì)體懸浮液的方法，和在脂質(zhì)體中摻入附加組合的方法。
可用各種技術(shù)制備脂質(zhì)體。為了形成多室性小泡(MLV)，將小泡形成脂質(zhì)的混合物溶于合適的有機(jī)溶劑(或溶劑混合物)中，在容器中蒸發(fā)形成薄膜，然后用水性介質(zhì)水合，形成脂質(zhì)小泡，通常大小為0.1-10μm，然后凍干。叔丁醇(TB)是該方法的一種特別適合的溶劑(用其制備的MLV稱為TB-MLV)?？蓪龈傻腗LV制品重新溶解成為水性懸浮液。然后可擠壓該水性懸液通過具有選擇的均一大小孔徑(通常為0.05-1.0微米)的聚碳酸酯膜，選擇性減小MLV懸液的粒子大小到所需的1微米或不到1微米的小泡。
本發(fā)明的小泡形成脂質(zhì)含有疏水鏈和極性頭部基團(tuán)，能在水中形成雙層小泡。例如，磷脂在水性環(huán)境中能自發(fā)形成小泡或穩(wěn)定摻入脂質(zhì)雙層中向內(nèi)的脂分子疏水部分中，脂質(zhì)分子的親水性極性頭部基團(tuán)朝向雙層小泡的外表面。設(shè)計(jì)脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層膜能將親水免疫原保持在內(nèi)，被脂膜小泡所包裹。
小泡形成脂質(zhì)可含有烴鏈、類固醇基團(tuán)或化學(xué)活性基團(tuán)，如酸、醇、醛、胺或酯，極性頭部基團(tuán)。磷脂包括磷脂酸(PA)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，它們通常含有二條約14-22個(gè)碳原子組成的飽和程度不同的烴鏈，由它們組合而形成小泡。加入脂類聚合物可穩(wěn)定小泡的脂質(zhì)成分。另外，糖脂，包括腦苷脂和節(jié)苷脂以及類固醇(如膽固醇)可形成小泡。也可購(gòu)得(Calbiochem)合成性膜形成磷脂酰衍生化合物，包括雙十六烷酰、二油酰、二月桂酰、雙十四烷酰或二棕櫚?；衔?，包括雙十四烷酰磷脂酰膽堿或雙十四烷酰磷脂酰甘油，可采用其與的和脂質(zhì)膜穩(wěn)定添加劑的混合物。
雖然免疫原性脂質(zhì)體組合物常規(guī)采用少量的抗原性高的病毒顆粒，但生物本身的，即自身激素或激素受體的抗原性非常低或可忽略不計(jì)，它們不需要免疫原性高的載體蛋白如白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素，而且已發(fā)現(xiàn)激素免疫原脂質(zhì)體需要相對(duì)大量的自身抗原分布在眾多的包裹脂質(zhì)體中，來維持其化學(xué)穩(wěn)定性和有利的輸送狀態(tài)，同時(shí)防止不利的反應(yīng)原性。除上述免疫原外，本發(fā)明的脂質(zhì)體也適合輸送其它水溶性物質(zhì)，包括經(jīng)修飾可提高免疫原性的激素、生長(zhǎng)因子、輔因子或佐劑。
已有各種方法在脂質(zhì)體中包裹其它或額外的制劑。例如，在反相蒸發(fā)方法中(Szoka的美國(guó)專利4,235,871)，采用少量水性介質(zhì)分散小泡形成脂質(zhì)的非水性溶液，形成油包水乳液。因此，就親脂制劑而言，可將活性成分溶在脂溶液中，就水溶性制劑而言，可溶在水溶液中。除去脂溶劑后，剩下的膠即轉(zhuǎn)變成脂質(zhì)體。這類反向蒸發(fā)小泡(REV)具有典型的約2-4微米平均大小，主要是寡室型，含有一個(gè)以上或至少多個(gè)脂質(zhì)雙層殼。如需要可通過擠壓使REV的大小成為最大尺寸0.05-1.5微米的寡室小泡?？蛇M(jìn)一步通過擠壓、超聲或高壓勻漿處理大的多室小泡(LMLV)或REV產(chǎn)生小的單室小泡(SUV)，其特征是不小為0.03-0.1微米?；蛘?，可通過脂質(zhì)的水性分散液勻漿化直接形成SUV。
在脂質(zhì)體組合物中加入添加組分的其它方法，包括將水性脂質(zhì)體分散液與其它組分共同凍干，將產(chǎn)生的固體重新分散形成MLV。另一方法(A.Adler，CancerBiother.10293，1995)是將待包裹的制劑水溶液加到脂質(zhì)的叔丁醇溶液中。超聲該混合物并凍干，得到的粉末重新復(fù)水。
如需要，在最后確定大小后可再處理含有包裹制劑的脂質(zhì)體組合物，以除去游離的(未包裹的)制劑。常規(guī)分離技術(shù)如離心、透析和超濾適合此目的。該組合物也可通過常規(guī)的0.45微米濾膜過濾除菌。為了形成本發(fā)明的組合物，可選擇脂質(zhì)體中的免疫原綴合物的濃度，在過濾后得到蛋白質(zhì)/脂質(zhì)分子量比為1∶100-1∶1000的、100％包裹的組合物。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的脂質(zhì)體制品可長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定。4℃貯存時(shí)，該脂質(zhì)體載體一年后仍相當(dāng)穩(wěn)定，包裹的免疫原性物質(zhì)可保留其初始活性的75-95％至少3-6個(gè)月。含IL-2的脂質(zhì)體特別穩(wěn)定。加有IL-2和抗原的脂質(zhì)體顯示6個(gè)月以上活性損失不超過10％。
該脂質(zhì)體組合物中也可加入穩(wěn)定劑。例如，當(dāng)在凍干介質(zhì)中加入鐵螯合劑如100μm濃度的DesferalTM或二亞乙基三胺戊基乙酸(DTPA)時(shí)，可進(jìn)一步減少IL-2生物活性的損失。為了貯存得更久，可將該組合物轉(zhuǎn)變成凍干粉末而穩(wěn)定一年以上，用前按需要加入水形成水懸浮液。
對(duì)于人，抗原的有效劑量為50微克至5毫克。
可通過胃腸道外注射給藥，如腹膜內(nèi)(i.p)、皮下(s.c)、靜脈內(nèi)(i.v)、肌肉內(nèi)(i.m)或透皮給藥。也可通過粘膜如鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)或口腔給予該疫苗。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多室性小泡能包裹大量的親水性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生含有例如抗胃泌素綴合物G17DT，或抗GnRH綴合物GnRHDT(也稱為D17DT)的疫苗制劑。一種包裹方法見實(shí)施例1中所述，雖然該方法不限于實(shí)施例中的顆粒性脂質(zhì)體免疫原。
按照共簽署的美國(guó)專利5,023,077和5,468,494(G17DT)及5,688,506(GnRHDT)和6,132,720(其內(nèi)容納入本文作參考)中所述方法制備這些綴合物。上面已描述了這些綴合物的序列同類物。
此外，上述的CCK-2/胃泌素受體免疫原(共簽署的待批申請(qǐng)S/N09/076,372公開內(nèi)容納入本文作參考)和hCG免疫原是適合包裹在上述脂質(zhì)體中的物質(zhì)。采用人胃泌素同類物或片段的實(shí)施例并不意味在實(shí)施本發(fā)明中包括其它動(dòng)物的胃泌素激素。
實(shí)施例1脂質(zhì)體包裹可用于產(chǎn)生多室性脂質(zhì)體(MLV)的雙層形成的組分，包括雙十四烷酰磷脂酰膽堿(DMPC)或雙十四烷酰磷脂酰甘油(DMPG)(Lipoid，Genzyme或Avanti Polar Lipid)。
凍干G17DT或GnRHDT免疫原加或不加去甲MDP佐劑的水溶液和脂質(zhì)(或單用中性DMPC或DMPC∶DMPG重量比9∶1溶于)叔丁醇溶液的混合液過夜，制備MLV。為將凍干脂質(zhì)體制備成可注射的懸浮液，水合和懸浮方法對(duì)脂質(zhì)體的蛋白質(zhì)包裹有著主要作用。當(dāng)以小的遞增量加入水進(jìn)行水合時(shí)獲得了最佳結(jié)果。
在評(píng)估脂質(zhì)/蛋白質(zhì)比例(w/w)對(duì)蛋白質(zhì)包裹的影響中，發(fā)現(xiàn)增加脂質(zhì)量達(dá)到DMPC/蛋白質(zhì)比為1000∶1時(shí)不能導(dǎo)致比500∶1更好的蛋白質(zhì)包裹。因此，本發(fā)明的大多數(shù)工作實(shí)施例采用500∶1的脂/-蛋白質(zhì)或DMPC/蛋白質(zhì)比率，或者300∶1的脂質(zhì)/蛋白質(zhì)比例(見表1和實(shí)施例6)。
脂質(zhì)體包裹GnRHDT和G17DT(以下也稱為“蛋白質(zhì)”)的效果，可通過離心后定量測(cè)定脂質(zhì)體沉淀組分中的蛋白質(zhì)和水相上清液中的未包裹游離蛋白質(zhì)來計(jì)算。蛋白質(zhì)定量采用改進(jìn)的Lowry法。Peterson G.L.1983.“總蛋白質(zhì)測(cè)定”Methods Enzymol.9195-119。為評(píng)估脂質(zhì)體水相中的污染物，用改進(jìn)的Bartlett法定量有機(jī)磷來測(cè)定磷脂的量Bartlett，G.R.1959.，和“柱層析中的磷測(cè)試”，J Biol Chem.234446-68；Y.Barenholz等，“脂質(zhì)體制備和相關(guān)技術(shù)”，1993，LysosomeTechnology，第一卷，第二版(Gregoriadis，G.ED)CRC Press，BOCA RATON，F(xiàn)L，pp.526-616。
