專利名稱:新穎的神經(jīng)元營養(yǎng)因子的制作方法
本發(fā)明涉及一種從哺乳動(dòng)物腦中，特別是從牛的尾狀核中分離出來的新的大分子神經(jīng)元營養(yǎng)因子(SDNF)，并涉及一種制備該物質(zhì)的方法。從化學(xué)觀點(diǎn)來看，純化的神經(jīng)元營養(yǎng)因子是等電點(diǎn)大約為10的堿性蛋白質(zhì)，用十二烷基硫酸鈉SDS凝膠電泳測(cè)得其分子量大約與溶菌酶相同，也就是大約為14，400道爾頓。從生物學(xué)觀點(diǎn)來看，該分子能夠在體外培養(yǎng)液中促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的存活。特別是那些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的存活。本發(fā)明的神經(jīng)元營養(yǎng)因子的來源、化學(xué)及生物學(xué)特性與其它曾報(bào)導(dǎo)的被確認(rèn)的大分子神經(jīng)元營養(yǎng)因子是有區(qū)別的。另外，還確定了SDNF的藥物應(yīng)用方法，該應(yīng)用方法也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
神經(jīng)元營養(yǎng)因子的定義及作用現(xiàn)在已經(jīng)確定，在體內(nèi)及體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長及存活系受到一系列大多為蛋白質(zhì)類或肽類的胞外類似激素的信號(hào)的調(diào)節(jié)，如所知的生長因子等的調(diào)節(jié)。從生物學(xué)上看，每一種生長因子作用在一組特殊的相應(yīng)靶細(xì)胞。
對(duì)大分子蛋白生長因子的研究表明，在發(fā)育階段及成熟期促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞存活及神經(jīng)元細(xì)胞生長的蛋白生長因子，目前對(duì)于神經(jīng)生物學(xué)的研究相當(dāng)有用。有人提出，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，直接從體液及細(xì)胞微環(huán)境中分離出的存于體外的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞的生存及死亡起到調(diào)節(jié)作用(Cowan W.M.et al.，Science 2251258，1984)。事實(shí)上有些報(bào)導(dǎo)說，對(duì)于靶衍生的(target-derived)神經(jīng)元營養(yǎng)因子的神經(jīng)支配軸突之間生長的竟?fàn)帲谂咛グl(fā)生過程中決定了哪些神經(jīng)元生存或哪些死亡。在成熟期，情況即使不完全相同，但也是類似的，有人提出神經(jīng)元營養(yǎng)因子對(duì)于維持神經(jīng)元細(xì)胞的生存及大腦正常功能聯(lián)系是必不可少的。(Varon S.，Discussions in Neuroscience，vol.II，No.3，1985.)因而，神經(jīng)細(xì)胞弱化或死亡(發(fā)生于外傷性損傷之后、或病理學(xué)過程，如發(fā)作或神經(jīng)變性疾病，以及衰老)會(huì)引起體內(nèi)神經(jīng)元營養(yǎng)學(xué)因子的缺乏或受到抑制。(Varon S.，ibid;Appel S.H.，Ann.Neurol.10499，1981;Varon S.et al.，Dev.Neurosci.673，1984.).有些研究者提出，成年的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元營養(yǎng)因子不單是在外圍神經(jīng)系統(tǒng)也是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)及再生過程的根源。的確，現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)技術(shù)在動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)所作的移植及損傷實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用使人們?cè)鰪?qiáng)了對(duì)成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)是可能的這一信念，并且提供了獲得正確營養(yǎng)信號(hào)是有效的信息(Gage F.H.et al.，Nature 308637，1984).直至近日，唯一能很好地確定其特性的大分子蛋白神經(jīng)元營養(yǎng)因子是神經(jīng)生長因子(NGF)(Levi-Montalcini R.et al.，physiol.Rev.48534，1968;Levi-Montalcini R.，Ann.Rev.Neurosci.5341，1982)人們發(fā)現(xiàn)NGF在體內(nèi)及體外，只能促進(jìn)有限類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的存活，從而使人們相信NGF僅是一族大分子神經(jīng)元營養(yǎng)因子(其中每種僅對(duì)確定類型的神經(jīng)元存活起調(diào)節(jié)作用)中的一種。目前，另外僅有兩種大分子神經(jīng)元營養(yǎng)因子被純化并且確定其特性，即為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)(Varon S.，Discussions in Neuroscience，vol.II，No.3，1985;Varon S.et al.，Dev.Neurosci.673，1984)及由腦中分離的神經(jīng)元營養(yǎng)因子(BDNF)(Varon S.，Discussions in Ncuroscience，vol.II，No.3，1985;Barde Y.et al.，Embo J.1549，1982)
以下對(duì)這些因子的來源、化學(xué)特性及生物學(xué)活性作概要的說明。
神經(jīng)元營養(yǎng)因子的生物測(cè)試體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)已被證實(shí)為對(duì)于組織提取物的神經(jīng)元營養(yǎng)活性的研究及對(duì)于適用于分離或純化神經(jīng)元營養(yǎng)因子的復(fù)雜手續(xù)進(jìn)行的監(jiān)測(cè)是基本的而又不可缺少的工具。有人作過演示表明，以單層有絲分裂后分離的(postmitotic)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物，置于體外合適的“限制性”培養(yǎng)條件之下時(shí)需要外部加入的營養(yǎng)補(bǔ)充物，并對(duì)之發(fā)生響應(yīng)。因而，半提純或提純的原料制品的神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)活力的評(píng)價(jià)可以通過對(duì)體外神經(jīng)元細(xì)胞存活的促進(jìn)能力大小來加以測(cè)定。更進(jìn)一步，對(duì)特定的神經(jīng)元標(biāo)記(例如神經(jīng)元絲含量的分析或特定識(shí)別標(biāo)記的分析)常?？捎糜趯?duì)形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行支持或確認(rèn)。
確認(rèn)神經(jīng)元營養(yǎng)因子的特性如前所述，目前所確認(rèn)的大分子神經(jīng)元營養(yǎng)因子為神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)元營養(yǎng)因子(CNTF)及從腦中分離的神經(jīng)元營養(yǎng)因子(BDNF)。下面對(duì)這些因子的生物學(xué)來源、化學(xué)特性及生物學(xué)活性作分別的說明。
1，神經(jīng)生長因子(NGF)來源NGF最初系于鼠肉瘤性腫瘤中發(fā)現(xiàn)(Levi-Montalcini R.et al.，J.Exp.Zool.116321，1951)它從雄性鼠的下頜下唾液腺中分離得到勻質(zhì)(Varon S.et al.，Biochemistry 62202，1967)，然后又從蛇毒中獲得(Angeletti R.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 65668，1970)。許多其它的相對(duì)富含NGF的來源也有報(bào)導(dǎo)，包括在豚鼠前列腺(Harper G.P.et al.，Nature 279160，1979)及人類胎盤(Goldstein L.D.et al.，Neurochem.Res.3175，1978)。據(jù)報(bào)導(dǎo)在其它組織中還存在有少量的NGF，這些組織包括哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Varon S.，Discussions in Ncuroscience，vol.II，No.3，1985;Hefti F.et al.，Neuroscience 1455，1985)。這些潛在的NGF來源及明顯的作用位點(diǎn)之間的生理學(xué)上的關(guān)系尚不很明了，但是人們普遍認(rèn)為NGF是那些需要被對(duì)NGF發(fā)生響應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)支配的各種外圍組織分泌的。同樣還對(duì)由雄性鼠的下頜下腺體得到的NGF的順序進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行克隆。(Scott J.et al.，Nature 302538，1983;Ulrich A.et al.，Nature 303821，1983)人類β-NGF基團(tuán)也被成功地進(jìn)行了分離，并且進(jìn)行了克隆。(Ulrich A.et al.，Nature 303821，1983;European Patent No.0121388).
