專利名稱：用咖啡酸苯乙酯衍生物、辣椒素和樹脂毒素抑制NF-kB的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑以及這些抑制劑在治療人體內(nèi)病理性病征的應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的5，6-二羥基雙環(huán)衍生物、CAPE的2，5-二羥基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺(nonenamide))和樹脂毒素來(lái)抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的方法，以及這些抑制劑在治療病理性病征(如中毒性休克、急性炎癥、急性時(shí)象反應(yīng)(phase response)、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥)中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是一種對(duì)B細(xì)胞具有特異性的蛋白質(zhì)，它與免疫球蛋白輕鏈κ基因座增強(qiáng)子區(qū)域中的特異性DNA序列結(jié)合。現(xiàn)已確定，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族成員存在于各種生物體(包括從蠅到哺乳動(dòng)物)中(參見(jiàn)Nolan等，Curr.Opin.Genet.Dev.2211-20(1992)；Liou等，Curr.Opin.Genet.Dev.5477-87(1993)；和Baeuerle和Henkel，Annu.Rev.Immunol.12141-79(1994))。該轉(zhuǎn)錄因子家族各成員間有35至61％的同源性，并且有約300氨基酸的Rel同源結(jié)構(gòu)域。
在哺乳動(dòng)物中，分布最廣的κB結(jié)合因子是由P50和P65(Rel-A)蛋白組成的異二聚物。該轉(zhuǎn)錄因子在各種應(yīng)答中起主要作用，它通過(guò)迅速誘導(dǎo)基因表達(dá)來(lái)引起宿主防御。特別是，它控制參與腫瘤轉(zhuǎn)移的各種炎性細(xì)胞因子、主要的組織適合性復(fù)合基因和粘著分子的表達(dá)。NF-κB以及依賴于NF-κB的基因的調(diào)節(jié)異常與各種病理性病征相關(guān)，它們包括中毒/膿毒性休克、移植物抗宿主反應(yīng)、急性炎癥、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒復(fù)制、放射性損傷、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥(參見(jiàn)Baeuerle和Henkel，Annu.Rev.Immunol.12141-79(1994)；和Siebenlist等，Annu.Rev.Cell.Biol.10405-55(1994))。
與其它轉(zhuǎn)錄因子不同，NF-κB蛋白被稱為IκBa的抑制性亞基束縛在細(xì)胞質(zhì)中呈無(wú)活性狀態(tài)。IκB的磷酸化以及其后的降解使得NF-κB轉(zhuǎn)運(yùn)到到胞核上。該活化過(guò)程由多種因素誘導(dǎo)，如炎性細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴毒素(LT)和白細(xì)胞介素(IL)-1)、促細(xì)胞有絲分裂劑、細(xì)菌產(chǎn)物、蛋白合成抑制劑、氧化應(yīng)力(H2O2)、紫外光和佛波酯。能下調(diào)NF-κB活化作用的試劑可用來(lái)治療這些病理性病征。本發(fā)明涉及一些這樣的試劑。
一種試劑是咖啡酸(3，4-二羥基肉桂酸)苯乙酯(CAPE)，它是蜂巢蠟?zāi)z中活性成分類黃酮的結(jié)構(gòu)類似物。它具有抗病毒、抗炎和調(diào)節(jié)免疫的性能，并且表現(xiàn)出能抑制不同類轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)(參見(jiàn)Grunberger等，Experientia 44230-32(1988)；Burke等，J.Med.Chem.384171-78(1995)；Su等，Cancer Res.541865-70(1994)；Su等，Mol.Carcinog.4231-42(1991)；Hlandon等，Arzneim.-Forsch./Drug Res.301847-48(1980)；和Guarini，L.等，Cell.Mol.Biol.38513-27(1992))。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，CAPE改變了氧化還原狀態(tài)并誘導(dǎo)了細(xì)胞程序死亡。而且，已經(jīng)報(bào)道了CAPE有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，具有抗氧化劑活性，并能抑制鳥氨酸脫羧酶、蛋白酪氨酸激酶和脂肪氧化酶的活性。CAPE也能抑制佛波酯誘導(dǎo)H2O2生成和誘發(fā)腫瘤增生(參見(jiàn)Bhimani等，Cancer Res.534528-33(1993)和Frenkel等，Cancer Res.531255-61(1993))。
本文中公開的另一種這樣的下調(diào)劑是辣椒素。辣椒素是高香草酸衍生物(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)，分子量為305.42。它是辣椒屬紅辣椒中的活性成分，并已用于人體局部治療束狀頭痛、帶狀皰疹和血管舒縮性鼻炎(參見(jiàn)Holzer，P.，Pharmacol.Rev.43143(1994)；Sicuteri等，Med.Sci.Res.161079(1988)；Waston等，Pain 33333(1988)；Marabini等，Regul.Pept.221(1988))。辣椒素能在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、膠原酶的合成以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液細(xì)胞(synoviocyte)分泌前列腺素(參見(jiàn)Matucci-Cerinic等，Ann.Rheum.Dis.49598(1990))。辣椒素也具有免疫調(diào)節(jié)性，這表現(xiàn)為它能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖、抗體的產(chǎn)生和嗜中性細(xì)胞趨化作用(參見(jiàn)Nilsson等，J.Immunopharmac.10747(1988)；Nilsson等，J.Immunopharmac.1321(1991)；和Eglezos等，J.Neuroimmunol.26131(1990))。這些作用在辣椒素治療關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用中起重要作用。另外，辣椒素能誘導(dǎo)線粒體腫脹、抑制NADH氧化酶、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡、刺激腺苷酸環(huán)化酶、激活蛋白激酶C、抑制超氧化物陰離子的產(chǎn)生，以及改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。
辣椒素的各種作用是通過(guò)一種與樹脂毒素(resiniferatoxin)共享的稱為類似香草堿(vanilloid)受體的特異性細(xì)胞受體來(lái)介導(dǎo)的。與辣椒素一樣，樹脂毒素是從大戟屬植物中獲得的生物堿。樹脂毒素是辣椒素的結(jié)構(gòu)同系物(見(jiàn)

