Kim－1拮抗劑及其在免疫系統(tǒng)調節(jié)中的應用的制作方法
專利名稱：Kim－1拮抗劑及其在免疫系統(tǒng)調節(jié)中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明領域為藥學、免疫學、分子生物學和蛋白質化學。
背景技術：
KIM-1(腎損傷分子-1)是I型細胞膜糖蛋白(Ichimura等，1998，J.Biol.Chem.2734135-4142)。KIM-1的胞外部分(胞外結構域)包含一個6個-半胱氨酸免疫球蛋白樣區(qū)和以粘蛋白樣O-糖基化蛋白為特征的富含T/SP的區(qū)域。粘蛋白區(qū)就像柄一樣從細胞表面向外延伸Ig樣區(qū)(Jentoft，1990，TrendsBiochem.Sci.15291-294)。KIM-1已被定為甲型肝炎病毒的受體(Kaplan等，1996，EMBO J.154282-4296；WO 96/04376；美國專利No.5,622,861)。已發(fā)現(xiàn)了兩種KIM-1剪接變體，一種主要存在于肝臟(Feigelstock，1998，J.Virol.726621-6628)，另一種主要存在于腎臟(Ichimura等，supra)。
KIM-1是稱作TIM(T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域)家族的基因家族中的一員。除了KIM-1，人至少有另外兩種TIM基因家族的成員。一個成員被克隆并被最初稱作“200基因”(WO200073498)，但隨后稱作TIM-3。另一個成員被克隆并被稱作“基因58”(WO99/38881)。
KIM-1作為腎臟損傷的臨床診斷標志物吸引了人們的興趣(Bailly等，2002，J.Biol.Chem.27739739-39748；Han等，2002，Kidney Intl.62237-244)。已報道KIM-1的小鼠同系物(TIM-1)存在于被認為與氣道高反應性的發(fā)生相關的遺傳基因座內(McIntire等，2001，Nature Immunology 21109)。已報道一種叫做TIM-2的小鼠蛋白在體內抗原特異性T細胞的產生中起作用(Kumanogoh等，2002，Nature 419629-633)。稱作TIM-3的小鼠蛋白與小鼠免疫反應的調控有關(Monney等，2002.Nature 415536-541)。
發(fā)明概述已經發(fā)現(xiàn)用KIM-1拮抗劑治療哺乳動物改變T細胞與其它免疫系統(tǒng)細胞之間的相互作用，例如，樹突細胞、單核巨噬細胞、和B細胞，從而能強烈抑制IgG對抗原的反應。另外，已發(fā)現(xiàn)這種治療幾乎消除了在對隨后用抗原的攻擊反應中由記憶B細胞產生IgG1。另外，已發(fā)現(xiàn)阻斷KIM-1與其受體的結合減少在混合淋巴細胞應答(MLR)試驗中由參與抗原應答的免疫細胞分泌IFN-γ?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供在自身免疫性疾病和哺乳動物免疫系統(tǒng)的其它病癥中治療性調節(jié)免疫功能的方法。
本發(fā)明提供抑制哺乳動物中T細胞和第二細胞，例如，抗原遞呈細胞(APC)之間信號傳遞的方法。該方法包括鑒定哺乳動物，例如，患有免疫疾病或病癥的動物，或者準備接受組織移植的動物；以及給予哺乳動物有效量的下列各種KIM-1拮抗劑中的一種(a)包括KIM-1 Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；和(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
T細胞可以是活化的T細胞，例如，輔助T細胞。其可以是Th2細胞或Th1細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中T細胞是被移植的，供體T細胞。APC可以是，但不限于，單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、或者B細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中，APC呈遞自身抗原。
優(yōu)選地，KIM-1拮抗劑是可溶性的多肽，其除了KIM-1 Ig區(qū)外可包括KIM-1粘蛋白區(qū)。在一些實施方案中多肽包括異源部分(heterologous moity)，例如，免疫球蛋白(Ig)部分，血清白蛋白部分，靶向部分，報告分子部分，多聚化部分，以及便于純化的部分。優(yōu)選的異源部分是Ig部分如Fc部分。
在一些實施方案中，KIM-1拮抗劑是與如聚亞烷基二醇、糖聚合物、或多肽的聚合物偶聯(lián)的多肽。優(yōu)選的聚合物是聚亞烷基二醇，特別優(yōu)選聚乙二醇(PEG)。聚合物的平均分子量優(yōu)選從2,000Da到30,000Da，優(yōu)選從5,000Da到20,000Da.，例如，約10,000Da。
本發(fā)明提供抑制哺乳動物中B細胞活化的方法，例如，通過活化的T細胞如Th2細胞。該方法包括使B細胞或其它APC與有效量的KIM-1拮抗劑接觸，或者T細胞，如果拮抗劑是抗KIM-1抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，活化的T細胞是被移植的，供體T細胞。
本發(fā)明提供在哺乳動物中抑制產生抗體如IgG的亞型的方法，所述亞型例如，對一種或多種抗原具有反應性的IgG1。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。在一些實施方案中，在哺乳動物的免疫系統(tǒng)首次識別一種或多種抗原前30分鐘和30天之間施用有效量的KIM-1拮抗劑?？乖瓰橥N抗原或自身抗原，根據(jù)被治療的疾病、障礙或情況不同。