化學(xué)特性對(duì)由鼠下頜下腺體獲得的NGF的特性了解得最為清楚。鼠腺體NGF為7S蛋白質(zhì)復(fù)合體(分子量約為140，000道爾頓)，具有三個(gè)亞單位(α、β、γ)并包含Zn++。NGF的活力僅與亞單位β(即2.5 SNGF)，即系分子量大約為25，300道爾頓(在SDS凝膠電泳中顯示分子量大約為12，650道爾頓)，等電點(diǎn)大約為9.3的堿性二聚蛋白質(zhì)。來自于雄鼠下頜下腺體及人類來源(Provenience)或其它來源的β-NGF的順序已經(jīng)有人作了報(bào)導(dǎo)。(Scott J.et al.，Nature 302538，1983;Ulrich A.et al.，Nature 303821，1983).
生物學(xué)活性來自鼠下頜下腺體的NGF已被用于體外及體內(nèi)的關(guān)于NGF活性的絕大多數(shù)研究。
NGF體外生物學(xué)活性范圍的評(píng)定，對(duì)初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞及在培養(yǎng)物的克隆細(xì)胞都作了測(cè)定。在體外對(duì)NGF發(fā)生響應(yīng)的初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞據(jù)報(bào)導(dǎo)包括位于背側(cè)根部神經(jīng)節(jié)的胎感覺中樞神經(jīng)元(胚胎期為8-12)，位于交感神經(jīng)神經(jīng)節(jié)的自主性釋放出去甲腎上腺素的(noradrenergic)胎兒神經(jīng)細(xì)胞，位于間隔(septum)的膽堿能的神經(jīng)細(xì)胞及發(fā)育中的腎上腺嗜鉻性細(xì)胞。其中感覺中樞及交感神經(jīng)的神經(jīng)元依賴NGF而生存并發(fā)展，然而膽堿能的神經(jīng)細(xì)胞卻似乎不需依賴NGF而生存，然而僅僅為了它們的分化，也可說表型特征在表達(dá)是與神經(jīng)元傳遞體(neurotransmittor)緊密相聯(lián)系的。在發(fā)育的初始階段在腎上腺嗜鉻性細(xì)胞(分離自神經(jīng)嵴)中加入NGF可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞表型的表達(dá)。在體外對(duì)NGF發(fā)生響應(yīng)的克隆細(xì)胞據(jù)報(bào)導(dǎo)包括分離自神經(jīng)嵴腫瘤的嗜鉻性腎上腺細(xì)胞，即為嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)及人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。當(dāng)用NGF處理之后，這些細(xì)胞從一個(gè)高度增生的形式突轉(zhuǎn)成分裂后的神經(jīng)細(xì)胞階段。
在體內(nèi)對(duì)NGF發(fā)生響應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞據(jù)報(bào)導(dǎo)包括背測(cè)根部神經(jīng)節(jié)的感覺中樞神經(jīng)元，交感神經(jīng)神經(jīng)元及發(fā)生在發(fā)育階段和成年期發(fā)生損傷之后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元。對(duì)于后種情形，在大腦中施用NGF可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活及表型特征的表達(dá)。這些作用與損傷后引起的行為變化的改善有聯(lián)系。
睫狀神經(jīng)元營養(yǎng)因子(CNTF)來源CNTF最初從胚胎組織(E8)從小雞的(chicks′)眼睛包括脈絡(luò)膜及有色素的上皮的虹膜睫狀體中檢測(cè)到并提純。隨后，CNTF活性系通過一系列不同的組織提取物，包括成年大鼠坐骨神經(jīng)及大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)傷液，來進(jìn)行確定。
化學(xué)特性將由小雞(chick)胚胎眼內(nèi)的組織提純的CNTF(按蛋白質(zhì)表示為大約2×10-4，按營養(yǎng)活性表示為9%)用SDS凝膠電泳測(cè)定分子量為20，400道爾頓，等電點(diǎn)大約為5。分子量與凈負(fù)電荷都顯示CNTF明顯地與來自于鼠下頜下的蛋白β-NGF不同。對(duì)于來自小雞(chicks′)眼睛的CNTF的順序還無人報(bào)導(dǎo)，也還沒有將制備規(guī)模的CNTF從哺乳動(dòng)物中分離純化的方法。
生物學(xué)活性生物學(xué)研究主要地用小雞(chicks′)眼睛的提取物，半提純或提純的CNTF制品，僅僅于體外進(jìn)行。在體外，產(chǎn)生響應(yīng)的神經(jīng)元包括來源于胎雞(chicks)的睫狀神經(jīng)節(jié)(E8)，來源于鼠背側(cè)根部神經(jīng)節(jié)的新生期神經(jīng)元，及來源于小雞(chick)E11神經(jīng)節(jié)及大鼠新生期神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)(sympathetic)神經(jīng)元。據(jù)報(bào)導(dǎo)，這些活性都不能被抗鼠下頜下β-NGF的抗體所阻礙或抑制。CNTF在體內(nèi)的作用尚未有人報(bào)導(dǎo)。
由腦中分離的神經(jīng)元營養(yǎng)因子(BDNF)來源BDNF的活性在來自于C6大鼠克隆細(xì)胞系的控制條件的培養(yǎng)基上及在各種動(dòng)物物種的腦提取物中進(jìn)行研究。該因子已可從成年豬腦中被提純。
化學(xué)特性提純自成年豬腦的BDNF(產(chǎn)量以蛋白質(zhì)表示為3.8×10-8，以營養(yǎng)活性表示低于5%)，是高度堿性的多肽(p I等電點(diǎn)大于10.1)，用SDS-凝膠電泳測(cè)定分子量大約為12，300道爾頓。沒有文獻(xiàn)對(duì)該因子的順序進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。BDNF分子及其提取手續(xù)由西德專利申請(qǐng)第DE3213963 AL號(hào)描述。
生物活性生物學(xué)活性的研究用豬腦提取原料，半提純及提純的BDNF制品僅僅在體外進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)來源于普拉西多氏盤(placode)的感覺中樞神經(jīng)細(xì)胞及來源于神經(jīng)嵴的感覺中樞袖經(jīng)細(xì)胞的存活有促進(jìn)作用，并且能夠促進(jìn)軸突的長出及體外視網(wǎng)膜移出物的細(xì)胞存活(Turner J.E.，Develop.Brain Res.18251，1985;Turner J.E.，Develop.Brain Res.18265，1985)盡管其化學(xué)特性與β-NGF非常類似，但檢測(cè)不出有交叉免疫反應(yīng)發(fā)生。另外，BDNF對(duì)于交感神經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞無作用。對(duì)于BDNF體內(nèi)作用還沒有人進(jìn)行報(bào)導(dǎo)。
由哺乳動(dòng)物腦中分離的新穎的神經(jīng)元營養(yǎng)因子本發(fā)明涉及一種新穎的神經(jīng)元營養(yǎng)因子(SDNF)，該因子分子量為14，400道爾頓，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元有活性作用，本發(fā)明還涉及制備該因子的方法。
