一種脂質(zhì)體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體及其應(yīng)用。所涉及的脂質(zhì)體包括脂質(zhì)體制備材料、抗癌藥物和核酸分子，所述核酸分子具有逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對所述包覆抗癌藥物耐藥性的功效。本發(fā)明利用脂質(zhì)體作為藥物載體，把核酸分子和抗癌藥物包入其內(nèi)，形成對癌細(xì)胞具有殺傷力并具有逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對抗癌藥物耐藥性的脂質(zhì)體藥物體系。該體系由于脂質(zhì)體易于進(jìn)入細(xì)胞、抗癌藥物具有強大的細(xì)胞殺傷力、核酸分子具有抗癌藥物耐藥性逆轉(zhuǎn)作用，在未來可以用于：(1)癌癥患者的抗癌藥物化療；(2)對阿霉素已經(jīng)形成耐藥性的癌癥患者的化療；(3)大大提高抗癌藥物療效而降低由于藥物耐藥性而導(dǎo)致的低化療效果和復(fù)發(fā)，改善目前癌癥病人化療的瓶頸問題。
【專利說明】
一種脂質(zhì)體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[000?]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含有抗癌藥與miRNAlOl合成產(chǎn)物或其表達(dá)質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體及該脂質(zhì)體用于制備抗癌藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥(Cancer)目前是一種最常見的、嚴(yán)重威脅人們健康和生命的重大疾病，目前對于癌癥的藥物治療仍然面臨許多瓶頸問題，如高復(fù)發(fā)率、迅速形成的抗藥性、高毒副作田筆筆
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[0003]現(xiàn)有抗癌藥物大多基于對細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的抑制，或者對蛋白的抑制而對癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯殺傷效果，但易于形成抗藥性而且毒性大。例如，阿霉素(Doxorubicin)是歷史悠久的抗癌一線藥物，具有強大的癌細(xì)胞殺傷作用。該藥的抗癌機理是藥物分子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并嵌入DNA雙螺旋分子而使細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄受到影響而殺死細(xì)胞，后來人們開發(fā)出了阿霉素脂質(zhì)體，由于它更易于與細(xì)胞膜融合而進(jìn)入細(xì)胞，從而進(jìn)一步強化了其對癌細(xì)胞的殺傷力。但是，癌細(xì)胞往往會很快建立對抗癌藥的多藥耐藥性(MultipIe drugresistance，MDR)而導(dǎo)致藥物治療效率降低、毒性顯著加強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供一種以脂質(zhì)體為運載物的抗癌藥物和可以使抗癌藥物MDR逆轉(zhuǎn)的癌癥化療新型藥物設(shè)計思路，這對于強化癌癥化療治療效果、抑制癌復(fù)發(fā)等具有巨大應(yīng)用價值。
[0005]本發(fā)明的脂質(zhì)體包括脂質(zhì)體制備材料、包覆抗癌藥物和包覆核糖核酸，所述包覆核糖核酸具有逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對所述包覆抗癌藥物耐藥性的功效。
[0006]本發(fā)明的包覆核糖核酸為小核糖核酸101a(miR-101a)、小核糖核酸1lMmiR-101b)、小核糖核酸1(!!^1?-1)、小核糖核酸1513(1^1?-1513)、小核糖核酸13013(1^1?-13013)、小核糖核酸34a(miR-34a)、小核糖核酸16(miR-16)、小核糖核酸122(miR-122)、小核糖核酸129-2(1^1?-129-2)、小核糖核酸132(11^1?-132)、小核糖核酸195(11^1?-195)、小核糖核酸1993(miR-199a)、小核糖核酸223(miR-223)和小核糖核酸375(miR-375)中的一種。