本發(fā)明提供在自身免疫性疾病中抑制疾病復發(fā)的方法。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供在自身免疫性疾病中抑制表位擴散的方法。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供治療Th2細胞介導的疾病的方法，例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、查加斯病(Chagas’disease)、格雷夫斯病(Graves’disease)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、韋格納肉芽腫(Wegener′sgranulomatosis)、結節(jié)性多動脈炎(polyarteritis nodosa)、急驟進展性新月體性腎小球腎炎(rapidly progressive crescentic glomerulonephritis)、或移植物抗宿主病(GVHD)、哮喘、特應性皮炎(atopic dermatitis)、特應性疾病(atopydisorders)如氣道高反應性疾病(airway hyperresponsive disease)和氣道應激綜合征(airway distress syndromes)。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供抑制GVHD的方法。該方法包括在移植前30分鐘和30天之間施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供抑制哺乳動物中由淋巴細胞分泌IFN-γ的方法。該方法包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供抑制Th1 T細胞效應子功能的活化，因此抑制在炎性情況中細胞免疫應答。這種炎性情況的實例是炎癥性腸病(inflammatory boweldisease)。該方法包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供治療哺乳動物炎性疾病或病癥的方法，例如，炎癥性腸病如克隆病(Crohn′s disease)、潰瘍性結腸炎、以及回腸炎。該方法包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
如這里使用的，“抗KIM-1抗體”指抗體，例如IgG分子，其特異性結合全長KIM-1多肽的細胞外部分。
如這里使用的，“全長的人KIM-1多肽”意思是全部SEQ ID NO1或全部SEQ ID NO2的多肽。這兩種多肽代表人KIM-1基因的剪接變體。
如這里使用的，“異源部分(heterologous moiety)”意思是不以全長KIM-1多肽出現(xiàn)的氨基酸序列。
如這里使用的，“KIM-1拮抗劑”意思是(a)包括KIM-1 Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或者(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段，每一個均阻斷、抑制、或干擾天然存在的KIM-1的生物學活性。
如這里使用的，“KIM-1融合蛋白”意思是包括融合到異源部分上的KIM-1部分的融合蛋白。
如這里使用的，“KIM-1片段”意思是全長KIM-1多肽的生物活性片段。
如這里使用的，“KIM-1多肽”意思是單獨的KIM-1部分或包括KIM-1部分的融合蛋白。
如這里使用的，“KIM-1 Ig區(qū)(domain)”意思是SEQ ID NO1中的一部分，其氨基端是29-36位氨基酸，其羧基端是105-107位氨基酸。
如這里使用的，“KIM-1粘蛋白區(qū)”意思是SEQ ID NO1中的一部分，其氨基端是126-130位氨基酸，其羧基端是255-274位氨基酸。
如這里使用的，“KIM-1跨膜區(qū)”意思是SEQ ID NO1的290-311位氨基酸部分。
如這里使用的，“KIM-1胞質區(qū)”意思是SEQ ID NO1的312-334位氨基酸，或SEQ ID NO2的312-359位氨基酸。
除非另外定義，這里所使用的所有專業(yè)和科學術語具有與發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。為避免沖突，本說明書，包括定義，將決定。所有這里提及的出版物、專利和其它參考資料并入作為參考。
盡管可在本發(fā)明的實踐或檢驗中使用與這里所描述的那些相似或等同的方法和材料，但是下面描述了優(yōu)選的方法和材料。材料、方法和實例只是用來說明的，并不打算用來限制。本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將從詳細的描述和從權利要求中顯而易見。
附圖的簡要描述
圖1(現(xiàn)有技術)是人KIM-1多肽的兩個天然存在的剪接變體的圖示。這兩個氨基酸序列從1到323殘基完全相同。信號序列(1-20位殘基)用下劃線標出。跨膜區(qū)(290-311位殘基)用雙下劃線標出。
圖2(現(xiàn)有技術)是359個氨基酸的人KIM-1剪接變體的圖示。信號序列和跨膜區(qū)用黑色陰影表示。Ig區(qū)中的半胱氨酸殘基用“C”表示。倒置的三角形表示N-聚糖(glycan)附著點。TSP富集區(qū)，其對應于粘蛋白區(qū)，用加寬的陰影表示。
圖3是總結在接受綿羊紅細胞初次攻擊的Bal b/c小鼠第14天測得的免疫球蛋白效價的直方圖(實驗1)。
圖4是總結在接受綿羊紅細胞初次攻擊的Bal b/c小鼠第14天測得的免疫球蛋白效價的直方圖(實驗2)。