來源及純化方法本發(fā)明的新穎神經(jīng)元營養(yǎng)因子可以根據(jù)以下的方法而獲得，以下的分離方法為構(gòu)成本發(fā)明的一部分。所采用的方法具有的特征為，將哺乳動(dòng)物，特別是牛的腦子，最好將尾狀核在中性條件下打成勻漿，然后在pH4～5進(jìn)行酸沉淀，然后用分子篩層析法，采用濃度在10 mM至30 mM之間的稀釋的緩沖液洗脫劑進(jìn)行洗脫;活性組分用陽離子交換層析法，采用濃度在0.1M至1M之間的乙酸銨緩沖劑進(jìn)行梯度洗脫以進(jìn)一步純化，然后收集活性組份并且冷凍干燥。
新鮮的及冷凍狀態(tài)(例如-70℃)的哺乳動(dòng)物腦子都能作用。以下所描述的所有純化步驟最好都在0℃至6℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
每一批制品，無論是采用全部或部分動(dòng)物腦子都要在2或4倍體積的緩沖溶液中打成勻漿，在pH變化為6至7.4的范圍內(nèi)稀釋，然后優(yōu)先采用鹽酸酸化至pH為4至5的變化范圍內(nèi)，優(yōu)先采用pH為4.5，隨后攪拌數(shù)小時(shí)。用離心(例如，40，000rpm，40分鐘)分離沉淀物質(zhì)，將上清液中和并對(duì)稀釋的緩沖溶液進(jìn)行透析，最后冷凍干燥?？梢詫⑼肝龇秶鸀榉肿恿吭?至10千道爾頓內(nèi)的透析膜透析。采用分離范圍為5，000至150，000道爾頓的固定相進(jìn)行分子過濾分離。采用濃度變化范圍在10 mM至30 mM，pH變化范圍為6至7.4的緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫。收集生物學(xué)活性組份，冷凍干燥，在陽離子交換層析柱上上柱并用濃度在0.1M至1M，pH為6至7的乙酸銨緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。神經(jīng)元營養(yǎng)活性組份在洗脫劑濃度大約為1M時(shí)洗脫，然后再次收集并冷凍干燥。
如果生物學(xué)活性物質(zhì)的濃度已經(jīng)達(dá)到足夠的程度，或如果采用其中較少的純化步驟時(shí)，上述方法可在任何純化步驟下中斷。
以下的例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，盡管并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
例子由屠宰場(chǎng)得到新鮮牛腦子，然后在冰上分割尾狀核。每批制品大約將150克有尾組織(25～30腦子)與3倍體積的磷酸緩沖液(PBS)打成勻漿(Polytron，setting 6，60 seconds)然后用含苯甲基磺酰氟(PMSF)(0.3mg/ml)及EGTA(乙二醇雙β胺基乙醚N，N′-四乙酸)(1mM)的緩沖溶液稀釋10倍(pH7.4)，用HCl酸化至pH4.5，在冰中維持2小時(shí)，隨后離心(40，000rpm，40分鐘)。收集上清液并中和至(pH7.4)，在稀釋的PBS110(pH7.4)中透析過夜，冷凍干燥后分成若干份并置于-20℃溫度下。使用前要立即(Imme-diately)，用蒸餾水重新將組份分散至原有的體積的1/10蛋白含量用Peterson G.L.的方法(Anal.Biochem.83346 1977)進(jìn)行測(cè)定。然后樣品在培養(yǎng)基中稀釋，用牛血清白蛋白(1mg/ml)浸透的0.45微米Millex濾器過濾，將合適數(shù)量的過濾上清液組份加入至無血清中腦細(xì)胞培養(yǎng)物中以測(cè)定神經(jīng)元營養(yǎng)活性。根據(jù)分子量采用葡聚糖G-150(細(xì)顆粒)層析柱(尺寸為8cm×120cm)分離上清液中的組成成份。將冷凍干燥的上清液重新分散在蒸餾水中，并進(jìn)行上柱(6ml緩沖洗脫液中含大約750mg蛋白質(zhì))。洗脫劑緩沖液的毫摩爾組成為(pH7.30)NaCl，13.68;KCl，0.27;Na2HPO4·7H2O，0.8;KH2PO4，1.5。
使用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)90毫升的流速對(duì)柱進(jìn)行洗脫。用紫外監(jiān)測(cè)儀在280nm波長下對(duì)洗脫液的光學(xué)密度進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。自動(dòng)收集15ml的組份并在冷凍干燥之后對(duì)神經(jīng)元營養(yǎng)活性進(jìn)行測(cè)試。凝膠過濾層析及組份收集都是在4℃溫度的冷房中進(jìn)行。
從葡聚糖G-150柱上洗脫下的具有生物學(xué)活性組份收集后進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥的各組份重新擴(kuò)散于100μl0.1M的CH3COO(NH4)，pH6.45。取10μl測(cè)定蛋白質(zhì)。剩下的100μl(1.9mg蛋白質(zhì))對(duì)TSK-CM-3 SW柱(一種用于高效液相層析HPLC的離子交換柱)進(jìn)行上柱。用(NH4)COOCH3(0.1M-1M)，pH6.45對(duì)組份進(jìn)行梯度洗脫，流速為每分鐘0.5毫升。緩沖液A0.1M(NH4)COOCH3，pH6.45。緩沖液B1M(NH4)COOCH3，pH6.45。洗脫曲線0-20分鐘，100%A/0%B(isoctatic 同溶劑洗脫)20-40分鐘，0%A/100%B(線性);40-70分鐘，0%A/100%B(isocratic同溶劑洗脫);70-75分鐘，100%A/0%B(線性)。組份冷凍干燥后重新分散于0.6ml磷酸緩沖液(10mM，pH5.7)中。
取100μl測(cè)定蛋白質(zhì)含量，剩下材料用于生物測(cè)定及SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析。
表1列出分離(純化)程序的各主要階段，并對(duì)該例的純化程度(用蛋白質(zhì)表示)，及在純化過程中可能獲得的神經(jīng)元營養(yǎng)活性的百分產(chǎn)率進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。蛋白質(zhì)及營養(yǎng)活性產(chǎn)率使該方法區(qū)別于用于純化CNTF及BDNF的其它方法。
表1 牛腦神經(jīng)元營養(yǎng)因子之主要純化階段的數(shù)據(jù)概要階段 總蛋白質(zhì)(mg) 純化 專一活性 總量 營養(yǎng)單位倍數(shù) μg/TU＊ 營養(yǎng)單位 回收%勻漿 11.625 1 - - -酸化沉 750 15.5 6 125，000 100%淀后的上清液葡聚糖 14.7 791 0.3 49，000 39%G-150CM- 0.361 32202 0.01 36，100 29%HPLC＊營養(yǎng)單位定義為可響應(yīng)最大數(shù)目的神經(jīng)細(xì)胞的一半存活的蛋白質(zhì)濃度(μg/ml)。
化學(xué)特性由勻漿經(jīng)過酸化沉淀、中和作用及透折獲得的上清液組份粗產(chǎn)品的生物學(xué)活性對(duì)胰蛋白酶(trpsin)是敏感的，表明了該活性分子的本質(zhì)為蛋白質(zhì)或肽類。上述上清液提出物粗產(chǎn)品中存在的生物學(xué)活性分子的各組份系從葡聚糖G-150柱上洗脫下來，相應(yīng)的分子量變化范圍為10，000至30，000道爾頓(圖1)。圖1顯示總勻漿在酸化沉淀、中和及透析之后所得的牛尾狀核上清液在葡聚糖G-150上柱而得到的典型的洗脫曲線，同時(shí)還顯示了對(duì)組份的生物學(xué)活性鑒定。制備的條件如上所述。所有各組份均以0.01至10μg/ml范圍內(nèi)的蛋白濃度對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定。觀察到的活性在圖1中用水平線標(biāo)明。存在于通過葡聚糖G-150柱層析而得到的活性組分的生物學(xué)活性分子再從TSK-CM-3 SW柱上用大約1M乙酸銨的緩沖液洗脫下來(圖2)。