[0007]本發(fā)明的脂質(zhì)體制備材料為天然材料或者化學(xué)材料，其中天然材料為卵磷脂(磷脂酰膽堿)、糖脂、鞘脂、膽固醇和紫杉醇中的一種或兩種以上;化學(xué)材料為合成磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(D0PE)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、十七烷酸磷脂、山梨醇、乙腈、甲醇、維生素E和聚乙二醇(PEG)中的一種或兩種以上。
[0008]本發(fā)明的包覆抗癌藥物為阿霉素(doxorubicin)、氟尿啼啶(f Iuorouracil )、順鈾(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、卡鉬(carboplatin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosvnamide)、長春喊(vincaleukoblastinum)、長春新喊(vincristine，leurocristine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氮芥(nitrogen mustard)、塞替派(th1tepa)、甲氨蝶呤(methotrexate)、替加氟(tegafur)、絲裂霉素(mitomycin)和柔紅霉M (daunomy c i η, rub i domy c i η)中的一種。
[0009]本發(fā)明所的包覆核糖核酸為小核糖核酸合成產(chǎn)物或者小核糖核酸質(zhì)粒表達(dá)載體。
[0010]本發(fā)明利用脂質(zhì)體作為藥物載體，把小核糖核酸和抗癌藥物包入其內(nèi)，形成對癌細(xì)胞具有殺傷力并具有逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對抗癌藥物耐藥性的脂質(zhì)體藥物體系。該體系由于脂質(zhì)體易于進(jìn)入細(xì)胞、抗癌藥物具有強大的細(xì)胞殺傷力、小核糖核酸具有抗癌藥物耐藥性逆轉(zhuǎn)作用，在未來可以用于:(I)癌癥患者的抗癌藥物化療；(2)對阿霉素已經(jīng)形成耐藥性的癌癥患者的化療；(3)大大提高抗癌藥物療效而降低由于藥物耐藥性而導(dǎo)致的低化療效果和復(fù)發(fā)，改善目前癌癥病人化療的瓶頸問題。
【附圖說明】
[0011]圖1:本發(fā)明技術(shù)方案示意圖；
[0012]圖2:本發(fā)明思路不意圖；
[0013]圖3:脂質(zhì)體粒度測定結(jié)果，其中，以納米粒度測試儀測定脂質(zhì)體成品粒徑為I OOnm-150nm，符合預(yù)期要求；
[0014]圖4:Lipo-miR101-D0X 的體外肝癌細(xì)胞殺傷作用(5yg/ml)，其中，A，B:HepG2+Lipo-DOX;C、D:HepG2+Lipo-miR101-DOX；E,F:HepG2/ADR+Lipo_D0X；G,H:HepG2/ADR+Lipo-miR101-D0X。結(jié)果顯示Lipo-miRlOl-DOX對普通和抗藥性肝癌細(xì)胞都具有明顯的體外殺傷力增強或抗藥性逆轉(zhuǎn)作用；
[0015]圖5:1^口01丨1?101-0(^對拖口62細(xì)胞？-3(^丨11影響的初步觀察，其中，六:1^口0-00父；B:Lipo-miR101-D0X；
[0016]圖6:Lipo-miRlO 1-D0X在體內(nèi)對肝癌的治療效果，其中，A:給藥第二天，B:給藥第十天。
[0017]以下結(jié)合附圖和具體實施實例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【具體實施方式】
[0018]文獻(xiàn)報道m(xù)iR-lOla在肝癌組織等明顯低表達(dá)，提高其表達(dá)水平可明顯促使肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，也有文獻(xiàn)報道在順鉑抗藥性胃癌、肝內(nèi)膽管癌、膀胱癌細(xì)胞強化miR-101a表達(dá)可以加強癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。