圖5是總結在接受綿羊紅細胞初次攻擊的C57B1/6小鼠第7天測得的免疫球蛋白效價的直方圖。
圖6是總結在被允許從初次攻擊(圖3)完全恢復后，接著被再次攻擊的實驗1的小鼠中測得的免疫球蛋白效價的直方圖。在再次攻擊后第3天測量免疫球蛋白效價。
圖7是總結在被允許從初次攻擊(圖4)完全恢復后，接著被再次攻擊的實驗2的小鼠中測得的免疫球蛋白效價的直方圖。在再次攻擊后第3天測量免疫球蛋白效價。
圖8是總結在小鼠MLR培養(yǎng)物中IFNγ產量數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后收獲上清液并用于測量IFNγ水平。在孵育期間用mAbs 3A2和1H9處理培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ的水平。
圖9是總結小鼠MLR培養(yǎng)物中細胞增殖數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后向培養(yǎng)物中加入活體染料(vital dye)，允許顯色1-4個小時。在3天培養(yǎng)期間用抗KIM-1抗體處理培養(yǎng)物不影響細胞增殖。
圖10是總結小鼠MLR培養(yǎng)物中IFNγ產量數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后收獲上清液并用于測量IFNγ水平。在孵育期間用KIM-1-Ig融合蛋白處理培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ的水平。
圖11是總結小鼠MLR培養(yǎng)物中細胞增殖數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后向培養(yǎng)物中加入活體染料，允許顯色1-4個小時。在3天培養(yǎng)期間用KIM-1-Ig融合蛋白處理培養(yǎng)物不影響細胞增殖。
圖12A和12B是總結人MLR培養(yǎng)物中IFNγ產量數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的JY細胞用于刺激正常人供體的外周血單個核細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后收獲上清液并用于測量IFNγ和IL-2水平。在孵育期間用mAbs AUF1和AKG7處理培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ水平(圖12A)，而IL-2的水平保持不變(圖12B)。
圖13是總結人MLR培養(yǎng)物中細胞增殖數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的JY細胞用于刺激正常人供體的外周血單個核細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后向培養(yǎng)基中加入活體染料，允許顯色1-4個小時。在6天培養(yǎng)期間用抗人KIM-1單克隆抗體處理培養(yǎng)物不顯著影響細胞增殖。
圖14是總結在小鼠中誘發(fā)炎癥性腸病后體重丟失數(shù)據(jù)的直方圖。將雌性Balb/c小鼠暴露于葡聚糖硫酸鈉(DSS)。8天后，將小鼠改回到凈水(plainwater)飼養(yǎng)并允許從DSS暴露中恢復。3天后，稱小鼠的重量。將重量換算成實驗開始時重量的百分比。用KIM-1-Ig融合蛋白治療賦予小鼠顯著的保護，如體重記分增加所示。每組有10只小鼠。均數(shù)的等值檢驗得到＞p＝0.0001的統(tǒng)計學意義。
圖15A和15B是總結在小鼠中誘發(fā)炎癥性腸病后臨床記分數(shù)據(jù)的直方圖。3天恢復期后，評價小鼠腹瀉和便中出現(xiàn)血的情況。用KIM-1-Ig融合蛋白治療的小鼠的記分顯著高于未治療或對照-Ig治療組(圖15A)。這部分由于在糞粒中出現(xiàn)血的小鼠顯著減少(圖15B)。均數(shù)等值檢驗(means equivilencetests)得到未經治療的對照組的臨床記分與KIM-1-Ig治療組相比的差異的顯著值(p＝0.05)。
發(fā)明詳述天然人KIM-1基因編碼含有334個氨基酸或359個氨基酸(SEQ ID NO1)的多肽(圖1)，根據(jù)剪接變異不同，其至少是部分組織依賴性的。兩個序列都包括信號序列、Ig區(qū)、粘蛋白區(qū)、跨膜區(qū)、以及胞質區(qū)。
使用可溶的，二聚化的，KIM-1胞外結構域-Fc融合蛋白(每個單體含有小鼠KIM-1胞外結構域和人Fc部分)和公認的動物模型(小鼠SRBC應答)，本發(fā)明人獲得了哺乳動物免疫反應的意義深遠的改變。不打算被理論束縛，本發(fā)明人將所觀察到的結果解釋為表明該融合蛋白作為KIM-1拮抗劑起作用，并且這種拮抗作用干擾KIM-1介導的T細胞和APCs之間的信號傳遞相互作用。這種干擾的下游效應包括哺乳動物免疫反應的有用調節(jié)。這種調節(jié)可用于治療自身免疫性疾病以及其它疾病和障礙，其中免疫系統(tǒng)通過T細胞毒性或者通過免疫球蛋白應答攻擊不恰當?shù)陌?。免疫系統(tǒng)調節(jié)將有利于的疾病或病癥的實例包括，但不限于，關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(也稱為SLE或狼瘡)，以及移植物抗宿主疾病(GVHD)。
在本發(fā)明的方法中，可溶的KIM-1拮抗劑多肽或KIM-1封閉抗體(或結合抗原的抗體片段)可以作為預制成的多肽直接施用?？蛇x擇地，其可通過核酸載體(編碼和表達該多肽)間接施用。無論哪種方法，結果都是拮抗KIM-1介導的對T細胞的效應，包括T細胞活化和刺激T細胞增殖。這種位于T細胞上的對KIM-1的拮抗作用可直接通過阻斷T細胞自身的破壞作用達到期望的治療效果。另外，這種拮抗作用可間接地達到期望的治療效果，通過阻斷活化的T細胞介導的B細胞的活化作用，因而減少有害抗體的產生。