圖2顯示了由葡聚糖G-150柱得到的活性洗脫液再從TSK-CM-3 SW柱上洗脫而得到的典型的HPLC洗脫曲線。純化條件已由上述。所有組份都用0.001至0.3μg/ml變化范圍內(nèi)的蛋白濃度對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定。用圖表上的水平線來代表由大約1M乙酸銨洗脫的組份中觀察到的活性。
后者洗脫時(shí)間近似于細(xì)胞色素C，表明活性分子的等電點(diǎn)近于細(xì)胞色素C，即大約為10-10.5。該特性區(qū)別于等電點(diǎn)大約為5的CNTF。用12.5%W/V聚丙烯酰胺凝膠板及(PAGF)根據(jù)Laemmli U.K.的方法(Nature 227680，1970)配成的含SDS的不連續(xù)(discontinuous)緩沖液按照Lee V.等人介紹的SDS-PAGE的電泳方法(Neuroscience 62773，1981)對(duì)由主要純化步驟(上清液提取物在對(duì)總勻漿進(jìn)行的酸沉淀、中和及透析之后通過對(duì)葡聚糖G-150及TSK-CM-3 SW上柱而得到)得到的生物學(xué)活性物質(zhì)進(jìn)行的SDS-PAGE電泳示于圖3A。圖3A顯示了用BioRad標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(第1及5行)及由主要的純化步驟，即，對(duì)總勻槳(第2行)進(jìn)行酸沉淀、中和及冷凍干燥，得到上清液提取物，用葡聚糖G-150柱純化物(第3行)及用TSK-CM-3 SW柱(第4行)，而得到的活性物質(zhì)(5μg蛋白質(zhì)/行)純化物進(jìn)行的銀著色之后進(jìn)行的SDS-PAGE凝膠電泳的例子。
所用的標(biāo)準(zhǔn)分子量指示物為肌球蛋白(分子量200，000)，β-半乳糖苷酶(分子量為116，250)，磷酸化酶b(分子量92，500)，牛血清白蛋白(分子量66，200)，卵白蛋白(分子量45，000)，碳酸酐酶(Carbon anhydrase)(分子量31，000)，大豆胰蛋白酶抑制劑(分子量21，500)及溶菌酶(分子量14，400)。用于電泳的緩沖液樣品的組成為62.5m M Tris[三(羥甲基)-氨基甲烷](pH6.8)，10%W/V甘油2%W/VSDS(十二烷基硫酸鈉)2.5mM EDTA，2.5mM EGTA，0.01%溴酸藍(lán)及5%的β-巰基乙醇。
由TSK-CM-3 SW柱得到的生物學(xué)活性物質(zhì)的信號(hào)帶的移動(dòng)情況與用標(biāo)準(zhǔn)的溶菌酶(Bio Rad)(Lysozyme)(Bio Rad)相近，因而具有的分子量大約為14，400道爾頓。該分子量與其它被確定的神經(jīng)元營養(yǎng)因子(NGF，CNTF，BDNF)不同。的確事實(shí)上，由TSK-CM-3 SW柱洗脫下來的活性物質(zhì)在SDS-PAGE凝膠電泳上移動(dòng)的位置與鼠唾液腺β-NGF不相近(圖3B)。
圖3B顯示了用標(biāo)準(zhǔn)Bio Rad指示物(第1及4行)及2.5μg來源于鼠下頜下腺的β-NGF(第2行)及2.5μg由TSK-CM-3 SW柱(第3行)洗脫下來的活性物質(zhì)進(jìn)行銀著色后進(jìn)行的SDS-PAGE凝膠電泳的例子。所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)如圖3A。
NGF移動(dòng)系在由TSK-CM-3 SW柱洗脫得到的活性分子移動(dòng)位置的下方。據(jù)報(bào)導(dǎo)BDNF在SDS電泳中移動(dòng)的位置與NGF相近。從而進(jìn)一步表明了由TSK-CM-3 SW柱洗脫得到的活性分子可能不同于BDNF。
生物活性由純化的主要步驟(對(duì)總勻漿進(jìn)行酸沉淀，中和及透析得到上清液提出物粗產(chǎn)品，在G-150柱及TSK-CM-3 SW柱上上柱得到洗脫液)的物質(zhì)的生物學(xué)活性常常通過監(jiān)測(cè)其對(duì)離體的胎鼠中腦細(xì)胞無血清培養(yǎng)的作用而測(cè)定。此外，還可以通過對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)中的專一的多巴胺能的(dopaminergic)神經(jīng)元對(duì)3H-多巴胺標(biāo)記的吸收及(GABAergic)神經(jīng)元的14C-GABA專一標(biāo)記的特定攝入進(jìn)行測(cè)定以確認(rèn)其形態(tài)學(xué)上的判斷。
下面系細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法，細(xì)胞存活數(shù)的計(jì)算及細(xì)胞培養(yǎng)液的特性及特定的攝入?yún)?shù)以及從純化工序中在幾個(gè)主要階段內(nèi)所得材料的作用效果。
1.細(xì)胞培養(yǎng)物的制備方法及用于評(píng)價(jià)在體外的細(xì)胞類型的免疫化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在無菌條件下從13天胚胎鼠的腦中分割嘴側(cè)的中腦蓋。在用下列毫摩爾組成的PBS溶液Na Cl，136.8;KCl，2.7;Na2HPO4·7H2O，8;KH2PO4，1.5及葡萄糖含量(6mg/ml)和牛的血清白蛋白(0.1mg/ml)(PH7.4)機(jī)械分裂混合的腦區(qū)。然后將此細(xì)胞離心(45轉(zhuǎn)/分鐘，離心4分鐘)，再將它懸浮在培養(yǎng)介質(zhì)中，通過一個(gè)20微米的耐泰克斯過濾器(Nytex filter)，用一個(gè)分離細(xì)胞的計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并鋪板在35毫米的佛爾康(Falcon)組織培養(yǎng)塑料碟中。
在每個(gè)碟上涂以牛皮膚膠原蛋白(Vitrogen，100微克蛋白質(zhì))，用伊格爾巴塞爾(Eagle′s Basal)培養(yǎng)基(BME)，(加入)Na HCO和NaOH以提高離子強(qiáng)度和pH值(埃爾斯泰勒T.等的組織生物學(xué)雜志(Elsdale T.et al，J.Cell.Biol.54626，1972)。
此培養(yǎng)基由BEM和用漢姆(Ham)F12(1∶1)的一種混合物構(gòu)成，用葡萄糖(33mM)、谷氨酰胺(2mM)、NaHCO3(15mM)海派斯(HEPES)(N-2-羥基乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(10mM)補(bǔ)充，用如戴安泡澤厄U.(Di Porzio U)等(Nature 288370，1980)所述的用胰島素(25μg/ml)、鐵傳遞蛋白(100μg/ml)、腐胺(60μM)、黃體酮(20nM)、亞硒酸鈉(30nM)、青霉素G(0.5U/ml)和鏈霉素(0.5μg/ml)補(bǔ)充;且含有T3(3，3′，5′-三碘代-DL-甲腺原氨酸)(30n M)[皮爾瑪羅特J.(Puymirat J.等，Neusoscience 10801，1983]。典型的，將2毫升含有所需的經(jīng)分離的細(xì)胞數(shù)的介質(zhì)加至每個(gè)碟中。