表1脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量比對(duì)蛋白質(zhì)包裹百分率的影響
由90％DMPC和10％DMPG以500∶1的脂質(zhì)/蛋白質(zhì)比率組成的陰電荷DMPC/DMPG脂質(zhì)體制劑的蛋白質(zhì)包裹效率，與100％DMPC脂質(zhì)體制劑大約相同。
加入采用Waterpro Ps HPLC/Ultrafilter Hybrid提供的低水平總有機(jī)碳和無機(jī)離子的無菌無熱原質(zhì)純水(pH5.4)，制備凍干樣品的水合懸浮液。測(cè)定水合當(dāng)天該溶液的pH值。雖然不同測(cè)試制品的確切pH值范圍在5.2-6.7，但其對(duì)制品的效能沒有明顯影響。制備脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量比為500∶1的脂質(zhì)體制劑如DMPC/蛋白質(zhì)、DMPC/蛋白質(zhì)/佐劑、DMPC/DMPG/蛋白質(zhì)、DMPC/DMPG與蛋白質(zhì)和佐劑的混合物。
如Y.Barenholz等(ibid)所述，在25℃用Coulter model N4 SD或用Coulter計(jì)數(shù)器(Coulter Multisizer Accucomp)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)光散射(DLS)測(cè)定了脂質(zhì)體分散液中的粒子大小分布。污染物或未負(fù)載的脂質(zhì)體為0.2-0.8μm。
用動(dòng)力學(xué)光散射(DLS)測(cè)定80-100％粒子，證實(shí)脂質(zhì)體大小分布的范圍是1.3-1.8μm.
用Coulter計(jì)數(shù)器測(cè)定所得脂質(zhì)體的大小一致證實(shí)其平均體積為3.7-5.0(標(biāo)準(zhǔn)差±3)。
電鏡觀察含GnRHDT(即D17DT)的脂質(zhì)體樣品并用負(fù)染色測(cè)定。圖1-圖4是電鏡圖，表明有二種不同脂質(zhì)體疫苗被磷鎢酸鈉負(fù)染(脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量比500∶1)。多次電鏡觀察所得顆粒直徑顯示，每種脂質(zhì)體制劑平均每50個(gè)顆粒平均直徑為1-2.5μm。
也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來確定脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比例脂質(zhì)體制備方法對(duì)包裹親水性蛋白質(zhì)成分，如上述綴合物的效果。具體說，發(fā)現(xiàn)速制的多室性小泡保持了高濃度或數(shù)量級(jí)的DT或其它水溶性蛋白質(zhì)，部分位于脂質(zhì)雙層膜中，部分完全包裹在膜內(nèi)或殼內(nèi)。
以下實(shí)施例顯示疫苗劑量的增加對(duì)組織反應(yīng)原性的影響。
實(shí)施例2低劑量G17DT脂質(zhì)體與G17DT乳液的比較脂質(zhì)體水懸液中的G17DT綴合物的劑量是100μg或200μg蛋白質(zhì)。在雌兔(3組)中于0、28和56天分別注射測(cè)試了脂質(zhì)體G17DT疫苗，與現(xiàn)有技術(shù)的對(duì)照G17DT乳液100μg劑量作比較。
在48天研究中間隔14天收集血清樣品，用ELISA測(cè)定抗胃沁素抗體滴度。發(fā)現(xiàn)100μg/0.2ml體積的脂質(zhì)體制品經(jīng)3次注射第70天誘導(dǎo)的反應(yīng)峰值平均滴度為10,370。其它所有脂質(zhì)體樣品的滴度為5,000或更低，表明誘導(dǎo)10,000以上的滴度至少需要注射3次，并且這些滴度不能持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間。加倍給予200μg/0.4ml劑量導(dǎo)致第3次注射后14天收集的血清平均滴度為11,162。增加劑量有時(shí)更有效，因?yàn)榈?次注射后14天獲得了9,335(接近約10,000)的平均滴度，表明測(cè)到了比100μg劑量方案更高的促進(jìn)。然而，這些反應(yīng)時(shí)間短，因?yàn)槠渌裳?0-14-26-56-84天)收集的血清平均滴度都低于5,000。雖然脂質(zhì)體制劑輸送的綴合物劑量加倍而獲得了加強(qiáng)，但反應(yīng)短暫。因此不認(rèn)為這些脂質(zhì)體是可用于臨床的疫苗，而采用100μg G17DT劑量含ISA 703的乳液(第13組)以相同方案產(chǎn)生的兔血清抗胃泌素抗體平均滴度在第42天超過10,000。
顯然，脂質(zhì)體免疫原的這種結(jié)果比以下的結(jié)果(實(shí)施例3)明顯要差。
然而，脂質(zhì)體制劑在注射部位能非常好地耐受，不產(chǎn)生可見的組織反應(yīng)。因?yàn)檫@較油包水乳劑免疫有所改進(jìn)，故以較高抗加載量測(cè)試了脂質(zhì)體對(duì)包裹抗原的明顯保護(hù)作用。如下述實(shí)施例所證實(shí)，給予較大量的水溶性免疫原(1-3mg/每劑)獲得了臨床上有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)而無明顯的組織反應(yīng)。
實(shí)施例3G17DT脂質(zhì)體如以上實(shí)施例2所示，當(dāng)以MontanideISA 703(“ISA 703”)修飾的乳劑給予時(shí)通常相當(dāng)有效的綴合物劑量，當(dāng)包裹在脂質(zhì)體中時(shí)就不夠有效。然而，給予數(shù)量級(jí)更高劑量的脂質(zhì)體包裹的G17DT(分布在大量顆粒中)提供了效果。如下所述。不論劑量的多少，只見到極低的組織反應(yīng)原性。此外，發(fā)現(xiàn)分開注射給予的細(xì)胞因子IL-2的免疫調(diào)節(jié)作用明顯增強(qiáng)了抗體應(yīng)答。
因此，用此實(shí)施例來評(píng)價(jià)用上述脂質(zhì)體配制的高劑量hG17DT(1.5mg或3mg)和或不和IL-2(脂質(zhì)體中的劑量為0、1,000、10,000或100,000cu)在一系列分開的注射中的免疫原性和局部耐受性。將此制劑的效果與作為對(duì)照的含G17DT的緩沖鹽水(PBS)制劑(1.5或3.0mg每劑)，以及含G17DT綴合物的MontanideISA 703乳劑(0.2ml乳液中含100μg，每劑)作比較。
具體說，用包裹在脂質(zhì)體中的G17DT免疫原和IL-2添加劑免疫13組家兔(n＝4，每組)。肌肉內(nèi)(i.m)注射1.0ml體積(1-11組)或皮下(s.c)注射2.0ml體積(12組)。第1組動(dòng)物第1次注射100μg G17DT含ISA 703，第2和3次注射1.5mg G17DT脂質(zhì)體(無IL-2)。第1和13組i.m注射0.2ml體積的ISA 703乳劑，各只家兔i.m注射0.1ml體積的IL-2制劑(除1、10、11和13組外的所有組)。在0、28和56天給予一系列3次注射。處理的84天中每隔14天收集血清樣品時(shí)，所有的家兔進(jìn)行麻醉并對(duì)注射部位的反應(yīng)打分。每組取2只家兔作活組織檢查顯微鏡觀察。
用ELISA直接結(jié)合試驗(yàn)方法測(cè)定了抗G17抗體反應(yīng)，其中結(jié)合于包被了胃泌素靶抗原孔的抗體，用抗-抗體酶標(biāo)復(fù)合物加酶底物直接檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)程序G17DT免疫原制劑從以下組分制備由G17DT免疫原和IL-2的不同配方組成的測(cè)試物質(zhì)1.hG17DThG17(1-9)pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys綴合于免疫原性載體(序列表中的SEQ ID NO18)；2.磷酸緩沖鹽水(PBS)
；3.MontanideISA 703(Seppic；Paris，F(xiàn)rance)；4.DMPChG17DT脂質(zhì)體；5.DMPC/DMPG細(xì)胞因子脂質(zhì)體；6.IL-2∶3×106cu貯存液；和7.無菌鹽水0.9％NaCI，用雙蒸水配，通過0.2μm針筒濾器過濾。
按美國(guó)專利5,468,494中所述方法制備hG17DT免疫原，該方法納入本文作參考。
測(cè)試制劑無菌配制組合的G17DT免疫原和IL-2添加劑見表A。對(duì)于所有脂質(zhì)體和IL-2制劑，將適當(dāng)體積的滅菌鹽水以100微升遞增量加入到各小瓶中，加入之間強(qiáng)烈震蕩。以70∶30(油∶水相，wt∶wt)比率用標(biāo)準(zhǔn)的手工混合方法制備ISA 703乳劑。用PBS作為稀釋液制備水相。將測(cè)試物質(zhì)分裝在針筒內(nèi)冰箱(2-8℃)保存至使用。
體外方法該研究中采用成年無特定病原體未交配過的雌性新西蘭白兔。給家兔分組(n＝4)并如表B所示用G17DT免疫原接種。按所示劑量體積于0、28和56天每只家兔注射3次。按標(biāo)準(zhǔn)方案在后肢作肌肉內(nèi)(i.m)或皮下(s.c)注射，第一次注射右后腿，第2次注射左后腿，第3次在右后腿比第1次注射部位較高處注射。在注射部位刺花紋便于后面的鑒定。