在不同的疾病中，包括自身免疫性疾病和某種類型的病原感染，損害由自身抗體應答引起，即，產生識別自身抗原的抗體。本發(fā)明提供通過干擾T細胞的活化和分化來減少這種損害的方法和分子。這反過來干擾活化的T細胞介導的B細胞活化，其干擾由B細胞產生和分泌的特異性免疫球蛋白，例如，IgG1。因此，以自身抗體應答為特征的任何疾病或病癥均可通過使用本發(fā)明的方法和分子治療。
當治療某種自身免疫性疾病時，暴露于抗原，以及免疫系統(tǒng)應答都是短暫的。這導致產生緩解期(remissions)，在緩解期施用有效量的KIM-1拮抗劑將抑制隨后對一種或多種抗原的免疫反應的再活化。本發(fā)明可以這種方法阻止疾病復發(fā)。當治療某種自身免疫性疾病時，哺乳動物的免疫系統(tǒng)首先識別一或多種抗原作為自身免疫疾病病程中表位傳播過程的一部分。
一旦移植，在移植物抗宿主病(GVHD)中許多損害直接由在宿主內被活化(對宿主抗原的應答)的供體T細胞的作用所致，例如在骨髓移植中。由于其能干擾T細胞活化，本發(fā)明有益于抑制GVHD。除了活化的供體T細胞的直接作用的損害，在GVHD中也有由抗體介導的成分。因為這種抗體介導的成分依賴供體T細胞的活化，其活化產生自身抗體的B細胞，因此本發(fā)明減少自身抗體介導的損害，以及在GVHD中細胞免疫介導的損害。
抗體介導的自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE；lupus)是一種TH-2介導的自身免疫障礙，以高水平的針對細胞內抗原如雙鏈DNA，單鏈DNA，和組蛋白的自身抗體為特征?？紤]到這些特點，系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為可根據(jù)本發(fā)明治療的自身免疫性疾病的例子。
適合依據(jù)本發(fā)明治療的其它器官特異性或系統(tǒng)性自身免疫性疾病的實例包括重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、查加斯病、格雷夫斯病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、韋格納肉芽腫，結節(jié)性多動脈炎和急驟進展性新月體性腎小球腎炎。見，例如，Benjamini等1996，Immunology，A Short Course，Third Ed.(Wiley-Liss，New York)。另外，類風濕性關節(jié)炎(RA)，曾被認為由細胞毒性T細胞的細胞毒活性介導，現(xiàn)已知具有B細胞和/或抗體成分(Leandro等，2002，Ann.Rheum.Dis.，61863-866；De Vita等，ArthritisRheum.462029-2033；Tsuji等，2002，J.Exp.Med.1961277-1290)，因此適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
對一些致病性感染劑的正常免疫反應引起有害的自身抗體應答。一個例子是查加斯病，一種在慢性感染了克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)的人和試驗動物中形成的炎性心肌病?？棺陨砜贵w存在于查加斯病病人的血清中(Bach-Elias等，1998，Parasitol.Res.84796-799；Tibbetts，等，1994，J.Immunol.1521493-1499)，因此這種疾病適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
由感染產生的自身抗體破壞細胞的另一個例子是特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，其中自身抗體導致血小板破壞(通過補體或具有Fc或C3b受體的吞噬細胞)并可導致出血。ITP適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
移植物抗宿主病(GVHD)GVHD作為可使用本發(fā)明的方法進行治療的T細胞介導的疾病的例子。當供體T細胞把宿主抗原識別為外源抗原時，引起GVHD。GVHD，常常是骨髓移植(BMT)病人的致命性結果，可以是急性的或慢性的。GVHD的急性和慢性型分別作為產生抗原特異性Th1和Th2應答的例子。急性GVHD在骨髓移植后頭兩個月內發(fā)生，特點是供體細胞毒性T細胞介導的對皮膚、腸、肝臟，和其它器官的損害。慢性GVHD似乎較晚(移植后100天)，特點是免疫球蛋白(Ig)產生過多，包括自身抗體，和由Ig沉積所致的對皮膚、腎臟，和其它器官的損害。將近90％的急性GVHD繼續(xù)發(fā)展成慢性GVHD。慢性GVHD似乎是Th2 T細胞介導的疾病(De Wit等，1993，J.Immunol.150361-366)。急性GVHD是Th1介導的疾病(Krenger等，1996，Immunol.Res.1550-73；Williamson等，1996，J.Immunol.157689-699)。T細胞細胞毒是急性GVHD的特點。可在好多方面看到供體抗宿主細胞毒性的后果。首先，宿主淋巴細胞被迅速破壞，結果經歷急性GVHD的小鼠受到極度地免疫抑制。其次，供體淋巴細胞移入并在宿主脾臟中擴增，它們的細胞毒活性可在體外通過利用表達可被供體細胞識別(作為外源抗原)的宿主抗原的細胞系直接測量。第三，由于另外的組織和細胞群被破壞，因此該病成為致命的。