通過利用單克隆抗體RT97對(duì)神經(jīng)絲蛋白質(zhì)(安德湯B.H(Anderton B.H.)等，Nature29884，1982)，一種體外特珠的神經(jīng)元細(xì)胞指示劑，如道赫蒂P.(Doherty P.)等所述的(J.Neurochem.)421116，1984)間接免疫熒光法進(jìn)行體外細(xì)胞類型的鑒別。簡單地說，在-20℃下將此培養(yǎng)物在甲醇中固定7分鐘。通過用在PBS中的0.1%(vol/vol)的三通X-100(一種聚氧化甲烯醚)處理，使此經(jīng)固定的培養(yǎng)物滲透，然后用含有PBS的10%的小牛胎兒血清(FCS)培養(yǎng)60分鐘以阻斷非特異性的蛋白質(zhì)粘合位置。用在PBS中的抗神經(jīng)元絲狀抗體(稀釋1∶500)培養(yǎng)，室溫下進(jìn)行60分鐘，且然后用含有10%的FCS的PBS沖洗3次。然后在室溫下60分鐘內(nèi)將若丹明結(jié)合的山羊抗鼠高度親和性的經(jīng)純化的免疫球蛋白G(稀釋1∶100)加至培養(yǎng)物中，且在PBS中用10%的FCS沖洗3次以后，用甘油/PBS(1∶1)覆蓋，并在一個(gè)裝有若丹明差向螢光和相對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)的策斯(Zeiss)照相顯微鏡Ⅲ中檢驗(yàn)。根據(jù)拉夫M.C.(Raff M.C.)等所述的方法(Brain Res，174283，1979)，用鼠GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)的原纖維酸性蛋白質(zhì))抗血清(加至體外的特異的標(biāo)記星形細(xì)胞)及山羊抗鼠高度親和的經(jīng)純化的若丹明-結(jié)合的免疫球蛋白G實(shí)行免疫螢光法測(cè)定。
2.在培養(yǎng)物中用時(shí)間來評(píng)定細(xì)胞存活的方法在體外試驗(yàn);根據(jù)時(shí)間，通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(即是，在體外，根據(jù)時(shí)間，通過相對(duì)比顯微鏡觀察存活細(xì)胞的數(shù)量)和用生物化學(xué)法測(cè)定DNA含量及用每個(gè)碟中存活的多巴胺能的細(xì)胞的數(shù)量來評(píng)定細(xì)胞存活。
DNA測(cè)定系根據(jù)歐文B.G.(Erwin B.G.)(Anal.Biochem.110-291，1981)所建立的方法，每一碟中多巴胺能的細(xì)胞數(shù)系根據(jù)特定的多巴胺攝入(量)及螢光神經(jīng)細(xì)胞的目測(cè)系波爾斯特德G.(BolstadG.)等(Comp.Biochem.Physiol.6261，1979)所敘述的乙醛酸-誘導(dǎo)的螢光法測(cè)定。為了后面的目的，此細(xì)胞用一個(gè)裝有兒茶酚胺差向螢光和相對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)的策斯照相顯微鏡Ⅲ觀察。利用預(yù)固定的同等物計(jì)算相應(yīng)于至少3%的總表面積的對(duì)GIF顯示陽性的經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量。
3.特異的多巴胺和GABA攝入的評(píng)定的方法如伯杰B.(Berger B.)等(Neuroscience7193，1982)所述進(jìn)行特異的3H-多巴胺攝入的評(píng)定。此細(xì)胞用用葡萄糖(5mM)、CaCl2(1mM)、MgSO4(1mM)、抗壞血酸(0.1mM)、帕吉林(Pargyline)(0.1mM)補(bǔ)充的經(jīng)預(yù)熱的PBS(液)洗滌一次，并用0.8毫升上述溶液預(yù)培養(yǎng)5分鐘。必要時(shí)，將苯托品(5μM)、去甲基丙咪嗪(5μM)或氟塞丁(fluoxetine)(1μM)加至此培養(yǎng)基中。常規(guī)地，然后加入0.2毫升3H-多巴胺(50μM)最終濃度，SA(特異活性)22-33-Ci/mmol)，并在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘。通過移去此培養(yǎng)混合物而停止攝入，然后用冰冷的PBS迅速?zèng)_洗4次。然后，用0.5ml0.4M的HCl O4加無水乙醇(3∶1v/v)從每個(gè)碟中萃取H-多巴胺二次?；厥粘^95%。在添加10ml的InstagelⅡ(一種液體閃光計(jì)數(shù)液體)之后，用一種派卡德特立卡伯(Packard Tri Carb)閃光計(jì)數(shù)器(型號(hào)460 C)評(píng)定放射活性。對(duì)培養(yǎng)末期的個(gè)別試樣和洗液中用0.5ml的高氯酸(0.4N)萃取細(xì)胞內(nèi)的放射活性，并用高壓液相色譜法(HPLC)分析(科特克C.(Kotate C.)等，J.Neurosci，21307，1982;舒姆A.(Shum A.)等，J.Chromatog，228123，1982)。在多巴胺滯留時(shí)間內(nèi)聚集的放射活性超過注入的放射活性的95%。
如普羅切恩茲A.(Prochiantz A.)等所述(Nature 293570，1981)，在37℃下，用添加的0.1μM的14C-GABA(225mMCi.nmol)測(cè)試C-GABA的特異的攝入量15分鐘。氨基氧乙酸(10μM)被用于阻止GABA分解代謝。必要時(shí)，加入此GABA攝入抑制劑，二氨基丁酸(10-3M)。洗滌和萃取過程為那些研究H-多巴胺攝入所述的。通過薄層層析(TLC)進(jìn)行GABA的鑒別(拉謝R.S.(Lasher R.S.)Brain Res.69235，1974)。超過90%的放射活性與一個(gè)具有真實(shí)的GABA的點(diǎn)一起移動(dòng)。
4.在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的形態(tài)學(xué)評(píng)定，存活性和生物化學(xué)性質(zhì)在4天和8天體外培養(yǎng)后，存在于碟中的超過98%的粘附生存的細(xì)胞對(duì)于具有單細(xì)胞系的抗體RT97的免疫細(xì)胞化學(xué)的染色法為陽性免疫反應(yīng)。同樣，在培養(yǎng)物中，少于1%的此細(xì)胞，在總的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)具有GFAP抗血清的染色法具有免疫反應(yīng)性的。這表明在培養(yǎng)物中超過98%的此細(xì)胞可被分類為神經(jīng)元的成分。在培養(yǎng)物系統(tǒng)中的多巴胺能激活神經(jīng)元的數(shù)量的顯影表明這些細(xì)胞近似于存在于體外的總的細(xì)胞(繁殖)數(shù)量的0.1-0.2%。
在所用的培養(yǎng)物系統(tǒng)中的細(xì)胞的存活性在體外多至4天未變。然而，在體外，在4天和8天之間，存活性降至約60-80%。這不僅在形態(tài)學(xué)評(píng)定之后，而且在下列每個(gè)碟中的DNA含量和多巴胺能的細(xì)胞的數(shù)量的評(píng)定之后都很清楚。這表面所用的在培養(yǎng)物條件下的中腦神經(jīng)元細(xì)胞的存活性是有限的，且在存在于此培養(yǎng)物系統(tǒng)中的不同類型的細(xì)胞的存活性方面無顯著的變化發(fā)生(參見附圖4)。
附圖4為一個(gè)表示總的神經(jīng)元的變量、陽性的GIF的神經(jīng)元的變量和BZT-靈敏的多巴胺攝入的變量和時(shí)間關(guān)系圖。將此中腦細(xì)胞放在一種濃度為1×106細(xì)胞/35mm碟的培養(yǎng)物介質(zhì)中。
附圖4上顯示如下(內(nèi)容)DNA/碟(●-●);BZT-靈敏的多巴胺攝入(量)(○-○);GIF+細(xì)胞的數(shù)量/碟(塊直方圖);BZT-靈敏的多巴胺攝入(量)/103GIF+細(xì)胞(虛線直方圖)。
同樣確定在培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活性、7H-多巴胺的特異攝入量和在體外、在第4天與第8天之間14C-GABA降至約60-80%。這又指示著在存在于體外的各種細(xì)胞類型之間在特性方面無明顯的區(qū)別，且意味著這些攝入?yún)?shù)是在體外的細(xì)胞存活性的合適的標(biāo)記。