為了評(píng)估免疫原性，從每隔14天直到84天獲得麻醉后的各只家兔的血樣品，制取血清。用18號(hào)針頭從耳邊緣靜脈收集血液(每次15ml)，存放在2-8℃過夜使凝塊收縮。然后離心(400g)樣品用移液器取出血清，分成單個(gè)樣品凍存在-10℃至-25℃直到測(cè)試。
抗體試驗(yàn)用ELISA測(cè)定血清中的抗胃泌素抗體滴度。測(cè)定測(cè)試日0、14、28、42、56、70和84天收集血清中的抗體。
粗略病理學(xué)檢查所有試驗(yàn)動(dòng)物于第84天作注射部位的粗略病理學(xué)檢查。注射部位位于刺花紋處，翻轉(zhuǎn)皮膚完全暴露肌肉，通過各注射部位的肌肉作完全的橫切口。肉眼評(píng)價(jià)組織的粗略病理學(xué)變化，評(píng)分0-3分，0分表明組織看來正常，3分表明整個(gè)組織注射部位存在廣泛的炎癥反應(yīng)。1分和2分代表局部反應(yīng)為水平中等。
顯微鏡病理學(xué)觀察粗略病理學(xué)檢查評(píng)分后，隨機(jī)選擇每個(gè)處理組二只家兔作顯微鏡病理學(xué)觀察。用手術(shù)刀切取2-2.5cm長(zhǎng)度的股四頭肌并立即將組織標(biāo)本浸在最小體積25ml的福爾馬林緩沖液中。將各樣品分置小瓶中用福爾馬林固定最少24小時(shí)。石蠟包埋后，切成5微米厚切片，固定，蘇木精伊紅染色，對(duì)各小瓶樣品作顯微鏡檢查進(jìn)行活檢組織區(qū)域的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。表C給出了實(shí)施例3的各組織學(xué)評(píng)分和評(píng)分系統(tǒng)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算了各抗體滴度和對(duì)所選血液樣品分組反應(yīng)的抗胃泌素抗體滴度的平均值和中位數(shù)值，用Student T檢驗(yàn)作比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果包括B組(G17DT乳劑)的平均滴度見表D。
計(jì)算出粗略病理學(xué)觀察的注射部位反應(yīng)的平均評(píng)分。計(jì)算的平均組織學(xué)評(píng)分見表D。
免疫學(xué)結(jié)果用ELISA測(cè)定了84天體內(nèi)免疫原性試驗(yàn)過程中每組家兔產(chǎn)生的抗hG17抗體應(yīng)答反應(yīng)。平均抗體滴度見表E。圖5是該平均滴度的圖，圖6是滴度中位數(shù)的圖。
如圖5和圖6所示，用MontanideISA 703配制的輸送100μg G17DT/每劑的對(duì)照G17DT免疫原性乳劑，誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)特征是，在整個(gè)研究期間誘導(dǎo)了抗hG17抗體的高峰滴度(84天)和最強(qiáng)的持續(xù)性抗體產(chǎn)生。i.m注射脂質(zhì)體制品的家兔應(yīng)答反應(yīng)滴度較低，時(shí)間較短，第2和第3次注射后有較高的增強(qiáng)反應(yīng)。然而，給予測(cè)試家兔組2、3、7、9和12的幾種脂質(zhì)體制劑誘導(dǎo)了超過10,000的持久性滴度。組1的峰滴度出現(xiàn)在第3次注射后，統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著高于i.m注射脂質(zhì)體的組(組2-8)，例外是組4和6。組4和組6(3.0mg G17DT，OIL-2)的應(yīng)答反應(yīng)特征是，峰平均滴度的標(biāo)準(zhǔn)差相對(duì)較低，與組1對(duì)照相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
組2(1.5mg，無IL-2)和組6(3.0mg，無IL-2)反應(yīng)平均峰值之間無顯著差異，表明G17DT劑量從1.5mg增加到3.0mg不能提高免疫原性。其它二個(gè)試驗(yàn)組，包括組1(第一次注射乳劑，第二和第三次注射1.5mg G17DT脂質(zhì)體制品)和組2(s.c.注射脂質(zhì)體)誘導(dǎo)的應(yīng)答抗體滴度大約等于組13對(duì)照，雖然應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)更接近類似于i，m脂質(zhì)體組。組12第3次注射后未測(cè)得滴度增高；雖然從第56天到研究結(jié)束時(shí)平均抗體水平較為穩(wěn)定，這提示第三次劑量可產(chǎn)生持久的抗體。如所預(yù)計(jì)的那樣，組9和10分別對(duì)PBS配的抗原高劑量1.5mg和3.0mg G17DT溶液呈低反應(yīng)。
如表4所顯示，在1.5mg G17DT劑量水平時(shí)，IL-2不明顯影響抗體水平。在3.0mg劑量時(shí)，只有組8(10,000cu IL-2)與組6(無IL-2)顯著不同；然而綴合物該劑量時(shí)，接受二種更高劑量的IL-2的組8和9抗體滴度比IL-2低劑量的組7和無IL-2的組6要高。這些資料提示添加給予10,000-100,000cu的刺激性IL-2增強(qiáng)了3.0mg G17DT的免疫原性。
第84天肉眼觀察所有家兔評(píng)估注射部位的反應(yīng)等級(jí)。如數(shù)據(jù)所示，除組13(皮下)和組13(標(biāo)準(zhǔn)乳液制劑)外所有組注射部位反應(yīng)很小。這二組第3次免疫原原注射部位評(píng)分＞1的組12有2/4只動(dòng)物，組13有1/4只動(dòng)物。組1-11中，觀察到IL-2注射的14/96處部位(15％)反應(yīng)評(píng)分最低0.5分。這些組中注射免疫原的部位大多數(shù)(66％)評(píng)分為0.5分(87/132處)，33％為0分(43/132處)。因此觀察評(píng)估表明，當(dāng)i.m給予時(shí)脂質(zhì)體制劑能被很好耐受。
顯微鏡病理學(xué)觀察表D顯示第84天時(shí)的組織病理學(xué)評(píng)估平均結(jié)果。注射部位活檢樣品的顯微鏡病理學(xué)觀察一般按照粗略肉眼觀察評(píng)價(jià)結(jié)果而定，最高分是注射ISA 703配制的免疫原處，或皮下給予免疫原處。注射免疫原處比IL-2處評(píng)分略高。注射脂質(zhì)體部位顯示有炎癥，有幾處(6處)為中等到明顯鈣化和/或肌纖維顯著損傷(4處，也有鈣化)。組13的肌肉肉反應(yīng)評(píng)分是油包水乳劑的典型評(píng)分。然而，組1第124號(hào)家兔部位1的2.5分對(duì)于給藥首次注射部位第84天后的評(píng)分有點(diǎn)異常。發(fā)現(xiàn)皮下給予脂質(zhì)體的組12評(píng)分較高。應(yīng)注意肉眼和組織學(xué)反應(yīng)評(píng)分系統(tǒng)相互是獨(dú)立和不相關(guān)的。通常組織學(xué)反應(yīng)評(píng)分高于肉眼評(píng)分。因此脂質(zhì)體引起的肌肉炎癥顯著少于油包水乳劑。
結(jié)論實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比率(500∶1)配制的、在大量MLV中含1.5和3.0mg G17DT的脂質(zhì)體，經(jīng)i.m注射誘導(dǎo)的抗hG17抗體水平，大約是含Montanide ISA 703的強(qiáng)乳劑疫苗所誘導(dǎo)的25％，其臨床效果已足夠高。同時(shí)盡管顯著提高了疫苗劑量所觀察到的組織反應(yīng)原性極低。1.5和3.0mg劑量的制劑免疫原性相同。添加給予10,000-100,000cu的IL-2與脂質(zhì)體混合提高了3.0mg劑量的免疫原性，而IL-2對(duì)1.5mg劑量的免疫原性無影響。皮下注射3.0mg免疫原劑量顯著增強(qiáng)了免疫原性，如同組1中第1次用Montanide乳劑然后用1.5mg脂質(zhì)體加強(qiáng)那樣。免疫原高含量的脂質(zhì)體制劑i.m注射后反應(yīng)原性顯著低下，但s.c注射則不低。這些結(jié)果表明，G17PT的高蛋白質(zhì)脂質(zhì)體制劑與免疫原劑量約1/10的montanide ISA703乳劑相當(dāng)，但反應(yīng)原性顯著降低，同時(shí)提供了有效的免疫原性。
表A免疫原制劑
表B家兔疫苗劑量分組
’＝分開注射IL-21小瓶＝1mlMLV＝脂質(zhì)體表C(實(shí)施例3)第84天注射部位的反應(yīng)評(píng)分
表D(實(shí)施例3)第84天注射部位的組織學(xué)平均評(píng)分
**有中等至顯著的鈣化##鑒定到肌肉纖維的顯著損傷組織病理學(xué)評(píng)分0-0.5無炎癥或其它組織病理學(xué)異常1.0-1.5輕度急性或局部慢性炎癥2.0-2.5中等急性或慢性炎癥3.0嚴(yán)重的急慢性炎癥表E(實(shí)施例3)家兔血清抗胃泌素抗體應(yīng)答反應(yīng)
實(shí)施例4低劑量GnRH與無乳劑GnRH的比較初步實(shí)驗(yàn)比較了脂質(zhì)體GnRHDT疫苗和油包水乳劑GnRH疫苗的原性和免疫原性。GnRHDT綴合物(即D17DT)包裹在脂質(zhì)體水懸液中，綴合物劑量為100-1000μg蛋白質(zhì)。分別在0、14和42天i.m.注射雌兔測(cè)試GnRH疫苗，與包有相同劑量的GnRHDT乳劑疫苗作比較。