慢性GVHD由抗體介導的宿主組織和細胞的破壞所致，被稱為“SLE樣”GVHD。表現(xiàn)包括自身抗體形成、各種器官中Ig沉積(腎臟、肝臟)、皮疹、淋巴增生、Sjgren樣損害、硬皮病樣損害、多動脈炎，和其它病變。這種疾病部分是由自身抗體形成介導?？紤]到前面的原因，慢性GVHD適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
其它Th2相關疾病特應性疾病的特點是免疫系統(tǒng)細胞，包括活化的T細胞和APC，表達細胞因子、趨化因子和其它分子，這些分子以Th2應答為特征，如IL-4、IL-5和IL-13細胞因子。因而這種特應性疾病可用拮抗產生Th2應答的方法來治療，如本發(fā)明的KIM-1拮抗劑。特應性疾病包括哮喘、氣道高反應性和應激性綜合癥，以及如特應性皮炎的病變。本發(fā)明提供抑制特應性疾病的方法。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
由活化的淋巴細胞、APC和促炎細胞因子介導的炎性疾病和病癥在小鼠和人模型系統(tǒng)中使用混合淋巴細胞反應試驗(MLR)，本發(fā)明人已經證明阻斷KIM-1結合其受體，例如，使用抗KIM-1單克隆抗體或KIM-1-Ig融合蛋白，減少由應答細胞分泌的IFNγ。因此，KIM-1拮抗劑可用于治療由IFNγ介導的任何疾病或病癥。
IFNγ是免疫反應中關鍵的細胞因子。它對炎癥和免疫進程的發(fā)展和程度有多向性(pleotropic)影響(Boehm等1997，Ann Rev Immunol 15749-795)。IFNγ產量的缺乏降低抗病毒和細菌的應答并且減弱炎癥反應。使用KIM-1拮抗劑可有助于降低IFBγ產量過度或不適當?shù)募膊≈械腎FNγ產量。這種疾病或病癥的例子包括自身免疫性疾病、結腸炎和慢性炎癥。
IFNγ是T細胞活化和B細胞應答的關鍵成分。它影響T細胞效應細胞發(fā)育(例如，通過與IL-4交叉調控)和B細胞的活化(例如，通過對MHC介導的抗原遞呈作用和B7分子表達的調控)。IFNγ是Th1 T細胞介導的免疫反應的關鍵成分。IFNγ顯著影響其它免疫系統(tǒng)成分，如巨噬細胞和中性粒細胞。它刺激它們活化并釋放有毒的效應分子。
IFNγ對組織固有細胞類型(resident cell types)有強烈的影響。內皮由IFNγ活化。當用IFNγ刺激時，患病組織中的固有細胞，例如，類風濕性關節(jié)炎中的滑膜細胞，分泌TNF和其它細胞因子，MCP-1和其它趨化因子，以及有毒的效應分子如氧化氮。所有這些由IFNγ介導的后面的功能在炎癥期間影響細胞運輸?shù)浇M織中。
如在實施例5(下面)中所示，阻斷KIM-1結合其受體將在SRBC模型系統(tǒng)中減少或消除IgG1生成。在MLR試驗中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)阻斷KIM-1結合其受體將減少由淋巴細胞產生的IFNγ。不打算被理論束縛，注意到IgG1產量的降低和IFNγ產量的降低可能代表KIM-1阻斷的兩種單獨的效應，可能無直接聯(lián)系。因此，當根據(jù)本發(fā)明使用KIM-1拮抗劑用于調節(jié)免疫功能時，KIM-1拮抗劑可通過兩種單獨的作用機理提供有益的效果。
融合蛋白和偶聯(lián)多肽本發(fā)明的一些實施方案包括KIM-1拮抗劑多肽，其中KIM-1部分融合到異源部分上形成KIM-1融合蛋白。KIM-1融合蛋白，與單獨的KIM-1部分相反，可用于完成各種目的。這些目的包括，例如，增加血清半衰期，提高生物利用率，在體內靶向特異性器官或組織類型，提高重組體表達效率，提高宿主細胞分泌，以及易于純化。根據(jù)將要獲得的目的，異源部分可以是惰性的或者是有生物學活性。同樣地，其可選擇與KIM-1部分是穩(wěn)定地融合或是可裂解的，在體外或在體內裂解。完成不同的目的的異源部分是本領域中公知的。
作為表達KIM-1融合蛋白的可選擇的方法，所選擇的異源部分可預先形成并用化學方法偶聯(lián)到KIM-1部分上。在絕大多數(shù)情況中，所選擇的異源部分，無論融合或偶聯(lián)到KIM-1部分上將起相似的功能。因此，在下面異源氨基酸序列的討論中，除非另有說明，應當理解異源序列可以融合蛋白的形式或作為化學偶聯(lián)物被連接到KIM-1部分上。
藥學上有活性的多肽如KIM-1多肽常常顯示在體內被迅速清除，需要很大劑量以便在體內獲得治療性有效濃度。另外，小于約20kDa的多肽可能經過腎小球濾過，其有時導致腎中毒?？墒褂孟鄬π〉亩嚯娜鏚IM-1片段的融合或結合以減少或避免這種腎中毒的危險。已知各種異源氨基酸序列，即，多肽部分或“載體”，用于提高治療性多肽的體內穩(wěn)定性，即，血清半衰期。
由于其半衰期長，在體內分布廣，沒有酶或免疫功能，因此基本上全長的人血清白蛋白(HSA)，或HSA片段，是優(yōu)選的異源部分。通過應用如那些在Yeh等，1992，Proc.Natl.Acad Sci.USA，891904-1908和Syed等，1997，Blood 893243-3252中所教導的方法和材料，HSA可被用于形成顯示藥學活性的KIM-1融合蛋白或偶聯(lián)物，其由于KIM-1部分顯示體內穩(wěn)定性顯著增加，例如，高出10倍到100倍。優(yōu)選地，將HSA的N-末端融合到KIM-1部分的C-末端。由于HSA是一種天然分泌的蛋白質，因此當融合蛋白在真核表達系統(tǒng)，例如，在哺乳動物中生產時，可利用HAS信號序列獲得KIM-1融合蛋白分泌到細胞培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的一些實施方案使用KIM-1多肽，其中KIM-1部分融合到Fc區(qū)上，即，Ig重鏈恒定區(qū)的C-末端。KIM-1-Fc融合潛在的優(yōu)點包括可溶性、體內穩(wěn)定性，和多價位，例如，二聚。使用的Fc區(qū)可以是IgA、IgD、或IgG的Fc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3)。可選擇地，其可以是IgE或IgM Fc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3-CH4)。優(yōu)選IgG的Fc區(qū)，例如，IgG1 Fc區(qū)或IgG4 Fc區(qū)。用于構建和表達編碼Fc融合的DNA的材料和方法在本領域中是已知的，可以應用，不用過多試驗就可獲得KIM-1融合體。