5.從純化過程的主要步驟中衍生的物質(zhì)的生物活性為此目的，在運(yùn)用前立即將從純化的主要步驟中衍生的冷凍干燥分成幾部分再懸浮起始體積1/10蒸餾水。根據(jù)彼得森G.L(Peterson G.L.)(Anal.Biochem.83346，1977)評(píng)定蛋白質(zhì)含量。用培養(yǎng)基稀釋試樣，通過米萊克斯(Millex)0.45微米的過濾器過濾，并在牛的血清白蛋白(1mg/ml)預(yù)飽和。然后，在鋪平板那天將適合量的經(jīng)過濾的物質(zhì)加至中腦細(xì)胞培養(yǎng)物中。同樣，將等量的牛的血清加至對(duì)照的細(xì)胞培養(yǎng)物中在各培養(yǎng)物中，每二天換一次介質(zhì)或交替地用從純化步驟中衍生的物質(zhì)補(bǔ)充或在對(duì)照培養(yǎng)物情況下用白蛋白補(bǔ)充。從各主要純化步驟衍生的物質(zhì)-在總的勻漿的酸沉淀之后所得到的粗上清液，從分子量范圍在10至30千道爾頓內(nèi)洗脫的萄聚糖凝膠G-150柱中所得到的流份和從用約1M乙酸銨洗脫的TSK-CM-3SW柱所得到的流分-均能提高存活性，即在培養(yǎng)物中的經(jīng)分離的胎兒的中腦神經(jīng)元的細(xì)胞存活并得到發(fā)育。在鋪板的(天0)那天起加至培養(yǎng)物介質(zhì)之后，粗培養(yǎng)物上層流份或白蛋白(對(duì)照培養(yǎng)物)在體外細(xì)胞培養(yǎng)物的第8天的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象，如附圖5A和5B中所示。這些附圖描述在添加10μg/ml的在對(duì)照培養(yǎng)物(附圖5A)中的白蛋白和10μg/ml在酸沉積及滲析總的勻漿液(附圖5B)所得到的上層萃取物之后，在體外(試驗(yàn)中)，在第8天時(shí)(出現(xiàn))胎兒鼠中腦細(xì)胞的典型現(xiàn)象。
同樣從總的DNA含量，每個(gè)碟子中多巴胺能的細(xì)胞的數(shù)量(附圖6)，及根據(jù)在體外(試驗(yàn)中)的時(shí)間3H-多巴胺和14C-GABA的特異攝入(量)的測(cè)定而得到證實(shí)。
附圖6表示在將10μg/ml白蛋白加至對(duì)照培養(yǎng)物(塊直方圖)以及添加10μg/ml在酸沉積及滲析總的勻漿液(虛線直方圖)后的上清液之后，體外(試驗(yàn))表明，在第8天時(shí)每個(gè)碟子中GIF+細(xì)胞的(例如，DA多巴胺能的)和DNA含量的數(shù)量的測(cè)定。三個(gè)為一組進(jìn)行分析，所得值±S.E.(意味著標(biāo)準(zhǔn)誤差)。附圖7表示根據(jù)多巴胺攝入的有關(guān)量與上層清液濃度的效果。這事實(shí)從每個(gè)碟子中的GABA和DNA攝入的確定中觀察到。
特別是，附圖7表示對(duì)BZT-靈敏的多巴胺攝入的各種濃度的牛腦的萃取物(在酸沉積及滲析總的勻漿后所得到的)的添加效果。將一種濃度為0.5×105細(xì)胞的中腦細(xì)胞/1毫升培養(yǎng)物介質(zhì)/池(24mm)中。在沉積時(shí)加入50μl/體積所示量的牛腦的萃取物。必要時(shí)，試樣用牛的血清白蛋白補(bǔ)充以達(dá)到40μg/ml蛋白質(zhì)的最終濃度。在體外(試驗(yàn)中)，在第4天測(cè)定攝入?yún)?shù)。三個(gè)試樣為一組進(jìn)行分析，所得值為±S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)的平均值。同時(shí)，這此結(jié)果表明活性物質(zhì)能提高存活和發(fā)育在體外(試驗(yàn)中)的各種神經(jīng)細(xì)胞類型，特別是那些存在于所用的培養(yǎng)物中的。盡管當(dāng)在(提取物的)上清液中，在用10和30千道爾頓(范圍)之間洗脫的葡聚糖凝膠G-150流份的池中及在用約1M的乙酸銨洗脫的TSK-CM-3 SW柱的流份組中測(cè)試營養(yǎng)活性時(shí)，可測(cè)得相似的效果，但這些效果必需的物質(zhì)的量不同。特別是，當(dāng)在體外(試驗(yàn)時(shí))加入濃度為約6μg/ml的顯示一種1/2最大(semimaximal)生物學(xué)活性的粗上層萃取物時(shí)，可測(cè)得在從葡聚糖凝膠G-150和TSK-CM-3SW柱中所得到在流份中的此1/2最大活性分別為約0.3μg/ml和10ng/ml(參見表1)。在體外(試驗(yàn)中)的其它類型的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的生物活性的測(cè)試，特別是從胎兒鼠紋狀體中分化的神經(jīng)元細(xì)胞，表明活性分子在存在于不同區(qū)域的神經(jīng)系統(tǒng)特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的各種神經(jīng)元類型的提高存活和發(fā)育方面(的作用)是有效的。進(jìn)一步講，在體外(試驗(yàn)中)活性物質(zhì)在增進(jìn)來自12天的胚胎小雞而不是來自8天的胚胎小雞的背側(cè)神經(jīng)末梢神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)的生長方面是有效的。這效果再一次表明神經(jīng)營養(yǎng)因子可以和自鼠唾液腺衍生的β-NGF有區(qū)別。實(shí)際上，添加各種濃度(從1ng至300ng/ml)的來自鼠唾液腺的β-NGF對(duì)在培養(yǎng)物中的常規(guī)所用的鼠的經(jīng)分化的中腦細(xì)胞的存活是無效的。
Ⅳ.由哺乳類動(dòng)物腦中所得到的神經(jīng)元營養(yǎng)因子在體內(nèi)的應(yīng)用本篇專利的另一個(gè)目標(biāo)是由哺乳類動(dòng)物腦中所得到的神經(jīng)元營養(yǎng)因子在體內(nèi)的應(yīng)用，如上面已經(jīng)討論過的，神經(jīng)元營養(yǎng)因子可調(diào)整神經(jīng)細(xì)胞的存活和神經(jīng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性(定義為神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于它所處的微生物環(huán)境的調(diào)整適應(yīng)的能力)，它不僅是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展方向，而且愈趨成熟。事實(shí)上，根據(jù)累積起來的證據(jù)，可以表明神經(jīng)因子可能這樣控制細(xì)胞的成熟過程(萬隆S.(Varon S.)discussions in Neuroscince第Ⅱ卷，第3篇，1985)。
Ⅰ.維持細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)和正常的細(xì)胞老熟即必定是充分地運(yùn)用神經(jīng)元營養(yǎng)因子，維持正常的營養(yǎng)需求，因此，體內(nèi)神經(jīng)變態(tài)的運(yùn)轉(zhuǎn)就反映了營養(yǎng)劑的不適當(dāng)。
Ⅱ.對(duì)于體內(nèi)化學(xué)和機(jī)械的細(xì)胞損壞進(jìn)行修復(fù)和重整，因?yàn)橛绕漭S突(神經(jīng)小胞)的損壞會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元營養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的供給缺乏，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)受到創(chuàng)傷或病理性的損傷甚至死亡，這其中可能也包括正常的老熟過程。
Ⅲ.在一些病理?xiàng)l件下，(萬隆S.ibid)的再生和死亡，即不同的病理?xiàng)l件伴隨不同的營養(yǎng)缺乏癥，營養(yǎng)供給系統(tǒng)的衰退或超過營養(yǎng)需要都可能導(dǎo)致營養(yǎng)缺陷。