圖1)。樹脂毒素在結(jié)構(gòu)上也與佛波酯(佛波醇肉豆寇酸·乙酸酯(phorbol myristate acetate))相似，該佛波酯能與不同的結(jié)合部位相互作用并激活蛋白激酶C(參見(jiàn)Szallasi等，Neurosci.30515(1989)；和Szallasi和Blumberg，Neurosci.30515(1989))。與樹脂毒素不同，辣椒素與佛波醇肉豆寇酸·乙酸酯并不同系，但是它能象樹脂毒素一樣激活蛋白激酶C，這說(shuō)明后一活化并不是由于樹脂毒素中的類似佛波酯的部分引起的。已經(jīng)知道，樹脂毒素能模擬許多辣椒素的作用。
因此，用咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的2，5-二羥基衍生物、CAPE的5，6-二羥基雙環(huán)衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)和樹脂毒素來(lái)抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的方法是已有技術(shù)中未知的。抑制NF-κB是治療由炎性細(xì)胞因子、促細(xì)胞有絲分裂劑、氧化應(yīng)力、佛波酯及其它試劑活化NF-κB引起的各種病理性病征中重要的步驟。本發(fā)明滿足了治療這些病理性病征領(lǐng)域中長(zhǎng)期存在的需求和希望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用各種抑制劑來(lái)抑制NF-κB活化的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供的抑制劑是咖啡酸苯乙酯(CAPE)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供的NF-κB的抑制劑是咖啡酸苯乙酯(CPAE)的2，5-二羥基衍生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供的NF-κB的抑制劑是咖啡酸苯乙酯(CAPE)的5，6-二羥基雙環(huán)衍生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供的抑制劑是辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)。
在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了樹脂毒素作為NF-κB的抑制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療由個(gè)體內(nèi)NF-κB活化而引起的病理性病征的方法，該方法包括對(duì)待治療的個(gè)體給予咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的5，6-雙環(huán)二羥基衍生物、CAPE的2，5-二羥基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)或樹脂毒素。
本發(fā)明這方面的各種實(shí)施例包括提供治療諸如中毒/膿毒性休克、移植物抗宿主反應(yīng)、急性炎癥、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒感染、放射性損傷易感性、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥之類的病理性病征的方法，該方法包括對(duì)待治療的個(gè)體給予咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的2，5-二羥基衍生物、CAPE的5，6-雙環(huán)二羥基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)或樹脂毒素。
本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)可以從下述的本發(fā)明較佳實(shí)施例中明顯獲得。給出這些實(shí)施例的目的只是為了公開本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述圖1示出了CAPE抑制依賴于TNF的NF-κB的劑量-反應(yīng)方式和動(dòng)力學(xué)。1A使U937細(xì)胞(2×106/ml)與指定濃度的CAPE 37℃預(yù)培育2小時(shí)，然后與0.1nM TNF一起培育15分鐘。
1B上圖為了對(duì)NF-κB活化進(jìn)行超移動(dòng)(supershift)和特異性分析，從未處理過(guò)的或TNF(0.1nM)處理過(guò)的細(xì)胞中制得核抽提物，與抗體一起培育30分鐘，然后測(cè)定NF-κB。
1B下圖使細(xì)胞與25μg/ml CAPE在37℃預(yù)培育不同的時(shí)間，然后測(cè)定不用或用0.1nM TNF 37℃15分鐘后NF-κB的活化情況。(-)表示在加入TNF前有CAPE存在，(0)表示CAPE與TNF共同培育，(+)表示在TNF后加入CAPE。在這些處理后，制得核抽提物并測(cè)定NF-κB。任意單位表示各條帶中放射性的相對(duì)量。
圖2證明了CAPE對(duì)佛波酯肉豆蔻酸·乙酸酯、神經(jīng)酰胺、岡田酸和H2O2介導(dǎo)的NF-κB活化有(抑制)作用。使U937細(xì)胞(2×106/ml)與CAPE(25μg/ml)37℃預(yù)培育120分鐘，然后在37℃用佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯(100ng/ml，60分鐘)、H2O2(0.5mM，30分鐘)、神經(jīng)酰胺C8(10μM，30分鐘)或?qū)锼?500nM，30分鐘)處理，再測(cè)定NF-κB的活化情況。另外再對(duì)佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯介導(dǎo)的活化進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定。
圖3示出了CAPE對(duì)NF-κB與DNA結(jié)合的(抑制)作用。對(duì)于圖3A，將從經(jīng)TNF激活的U937細(xì)胞中制得的核抽提物與指定濃度的CAPE在37℃培育30分鐘，然后分析NF-κB的活化情況。對(duì)于圖3B，在有或沒(méi)有指定濃度的CAPE存在下，用脫氧膽酸處理未經(jīng)處理的細(xì)胞的胞質(zhì)抽提物，分析NF-κB的活化情況。
圖4示出了CAPE對(duì)AP-1、Oct-1和TFII D轉(zhuǎn)錄因子的影響。用25μg/ml的CAPE在37℃處理細(xì)胞2小時(shí)，制得核抽提物用于電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定。
圖5
示出了CAPE對(duì)TNF誘導(dǎo)的IκBa降解以及對(duì)胞質(zhì)和胞核中p65水平的影響。使經(jīng)過(guò)或未經(jīng)CAPE(25μg/ml)37℃預(yù)處理2小時(shí)的U937細(xì)胞(2×106/ml)與和不與TNF(0.1nM)一起培育不同的時(shí)間，然后測(cè)定IκBa(上圖)。對(duì)于p65(下圖)，使經(jīng)或未經(jīng)CAPE(25μg/ml)37℃預(yù)處理2小時(shí)的細(xì)胞，與和不與TNF(0.1nM)一起培育15分鐘，制得細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抽提物，用western印跡法測(cè)定p65。
圖6表示DTT、BME和DMP對(duì)CAPE誘導(dǎo)的NF-κB活化抑制的影響。在CAPE(25μg/ml)存在或不存在下，使U937細(xì)胞(2×106/ml)與DTT(100μM)、BME(142μM)或DMP(100μM)一起培育2小時(shí)，用TNF(0.1nM)活化15分鐘，然后測(cè)定NF-κB的活化情況。
圖7顯示了不同的CAPE類似物的結(jié)構(gòu)(7A)及其對(duì)TNF誘導(dǎo)NF-κB活化的影響(7B)。使U-937細(xì)胞(2×106/ml)與不同的CAPE類似物(25μg/ml)37℃培育2小時(shí)，用(上圖)或不用(下圖)TNF(0.1nM)活化15分鐘，測(cè)定NF-κB的活化情況。C表示只經(jīng)過(guò)TNF處理，P表示用母化合物CAPE然后用TNF處理。任意單位代表存在的放射活性的相對(duì)量。