優(yōu)選地，構建有方向的KIM-1-Fc融合，其中KIM-1部分形成融合蛋白的氨基末端部分。構建和表達具有這種方向的Fc融合的例子，見，例如，Wallner等，美國專利No.5,547,853(pSAB152)。可選擇地，可構建具有相反方向的融合，即，其中KIM-1部分形成融合的羧基末端部分。這種方向的例子和討論，見，例如，Lo等，美國專利No.5,541,087。
本發(fā)明的一些實施方案使用根據(jù)Lo等，美國專利No.5,541,087，通過構建KIM-1免疫融合(immunofusin)DNA獲得的KIM-1融合蛋白。免疫融合DNA包括編碼分泌盒的多核苷酸。分泌盒包括編碼(以5’到3’方向)信號序列的序列，免疫球蛋白Fc區(qū)和融合到分泌盒3’端的KIM-1部分。DNA可在宿主細胞中以高水平表達，宿主細胞高效地產生和分泌融合蛋白。不需要溶解宿主細胞就可以從培養(yǎng)基中收集所分泌的免疫融合物。
在一些實施方案中，該DNA序列在KIM-1部分和異源部分之間編碼蛋白酶剪切位點。剪切位點提供用于所編碼的融合蛋白的蛋白酶性剪切，因此將Fc區(qū)從靶蛋白中分離。有用的蛋白酶剪切位點包括蛋白酶如胰蛋白酶、纖溶酶或腸激酶K識別的氨基酸序列。
KIM-1多肽構建體可被整合到可復制的表達載體中。有用的載體包括線性核酸、質粒、噬菌粒、粘粒等。一種示范性的表達載體是pSAB152(Wallner等，美國專利No.5,547,853)。另一種示范性的表達載體是pdC，其中免疫融合DNA的轉錄被置于在人巨細胞病毒的增強子和啟動子的控制下(Lo等，1991，Biochim.Biophys.Acta 1088712；和Lo等，1998，Protein Engineering11495-500)?？捎镁幋aKIM-1多肽的DNA轉化或轉染適當?shù)乃拗骷毎⒂糜贙IM-1多肽的表達和分泌。優(yōu)選的宿主細胞包括永生的雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Hela細胞，以及COS細胞。
完全完整的，野生型Fc區(qū)顯示效應子功能在根據(jù)本發(fā)明的Fc融合蛋白中正常地是不必要的和不希望的。因此，在KIM-1-Fc融合蛋白的構建中優(yōu)選從Fc區(qū)刪除某些結合位點。例如，由于不必與輕鏈的共表達，因此重鏈的蛋白結合位點，Bip(Hendershot等，1987，Immunol.Today 8111-114)，從IgE的Fc區(qū)中刪除，這樣這個位點不干擾融合蛋白的有效分泌。同樣地，在Fc區(qū)中存在的負責結合免疫球蛋白輕鏈的半胱氨酸殘基應當被刪除或用另外的氨基酸取代，這樣當其以免疫融合物形式產生時，這些半胱氨酸殘基不干擾Fc區(qū)的正確折疊。跨膜區(qū)序列，如那些在IgM中存在的序列，應當被刪除。
優(yōu)選IgG1 Fc區(qū)。可選擇地，免疫球蛋白γ的其它亞類(γ-2，γ-3和γ-4)的Fc區(qū)可在分泌盒中使用。優(yōu)先在分泌盒中使用的免疫球蛋白γ-1的IgG1 Fc區(qū)包括絞鏈區(qū)(至少部分)、CH2區(qū)、和CH3區(qū)。在一些實施方案中，免疫球蛋白γ-1的Fc區(qū)是刪除CH2的Fc，其包括部分絞鏈區(qū)和CH3區(qū)，但不包括CH2區(qū)。Gillies等，1990，Hum.Antibod.Hybridomas，147描述了刪除CH2的Fc。在一些實施方案中，使用IgA、IgD、IgE、或IgM的Fc區(qū)。
KIM-1-Fc融合蛋白可構建成幾種不同的構型。在一種構型中KIM-1部分的C-末端直接融合到Fc部分的N-末端。在輕微不同的構型中，短接頭，例如，2-10個氨基酸，在KIM-1部分的C-末和Fc部分的N-末端之間結合到融合物中。這種接頭提供構象的彈性，其在一些情況中可提高生物學活性。如果在Fc部分中保留足夠長的鉸鏈區(qū)部分，那么KIM-1-Fc融合將二聚化，因此形成二價分子。單體Fc融合物的同源群將產生單特異性的、二價二聚體。兩種具有不同特異性的單體Fc融合物的混合將產生雙特異性的、二價二聚體。
可使用現(xiàn)有技術中已知的方法構建KIM-1偶聯(lián)物。許多含有相應的氨基反應基和巰基反應基的交聯(lián)劑中的任何一種均可用于將KIM-1連接到血清白蛋白上。合適接頭的實例包括插入巰基反應性-馬來酰亞胺的胺反應性交聯(lián)劑。這些包括，例如，SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS、或GMBS。其它合適的接頭插入巰基反應性-鹵代乙酸基團。這些包括，例如，SBAP、SIA、SIAB，提供保護性或非保護性硫醇用于與巰基反應產生可還原鍵的是SPDP、SMPT、SATA、或SATP，所有這些都可以買到(例如，Pierce Chemicals)。本領域的技術人員可類似地設想用另外的策略將KIM-1N-末端與血清白蛋白連接。
本領域中的技術人員可生產對血清白蛋白的偶聯(lián)物，其不靶向KIM-1多肽的N-末端或血清白蛋白上的巰基部分。例如，可使用基因工程技術生產KIM-1白蛋白融合物，其中KIM-1部分在其氨基末端(N-ter)、羧基末端(C-ter)，或在兩端與血清白蛋白基因融合。