從0-70天每隔14天收集家兔血清，用ELISA測(cè)定抗-GnRH抗體滴度。發(fā)現(xiàn)i.m.注射脂質(zhì)體輸送100μg/0.2ml體積在3次注射后第70天誘導(dǎo)了2,004的平均峰值滴度。觀察的所有其它血清樣品顯示582的平均峰值滴度，表明誘導(dǎo)2,000滴度至少需要需要注射3次。然而此抗體滴度不能持久，在達(dá)到峰值后不久即顯著降低。
免疫原綴合物的劑量倍增到200μg/0.4ml脂質(zhì)體維持平均滴度2,005到第70天。已發(fā)現(xiàn)提高劑量在第2次注射后14天評(píng)估時(shí)，能更有效地誘導(dǎo)平均768的滴度，而100μg/0.2ml劑量?jī)H誘導(dǎo)了166的低滴度。進(jìn)一步提高劑量，如500μg/1.0ml和1000μg/1.0ml抗原分別在第56天誘導(dǎo)了2,962和3,494的平均滴度，第70天分別下降至2,133和2,889。因此這些應(yīng)答反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短，對(duì)脂質(zhì)體免疫的抗體應(yīng)答從28天-42天-56天-79天顯著下降。然而看來提供綴合物劑量可導(dǎo)致抗-GnRH抗體應(yīng)答的增強(qiáng)。
雖然提高GnRHDT綴合物脂質(zhì)體的劑量到1mg/ml顯示了所需的低反應(yīng)原性，但免疫應(yīng)答仍達(dá)不到充分中和GnRH活性(免疫滅活)所需的誘導(dǎo)5000以上滴度抗體的域值。
實(shí)施例5GnRHDT(即D17DT)如以下所述，進(jìn)行了一實(shí)驗(yàn)來評(píng)估在脂質(zhì)體中加入較高劑量D17DT形式的GnRHDT時(shí)，對(duì)其免疫原性和反應(yīng)原性的影響。此項(xiàng)研究也調(diào)查了與脂質(zhì)體分開注射給予IL-2的免疫調(diào)節(jié)作用。如實(shí)施例4中所述的研究已證明脂質(zhì)體疫苗制品能克服用提高的乳劑疫苗劑量免疫動(dòng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)原性增加(料施例4)的問題。
含劑量100μg和200μg GnRHDT用Montanide ISA 703配制的乳劑在大多數(shù)情況下對(duì)于臨床上有效的免疫是足夠的，雖然一般會(huì)引起較重的組織反應(yīng)。然而，有時(shí)需要提高乳劑劑量到500μg-1000μg/0.2ml-0.5ml注射體積。發(fā)現(xiàn)提高劑量也增加了受治療患者發(fā)生更嚴(yán)重的組織反應(yīng)。因此，對(duì)于反應(yīng)原性設(shè)立了200μg/0.2ml的劑量限制，需要更加改進(jìn)的方法。
發(fā)現(xiàn)采用脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比率時(shí)，脂質(zhì)體能包裹大量的免疫原，其水溶性蛋白質(zhì)分布在大量小小泡中。本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了用高脂質(zhì)比率配制的大劑量(1.5mg或3.0mg)GnRHDT(即D17DT)，當(dāng)與和不與IL-2(0、1,000；10,000或100,000cu量)分開注射的免疫效果。這些制劑按實(shí)施例1中抽述方法制備，與含有GnRHDT的PBS水溶液制劑(1.5或3.0mg綴合物，0.2ml體積)以及含GnRHDT(100μg/0.2ml)的MontanideISA 703乳劑相比較(見表1小結(jié))。13組，每組4只家兔用GnRHDT免疫原和IL-2添加劑免疫(見表2)。組1-9肌肉內(nèi)注射(i.m.)1.0ml體積的脂質(zhì)體，組12皮下注射(s.c.)0.2ml體積。組1第1次注射接受100μg能力GnRHDT，ISA 703，第2和第3次注射1.5mg GnRHDT的MLV脂質(zhì)體(無IL-2)。對(duì)照組1和13i.m.注射0.2ml體積的ISA 703乳劑疫苗。組2-9和12在其接受免疫原的同一天i.m.注射0.1ml體積的IL-2制劑。組10和11分別注射PBS水溶液配制的1.5和3.0mg GnRHDT綴合物。第0、28和56天進(jìn)行注射。84天中每隔14天收集血清樣品，對(duì)注射部位的反應(yīng)作肉眼觀察評(píng)分，每組取二只動(dòng)物的活檢組織作顯微鏡檢查。用ELISA測(cè)定抗-GnRH抗體應(yīng)答G(表3)。
此實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)顯示，脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比率的脂質(zhì)體制劑作為載體，在i.m.或.s.c.(只是3.0mg)注射家兔后輸送1.5mg和3.0mg GnRHDT，可誘導(dǎo)抗-GnRH抗體應(yīng)答(見圖7和圖8)。劑量反應(yīng)顯示3.0mg綴合物的免疫原性比1.5mg高。然而，3.0mg劑量不加IL-2誘導(dǎo)了比對(duì)照Monitanide ISA 703免疫原乳劑更高的抗-GnRH抗體滴度。令人驚奇的是，脂質(zhì)體的免疫原性不因添加注射IL-2而增強(qiáng)；事實(shí)上，在3.0mg劑量時(shí)，IL-2甚至降低了應(yīng)答反應(yīng)。
與i.m.給予脂質(zhì)體制劑相比，組12中s.c.給予3.0mg劑量顯著增強(qiáng)了免疫原性，而初次免疫家兔用Montanide制劑(組1)后用1.5mg脂質(zhì)體(GnRH，MLV)加強(qiáng)只顯示略微提高的滴度。注射脂質(zhì)體制劑的局部肌肉組織反應(yīng)原性，與對(duì)照montanide ISA703免疫原乳劑相比，顯著下降。抗體應(yīng)答類似于乳劑對(duì)照，包括3.0mg i.m.不加IL-2T和3.0mg s.c.注射組，同時(shí)組織學(xué)評(píng)分均較低，觀察平分較差。相反，采用GnRHDT的高蛋白PBS溶液治療在肌肉中不引起組織強(qiáng)反應(yīng)，而抗-GnRH抗體滴度低至無效。
以上結(jié)果證明，配制的含數(shù)量級(jí)較高劑量GnRHDT的多室性脂質(zhì)體制劑，就免疫原性和反應(yīng)原而言，比Montanide ISA 703 GnRHD免疫原乳劑為優(yōu)。
實(shí)驗(yàn)程序GnRHDT免疫原配制測(cè)試物質(zhì)由不同的GnRHDT免疫原制劑和IL-2組成，它們由以下組分配制1.GnRHDTGnRH(1-10)Ser-1-DT，也稱為D17DT；2.磷酸緩沖鹽水(PBS)
；3.MontanideISA 703(Seppic；Paris，F(xiàn)rance)；4.DMPCGnRHDT脂質(zhì)體；5.IL-2或其它細(xì)胞因子的DMPC/DMPG脂質(zhì)體；6.IL-2∶3×106cu；和7.無菌鹽水0.9％NaCI，用雙蒸水配，通過0.2μm針筒濾器過濾。
測(cè)試制劑在清潔條件下配制GnRHDT免疫原和IL-2I添加劑的不同組合，見表1。為了懸浮脂質(zhì)體將適當(dāng)體積的滅菌鹽水以100微升遞增量加入到各小瓶中，加入之間強(qiáng)烈震蕩。將調(diào)節(jié)劑IL-2溶于無菌鹽水與DMPC/DMPG脂質(zhì)體混合至適當(dāng)濃度的IL-2。以70∶30(油∶水相，wt∶wt)比率用標(biāo)準(zhǔn)的手工混合方法制備ISA 703乳劑。用PBS作為稀釋液制備水相。將測(cè)試物質(zhì)分裝在針筒內(nèi)冰箱(2-8℃)保存至使用。
體外方法該研究中采用52只成年無特定病原體未交配過的雌性新西蘭白兔。給家兔分組(n＝4)并用GnRHDT-免疫原接種。按ge 2所示劑量體積于0、28和56天每只家兔注射3次。按標(biāo)準(zhǔn)方案在后肢作肌肉內(nèi)或皮下注射，第一次注射右后腿，第2次注射左后腿，第3次在右后腿比第1次注射部位較高處注射。在注射部位剌花紋便于后面的鑒定。
為了評(píng)估免疫原性，每隔14天直到84天從麻醉后的各只家兔獲得血樣品，制取血清。用18號(hào)針頭從耳邊緣靜脈收集血液(每次15ml)，存放在2-8℃過夜使凝塊收縮。然后離心(400g)樣品用移液器取出血清，分成單個(gè)樣品凍存在-10℃至-25℃直到測(cè)試。
抗體試驗(yàn)用ELISA測(cè)定血清中的抗-GnRH抗體滴度。測(cè)定測(cè)試日0、14、28、42、56、70和84天收集血清中的抗體。
粗略病理學(xué)檢查如實(shí)施例3中所述，評(píng)估所有家兔第84天時(shí)注射部位的粗略病理學(xué)變化。
顯微鏡病理學(xué)檢查粗略病理學(xué)評(píng)分后，隨機(jī)選擇每組二只家兔作顯微鏡病理學(xué)觀察。用手術(shù)刀切取2-2.5cm長(zhǎng)度的股四頭肌并立即將組織標(biāo)本浸在最小體積25ml的HistochoiceTM中。將各樣品分置小瓶中在該溶液中固定最少24小時(shí)，作組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。