[0019]發(fā)明人據(jù)此設(shè)想miR-lOla可能會抑制癌細(xì)胞形成MDR而逆轉(zhuǎn)耐藥性，于是選擇阿霉素做了以下實例研究:以人肝癌細(xì)胞HepG2和阿霉素耐藥性肝癌細(xì)胞HepG2/ADR進(jìn)行了包含阿霉素和miR-101表達(dá)質(zhì)粒的脂質(zhì)體載藥體系(Lipo-miR101-D0X)的抗癌效果研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該體系可以大大降低癌細(xì)胞對阿霉素MDR的形成，并對阿霉素耐藥性肝癌細(xì)胞HepG2/ADR具有很好的殺傷作用。適用于本發(fā)明方案的抗癌藥物還有:氟尿啼啶(fluorouracil)、順鈾(c i s P I a t i η )、奧沙利鈾(o x a I i ρ I a t i η )、卡鈾(c a r b ο ρ I a t i η )、環(huán)磷酰胺(cyclophosvnamide)、長春喊(vincaleukoblastinum)、長春新喊(vincristine，leurocristine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氮芥(nitrogen mustard)、塞替派(th1tepa)、甲氨蝶呤(methotrexate)、替加氟(tegafur)、絲裂霉素(mitomycin)或柔紅霉素((^111101117(^11，1'1113丨(101117(^11)。適用于本發(fā)明方案的小核糖核酸還有:小核糖核酸10Ib(miR-lOlb)、小核糖核酸l(miR-l )、小核糖核酸15b(miR-15b)、小核糖核酸130b(miR-130b)、小核糖核酸34a(miR-34a)、小核糖核酸16(miR-16)、小核糖核酸122(miR-122)、小核糖核酸129-2(miR-129-2)、小核糖核酸132(miR-132)、小核糖核酸195(miR-195)、小核糖核酸 199a(miR-199a)、小核糖核酸223(miR-223)、小核糖核酸375(miR-375)。
[0020]根據(jù)在學(xué)術(shù)界已經(jīng)報導(dǎo)或證明的可能參與形成抗癌藥物MDR的有關(guān)基因，發(fā)明人分析了初步實驗結(jié)果顯示的本發(fā)明的組合設(shè)計引起MDR逆轉(zhuǎn)的可能機理，如附圖2的細(xì)胞內(nèi)部分示意圖。
[0021 ] 實施例:
[0022]該實施例的技術(shù)路線如圖1所示。
[0023]1.主要實驗材料
[0024]1.1脂質(zhì)體材料:大豆卵磷脂、膽固醇，購于石家莊寧諾商貿(mào)有限公司，聚乙二醇(PEG)購于美國Sigma。
[°°25] 1.2阿霉素原料藥，購于美國Sigma。
[0026]1.3 pcDNA6.2質(zhì)粒，購于美國Promega。
[0027]1.4細(xì)胞株:HepG2，SMMC7721，HepG2/ADR，購于上海細(xì)胞所。
[0028]2.主要方法步驟
[0029]2.1表達(dá)miR-lOla的質(zhì)粒載體構(gòu)建:從在線數(shù)據(jù)庫獲得miR-lOla前體序列，以一般分子克隆方法把它克隆至pcDNA6.2質(zhì)粒構(gòu)成pcDNA6.2/miRNA101重組體。
[0030]2.2脂質(zhì)體載藥體系制備:按7: 2:2的比例分別稱取大豆卵磷脂、膽固醇、PEG。以環(huán)己烷溶解大豆卵磷脂和膽固醇(超聲處理20min)，以超純水溶解PEG，超聲處理20min，以磁力攪拌器在50°C反應(yīng)2小時后置室溫I小時。將大豆卵磷脂溶液進(jìn)行禍旋(5min)，再超聲處理5min，8000r離心lOmin，取上清液。將三種溶液混合，以磁力攪拌器在50°C反應(yīng)2小時。將反應(yīng)后的溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到的脂膜加入含有pcDNA6.2/miR101重組質(zhì)粒DNA(50mM)、阿霉素(10mM)的超純水后超聲溶解，再放置臺式振蕩器50 °C振蕩2小時，再超聲處理10!11；[11，5000!'離心10111；[11，取上清液，是為“1^011丨1?101-0(^”載藥脂質(zhì)體。用納米粒度儀測粒徑(size)。
[0031]2.3體外細(xì)胞殺傷實驗:以RPMI 1640完全培養(yǎng)基、37°C、飽和濕度、5%⑶2孵箱培養(yǎng)細(xì)胞。在HepG2、HepG2/ADR細(xì)胞培養(yǎng)分別加入同等濃度載藥脂質(zhì)體(5yg/ml)，分別于培養(yǎng)O小時、48小時拍照觀察細(xì)胞死亡和存活情況，后收集細(xì)胞以MTT測蛋白總量。同時制備細(xì)胞爬片在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架主要蛋白F-actin的表達(dá)和聚合情況。