圖8示出了辣椒素、樹脂毒素和佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是同系的。
圖9示出了電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定的結(jié)果，該結(jié)果表明辣椒素抑制依賴于TNF的NF-κB活化的劑量-反應(yīng)方式和動(dòng)力學(xué)。
9A使ML-1a細(xì)胞(2×106/ml)與不同濃度的辣椒素在37℃預(yù)培育2小時(shí)，然后用或不用0.1nM TNF活化15分鐘。
9B使細(xì)胞(2×106/ml)與300μM辣椒素在37℃預(yù)培育2小時(shí)，然后測(cè)定在37℃用所示不同濃度的TNF活化15分鐘后的NF-κB活化情況。
9C使ML-1a細(xì)胞(2×106/ml)與300μM辣椒素在37℃預(yù)培育不同的時(shí)間，然后測(cè)定在37℃用0.1nM TNF活化15分鐘后的NF-κB活化情況。(-)表示在加入TNF前，辣椒素存在的時(shí)間；(0)表示與TNF共同培育；(+)表示在TNF后，加入辣椒素的時(shí)間。在這些處理后，制得核抽提物并測(cè)定NF-κB。
圖10示出了樹脂毒素抑制依賴于TNF的NF-κB活化的劑量-反應(yīng)方式。使細(xì)胞(2×106/ml)與所示不同濃度的樹脂毒素在37℃預(yù)培育2小時(shí)，用0.1nM TNF 37℃活化30分鐘，然后測(cè)定NF-κB。在這些處理后，制得核抽提物，然后測(cè)定NF-κB。UT表示未經(jīng)處理的細(xì)胞。
圖11超移動(dòng)試驗(yàn)和辣椒素對(duì)NF-κB活化的抑制作用的特異性。對(duì)于圖(A)，從未經(jīng)TNF(0.1nM)處理的或經(jīng)處理的細(xì)胞(2×106/ml)中制得核抽提物，與抗體培育30分鐘，然后測(cè)定NF-κB。對(duì)于圖(B)，用不同濃度的辣椒素處理細(xì)胞2小時(shí)，再用TNF處理15分鐘，制得細(xì)胞質(zhì)抽提物，用8％脫氧膽酸處理這些抽提物，用電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定測(cè)定NF-κB。對(duì)于圖(C)，使經(jīng)TNF處理過(guò)的細(xì)胞的核抽提物與不同濃度的辣椒素培育15分鐘，用電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定分析NF-κB。
圖12示出了辣椒素對(duì)不同NF-κB活化劑(佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯和岡田酸)的影響。對(duì)于圖12A，使ML-1a細(xì)胞(2×106/ml)與辣椒素在37℃預(yù)培育2小時(shí)，用佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯(25ng/ml)、岡田酸(500nM)或TNF(0.1nM)處理30分鐘，然后測(cè)定NF-κB的活化情況。用100倍過(guò)量的、冷的或突變的寡核苷酸來(lái)測(cè)定結(jié)合特異性。標(biāo)記為Mut.探針的泳道系將突變的探針作標(biāo)記然后用來(lái)檢測(cè)此結(jié)合。
對(duì)于圖12B，使指定濃度的辣椒素與U-937或Hela細(xì)胞(2×106/ml)在37℃預(yù)培育2小時(shí)，然后用TNF(0.1nM)活化15分鐘，然后測(cè)定NF-κB。
圖13示出了辣椒素對(duì)TNF誘導(dǎo)的IkBa降解和對(duì)p65水平的影響。
13A使未經(jīng)處理的或用300μM辣椒素在37℃預(yù)處理2小時(shí)的ML-1a(2×106/ml)細(xì)胞與TNF(0.1nM)培育不同的時(shí)間，然后用western印跡分析測(cè)定胞質(zhì)級(jí)分中的IκBa。S和N表示緩慢遷移和正常遷移的條帶。
13B用辣椒素處理細(xì)胞不同的時(shí)間，然后用western印跡分析測(cè)定胞質(zhì)級(jí)分中的IκBa或p65。
13C使經(jīng)辣椒素預(yù)處理2小時(shí)的ML-1a細(xì)胞(2×106/ml)與TNF(0.1nM)一起培育30分鐘，然后用Western印跡分析測(cè)定核抽提物和細(xì)胞質(zhì)抽提物中的p65。
13D用不同濃度的辣椒素預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)，然后用或不用TNF(0.1nM)處理15分鐘，再用western印跡分析測(cè)定胞質(zhì)級(jí)分中的p50或c-Rel。
圖14示出了辣椒素對(duì)與CAT基因相連的IκBa啟動(dòng)子的活性的影響。用pIκBCAT和pmutIκBCAT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用300μM辣椒素處理該細(xì)胞2小時(shí)并使其接觸0.1nM TNF 1小時(shí)，測(cè)定CAT活性。結(jié)果用未經(jīng)處理的對(duì)照的活性倍數(shù)表示。
本文包括了這些附圖，這樣就能清楚詳細(xì)地了解本發(fā)明的上述特征、優(yōu)點(diǎn)和目的。這些附圖組成了本說(shuō)明書的一部分。然而，應(yīng)當(dāng)注意，附圖只是描述了本發(fā)明的較佳實(shí)施例，其不應(yīng)被認(rèn)為限制了本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
在對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神下顯然可對(duì)本文公開的發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核因子NF-κB”或“NF-κB”應(yīng)指對(duì)B細(xì)胞有特異性的、與免疫球蛋白輕鏈κ基因座增強(qiáng)子區(qū)域中的特異性DNA序列(5-GGGGACTTTCC-3)結(jié)合的蛋白，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)是由p50和p65(Rel-A)蛋白組成的異源二聚物。NF-κB在各種應(yīng)答中起主要作用，其通過(guò)迅速誘導(dǎo)基因表達(dá)來(lái)引起宿主防御，并控制參與腫瘤轉(zhuǎn)移的各種炎性細(xì)胞因子、主要的組織適合性復(fù)合基因和粘著分子的表達(dá)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“CAPE”指咖啡酸(3，4-二羥基肉桂酸)苯乙酯。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“CAPE的5，6-二羥基雙環(huán)衍生物”指圖7A中化合物編號(hào)6表示的CAPE類似物分子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“CAPE的2，5-二羥基衍生物”指圖7A中化合物編號(hào)1表示的CAPE類似物分子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“辣椒素”指高香草酸衍生物，8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺，其分子量為305.42。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“樹脂毒素”指圖8B所示辣椒素的結(jié)構(gòu)同系物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“病理性病征”指與疾病有關(guān)或由疾病引起的病征。這些病征可以包括(但不局限于)，中毒或膿毒性休克、移植物抗宿主反應(yīng)、急性炎癥、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒復(fù)制、放射性損傷、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“試劑的治療有效量”指試劑量在生理上是顯著的，并能改善個(gè)體的健康狀況。如果試劑的存在改變了接受者的生理狀況，則稱試劑“在生理上是顯著的”。例如，在治療病理性病征時(shí)，給予的劑量能緩解或阻止病征的進(jìn)一步發(fā)展，則認(rèn)為給予的試劑在生理上是顯著的，并且在治療上是有效的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“CAT”指氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明涉及用各種抑制劑來(lái)抑制NF-κB活化的方法。另外還考慮了治療個(gè)體內(nèi)由NF-κB的活化引起的病理性病征的方法。