結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算了各組(表3)和報(bào)選血樣的抗GnRH抗體滴度的平均值和中位數(shù)值及及反應(yīng)，用Student T檢驗(yàn)作比較。計(jì)算了第84天粗略病理學(xué)觀察的注射部位反應(yīng)平均評(píng)分，結(jié)果見表4。計(jì)算的平均組織學(xué)評(píng)分見表5。
免疫學(xué)結(jié)果用ELISA測(cè)定了84天體內(nèi)試驗(yàn)過程中每組家兔產(chǎn)生的抗GnRH抗體應(yīng)答反應(yīng)。抗體滴度的中位數(shù)和平均值見表3。圖7是該平均滴度的圖，圖8是滴度中位數(shù)的圖。
如圖7和圖8所示，用MontanideISA 703配制的輸送100μg GnRHDT/每劑的對(duì)照GnRHDT免疫原性制劑，在第70天誘導(dǎo)了抗-GnRH抗體的高峰滴度。i.m注射脂質(zhì)體制品的家兔(組2-9)應(yīng)答反應(yīng)滴度一般低于乳劑對(duì)照所誘導(dǎo)的；然而，但該滴度在臨床上有效，足夠降低或中和免疫動(dòng)物中的GnRH。對(duì)于此總體結(jié)果的一個(gè)例外是組6(3.0mg GnRHDT，無IL-2)其平均/中位數(shù)滴度超過對(duì)照組13。所有組的應(yīng)答反應(yīng)在每次注射后均有相應(yīng)增強(qiáng)。事實(shí)上，第3次注射后平均峰滴度值的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較表明，i.m注射二種劑量綴合物的脂質(zhì)體所誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)，不顯著低于對(duì)照Montanide/免疫原乳劑(組13)的反應(yīng)。
通常輸送3.0mg劑量GnRHDT的脂質(zhì)體免疫原性比1.5mg劑量的高(圖2)。當(dāng)考慮到中和GnRH生物活性從而導(dǎo)致不生育或抑制類固醇性腺激素的合成，需要的應(yīng)答反應(yīng)抗體滴度時(shí)，這特別有關(guān)。先前Aphton的研究表明5,000滑翔度可使家兔不能生育。如圖2所示，用3.0mg GnRHDT劑量i.m.免疫家兔(組2-9)看來比用1.5mg劑量免疫有家兔誘導(dǎo)了更快更持久的有效抗體滴度。這種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余二試驗(yàn)組1和12產(chǎn)生的抗-GnRH應(yīng)答超過所有其它脂質(zhì)體組，除組6外。組12(3mg GnRHDT，s.c.)是本研究中應(yīng)答最高的組，提示皮下注射途徑對(duì)于脂質(zhì)體制劑是更可行的誘導(dǎo)抗體高滑翔度的途徑。如預(yù)期的那樣，分別注射1.5mg和3.0mg G17DT的PBS溶液的第9組只誘導(dǎo)了低反應(yīng)。
細(xì)胞因子IL-2與1.5mg GnRHDT組合不顯著影響抗體水平。3.0mg劑量而無IL-2的組6產(chǎn)生的滴度顯著高于其它i.m.注射3.0mg脂質(zhì)體制劑的組7、8和9。然而，組7-9之間的反應(yīng)無顯著差異。這些資料提示家兔起鶻落中脂質(zhì)體輸送的免疫原性不因加入IL-2而增強(qiáng)。
如表4提供的數(shù)據(jù)所示，所有組注射部位的反應(yīng)均很小，評(píng)分不超過1.0。雖然組13動(dòng)物(對(duì)照乳劑)在第3次免疫原注射部位的評(píng)分均為1.0分，但脂質(zhì)體組1、7、9和12各只有一只家兔第3次注射部位為1.0分。i.m.脂質(zhì)體注射部位大多數(shù)(74％)為0.5分，23％為0.1分。此外，免疫原性佐劑能被很好耐受，88％為0分。因此，肉眼評(píng)分表明i.m.注射脂質(zhì)體制劑能被很好耐受。
顯微鏡病理學(xué)觀察(表5)注射部位活檢樣品的顯微鏡病理學(xué)觀察一般按照粗略肉眼觀察評(píng)價(jià)結(jié)果而定，最高分是注射ISA 703配制的免疫原部位。組13中所見到的肌肉反應(yīng)評(píng)分與采用MontanideISA 703制劑通常觀察到的相一致。當(dāng)免疫原經(jīng)s.c.給予時(shí)(組12)獲得的評(píng)分略低于乳劑所引起的。家兔起鶻落對(duì)i.m.注射(組6)。幾乎氖其它i.m.注射脂質(zhì)體的部位炎癥反應(yīng)都最小。注射免疫原的部位傾向于評(píng)分略高于注射IL-2的部位，后者通常顯示幾乎沒有炎癥跡象除組6和9有一處外。應(yīng)注意肉眼和組織學(xué)反應(yīng)評(píng)分系統(tǒng)相互是獨(dú)立和不相關(guān)的。通常組織學(xué)反應(yīng)評(píng)分高于肉眼評(píng)分?？傊@些評(píng)價(jià)表明，盡管增加了注射體積，脂質(zhì)體看來引起的肌肉炎癥顯著少于油包水乳劑。
結(jié)論實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以脂質(zhì)/蛋白質(zhì)重量比率500∶1配制的、SK在大量較小脂類顆粒中輸送1.5和3.0mg GnRHDT的脂質(zhì)體，經(jīng)i.m或s.c.(3.0mg)注射家兔后誘導(dǎo)了抗GnRH抗體應(yīng)答。劑量反應(yīng)證明3.0mg綴合物比1.5mg誘導(dǎo)了更高的免疫力。令人奇怪的是3.0mg劑量不添加IL-2誘導(dǎo)了比Montanide ISA 703gjq y，rrym3-GnRH滴度。因此，添加注射IL-2不能增強(qiáng)免疫原性；事實(shí)上，在3.0mg劑量時(shí)，IL-2甚至?xí)档蛻?yīng)答反應(yīng)。與脂質(zhì)蛋白質(zhì)高比第的脂質(zhì)體制劑相比，不論它們是通過i.m還是s.c.給予3.0mg劑量都能顯著增強(qiáng)免疫原性，而用montanide制劑初免疫，然后用1.5mg脂質(zhì)體加強(qiáng)，只略為提供了滴度。盡管增加了疫苗的劑量體積，脂質(zhì)體制劑的反應(yīng)原性比劑量低得多的GnRHDTMontanide ISA 703乳劑對(duì)照顯著要低。因此，注射部位的組織學(xué)評(píng)分較低，它們的肉眼觀察評(píng)分比乳劑對(duì)照要好，雖然抗體應(yīng)答反應(yīng)與乳劑對(duì)照相當(dāng)。這些結(jié)果表明，劑量高達(dá)3.0mg GnRHD、以脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比率配制的脂質(zhì)體制劑比用montanide ISA 703乳劑配制的免疫原要好，基反應(yīng)原性顯著降低甚至消失，仍能產(chǎn)生有效的抗-GnRH抗體滴度。另外，本研究證明，細(xì)胞因子刺激患者免疫系統(tǒng)的潛在毒性作用可通過采用從該組合物或治療中刪去細(xì)胞因子或類似制劑的本發(fā)明脂質(zhì)體疫苗得以避免。
表1免疫制劑(實(shí)施例5)
表2家兔劑量分組(實(shí)施例5)
1小瓶＝1ml’＝分開注射表3家兔抗GnRH抗體應(yīng)答反應(yīng)(實(shí)施例5)
表4第84天注射部位的平均反應(yīng)評(píng)分(實(shí)施例5)
表5第84天天注射部位的組織學(xué)平均評(píng)分(實(shí)施例5)
**有中等至顯著的鈣化組織病理學(xué)評(píng)分0-0.5無炎癥或其它組織病理學(xué)異常1.0-1.5輕度急性或局部慢性炎癥2.0-2.5中等急性或慢性炎癥3.0嚴(yán)重的急慢性炎癥實(shí)施例6G17DT-脂質(zhì)體的最優(yōu)脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例和水合溶液如以上實(shí)施例3所示，高訪日劑量綴合物當(dāng)包裹在脂質(zhì)體中有效。為進(jìn)一步優(yōu)化G17DT脂質(zhì)體的免疫原性，我們進(jìn)行了此實(shí)施例中所述的實(shí)驗(yàn)，其中以不同的脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例配制G17DT脂質(zhì)體以確定最佳脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例。另外，我們測(cè)試了二種水合液，包括水和含5％乙醇的水，以測(cè)定它們對(duì)免疫原性和和注射部位反應(yīng)原性的影響。
因此，本實(shí)施例評(píng)價(jià)了如上述DMPC脂質(zhì)體那樣配制的但脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例為50∶1、100∶1、150∶1和300∶1的含高劑量hG17DT(1.5、3.0或4.5mg)脂質(zhì)體疫苗的免疫原性和局部耐受性。將該制劑的效果與作為對(duì)照的含G17DT綴合物(100μg/0.2ml)MontanideISA 703乳劑作比較。
脂質(zhì)體水合是制備可可注射制劑的最后一步。通常將水合液以一系列等份加到凍干脂質(zhì)中(蛋白質(zhì)可與脂質(zhì)一起或以水溶液凍干)，每次加入水合液后旋渦振蕩混合。通常采用注射用水(WFI)。我們也嘗試了加有5％乙醇的WFI(EtOH)，它有提高脂質(zhì)體水合的優(yōu)點(diǎn)。
具體說，用包裹在脂質(zhì)體中的G17DT免疫原免疫8組家兔(每組n＝6)。肌肉內(nèi)i.m.注射1.0ml體積的脂質(zhì)體，每個(gè)注射日注射0.5ml二處(組1-7)。組8動(dòng)物肌內(nèi)注射100μg G17DT/0.2mlMontanideISA 703。于0、28和56天給予一系列3次注射。84天治療期間每隔14天麻醉所有家兔收集血清樣品并給注射部位的反應(yīng)打分。顯微鏡檢查每組2動(dòng)物的活檢組織樣品。
用ELISA直接結(jié)合試驗(yàn)方法測(cè)定抗G17抗體應(yīng)答反應(yīng)。用抗-抗體酶標(biāo)復(fù)合物和酶底物間接法檢測(cè)與包被的胃泌素靶抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)驗(yàn)程序G17DT免疫原制劑從以下組分制備由G17DT免疫原的不同配方組成的測(cè)試物質(zhì)1.hG17DThG17(1-9)pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys綴合于免疫原性載體(序列表中的SEQ ID NO18)；2.磷酸緩沖鹽水(PBS)
；3.MontanideISA 703(Seppic；Paris，F(xiàn)rance)；4.DMPChG17DT脂質(zhì)體；7.注射用水(WFI)；8.含體積5％乙醇的WFI(WFI/5％EtOH)按美國(guó)專利5,468,494中所述方法制備hG17DT免疫原，該方法納入本文作參考。
測(cè)試制劑無菌配制組合的G17DT免疫原見表I。對(duì)于所有脂質(zhì)體制劑，將適當(dāng)體積的滅菌WFI或WFI/5％EtOH以100微升遞增量加入到各小瓶中，加入之間強(qiáng)烈震蕩。以70∶30(油∶水相，wt∶wt)比率用標(biāo)準(zhǔn)的手工混合方法制備ISA 703乳劑。用PBS作為稀釋液制備水相。將測(cè)試物質(zhì)分裝在針筒內(nèi)冰箱(2-8℃)保存。
體外方法該研究中采用成年無特定病原體未交配過的雌性新西蘭白兔。給家兔分組(n＝6)并如表I所示用G17DT免疫原接種。3個(gè)注射日每次注射，將總劑量1.0ml分成2個(gè)0.5ml注射。于0、28和56天給家兔注射3次。按標(biāo)準(zhǔn)方案在后肢(每只后肢0.5ml)作肌肉內(nèi)(i.m)注射。對(duì)照家兔用Montanide ISA 703 G17DT乳化免疫原免疫，在0-28-56天，于后腿，右-左-右交替每次注射免疫原0.2ml。
為了評(píng)估免疫原性，從每隔14天直到84麻醉后獲得各只家兔的血樣品，制取血清。用18號(hào)針頭從耳邊緣靜脈收集血液(每次15ml)，存放在2-8℃過夜使凝塊收縮。然后離心(400g)樣品用移液器取出血清，分成單個(gè)樣品凍存在-10℃直到試驗(yàn)。
抗體試驗(yàn)用ELISA測(cè)定血清中的抗胃泌素抗體滴度，數(shù)據(jù)見表II。測(cè)定測(cè)試日0、14、28、42、56、70和84天收集血清中的抗體。
粗略病理學(xué)檢查所有試驗(yàn)動(dòng)物于第84天作注射部位的粗略病理學(xué)檢查。注射部位位于剌花紋處，翻轉(zhuǎn)皮膚完全暴露肌肉，通過各注射部位的肌肉作完全的橫切口。肉眼評(píng)價(jià)組織的粗略病理學(xué)變化，評(píng)分0-3分，0分表明組織看來正常，3分表明整個(gè)組織注射部位存在廣泛的炎癥反應(yīng)。1分和2分代表局部反應(yīng)為水平中等。圖6和表II給出了各粗略病理學(xué)檢查的評(píng)分。
顯微鏡病理學(xué)觀察粗略病理學(xué)檢查評(píng)分后，隨機(jī)選擇每個(gè)治療組二只家兔作顯微鏡病理學(xué)觀察。用手術(shù)刀切取i.m.注射部位2-2.5cm長(zhǎng)度的股四頭肌并立即將組織標(biāo)本浸在最小體積25ml的福爾馬林緩沖液中。將各樣品分置小瓶中用福爾馬林固定最少24小時(shí)。石蠟包埋后，切成5微米厚切片，固定，蘇木精伊紅染色，對(duì)各小瓶樣品作顯微鏡檢查進(jìn)行活檢組織區(qū)域的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。表IV給出了實(shí)施例6的各組織學(xué)評(píng)分和評(píng)分系統(tǒng)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算了各抗體滴度和對(duì)分組反應(yīng)的抗胃泌素抗體滴度的平均值和中位數(shù)值(表II)，用Student T檢驗(yàn)比較各組之間抗體滴度的峰平均值(P＜0.05)。
計(jì)算出粗略病理學(xué)觀察的注射部位反應(yīng)R平均評(píng)分。計(jì)算的平均組織學(xué)評(píng)分別見表、III和IV。
免疫學(xué)結(jié)果用ELISA測(cè)定了84天體內(nèi)免疫原性試驗(yàn)過程中每組家兔產(chǎn)生的抗hG17抗體應(yīng)答反應(yīng)。單個(gè)、平均和中位數(shù)抗體滴度見表B。圖0是該平均滴度的圖，圖10是滴度中位數(shù)的圖。
如圖9和圖10所示，用MontanideISA 703配制的輸送100μg G17DT/每劑的對(duì)照G17DT免疫原性乳劑，誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)類似于脂質(zhì)體制劑所誘導(dǎo)的，直到第84天ISA 703的反應(yīng)升高到脂質(zhì)體反應(yīng)的二倍。與之相比較，i.m.注射脂質(zhì)體制劑的家兔反應(yīng)滴度較低，傾向于時(shí)間更短，第2次和第3次注射后有較高的增強(qiáng)反應(yīng)。然而所有的脂質(zhì)體制劑誘導(dǎo)了超過10,000的持久性滴度。組191.5mg G17DT，450mgDMPC，用WFI/5％EtOH水合)的反應(yīng)特別穩(wěn)定，從本研究過程中的42天到84天有持久的抗體產(chǎn)生。此制劑是脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)＝1∶300比例(wt∶wt)，用WFI/5％EtOH水合特別有效。
組8和脂質(zhì)體各組反應(yīng)的平均峰值之間無顯著差異，但組4例外(p＝0.096)，表明脂質(zhì)體免疫原有效。用WFIT WFI/5％EtOH水合制備的脂質(zhì)體特別有效。但注意到用WFI/5％EtOH水合的脂質(zhì)體粘度升高，這可提高其長(zhǎng)效免疫的效果達(dá)到所需的抗體產(chǎn)生穩(wěn)定水平。組1的抗體應(yīng)答反應(yīng)提供了這種例子。
第84天肉眼觀察所有家兔評(píng)估注射部位的反應(yīng)等級(jí)。如數(shù)據(jù)所示，除組8(標(biāo)準(zhǔn)乳液制劑)外所有組注射部位反應(yīng)很小。組8的6只動(dòng)物中有2只第3次免疫原注射部位評(píng)分＞1。組1-7在觀察的252處部位反應(yīng)評(píng)分無一超過0.5分。因此觀察評(píng)估表明，當(dāng)i.m給予時(shí)脂質(zhì)體制劑能被很好耐受。
顯微鏡病理學(xué)觀察表IV顯示第84天時(shí)的組織病理學(xué)評(píng)估平均結(jié)果。注射部位活檢樣品的顯微鏡病理學(xué)觀察一般按照粗略肉眼觀察評(píng)價(jià)結(jié)果而定，最高分是第3次注射ISA 703配制的免疫原部位。幾乎所有i.m.注射脂質(zhì)體部位的炎癥反應(yīng)都最少。組8中所見的肌肉肉反應(yīng)評(píng)分是油包水乳劑的典型評(píng)分。應(yīng)注意肉眼和組織學(xué)反應(yīng)評(píng)分系統(tǒng)相互是獨(dú)立和不相關(guān)的。通常組織學(xué)反應(yīng)評(píng)分高于肉眼評(píng)分。認(rèn)為評(píng)分0.5或不到的部位無病理學(xué)變化。因此脂質(zhì)體引起的肌肉炎癥顯著少于油包水乳劑。
結(jié)論實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以脂質(zhì)/蛋白質(zhì)高比率300∶1配制的、以5％EtOH-WFI溶液水合的含1.5 G17DT的脂質(zhì)體，誘導(dǎo)了可接受滴度的持久抗hG17抗體水平。類似地，其它測(cè)試的脂質(zhì)體制劑也誘導(dǎo)了相當(dāng)水平的抗-G17抗體，雖然應(yīng)答水平不太高(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，或不如上述組那樣穩(wěn)定。然而，與Montanide ISA 703乳劑對(duì)照相比較，所有的脂質(zhì)體制劑都觀察到極低的組織反應(yīng)原性。注射部位反應(yīng)水平低表明增加注射次數(shù)有可能被接受，成為提高應(yīng)答水平同時(shí)保持注射部位反應(yīng)最少的一種方法。這些結(jié)果表明，G17DT的高蛋白質(zhì)脂質(zhì)體制劑可通過選擇有效的脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例以及在脂質(zhì)體水合液中加入5％乙醇而最優(yōu)化。