從上面的觀點(diǎn)來看，這篇專利也引導(dǎo)了下列有關(guān)親神經(jīng)元因子SDNF的應(yīng)用，特別指出了不經(jīng)腸胃的用法(包括雖然并非全部是包括硬膜外的、腦池內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、舌下的、牙齦間的、直腸的和鼻骨的)，SDNF分子單獨(dú)進(jìn)入體內(nèi)或者與神經(jīng)節(jié)苷酯(尤其，牛腦神經(jīng)節(jié)苷酯混合劑，即從牛腦中所得到的單一神經(jīng)節(jié)苷酯片斷GM，以及半合成神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物，更好的是神經(jīng)節(jié)內(nèi)酯衍生物)，結(jié)合使用或和與磷酯(牛腦磷酸酯混合劑，或是單一的牛腦磷酯片斷及磷酯酰絲氨酸，或是半合成磷酯衍生物)相結(jié)合使用，這取決于神經(jīng)病理?xiàng)l件Ⅰ急性的、亞急性的、或慢性的神經(jīng)系統(tǒng)損傷;包括外部損傷、化學(xué)損傷、脈管損傷及缺損(如中風(fēng))，以及傳染性的、炎性的和因腫瘤引發(fā)的損傷。
Ⅱ神經(jīng)系統(tǒng)的老化包括阿爾茨海默病。
Ⅲ神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病。
Ⅳ神經(jīng)系統(tǒng)或影響神經(jīng)系統(tǒng)的免疫學(xué)疾病。
SDNF分子與神經(jīng)節(jié)苷酯及磷酯的聯(lián)合使用結(jié)果表明牛腦神經(jīng)節(jié)苷酯和牛腦磷酯可增加細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元營養(yǎng)因子的應(yīng)答活性，這在體外和很有可能在體內(nèi)的試驗(yàn)當(dāng)中反應(yīng)出來。
下面的表格描述了GM，和牛紋狀體浸出物對(duì)于中腦炎細(xì)胞培養(yǎng)的影響。
表2BIT-靈敏的3H- BABA-靈敏的DA攝入14C-GABA攝入物質(zhì) fmol/平板15分鐘 pmol/平板15分鐘白蛋白 29.51±5.78 0.56±0.14白蛋白+GM 69.14±3.38 1.04±0.05紋狀體浸出物 104.68±7.60 2.41±0.27紋狀體浸出物+GM 140.58±17.82 4.56±0.10＊中腦炎細(xì)胞(1×106/平板)在含中白蛋白(15μg/ml)或紋狀體浸出物(15μg/ml)的無血清培養(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)，或在培養(yǎng)基中再加入10-7mGM1。椐在Ⅲc中報(bào)道的攝入量試驗(yàn)的方法，將上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行四天，三個(gè)為一組進(jìn)行分析，所得平均值為±S.E.
牛紋狀體浸出物以前面所報(bào)導(dǎo)的方法(Ⅲa)進(jìn)行制備。
a.藥劑組成由哺乳動(dòng)物腦內(nèi)所得SDNF分子，再制備藥劑，這里不描述了，對(duì)于神經(jīng)節(jié)苷酯和磷酯可能是同樣的情況，包括我們所知道的合成有效的藥劑的方法及對(duì)病人的最佳用法都是一樣的，這就意味著，大量的SDNF有效活性與合適的藥物載體分不開。合適的載體和它們的配方包含一些蛋白質(zhì)，例如，在“雷明頓(Remington′s Phaema ceutical Sciences”一書(雷明頓的Pharmaceulical Sciencese.瑪克(Mack)印刷公司，伊斯頓(Easton)，Pa.美國，1985).中就有例子。這些載體介質(zhì)含有可注射的“已存儲(chǔ)的配方”。
由上可見，藥物配方包括(也不是全部的)SDNF溶液或是冷凍干燥的SDNF粉末與一個(gè)或更多的藥物載體或稀釋劑一起，該稀釋劑保存在一適當(dāng)pH緩沖劑和等滲性的生理液體中，表3表明的只是說明目的，而不應(yīng)受這些限制，這些體系制備成溶液的狀態(tài)，以對(duì)付神經(jīng)系統(tǒng)紊亂者。在冷凍干燥粉劑的制備時(shí)，要提供賦形劑，但這不是絕對(duì)的，也可采用甘露醇或甘氨酸，并要具備相應(yīng)的緩沖劑，緩沖劑的體積要求是能夠達(dá)到等滲性，緩沖劑的pH要求適當(dāng)，相似的溶液也可以用于SDNF分子的藥劑組成物，得在所需的一定體積的等滲溶液中形成，但這也不是絕對(duì)的，用磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖的生理含鹽水可得到多種藥物配方時(shí)所需的等滲溶液，并具一定所希望的pH，如中性pH等。
又為了所述的目的，表4A和4B列出一些治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的可能的藥劑組成。在表4A和4B中列出的藥劑組成每一劑量用兩個(gè)小瓶制備。第一個(gè)小瓶含有具有約0.01%至50活性物質(zhì)重量%的一種組成，與一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑，如甘氨酸或甘露醇。第二個(gè)小瓶含有一種用配成所需體積的磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖的鹽水溶液。在使用前混合此兩個(gè)小瓶中的物質(zhì)立即使用，且此冷凍干燥的活性物質(zhì)馬上溶解而得到一種可注射的溶液。表4B也列出了用于皮下注射的一種藥劑學(xué)組成的可能的實(shí)施例(系統(tǒng)5)。
此藥劑配方也包括，但不限于此，具有親脂性的例如，水溶性的、自行乳化的糖原白明膠的或其它類型的賦形劑直腸施用的栓劑。在此制備中，SDNF可以重量在總的賦形劑的0.001%和1%重量范圍內(nèi)存在。此栓劑的形式也可含有，但不限于此適合量的乙?；?水楊酸鹽。表5列出，僅為所述的目的，治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的可能的栓劑的制備。
進(jìn)一步講，以冷凍干燥的形式和作為溶液的SDNF的藥物制備均可包括有效劑量的上述磷脂或神經(jīng)節(jié)苷酯，例如，此劑量可分別與(雖然不是唯一的)通常用于人類治療神經(jīng)恢復(fù)或由于年老的神經(jīng)病所用的劑量一樣，且可根據(jù)施用途徑。SDNF的藥物學(xué)制備劑量和施用次數(shù)由所需的效果(由臨床試驗(yàn)決定)和施用途徑?jīng)Q定，例如，(施用的)劑量和次數(shù)可與通常用于用其它神經(jīng)元營養(yǎng)劑如NGF研究的一樣(雖然，不是唯一的)。
表3用于可注射的溶液的藥劑組成的實(shí)施例制備1-一個(gè)2ml的安瓿瓶包含活性物質(zhì) μg 5 (500TU)氯化鈉 mg 16檸檬酸鹽緩沖劑PH＝7 ml 2在無熱源的蒸餾水 q.b.中制備2-一個(gè)2ml的安瓿瓶包含活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)氯化鈉 mg 16檸檬酸鹽緩沖劑PH＝7 ml 2在無熱源的蒸餾水 q.b.中此營養(yǎng)單元(TU)如表1中定義。
表4A藥劑組成系統(tǒng)的實(shí)施例系統(tǒng)1a)一個(gè)2ml的小瓶包含冷凍干燥的活性物質(zhì) μg 5 (500TU)甘氨酸 mg 30b)一個(gè)2ml的小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 16
在水中的檸檬酸鹽緩沖劑 ml 2無熱原的蒸餾水 q.b.
系統(tǒng)2a)一個(gè)2ml的小瓶包含凍干的活性物質(zhì) μg 5 (500TU)甘露醇 mg 40b)一個(gè)2ml小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 16在水中的檸檬酸鹽緩沖劑 ml 2在無熱原的蒸餾水 q.b.