對(duì)于治療應(yīng)用，分子藥理學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員能不進(jìn)行多余的實(shí)驗(yàn)即可確定本發(fā)明中抑制NF-κB活化的新穎的抑制劑的合適劑量和給藥途徑。
給出下列實(shí)施例只是為了描述本發(fā)明的各種實(shí)例，而并不意味著以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1材料青霉素、鏈霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO(GrandIsland，NY)。佛波酯和牛血清白蛋白鹽購(gòu)自Sigma Chemical Co.(St.Louis.MO)。從細(xì)菌獲得的、并經(jīng)純化至均質(zhì)的比活為5×107單位/毫克的重組人TNF由Genentech，Inc.(South San Franciso，CA)提供?？笽κBa的抗體、細(xì)胞周期蛋白D1和NF-κB亞基p50和p65，以及具有AP-1和Oct-1共有序列的雙鏈寡核苷酸購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。神經(jīng)酰胺(C8)購(gòu)自Calbiochem(SanDiego，CA)。Tris、甘氨酸、NaCl、SDS、樹脂毒素、佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯、氯霉素和牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。32P-標(biāo)記的γ-ATP(比活為7000Ci/毫摩爾)購(gòu)自ICN(Costa Mesa，Ca)。岡田酸(OA)購(gòu)自LCLaboratories(Woburn，MA)，辣椒素購(gòu)自Tocris Cookson Inc.(St.Louis，MO)，乙酰輔酶A購(gòu)自Pharmacia Biotech(Alameda，CA)，氚化的乙酰輔酶A購(gòu)自AmershamLife Sciences(Arlington Heights，IL)。GIBCO-BRL磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)試劑盒(Cat.#18306-019)購(gòu)自Life Technologies(Madison，WI)。
CAPE及其類似物為了進(jìn)行結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的研究，如Grunberger等，Experientia 44230-32(1988)和Burke等，J.Med.Chem.384171-78(1995)所述，合成幾個(gè)CAPE的類似物。這些類似物包括環(huán)取代基、酯基、旋轉(zhuǎn)受限的變異體以及飽和的酰胺類似物。在50℃乙醇中制得濃度為1-5mg/ml的CAPE及其類似物的貯備液，再在細(xì)胞培養(yǎng)基中作進(jìn)一步稀釋。
細(xì)胞系對(duì)于CAPE研究，使人組織細(xì)胞型細(xì)胞系U937細(xì)胞在補(bǔ)加了谷氨酰胺(2mM)、慶大霉素(50mg/ml)和胎牛血清(FBS)(10％)的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)生長(zhǎng)。將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/毫升的密度接種入含10毫升培養(yǎng)基的T25燒瓶(Falcon 3013，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)中，并在37℃、95％空氣和5％CO2下生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)物每隔3或4天分裂一次。有時(shí)，用DNA為基的試劑盒(購(gòu)自Gen-Probe，San Diego，CA)測(cè)定細(xì)胞中支原體的污染情況。
對(duì)于辣椒素和樹脂毒素的研究采用ML-1a細(xì)胞，它是一種人骨髓單核母細(xì)胞白血病細(xì)胞系，由Dr.Ken Takeda(Showa University，Japan)提供；U-937和Hela細(xì)胞系(從ATCC獲得)。使細(xì)胞在補(bǔ)加了谷氨酰胺(2mM)、慶大霉素(50mg/ml)和胎牛血清(FBS)(10％)的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)生長(zhǎng)。將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/毫升的密度接種入含10毫升培養(yǎng)基的T25燒瓶(Falcon 3013，Becton Diekinson Labware，Lincoln Park，NJ)中，并在37℃、95％空氣和5％CO2生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)物每隔3或4天分裂一次。
DNA構(gòu)建物氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因上游連接有0.2kb片段的IκBa質(zhì)粒pIκBCAT，以及含有與CAT相連的、但具有NF-κB突變位點(diǎn)的0.2kb片段的質(zhì)粒pmutIκBCAT由M.D.Anderson Cancer Center，H6uston，TX的Dr.PaulChiao提供。這些質(zhì)粒的性質(zhì)鑒定在Schreiber等，Nucleic Acids Res.176419(1989)中有詳細(xì)描述。
實(shí)施例2電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定這些試驗(yàn)如以前Chaturvedi等，J.Biol.chem.26914575-83(1994)以及Schreiber等，Nucleic Acids Res.176419(1989)中詳細(xì)描述的那樣進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，用冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2×106個(gè)細(xì)胞，然后懸浮在0.4ml裂解緩沖液(10mM HEPES pH7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mMEGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF，2.0mg/ml亮抑酶肽，2.0mg/ml抑蛋白酶肽和0.5mg/ml苯甲脒)中。使細(xì)胞在冰上溶脹15分鐘，然后加入12.5ml 10％NP-40。然后使試管劇烈旋渦10秒種，再離心勻漿物30秒種。將細(xì)胞核沉淀重新懸浮在25μl冰冷的核抽提物緩沖液(20mM HEPES pH7.9，0.4M NaCl，1mM EDTA，lmMEGTA，1mM DTT，1mM PMSF，2.0mg/ml亮抑酶肽，2.0mg/ml抑蛋白酶肽和0.5mg/ml苯甲脒)中，置于冰上培育30分鐘間以混合攪拌。使樣品4℃離心5分鐘，上清液(核抽提物)可立即使用，或保藏在-70℃。用Bradford，M.M.，Anal.Biochem.72248-254(1976)所述的方法測(cè)定蛋白含量。