表I(實(shí)施例6)免疫原制劑
表II(實(shí)施例6)家兔抗-G17抗體應(yīng)答應(yīng)答反應(yīng)
表III(實(shí)施例6)第84天注射部位的反應(yīng)
表IV(實(shí)施例6)第84天天注射部位組織學(xué)單個(gè)和平均評(píng)分
組織病理學(xué)評(píng)分0-0.5無炎癥或其它組織病理學(xué)異常1.0-1.5輕度急性或局部慢性炎癥2.0-2.5中等急性或慢性炎癥3.0嚴(yán)重的急慢性炎癥結(jié)尾上述實(shí)施例說明了，但不意味限制，本發(fā)明具有高脂比例包裹水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)方面。本發(fā)明的有經(jīng)驗(yàn)實(shí)施者知道，可將此系統(tǒng)應(yīng)用于其它有用的物質(zhì)，如輸送水溶性細(xì)胞因子、輔因子、激素、其同類物或修飾物，來治療人類疾病或疾患難。
序列表<110>埃弗頓有限公司(Aphton Corporation)<120>脂質(zhì)體疫苗<130>1102865-0059<160>14<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>酰胺化的苯丙氨酸<400>1Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Xaa1 5 10 15<210>2<211>18<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>2Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly1 5 10 15
<210>3<211>5<212>PRT<213>人造的<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>3Xaa Gly Pro Trp Leu1 5<210>4<211>6<212>PRT<213>人造的<400>4Xaa Gly Pro Trp Leu Glu1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人造的<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>5Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu1 5
<210>6<211>8<212>PRT<213>人造的<220>
<223>人胃泌素17的氨基酸序列1-8的合成肽，連接有一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>6Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人造的<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>7Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu1 5<210>8<211>10<212>PRT<213>人造的<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>8Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu1 5 10<210>9<211>6<212>PRT<213>人造的，假設(shè)的<220>
<223>合成肽間隔區(qū)<400>9Arg Pro Pro Pro Pro Cys1 5<210>10<211>7<212>PRT<213>人造的，假設(shè)的<220>
<223>合成肽間隔區(qū)<400>10Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>人造的，假設(shè)的<220>
<223>合成肽間隔區(qū)<400>11
Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys1 5<210>12<211>22<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<400>12Xaa Leu Gly Pro Glu Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys Lys Glu1 5 10 15Gly Pro Trp Leu20<210>13<211>13<212>PRT<213>人造的<220>
<223>人胃泌素34的氨基酸序列1-6的合成肽，連接有一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<220>MOD_RES<221>
<222>(13)..(13)<223>綴合于白喉類毒素的半胱氨酸<400>13
Xaa Leu Gly Pro Glu Gly Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10<210>14<211>13<212>PRT<213>人造的<220>
<223>人胃泌素34的氨基酸序列1-6的合成肽，連接有一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>綴合于白喉類毒素的半胱氨酸<400>14Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu Leu Gly Pro Glu Gly1 5 10<210>15<211>10<212>PRT<213>人造的<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸或5’-羥脯氨酸<220>
<221>MOD_RES<222>(10)..(10)<223>酰胺化的甘氨酸或甘氨酰胺<400>15Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Xaa1 5 10<210>16
<211>35<212>PRT<213>人造的<300>
<301>美國(guó)專利4,767,842<302>對(duì)相應(yīng)于β亞基111-145序列的人絨毛膜促性腺激素C末端片段(結(jié)構(gòu)II)特異的抗-肽抗體<400>16Asp Asp Pro Arg Thr Glu Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro1 5 10 15Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln20 25 30 35<210>17<211>16<212>PRT<213>人造的<220>
<223>人絨毛膜促性腺激素的氨基酸序列138-145的合成肽，連接到一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>5’-羥脯氨酸<220>
<221>MOD_RES<222>(16)..(16)<223>半胱氨酸綴合于白喉類毒素<400>17Xaa Ser Asp Thr Pro Ile Pro Gln Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10 15<210>18<211>17
<212>PRT<213>人造的<220>
<223>胃泌素17的氨基酸序列的合成肽，連接到一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>半胱氨酸綴合于白喉類毒素<400>18Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10 15<210>19<211>17<212>PRT<213>人造的<220>
<223>GnRH氨基酸序列的合成肽，連接到一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>半胱氨酸綴合于白喉類毒素<400>19Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Xaa1 5 10 15<210>20<211>15<212>PRT
<213>人造的<220>