系統(tǒng)3a)一個(gè)3ml的小瓶包含冷干的活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)甘氨酸 mg 45b)一個(gè)3ml小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 24在水中的檸檬酸鹽緩沖劑 ml 3在無熱原的蒸餾水 q.b.
此營養(yǎng)單元的單位(TU)如表1中定義。
表4B藥物學(xué)組成系統(tǒng)的實(shí)施例系統(tǒng)4a)一個(gè)3ml的小瓶包含凍干的活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)甘露醇 mg 60
b)一個(gè)3ml的小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 24在水中的檸檬酸鹽緩沖劑 ml 3在無熱原的蒸餾水 q.b.
系統(tǒng)5(用于皮下注射的實(shí)施例)a)一個(gè)2ml的小瓶包含凍結(jié)的干燥的活性物質(zhì) μg 10 (1，000TU)甘氨酸 mg 30b)一個(gè)2ml小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 16在水中的檸檬酸鹽緩沖劑 ml 2無熱原的蒸餾水 q.b.
此營養(yǎng)單元單位(TU)如表1中定義。
表5以用于直腸途徑的栓劑形式(存在)的藥物學(xué)組成的實(shí)施例制備1活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)可可脂 g 2.5制備2活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)卡波蠟1540(carbo wax) g 1.75卡波蠟6000 g 0.75制備3
活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)吐溫61 g 2.125羊毛脂 g 0.25制備4活性物質(zhì) μg 100 (10，000TU)甘油 g 1.5水 g 0.75白明膠 g 0.25此營養(yǎng)單位(TU)如表1中定義。
權(quán)利要求
1.一種制備分子量大約為14，400道爾頓的堿性蛋白質(zhì)神經(jīng)元營養(yǎng)因子的方法，其特征為，所述方法包括如下步驟(a)哺乳動(dòng)物腦組織的勻槳化(b)對(duì)制得的勻槳進(jìn)行酸沉淀(c)用阻留分子量范圍為5至10千道爾頓的透析膜對(duì)得到的上清液進(jìn)行透析(c)根據(jù)分子量的大小對(duì)透析得到的上清液進(jìn)行層析分離。
2.如權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，還包括以下步驟(e)用乙酸銨緩沖液梯度洗脫的陽離子交換層析法對(duì)得到的神經(jīng)元營養(yǎng)活性組份進(jìn)行純化。
3.如權(quán)利要求
1或2所述之方法，其特征為，其中所述之哺乳動(dòng)物腦組織為牛腦組織。
4.如權(quán)利要求
1或2所述之方法，其特征為，將由牛腦分出的尾狀核用于上述方法的步驟中。
5.如權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，步驟(b)在pH4至5的酸度下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中的層析分離步驟(d)是用濃度為10n M至30n M之間的稀釋緩沖洗脫劑在分子篩上進(jìn)行的。
7.如權(quán)利要求
6所述之方法，其特征為，采用分離范圍為5，000至150，000道爾頓的固定相進(jìn)行分離。
8.如權(quán)利要求
2所述之方法，其特征為，用濃度自0.1M至1MpH自6至7的梯度乙酸銨緩沖液洗脫劑對(duì)陽離子交換層析柱進(jìn)行洗脫，而獲得神經(jīng)元營養(yǎng)活性組份。
9.如權(quán)利要求
1或2所述之方法，其中各步驟在0℃至6℃的溫度下進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求
1或2所述之方法，其特征為，將神經(jīng)元活性組份收集在一起并進(jìn)行冷凍干燥。
11.一種分子量大約14，400道爾頓的堿性蛋白質(zhì)神經(jīng)元營養(yǎng)因子。
12.如權(quán)利要求
11所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，該神經(jīng)元營養(yǎng)因子的等電點(diǎn)大約為10。
13.如權(quán)利要求
11所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，至少具有0.01mg/營養(yǎng)單位的專一活性，所述的神經(jīng)單位的定義為，使響應(yīng)于飽和濃度的活性物質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞存活的量大數(shù)目的一半存活時(shí)所需蛋白質(zhì)濃度(μg/ml)。
14.一種神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，該神經(jīng)元營養(yǎng)因子為哺乳動(dòng)物腦尾狀核中分離的堿性蛋白質(zhì)，具有神經(jīng)元營養(yǎng)活性，其分子量大約為14，4000道爾頓。
15.如權(quán)利要求
14所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，其等電點(diǎn)大約為10。
16.如權(quán)利要求
1所述方法制備的神經(jīng)元營養(yǎng)因子。
17.如權(quán)利要求
16所述之神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，當(dāng)用葡聚糖G-150進(jìn)行所述層析分離時(shí)，組份用圖1中的完全水平線段表示。
18.如權(quán)利要求
2所述方法制備的親神經(jīng)因子。
19.如權(quán)利要求
18所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，組份用圖2中的完全水平線段表示。
20.如權(quán)利要求
1或2所述的方法所制備的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，其特征為，該神經(jīng)元營養(yǎng)因子能夠促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的生存及分化。
21.一種含有神經(jīng)元營養(yǎng)活性數(shù)量的如權(quán)利要求
11所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子的復(fù)合藥物，及藥物上可接受的賦形劑或稀釋用載體。
22.一種含有神經(jīng)元營養(yǎng)活性數(shù)量的如權(quán)利要求
14或15所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子的復(fù)合藥物，及藥物上可接受的賦形劑或稀釋用載體。
23.一種含有神經(jīng)元營養(yǎng)活性數(shù)量的如權(quán)利要求
1或2所述方法制得的神經(jīng)元營養(yǎng)因子的復(fù)合藥物，及藥物上可接受的賦形劑或稀釋用載體。
24.如權(quán)利要求
21至23中任一項(xiàng)所述的藥物復(fù)合物，其特征為，還進(jìn)一步包括至少為一種神經(jīng)節(jié)脂或磷脂的組成成份。
25.一種對(duì)神經(jīng)元疾病的治療方法，其特征為，該方法包括對(duì)病人施以有效數(shù)量的如權(quán)利要求
11或14所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子。
26.如權(quán)利要求
25所述之方法，其特征為，所述的神經(jīng)元疾病為在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生的外傷性損傷、化學(xué)損傷、脈管損傷、脈管短缺、由感染或炎癥或腫瘤引起神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。
27.如權(quán)利要求
25所述的方法，其特征為，所述的神經(jīng)元疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的老化。
28.如權(quán)利要求
25所述之方法，其特征為，所述的神經(jīng)元疾病為慢性神經(jīng)變性或?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響的慢性免疫學(xué)疾病。
29.如權(quán)利要求
25所述之方法，其特征為，所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子是根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法制備的。
30.如權(quán)利要求
25所述的方法，其特征為，所述的神經(jīng)元營養(yǎng)因子至少是和一種神經(jīng)節(jié)甙脂或一種磷脂一起施用的。
專利摘要
一種新穎的神經(jīng)元營養(yǎng)因子，分子量大約為14,400道爾頓，等電點(diǎn)大約為10，通過以下方法制備將哺乳動(dòng)物腦組織，特別是牛腦組織勻漿化，對(duì)勻漿進(jìn)行酸沉淀，用阻留范圍為5至10千道爾頓的透析膜對(duì)上清液進(jìn)行透析，然后對(duì)經(jīng)透析的上清液進(jìn)行層析。神經(jīng)元營養(yǎng)活性組分可用乙酸銨梯度緩沖液對(duì)陽離子交換層析柱洗脫以進(jìn)一步純化。本發(fā)明的神經(jīng)元營養(yǎng)因子可用于各種神經(jīng)疾病的治療。
文檔編號(hào)C07K14/435GK87105478SQ87105478
公開日1988年2月17日 申請(qǐng)日期1987年8月7日
發(fā)明者弗朗西斯科·德拉瓦勒 申請(qǐng)人:菲迪安股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan