專(zhuān)利名稱(chēng)：具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種修復(fù)和重建骨缺損的生物材料，特別是一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法。
背景技術(shù)：
同種骨組織具有來(lái)源廣、提供生物愈合以及治療費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于各種原因引起的骨關(guān)節(jié)缺損修復(fù)與重建治療。歐美國(guó)家，每年大約使用100萬(wàn)件，我國(guó)同種骨移植的臨床應(yīng)用從上個(gè)世紀(jì)五十年代開(kāi)始，近10年才建立正規(guī)的骨組織組織庫(kù)，每年大約使用2萬(wàn)件。
目前骨組織庫(kù)提供的產(chǎn)品，包括新鮮冷凍骨、冷凍干燥骨和脫鈣骨。制備過(guò)程取材、修整、脫脂/脫鈣、滅菌、冷凍和深低溫保存，其制備方法為直接冷凍和鈷源輻射滅菌，經(jīng)處理后的骨組織失去其生物活性，同時(shí)鈷源輻射后骨的生物力學(xué)強(qiáng)度明顯降低。依據(jù)組織凍傷理論，如果將常溫下骨組織直接放入-80℃或更低溫的環(huán)境下，骨表層和深層降溫速率的不一致將導(dǎo)致骨組織細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的不一致，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)冰晶形成(intracellular ice formation，IIF)、細(xì)胞的冷休克、細(xì)胞外液的玻璃樣變以及凍融過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的影響是細(xì)胞損傷的重要因素。導(dǎo)致制備后同種骨組織的生物誘導(dǎo)活性消失，生物力學(xué)強(qiáng)度下降，移植后出現(xiàn)骨折、骨不愈合和關(guān)節(jié)功能障礙等并發(fā)癥，嚴(yán)重制約臨床應(yīng)用。在游離細(xì)胞的凍存研究中，冷凍生物學(xué)家們發(fā)現(xiàn)緩慢降溫和快速?gòu)?fù)溫有利于細(xì)胞的存活，在歐美等國(guó)正在進(jìn)行器官方面包括心臟、腎臟和肝臟等的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，在骨組織方面未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具備良好的生物誘導(dǎo)活性和生物力學(xué)強(qiáng)度，維持一定數(shù)量具有生物活性的軟骨細(xì)胞，增加移植后同種骨的愈合能力，減少并發(fā)癥的發(fā)生率，改善移植后的關(guān)節(jié)功能，為臨床提供適宜的生物移植材料的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其步驟為1、生物活性骨組織的獲取在無(wú)菌條件下獲取同種骨關(guān)節(jié)組織；2、生物活性骨組織的修整剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌肉的附著點(diǎn)；3、生物活性骨組織的脫脂氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝；4、梯度降溫將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以0.5～2℃/min的速率梯度降溫至-40℃～-60℃，歷時(shí)20-80min；5、保存將降溫后的骨組織投入-60～80℃冰箱中保存。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)梯度降溫、深低溫保存的同種骨關(guān)節(jié)能夠保持骨的超微結(jié)構(gòu)的完整性、骨誘導(dǎo)活性、生物力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)維持一定數(shù)量的成活的軟骨細(xì)胞，能夠增加移植后與宿主的愈合能力，減少并發(fā)癥的發(fā)生率，改善移植后的關(guān)節(jié)功能，為臨床提供具備生物活性的同種骨關(guān)節(jié)。
四說(shuō)明書(shū)附圖
附圖是本發(fā)明的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法的流程示意圖。
五
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1。結(jié)合附圖，一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其具體的實(shí)施過(guò)程為在無(wú)菌條件下獲取同種骨關(guān)節(jié)組織，剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌肉的附著點(diǎn)，用氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝，將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以2℃/min的速率梯度降溫至-40℃，歷時(shí)80min，將降溫后的骨組織投入-80℃箱中保存。
經(jīng)本發(fā)明制備和保存后一月的同種骨組織的力學(xué)數(shù)據(jù)如下拉伸彈性模量壓縮彈性模量拉伸 壓縮處理(Gpa) (Gpa)泊松比μ 泊松比μ本發(fā)明制備、18.23 13.630.32 0.345保存同種骨Reilly測(cè)試17.918.3正常新鮮股骨數(shù)據(jù)表明以本發(fā)明制備、保存的同種骨組織的彈性模量與新鮮骨組織無(wú)明顯差異，說(shuō)明經(jīng)制備、保存后骨組織的生物力學(xué)特性與新鮮骨相近。
實(shí)施例2。結(jié)合附圖，一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，用于骨腫瘤切除后修復(fù)、重建大段骨缺損的保肢治療。
患者，男性，16歲。右大腿下部疼痛一月，經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查證實(shí)為右股骨下段骨肉瘤，經(jīng)手術(shù)切除完整右股骨下段的腫瘤骨關(guān)節(jié)，切除長(zhǎng)度16公分，切除后遺留的股骨下段缺損，采用本發(fā)明方法制備的同種異體股骨下段進(jìn)行骨骼重建，不僅徹底地切除了腫瘤組織，而且保留了患肢的功能。采用同種異體骨移植是肢體腫瘤保肢治療的主要方法之一，國(guó)外文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)90％以上的肢體惡性骨腫瘤都獲得保肢治療。