<223>人絨毛膜促性腺激素的氨基酸序列138-145的合成肽，連接到一間隔肽并綴合于白喉類毒素<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>半胱氨酸綴合于白喉類毒素<400>20Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種輸送水溶性物質(zhì)的可注射的脂質(zhì)體組合物，其特征在于，該組合物包含眾多脂質(zhì)與所包裹的水溶性物質(zhì)呈高重量比例的脂質(zhì)體小泡，從而實(shí)現(xiàn)高效包裹。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述包裹效率為50％以上。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述包裹效率為80％以上。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述包裹的物質(zhì)分布在眾多脂質(zhì)體小泡中。
5.如權(quán)利要求1或4所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體小泡是多室性小泡(MLV)。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述水溶性物質(zhì)包括一種以上的化合物。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述水溶性物質(zhì)選自蛋白質(zhì)、蛋白聚糖和碳水化合物。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述水溶性物質(zhì)包括疫苗。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述疫苗是針對(duì)激素或激素相關(guān)受體的疫苗。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述疫苗包含至少一種與免疫原性親水載體蛋白綴合的激素-免疫模擬肽或激素受體-免疫模擬肽。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)與包裹物質(zhì)的比例為約500-1000。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)與包裹物質(zhì)的比例為約300。
13.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中，所述免疫模擬肽選自胃泌素G-17、胃泌素G-34、GnRH和hCG的合成序列。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述合成的胃泌素G-17肽序列是SEQ IDNO1或其片段(SEQ ID NO3-8)。
15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述合成的G-34肽序列是SEQ ID NO12。
16.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述合成的GnRH免疫模擬肽序列是SEQID NO15。
17.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述合成的hCG免疫模擬肽序列是SEQID NO16。
18.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體含有能形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中，所述能形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)含有一疏水性尾部分和一極性或化學(xué)活性部分。
20.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中，所述能形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)含有烴鏈或類固醇尾基團(tuán)和一極性頭部基團(tuán)。
21.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中，所述極性頭部基團(tuán)或化學(xué)活性部分包括酸、醇、醛、胺或酯。
22.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中，所述能形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)包括磷脂。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述磷脂選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
24.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體含有至少70％摩爾百分比的雙十四烷酰磷脂酰膽堿(DMPC)。
25.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述包裹的疫苗的劑量至少約為50微克。
26.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述包裹的抗激素疫苗或抗激素受體疫苗的劑量范圍大約為0.3-5毫克。
27.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中，所述免疫模擬肽通過一間隔肽綴合于免疫原性載體。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中，所述間隔肽選自SEQ ID NO9、10和11。
29.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體分開包裹或一起包裹一水溶性免疫原和水溶性高分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。
30.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體分開包裹或一起包裹一水溶性免疫原和水溶性低分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中，所述高分子量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)包括細(xì)胞因子。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其中，所述低分子量物質(zhì)選自去甲MDP、蘇氨酰MDP、莫拉丁酯、N-乙酰葡糖胺-MDP和murametide。
33.一種無菌組合物，其含有如權(quán)利要求8-17中任何一項(xiàng)所述組合物的可注射的含水懸液。
34.一種藥物制劑，其含有治療有效量的如權(quán)利要求8-17中任何一項(xiàng)所述的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
35.一種治療疾病或疾患的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要治療的患者治療有效量的如權(quán)利要求33或34所述的藥物制劑。
36.一種生產(chǎn)脂質(zhì)體疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟制備磷脂多室性小泡并包裹水溶性免疫原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，其中所述脂質(zhì)體具有高脂質(zhì)-蛋白質(zhì)比例。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述比例約為50-1000。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述比例約為300。
39.一種高脂質(zhì)-蛋白質(zhì)重量比的脂質(zhì)體組合物，其特征在于，所述組合物含有與選自SEQ ID NO17、18、19和20的肽相綴合的免疫原性載體的免疫原性構(gòu)建物。
40.一種制備含有高劑量免疫原的脂質(zhì)體疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括用水或乙醇水溶液復(fù)水凍干的脂質(zhì)組合物，在此復(fù)水步驟中將免疫原包含在脂質(zhì)組合物中或乙醇水溶液中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種脂質(zhì)體載體，其包裹有較高水平的含針對(duì)胃泌素和促性腺素釋放激素免疫原的水溶性物質(zhì)?？蓪罅棵庖咴脑撝|(zhì)體經(jīng)胃腸外途徑注射來誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而不會(huì)顯示明顯的不良組織反應(yīng)原性。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1665487SQ03815917
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者D·麥克爾, S·格里姆斯, Y·巴里赫爾茲, S·伊文一辰 申請(qǐng)人:埃弗頓有限公司, 耶路撒冷希伯萊大學(xué)葉森姆研究發(fā)展公司