電泳遷移率變動(dòng)分析如下進(jìn)行使4mg核抽提物與16fmol32P末端標(biāo)記的HIV-LTR的45聚雙鏈NF-κB寡核苷酸5′-TTGTT ACAAG GGACTTT CCGCTGGGGAC TTTCCA GGGAG GCGTGG-3′(Nabel，G.和Baltimore，D.，Nature326711-13(1987))37℃培育15分鐘。培育混合物包括在結(jié)合緩沖液(25mM HEPESpH7.9，0.5mM EDTA，0.5 mM DTT，1％NP-40，5％甘油和50mM NaCl)中的2-3mg聚(dI-dC)。在4.5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上用含有50mM Tris，200mM甘氨酸pH8.5和1mM EDTA的緩沖液使形成的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與游離的寡核苷酸分離，然后干燥凝膠。用雙鏈突變的寡核苷酸5′-TTGTTA CAACTC ACTTTCCGCTGCTCAC TTTCCA GGGAGG CGTGG-3′來(lái)檢測(cè)NF-κB與DNA結(jié)合的特異性。結(jié)合特異性還可通過(guò)與未標(biāo)記的寡核苷酸競(jìng)爭(zhēng)來(lái)檢測(cè)。
對(duì)于超移動(dòng)試驗(yàn)，在對(duì)復(fù)合物進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析前，使從經(jīng)TNF處理過(guò)的細(xì)胞中制得的核抽提物在室溫下與抗NF-κB的p50或p65亞基的抗體一起培育30分鐘(Singh，S.和Aggarwal，B.B，J.Biol.Chem.27010631-39(1995))。另加入抗細(xì)胞周期蛋白D1的抗體作為陰性對(duì)照。
對(duì)AP-1、TFII D和Oct-l作電泳遷移率變動(dòng)分析，如NF-κB一樣，也用32P末端標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸。如Singh，S.和Aggarwal，B.B，J.Biol.Chem.27010631-39(1995)中所述的，常規(guī)用過(guò)量未標(biāo)記的寡核苷酸競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定對(duì)結(jié)合的特異性。使放射活性條帶顯色，并用磷光測(cè)定儀(phosphorimager)(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)和“Image-quant”軟件對(duì)其作定量測(cè)定。
實(shí)施例3Western印跡分析IκBa和p65為分析IκBa，在NF-κB活化反應(yīng)后，將核后(postnuclear)抽提物溶解在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。為了測(cè)定p65水平，將核和核后(細(xì)胞質(zhì))抽提物溶解在8％SDS聚丙烯酰胺凝膠中。將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到Immobilon P膜上，用抗IκBa或抗p65的兔多克隆抗體作為探針進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(ECL-Amersham；30)。
實(shí)施例4CAPE對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的(抑制)作用用U937細(xì)胞來(lái)作這些研究，因?yàn)殛P(guān)于U937細(xì)胞對(duì)因各種刺激而活化的NF-κB反應(yīng)已作了很好地性質(zhì)鑒定(參見(jiàn)Reddy，等，J.Biol.Chem.26925369-72(1994))。在這些實(shí)驗(yàn)中，所有濃度的CAPE及其類似物均獲得了98％以上的細(xì)胞存活率。使U937細(xì)胞與不同濃度的CAPE預(yù)培育2小時(shí)，再用TNF(0.1nM)在37℃處理15分鐘，然后檢測(cè)NF-κB的活化情況。結(jié)果(圖1A)表明CAPE以劑量依賴方式抑制了TNF依賴的NF-κB活化，在25μg/ml時(shí)有最大效果。在未經(jīng)TNF處理的細(xì)胞、或只用載體(乙醇)處理過(guò)的細(xì)胞或只廚CAPE處理過(guò)的細(xì)胞中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NF-κB活化。
為了表明在經(jīng)TNF處理過(guò)的細(xì)胞中電泳遷移率變動(dòng)分析所見(jiàn)的滯后條帶的確是NF-κB，將核抽提物與抗p50(NF-κBl)或p65(Rel A)亞基的抗體分開來(lái)培育，然后進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖1B，上圖)表明，抗NF-κB中任一亞基的抗體使條帶移動(dòng)至較高分子量處，這說(shuō)明TNF活化的復(fù)合物由p50和p65亞基組成?？辜?xì)胞周期蛋白D的非特異性的抗體對(duì)NF-κB的遷移率沒(méi)有影響。另外，當(dāng)采用了未標(biāo)記的寡核苷酸(100倍過(guò)量)時(shí)，經(jīng)TNF處理過(guò)的細(xì)胞中電泳遷移率變動(dòng)分析所見(jiàn)的滯后條帶消失，而當(dāng)采用了突變型寡核苷酸時(shí)，條帶卻不會(huì)消失(圖1B，上圖)。
在加入TNF前120、90、60和30分鐘時(shí)、在加入TNF的同時(shí)、在加入TNF后5和10分鐘時(shí)，使細(xì)胞與CAPE一起培育，以檢測(cè)抑制動(dòng)力學(xué)。細(xì)胞用TNF處理15分鐘。只有當(dāng)細(xì)胞預(yù)先用CAPE處理過(guò)時(shí)，TNF反應(yīng)才會(huì)受到抑制(圖1B，下圖)。用TNF和CAPE共同處理細(xì)胞是無(wú)效的。
實(shí)施例5CAPE也能抑制由佛波酯、神經(jīng)酰胺、岡田酸和過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的NF-κB活化佛波酯(佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯)、神經(jīng)酰胺、岡田酸和過(guò)氧化氫也能誘導(dǎo)NF-κB的活化(Meyer，等，EMBO J.122005-15(1993))。然而，這些試劑誘導(dǎo)導(dǎo)致NF-κB活化的初始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同。因此，檢測(cè)CAPE對(duì)這些不同試劑活化轉(zhuǎn)錄因子的(抑制)作用。圖2中的結(jié)果表明CAPE完全阻斷了所有四種試劑誘導(dǎo)的NF-κB活化，這表明CAPE作用于導(dǎo)致NF-κB活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的趨同(converge)步驟。