惡性骨腫瘤保肢治療的重要環(huán)節(jié)，是如何重建惡性骨腫瘤切除后的大段骨缺損，大段同種骨移植是最常用的方法。其具體的實(shí)施過(guò)程為在無(wú)菌條件下獲取同種骨關(guān)節(jié)組織，剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌肉的附著點(diǎn)，用氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝，將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以1.0℃/min的速率梯度降溫至-50℃，歷時(shí)50min，將降溫后的骨組織投入-100℃冰箱中保存。
采用梯度降溫、深低溫保存的同種骨組織進(jìn)行移植手術(shù)，在臨床上具有良好的愈合能力，通常移植后的四個(gè)月在同位素锝99骨掃描片上可觀察到移植部位骨濃聚的現(xiàn)象，特別在宿主骨與移植骨的結(jié)合部位，表明移植骨的骨代謝活躍，提示與宿主開(kāi)始骨愈合。在移植后6個(gè)月普通X-線平片上可觀察新生骨已形成并包繞移植骨。通常在8-10月宿主骨與移植骨的結(jié)合部位的間隙消失，表明宿主骨與移植骨已完全愈合，較直接冷凍骨和冷凍干燥骨相比，骨愈合的時(shí)間縮短約2-3個(gè)月，其中最長(zhǎng)的隨訪時(shí)間達(dá)36個(gè)月，移植骨未發(fā)現(xiàn)骨折的現(xiàn)象。目前已在臨床實(shí)驗(yàn)性已應(yīng)用60余例，各種并發(fā)癥的發(fā)生率低于25％。
實(shí)施例3。結(jié)合附圖，一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，用于骨感染性骨缺損的修復(fù)、重建治療。因骨髓炎引起骨缺損是臨床上常見(jiàn)的感染性疾病，自體骨移植是常用的治療方法，一方面給患者帶來(lái)新的痛苦，另一方面自體骨往往滿足不了缺損的需要，應(yīng)用同種骨組織移植是新的治療方法。其具體的實(shí)施過(guò)程為在無(wú)菌條件下獲取同種骨關(guān)節(jié)組織，剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌肉的附著點(diǎn)，用氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝，將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以1.5℃/min的速率梯度降溫至-40℃，歷時(shí)60min，將降溫后的骨組織投入-90℃冰箱中保存。
采用梯度降溫、深低溫保存的同種骨組織進(jìn)行感染性骨缺損的修復(fù)手術(shù)，在臨床上能夠修復(fù)因感染引起的骨缺損，恢復(fù)骨的連續(xù)性，同時(shí)能夠有效的控制感染，使骨髓炎得到康復(fù)。目前已在臨床實(shí)驗(yàn)性已應(yīng)用20余例，臨床有效率達(dá)96％。為臨床治療骨髓炎提供一種可靠、經(jīng)濟(jì)的修復(fù)手段。
外傷性骨缺損、骨腫瘤性和感染性骨缺損是臨床常見(jiàn)的疾病，通常需要骨移植進(jìn)行修復(fù)和重建。歐美國(guó)家應(yīng)用廣泛，每年大約使用100萬(wàn)件，而國(guó)內(nèi)有記錄的每年大約只有2萬(wàn)件。我國(guó)的人口基數(shù)大，同時(shí)處于發(fā)展中國(guó)家，骨的創(chuàng)傷、感染和腫瘤等疾病的發(fā)病率高，具有普遍的應(yīng)用基礎(chǔ)。本發(fā)明獲得的同種骨組織的制備方法，所獲得的同種骨移植材料，能夠保持骨的超微結(jié)構(gòu)的完整性、骨誘導(dǎo)活性、生物力學(xué)強(qiáng)度。能夠加速移植后與宿主的愈合能力，減少并發(fā)癥的發(fā)生率，改善移植后的關(guān)節(jié)功能，為臨床提供具備生物活性的同種骨組織，具有廣泛的應(yīng)用前景，能夠產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
權(quán)利要求
1.一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其特征在于其步驟為1.1生物活性骨組織的獲取在無(wú)菌條件下獲取同種骨關(guān)節(jié)組織；1.2生物活性骨組織的修整剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌肉的附著點(diǎn)；1.3生物活性骨組織的脫脂氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝；1.4梯度降溫 將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以0.5～2℃/min的速率梯度降溫至-40℃～-60℃，歷時(shí)20-80min；1.5保存將降溫后的骨組織投入-80℃～180℃冰箱中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其特征在于將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以1～2℃/min的速率梯度降溫至-40℃～-50℃，歷時(shí)20-80min，將降溫后的骨組織投入-70～80℃冰箱中保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其特征在于將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以2℃/min的速率梯度降溫至-40℃，歷時(shí)80min，將降溫后的骨組織投入-80℃～180℃冰箱中保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其步驟為1.生物活性骨組織的獲取在無(wú)菌條件下獲取同種骨關(guān)節(jié)組織；2.生物活性骨組織的修整剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌肉的附著點(diǎn)；3.生物活性骨組織的脫脂氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝；4.梯度降溫將預(yù)處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以0.5～2℃/min的速率梯度降溫至－40℃～－60℃，歷時(shí)20－80min；5.保存將降溫后的骨組織投入－60～80℃冰箱中保存。本發(fā)明能夠保持骨的超微結(jié)構(gòu)的完整性、骨誘導(dǎo)活性、生物力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)維持一定數(shù)量的成活的軟骨細(xì)胞，能夠增加移植后與宿主的愈合能力，減少并發(fā)癥的發(fā)生率，改善移植后的關(guān)節(jié)功能。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1528469SQ20031010603
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者施鑫, 吳蘇稼, 趙建寧, 周光新, 陸盟, 施 鑫 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院