[0032]2.4體內(nèi)治療效果觀察:以肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC7721以皮下注射方式制備裸鼠移植瘤模型，2周后以尾靜脈注射Lipo-miR101-D0X(lyg/克體重)，給藥后第二天、第十天以小動物體內(nèi)活體成像系統(tǒng)對治療效果進(jìn)行觀察。
[0033]2.5統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 16.0-GLM中的Univariate分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以土 SD表示，組間多重比較采用Duncan檢驗處理。P〈0.01為差異極顯著，P〈0.05為差異顯著，P>0.05為無統(tǒng)計學(xué)意義。
[0034]3.實驗結(jié)果
[°035] 3.1脂質(zhì)體粒度測定:如圖3所示。結(jié)果顯示，制備的Lipo-miRlO1-DOX成品粒徑為I OOnm-150nm，符合預(yù)期要求。
[0036]3.2 Lipo-miRlOl-DOX體外癌細(xì)胞殺傷和耐藥性逆轉(zhuǎn):如圖4所示。結(jié)果顯示，與普通阿霉素脂質(zhì)體(Lip-DOX)相比，Lipo-miRlOl-DOX對普通和耐藥性肝癌細(xì)胞都具有明顯的體外殺傷力增強或抗藥性逆轉(zhuǎn)作用；其中，A，B:HepG2+Lipo-D0X;C、D:HepG2+Lipo-miR101-DOX;E，F(xiàn):HepG2/ADR+Lipo-D0X;G，H: H印G2/ADR+Lipo-miR101_D0X。
[0037]3.3 Lipo-miR101-D0X對細(xì)胞主要骨架蛋白F-actin的影響:如圖5所示。結(jié)果顯示，與普通阿霉素脂質(zhì)體(Lip-DOX)相比，Lipo-miR101-D0X對肝癌細(xì)胞HepG2的F-actin的表達(dá)、聚合度都具有明顯的抑制作用；其中，A:Lipo-D0X;B:Lipo-miRl(n-D0X。
[0038]3.4 Lipo-miR101-D0X體內(nèi)對肝癌的治療效果:如圖6所示；結(jié)果顯示Lipo-miR101-D0X對肝癌裸鼠移植瘤具有明顯的治療效果;其中，A:給藥第二天，B:給藥第十天。
【主權(quán)項】
1.一種脂質(zhì)體，其特征在于，該脂質(zhì)體包括脂質(zhì)體制備材料、包覆抗癌藥物和包覆核糖核酸，所述包覆核糖核酸具有逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對所述包覆抗癌藥物耐藥性的功效。2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述包覆核糖核酸為小核糖核酸101a、小核糖核酸10Ib、小核糖核酸1、小核糖核酸15b、小核糖核酸130b、小核糖核酸34a、小核糖核酸16、小核糖核酸12 2、小核糖核酸12 9 - 2、、小核糖核酸13 2、小核糖核酸19 5、小核糖核酸199a、小核糖核酸223和小核糖核酸375中的一種。3.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體制備材料為天然材料或者化學(xué)材料，所述天然材料為卵磷脂、糖脂、鞘脂、膽固醇和紫杉醇中的一種或兩種以上;所述化學(xué)材料為合成磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、十七烷酸磷脂、山梨醇、乙腈、甲醇、維生素E和聚乙二醇中的一種或兩種以上。4.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述包覆抗癌藥物為阿霉素、氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、長春堿、長春新堿、阿糖胞苷、氮芥、塞替派、甲氨蝶呤、替加氟、絲裂霉素和柔紅霉素中的一種。5.如權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述包覆小核糖核酸為小核糖核酸的合成產(chǎn)物或者小核糖核酸的質(zhì)粒表達(dá)載體。6.如權(quán)利要求1、2、3或4所述脂質(zhì)體用于制備抗癌藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K45/06GK106074388SQ201610472830
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】侯穎春, 肖麗, 馬妮, 何慧敏, 黎金媚, 程思楠, 楊倩
【申請人】陜西師范大學(xué)