實(shí)施例6CAPE特異性地抑制NF-κB(而不是其它轉(zhuǎn)錄因子)與DNA的結(jié)合TPCK(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和除莠霉素(蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑)均表現(xiàn)出能通過(guò)干擾NF-κB與DNA的結(jié)合來(lái)阻斷NF-κB的活化(Finco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9111884-88(1994)；和Mahon，T.M.和O′Neill，L.A.J.，J.Biol.Chem.27028577-64(1995))。為了測(cè)定CAPE對(duì)NF-κB與DNA的結(jié)合的影響，使預(yù)先用TNF活化的細(xì)胞的核抽提物與各種濃度的CAPE一起培育。電泳遷移率變動(dòng)分析(圖3，上圖)表明CAPE能防止NF-κB與DNA結(jié)合。由于IκBa也可通過(guò)洗滌劑(如脫氧膽酸)溫和處理從NF-κB上解離下來(lái)，因此檢測(cè)經(jīng)脫氧膽酸處理過(guò)的細(xì)胞質(zhì)抽提物與經(jīng)或未經(jīng)CAPE處理的DNA結(jié)合的能力。同樣，CAPE也干擾了NF-κB蛋白與DNA的結(jié)合(圖3，下圖)。
測(cè)試CAPE抑制其它轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1、TFII D和Oct-1)結(jié)合的能力。CAPE對(duì)NF-κB結(jié)合的抑制作用是特異性的，因?yàn)樗灰种破渌D(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力(圖4)。
實(shí)施例7CAPE不抑制依賴于TNF的IκBa磷酸化和降解NF-κB轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核上是通過(guò)IκBa的磷酸化和蛋白水解來(lái)進(jìn)行的(參見(jiàn)Thanos，D.和Maniatis，T.，Cell80529-32(1995))。為了確定CAPE的抑制作用是否是因?yàn)閷?duì)IκBa降解有抑制作用，用western印跡分析檢測(cè)IκBa蛋白的細(xì)胞質(zhì)水平。如圖5上圖所示，用CAPE處理細(xì)胞對(duì)IκBa的細(xì)胞質(zhì)庫(kù)沒(méi)有影響，但是用TNF處理細(xì)胞卻會(huì)使IκBa條帶在5分鐘內(nèi)減少，在15分鐘時(shí)完全消失，然后在30分鐘時(shí)重現(xiàn)。CAPE的存在對(duì)TNF誘導(dǎo)IκBa降解的速率沒(méi)有顯著影響，但是它延遲了IκBa的重新合成。這種延遲可能是一種反饋調(diào)節(jié)，因?yàn)镮κBa的重新合成取決于NF-κB的活化。
由于NF-κB活化需要NF-κBp65亞基的核轉(zhuǎn)運(yùn)，因此用western印跡分析來(lái)檢測(cè)p65蛋白的胞質(zhì)和胞核庫(kù)。如圖5下圖所示，沒(méi)有一種處理明顯改變了p65的胞質(zhì)庫(kù)，但是TNF誘導(dǎo)的胞核內(nèi)p65的出現(xiàn)被CAPE阻斷。在經(jīng)TNF處理過(guò)的細(xì)胞中，p65相應(yīng)胞質(zhì)庫(kù)中的降低量并不顯著，這可能是因?yàn)樵诨罨瘯r(shí)，只有20％的p65被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核中。
實(shí)施例8還原劑逆轉(zhuǎn)了CAPE的作用已經(jīng)知道，過(guò)釩酸鹽、TPCK和除莠霉素A抑制NF-κB活化的生物作用可被還原劑逆轉(zhuǎn)。因此，測(cè)定DTT、2，3-二巰基丙醇(DMP)和β巰基乙醇(BME)使CAPE作用逆轉(zhuǎn)的能力。在有或沒(méi)有DTT、DMP或BME存在下，用CAPE處理細(xì)胞，并檢測(cè)用TNF活化NF-κB的情況。如圖6所示，沒(méi)有一種還原劑本身對(duì)依賴于TNF的NF-κB活化有明顯影響，但是所有的還原劑均使CAPE誘導(dǎo)的抑制作用完全逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果暗示，巰基在依賴于TNF的活化NF-κB中起關(guān)鍵作用。
實(shí)施例9對(duì)CAPE的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系的研究為了進(jìn)一步描述CAPE在抑制NF-κB活化中的作用，采用具有四類不同修飾的CAPE類似物。這些類似物包括環(huán)取代基(化合物1、2、3)、酯基團(tuán)(化合物4)、旋光受限的變體(化合物5和6)和飽和的酰胺類似物(化合物7和8)，它們均顯示在圖7A中。以前已經(jīng)對(duì)這些類似物抑制人HIV整合酶和細(xì)胞生長(zhǎng)的能力作了性質(zhì)鑒定(參見(jiàn)Burke等，J.Med.Chem.384171-78(1995))。盡管所有這些化合物在抑制NF-κB活化上具有活性，但是它們的抑制能力有顯著差別(圖7B)。
從3，4-二羥基模式變?yōu)?，5二羥基模式(化合物1)的羥基部位的改變提高了抑制效能，該效能高于用兩個(gè)甲醚來(lái)代替CAPE的羥基(化合物2)所得的效能。然而，加入第三個(gè)羥基形成2，3，4-三羥基衍生物(化合物3)卻使效能有所損失，這說(shuō)明，羥基數(shù)目和部位是抑制程度的一個(gè)關(guān)鍵性決定因素。在酯類似物組中，分子的咖啡酸部分(3，4-二羥基肉桂酸)保持不變，而改變苯乙基側(cè)鏈。烷基間隔長(zhǎng)度的增加(化合物4)會(huì)使抑制效果明顯喪失。
在旋光受限的變體中，采用了羥基取代基部位不同的兩個(gè)CAPE異構(gòu)體的雙環(huán)類似物。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)類似物的抑制效能有顯著變化。異構(gòu)體5完全失效，而異構(gòu)體6完全消除了結(jié)合，這再一次表明羥基部位在抑制NF-κB活化中起關(guān)鍵作用。
在飽和酰胺類似物中，檢測(cè)了側(cè)鏈鍵和酯基氧的重要性。(苯乙基)胺環(huán)中具有額外的三個(gè)羥基的類似物(化合物7)以及反向酰胺類似物(化合物8，它沒(méi)有額外的羥基)的活性比CAPE差。因此，CAPE的結(jié)構(gòu)類似物可能比CAPE更具活性(如化合物6)，可能與CAPE的活性相同(如化合物1)，也可能活性低于CAPE(如化合物2、3、4、5、7和8)。
實(shí)施例10瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和CAT試驗(yàn)用磷酸鈣方法，根據(jù)生產(chǎn)商(GIBCO-BRL)提供的說(shuō)明書，用pIκBCAT以及pmutIκBCAT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞20小時(shí)。在轉(zhuǎn)染后，更換培養(yǎng)基(MEM)；使細(xì)胞在37℃培育24小時(shí)，然后用辣椒素(300μM)處理2小時(shí)，再用0.1nM TNF刺激1小時(shí)。然后用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞，并如Sambrook J.，E.E.Fritsch，和T.Maniatis.編輯，Molecular cloningA laboratorymanual，第2版，Cold Spring Harbor Press.，New York中所述的檢測(cè)CAT活性。
實(shí)施例11辣椒素能抑制依賴于TNF的NF-κB活化測(cè)試?yán)苯匪丶捌漕愃莆飿渲舅?樹脂毒素也與佛波酯在結(jié)構(gòu)上是同系物(見(jiàn)圖8))調(diào)節(jié)NF-κB活化的能力。采用的培育最大時(shí)間和化合物濃度對(duì)細(xì)胞存活力或TNF受體的影響最小。用臺(tái)盼藍(lán)排阻法測(cè)得細(xì)胞在暴露在100μM、200μM和300μM辣椒素下2小時(shí)時(shí)的細(xì)胞存活力分別為99％、98％和95％。