KIM-1多肽的其它衍生物包括修飾的KIM-1或其片段與其它蛋白或多肽的共價或聚合偶聯(lián)物，如通過在重組體培養(yǎng)物中合成作為另外的N-末端或C末端。例如，結合肽在蛋白的N-末端區(qū)可以是信號(或前導)多肽序列，其在翻譯同時或翻譯后(co-translationally or post-translationally)指導蛋白從其合成位點轉移到其細胞膜或細胞壁內外的功能位點(例如，酵母α因子的前導區(qū))。KIM-1多肽可被融合到異源肽上以易于純化或KIM-1部分的鑒定(例如，組氨酸/KIM-1融合物)。KIM-1部分也可被連接到Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO)上(Hopp等，1988，Biotechnology 61204)。這個序列具有高抗原性并提供被特異性單克隆抗體可逆性結合的表位。所以，它易于所表達的重組體蛋白的分析和純化。這個序列被牛粘膜腸激酶在緊接Asp-Lys配對后面的殘基處特異性切割。
使用采用基因融合構建體的表達系統(tǒng)以提高蛋白在細菌中的產量。使用正常情況下以非常高的水平表達的細菌蛋白作為融合蛋白的氨基末端融合配偶體，有助于確保信息有效的轉錄和翻譯，以及在一些情況中確保融合蛋白的分泌和溶解(Smith等，1988 Gene 6731；Hopp等，supra；La Vallie等，1993，Biotechnology 11187)。
偶聯(lián)的聚合物(不同于多肽)本發(fā)明的一些實施方案包括KIM-1多肽，其中一種或多種聚合物結合(共價連接)到KIM-1多肽上。適與這種偶聯(lián)的聚合物的實例包括如多肽(上面所討論的)、糖聚合物和聚亞烷基二醇鏈。典型地，但不是必須地，將聚合物結合到KIM-1多肽上用于提高以下一種或多種特性可溶性，穩(wěn)定性，或生物利用率。
用于與KIM-1多肽結合的優(yōu)選的聚合物種類是聚亞烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是優(yōu)選的聚亞烷基二醇。與單獨的KIM-1多肽相比，PEG部分，例如，1-6PEG聚合物，可與每種KIM-1多肽共價結合以提高血清半衰期。PEG部分是無抗原性并且基本上是生物學惰性。在本發(fā)明的實踐中使用的PEG部分可以是分枝的或不分枝的。
附著到KIM-1多肽上的PEG部分的數(shù)量和單個PEG鏈的分子量可變化?？偟膩碚f，聚合物的分子量越高，附著到多肽上的聚合物鏈就越少。優(yōu)選地，PEG的平均分子量從2kDa到100kDa。更優(yōu)選地，平均分子量從5kDa到20kDa，最優(yōu)選8-12kDa。
聚合物，例如，PEG，可通過多肽上的任何合適的，暴露的活性基團連接到KIM-1多肽上。暴露的活性基團可以是，例如，N末端氨基或內部賴氨酸殘基的ε氨基，或兩者?？墒褂锰烊淮嬖诘馁嚢彼釟埢糜谶@種目的，或者可將賴氨酸殘基人工改造到KIM-1氨基酸序列內。活化的聚合物可在KIM-1多肽上的任何游離氨基處反應和共價連接。游離的羧基、適當活化的羰基、羥基、胍基、咪唑、被氧化的碳水化合物部分和KIM-1的巰基(如果可利用)也可以用作聚合物附著的反應基團。
優(yōu)選地，在結合反應中，根據(jù)多肽濃度不同，每摩爾多肽使用約1.0到約10摩爾活化的聚合物。通常，所選的比值代表使反應最大而損害KIM-1部分的期望的藥理學活性的副反應(常常是非特異的)最小之間的平衡。優(yōu)選地，保留KIM-1多肽生物學活性的至少50％，最優(yōu)選地幾乎100％保留。
可使用常規(guī)的化學方法將聚合物結合到KIM-1多肽上。例如，聚亞烷基二醇部分可被偶聯(lián)到KIM-1多肽的賴氨酸ε氨基上。連于賴氨酸側鏈的鍵可用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯如PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)。合適的聚亞烷基二醇部分包括，例如，羧甲基-NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、醛、環(huán)氧化物、羰基咪唑、和PNP碳酸鹽(酯)。這些試劑可買到?？捎昧硗獾陌贩磻訮EG接頭取代琥珀酰亞胺基部分。這些包括，例如，異硫氰酸鹽(酯)、硝基苯基碳酸鹽(酯)、環(huán)氧化物、和苯并三唑碳酸鹽(酯)。優(yōu)選的條件是使選擇性和程度或反應達到最大。這種反應條件的最優(yōu)化是在本領域普通技術人員掌握之內。
可通過現(xiàn)有技術中已知的任何PEG化反應進行PEG化。見，例如，F(xiàn)ocuson Growth Factors，34-10，1992；公開的歐洲專利申請EP 0 154 316和EP 0401 384。可使用與活性聚乙二醇分子(或類似有活性的水溶性聚合物)酰化反應或烷基化反應進行PEG化。
通過?；腜EG化通常包括使有活性的聚亞烷基二醇的酯衍生物反應。任何活性PEG分子均可用于PEG化。優(yōu)選的活化PEG酯是PEG酯化形成的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。如這里所使用的，“?；卑ㄔ谥委熜缘鞍缀退芫酆衔锶鏟EG之間的下列類型的連接酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。見，例如，Bioconjugate Chem.5133-140，1994。應當選擇反應參數(shù)以避免將破壞或滅活KIM-1多肽的溫度，溶劑和pH的條件。