用不同濃度的辣椒素(高達(dá)300μM)預(yù)處理ML-1a細(xì)胞2小時(shí)，再與或不與TNF(0.1nM)一起37℃培育15分鐘，用電泳遷移率變動(dòng)分析測(cè)定NF-κB的活化情況(圖9A)。結(jié)果顯示，辣椒素本身不會(huì)活化NF-κB，而200-300μM的辣椒素則抑制了大部分TNF誘導(dǎo)的NF-κB活化。TNF活化NF-κB是非常特異性的，因?yàn)樵诩尤胛礃?biāo)記寡核苷酸時(shí)條帶消失，而在加入帶有突變型結(jié)合部位的寡核苷酸時(shí)則條帶不消失(圖13A)。
以前的研究已經(jīng)表明，高濃度的TNF(10nM)能誘導(dǎo)出更強(qiáng)而迅速(在5分鐘內(nèi))的NF-κB活化(Chaturvedi等，J.Biol.Chem.26914575-83(1994))。為了確定辣椒素是否也能抑制對(duì)TNF的強(qiáng)反應(yīng)，用濃度增加的TNF(高達(dá)10nM)作用于經(jīng)辣椒素預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞15分鐘，然后檢測(cè)NF-κB(圖9B)。盡管10nM TNF的NF-κB活化作用非常強(qiáng)，但是辣椒素完全抑制了該活化作用(就如其對(duì)0.01nM濃度的TNF那樣有效)。這些結(jié)果表明，辣椒素是一種抑制NF-κB活化的非常有效的抑制劑。
為了更進(jìn)一步地了解抑制的動(dòng)力學(xué)，使細(xì)胞與辣椒素共同培育120、60。30和10分鐘，然后使細(xì)胞受TNF作用。另外還在加入TNF的同時(shí)(0分鐘)及加入后10分鐘時(shí)加入辣椒素。每種情況下的TNF均作用30分鐘。如圖9C所示，辣椒素和TNF與細(xì)胞共同培育不會(huì)阻斷NF-κB的活化。只有當(dāng)細(xì)胞與辣椒素預(yù)先培育120分鐘時(shí)才發(fā)現(xiàn)有抑制TNF反應(yīng)的最大效果。
實(shí)施例12樹脂毒素也能抑制NF-κB活化樹脂毒素是辣椒素的結(jié)構(gòu)類似物，兩者共享一個(gè)公共的受體(參見(jiàn)Holzer，H.Pharmacol.Rev.43143(1994)；和Szallasi，A.，和Blumberg，P.，Brain Res.524106(1990))。因此，對(duì)樹脂毒素抑制TNF介導(dǎo)NF-κB活化的能力進(jìn)行測(cè)定。與辣椒素一樣，用樹脂毒素本身處理細(xì)胞不會(huì)活化NF-κB，但是它能以劑量依賴方式(圖10)完全抑制TNF介導(dǎo)的NF-κB活化。由于40μM的樹脂毒素就足以實(shí)現(xiàn)對(duì)TNF反應(yīng)的最大抑制，因此認(rèn)為樹脂毒素的效力約為辣椒素的8倍。
實(shí)施例13受辣椒素抑制的、活化的NF-κB由p50和p65亞基組成Rel/NF-κB蛋白的不同組合能構(gòu)成有活性的、與DNA中特異性序列結(jié)合的NF-κB異二聚物。為了證明經(jīng)TNF處理過(guò)的細(xì)胞中電泳遷移率變動(dòng)分析顯示的滯后條帶的確是NF-κB，使受TNF活化的細(xì)胞核抽提物與抗p50(NF-κB1)或p65(Rel A)亞基的抗體一起培育，并進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析?？筃F-κB的任一亞基的抗體使條帶移動(dòng)到更高的分子量處(圖11A)，這就說(shuō)明TNF-活化的復(fù)合物由p50和p65亞基組成?？筽65抗體的部分移動(dòng)可能是由于所用抗體的性質(zhì)或條件的緣故。用不相關(guān)的抗體(NS)作為對(duì)照跑電泳；它對(duì)NF-κB條帶沒(méi)有影響。
已經(jīng)證明，TPCK(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和除莠霉素(酪氨酸激酶抑制劑)均能通過(guò)化學(xué)改變NF-κB亞基，從而防止NF-κB與DNA結(jié)合，下調(diào)NF-κB的活化。為了確定辣椒素是否直接修飾NF-κB蛋白，使DNA與以下兩種抽提物一起培育并進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析(1)受辣椒素作用的細(xì)胞的經(jīng)脫氧膽酸處理過(guò)的細(xì)胞質(zhì)抽提物(圖11B)和(2)在經(jīng)TNF處理后受辣椒素作用的核抽提物(圖11C)。已經(jīng)知道，用脫氧膽酸處理能解離IκBa亞基，從而釋放出NF-κB與DNA結(jié)合。圖11B和11C的結(jié)果表明，辣椒素不改變NF-κB與DNA的結(jié)合能力。因此，辣椒素通過(guò)不同于TPCK或除莠霉素A的作用機(jī)理，抑制了NF-κB活化。
實(shí)施例14辣椒素也能阻止其它試劑誘導(dǎo)的NF-κB活化NF-κB可被其它各類試劑誘導(dǎo)活化，它們包括TNF、佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯和岡田酸。然而，關(guān)于所有這些試劑導(dǎo)致NF-κB活化的途徑是否相同還不清楚。因此，測(cè)定了辣椒素對(duì)不同試劑活化NF-κB的(抑制)效果。與TNF一樣，辣椒素能完全抑制佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯誘導(dǎo)的NF-κB活化，但是只能部分地抑制通過(guò)岡田酸介導(dǎo)的活化(圖12A)。
實(shí)施例15辣椒素抑制NF-κB活化對(duì)細(xì)胞類型沒(méi)有特異性除了ML-1a細(xì)胞外，還測(cè)定了辣椒素在其它骨髓樣細(xì)胞(U-937)和上皮細(xì)胞(HeLa)中阻抑TNF介導(dǎo)的NF-κB活化的能力。圖12B中顯示了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)果表明，辣椒素能在這兩類細(xì)胞中抑制TNF誘導(dǎo)的NF-κB。在200μM時(shí)辣椒素發(fā)現(xiàn)有幾乎完全的抑制，這就說(shuō)明辣椒素的這種抑制作用對(duì)細(xì)胞類型沒(méi)有特異性。
實(shí)施例16辣椒素抑制依賴于TNF的IκBa降解已經(jīng)知道，在刺激細(xì)胞時(shí)，IκBa被磷酸化并經(jīng)歷蛋白降解，從而使NF-κB轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。本發(fā)明的一個(gè)目的是確定辣椒素的抑制作用是否是由于阻止了IκBa降解的緣故。用western印跡分析測(cè)定IκBa蛋白的細(xì)胞質(zhì)水平。圖13A所示的結(jié)果表明，用TNF處理細(xì)胞會(huì)使遷移較緩慢的IκBa條帶在5分鐘內(nèi)出現(xiàn)，在15分鐘時(shí)完全消失(上圖)。然而，用辣椒素預(yù)處理細(xì)胞則消除了TNF介導(dǎo)的遷移較慢條帶的出現(xiàn)以及IκBa的降解(下圖)。已經(jīng)知道，遷移較慢的條帶的出現(xiàn)是由IκBa中32位和36位絲氨酸的磷酸化誘導(dǎo)而致(參見(jiàn)Finco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9111884-88(1994))。
研究用辣椒素處理不同時(shí)間后的細(xì)胞胞質(zhì)中的p65和IκBa水平(圖13B)。在經(jīng)辣椒素處理過(guò)的細(xì)胞中，IκBa(上圖)和p65(下圖)的細(xì)胞質(zhì)水平保持不受影響。然而，在檢測(cè)經(jīng)辣椒素單獨(dú)處理、經(jīng)TNF和辣椒素一同處理或經(jīng)TNF單獨(dú)處理的細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中的p65水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)TNF誘導(dǎo)p65蛋白遷移入胞核中。辣椒素本身不誘導(dǎo)這種遷移，但是它抑制了TNF誘導(dǎo)的遷移。這些結(jié)果表明辣椒素不影響p65的水平，而是阻止了依賴于TNF的向胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。除p65外，還檢測(cè)了辣椒素對(duì)Rel蛋白家族其它成員的胞質(zhì)庫(kù)的影響。圖13D的結(jié)果表明，辣椒素本身以及辣椒素與TNF的組合對(duì)p50或C-Rel蛋白的水平均沒(méi)有影響。
實(shí)施例17辣椒素阻遏了IκBa-CAT基因的表達(dá)由于IκBa基因的啟動(dòng)子有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，它在NF-κB活化時(shí)受到調(diào)節(jié)，在幾分鐘內(nèi)迅速地誘導(dǎo)基因表達(dá)，因此用瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定辣椒素對(duì)與CAT基因相連的、TNF誘導(dǎo)的IκBa啟動(dòng)子的影響。如所預(yù)計(jì)的，在用TNF刺激時(shí)，CAT活性幾乎提高4倍(圖14)。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)染了pIκBCAT的細(xì)胞在TNF處理前用辣椒素預(yù)處理2小時(shí)時(shí)，TNF所增強(qiáng)的CAT活性明顯減少。用含突變型NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的IκB啟動(dòng)子(pmutIκBCAT)來(lái)轉(zhuǎn)染沒(méi)導(dǎo)致TNF誘導(dǎo)出CAT。這些結(jié)果證明了，辣椒素也能阻遏NF-κB激活劑誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
本說(shuō)明書中提及的任何專利或出版物均說(shuō)明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。另外，這些專利和出版物均納入本文作參考，其程度就如各出版物具體地和單獨(dú)地納入本文作參考一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)本文所述的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，而且還能實(shí)現(xiàn)本文中固有的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文所述的這些實(shí)施例、以及方法、步驟、處理、分子和具體化合物都以較佳實(shí)施例為代表，它們是示范性的，并不意味著限制了本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作變化以及其它應(yīng)用，它們均包括在權(quán)利要求范圍所明確的本發(fā)明的宗旨內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在體外抑制細(xì)胞內(nèi)核因子NF-κB活化的方法，該方法包括用CAPE的2，5-二羥基類似物來(lái)處理所述細(xì)胞的步驟。
2.一種在體外抑制細(xì)胞內(nèi)核因子NF-κB活化的方法，該方法包括用CAPE的5，6-二羥基雙環(huán)類似物來(lái)處理所述細(xì)胞的步驟。
3.一種在體外抑制細(xì)胞內(nèi)核因子NF-κB活化的方法，該方法包括用8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺，即辣椒素，來(lái)處理所述細(xì)胞的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述NF-κB的活化由腫瘤壞死因子來(lái)誘導(dǎo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述NF-κB的活化由佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯來(lái)誘導(dǎo)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述NF-κB的活化由岡田酸來(lái)誘導(dǎo)。
7.一種在體外抑制細(xì)胞內(nèi)核因子NF-κB活化的方法，該方法包括用樹脂毒素來(lái)處理所述細(xì)胞的步驟。
8.CAPE的2，5-二羥基類似物在制備用來(lái)治療個(gè)體內(nèi)由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、膿毒性休克、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒感染、放射易感性、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、急性炎癥或移植物抗宿主反應(yīng)。
10.CAPE的5，6-二羥基雙環(huán)類似物在制備用來(lái)治療個(gè)體內(nèi)由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的藥物中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、膿毒性休克、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒感染、放射易感性、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、急性炎癥或移植物抗宿主反應(yīng)。
12.8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺，即辣椒素在制備用來(lái)治療個(gè)體內(nèi)由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、膿毒性休克、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒感染、放射易感性、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、急性炎癥或移植物抗宿主反應(yīng)。
14.樹脂毒素在制備用來(lái)治療個(gè)體內(nèi)由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的藥物中的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、膿毒性休克、急性時(shí)象反應(yīng)、病毒感染、放射易感性、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、急性炎癥或移植物抗宿主反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)咖啡酸苯乙酯的兩種類似物來(lái)阻斷NF－κB活化的方法。另外，辣椒素(8－甲基－N－香蘭基－6－壬烯酰胺)和樹脂毒素抑制了不同制劑誘導(dǎo)活化NF－κB。而且，本發(fā)明還公開了用這些抑制劑來(lái)治療因NF－κB活化引起的病理性病征(如中毒性休克、急性炎癥、急性時(shí)象反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥)的方法。
文檔編號(hào)A61K33/40GK1495254SQ20031010287
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期1997年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月5日
發(fā)明者B·B·阿加爾瓦爾, D·格林貝格爾, B B 阿加爾瓦爾, 直錘穸 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)