優(yōu)選地，連接鍵是酰胺。優(yōu)選地，至少最終產物的95％是單、二，或三PEG化的。然而，根據(jù)所使用的特異性反應條件不同，可以不同量形成某些具有更高程度PEG化的種類?？蛇x擇地，純化的PEG化的種類從混合物，特別是未反應的種類中分離，通過常規(guī)的純化方法，包括，例如，透析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析、以及電泳。
通過烷基化的PEG化通常包括使PEG的末端醛衍生物與KIM-1在還原劑存在時反應。另外，可操縱反應條件以利于基本上僅在KIM-1的N-末端的α-氨基上PEG化(即，單-PEG化的蛋白)。在單PEG化或聚PEG化的情況中，PEG基團優(yōu)選通過-CH2-NH-基團附著到蛋白上。特別關于-CH2-基團，這種類型的鍵被稱為“烷基”鍵。
通過還原性烷基化以產生單PEG化產物的衍生化作用，利用不同種類的可用于衍生化作用的伯氨基基團(賴氨酸對N-末端)的差異反應性。反應是在允許利用賴氨酸殘基的ε-氨基和蛋白N-末端的α-氨基之間的pKa差異的pH下完成。通過這種選擇性的衍生化作用，控制含有活性基團如醛的水溶性聚合物附著到蛋白上與聚合物的結合主要發(fā)生在蛋白的N-末端，沒有發(fā)生對其它活性基團如賴氨酸側鏈氨基的有意義的修飾。在酰化和烷基化方法中使用的聚合物分子可從上述水溶性聚合物中選擇。應當修飾所選擇的聚合物以具有單一活性基團，如用于?；幕钚怎セ蛘哂糜谕榛娜Y果聚合的程度可被控制到本方法所提供的程度。示范性的活性PEG醛是聚乙二醇丙醛，其是水溶性的，或單C1-C10烷氧基或其芳氧基衍生物(見，美國專利No.5,252,714)。聚合物可以是分枝的或不分枝的。對于酰化反應，所選擇的聚合物應當具有單一活性酯基。對于還原性烷化，所選擇的聚合物應當具有單一活性醛基。通常，將不會從天然存在的糖基殘基中選擇水溶性聚合物，因為這些通常由哺乳動物重組表達系統(tǒng)更方便地制備。
制備PEG化的KIM-1的方法通常包括步驟(a)在使分子附著到一個或多個PEG基團的條件下，使KIM-1蛋白或多肽與聚乙二醇(如PEG的活性酯或醛衍生物)反應，以及(b)獲得反應產物?？偟膩碚f，基于已知的參數(shù)和期望的結果將一步步決定?；磻淖罴逊磻獥l件。例如，PEG蛋白的比例越大，聚PEG化產物的百分率就越高。
還原性烷基化以產生基本上均一(homogeneous)的單聚合物/KIM-1群通常包括以下幾步(a)在還原性烷基化反應條件下，在適于在KIM-1的氨基末端的α-氨基的pen-nit選擇性修飾的pH，使KIM-1多肽與活性PEG分子反應；以及(b)獲得反應產物。
對于基本上均一的單聚合物/KIM-1群，還原性烷基化反應條件是那些允許水溶性聚合物部分選擇性附著到KIM-1的N-末端的條件。這種反應條件通常提供賴氨酸氨基和N-末端的α-氨基之間的pKa差異(pKa是50％的氨基被質子化，50％未被質子化的pH)。該pH也影響將使用的聚合物與蛋白的比?？偟恼f來，如果pH較低，將期望聚合物大大地超過蛋白(即，活性N-末端α-氨基越少，達到最佳條件所需要的聚合物就越多)。如果pH較高，聚合物蛋白的比值不必那樣大。(因為可利用的活性基團越多，需要的聚合物分子就越少)。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選的pH是在3-9的范圍，優(yōu)選3-6。
KIM-1多肽可包含標簽，例如，可隨后被蛋白酶解釋放的部分。因此，賴氨酸部分可被選擇性修飾，通過首先將修飾的組氨酸標簽與低分子量如將與賴氨酸和N-末端都反應的Traut′s試劑(Pierce)接頭反應，然后釋放組氨酸標簽。多肽然后將包含游離SH基，該SH基可被含有巰基活性頭部基團如馬來酰亞胺基、乙烯砜基、鹵代乙酸基團、游離的或被保護的SH的PEG選擇性修飾。
Traut′s試劑可以用將建立PEG附著的特異性位點的任何接頭取代。作為例子，Traut′s試劑可被SPDP、SMPT、SATA、或SATP(所有都可從Pierce買到)取代。類似地，可將蛋白與插入馬來酰亞胺(例如，SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS、或GMBS)、鹵代乙酸基團(SBAP、SIA、SIAB)、或乙烯砜基的胺反應性接頭反應，以及將最終的產物與含有游離SH基的PEG反應。對所使用的接頭的唯一限制是不能阻滯隨后N-末端標簽的去除。
在一些實施方案中，聚亞烷基二醇部分偶聯(lián)到KIM-1多肽的胱氨酸基團上。使用例如，馬來酰亞胺、乙烯砜基、鹵乙酸基團、和巰基可影響偶聯(lián)。
可選擇地，KIM-1多肽通過不穩(wěn)定的鍵結合到聚乙二醇上。該不穩(wěn)定的鍵可被切割，例如，生化水解、蛋白酶解、或巰基裂解。例如，該鍵可在體內(生理)條件下被切割。
可通過用于使生物活性材料與惰性聚合物反應的任何合適的方法進行該反應，優(yōu)選地在約pH 5-8，例如，pH 5，6，7，或8，如果活性基團位于N-末端的α-氨基。通常該過程包括制備活化的聚合物，然后使蛋白與活化的聚合物反應以產生適于制備制劑的可溶性蛋白。
在KIM-1多肽上的一個或多個位點可偶聯(lián)聚合物。例如，可將1，2，3，4或5個PEG部分附著到氨基末端。
抗KIM-1抗體根據(jù)本發(fā)明所使用的抗KIM-1抗體或其抗原結合片段可以是各種類型分子中的任何一種，包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化抗體、完全人抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、雙抗體(diabody)、Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2、Fv片段、Fd片段、dAb片段、以及含有互補決定區(qū)(CDR)的片段。
如這里所使用的Fd意思是由VH和CH1區(qū)構成的片段；Fv意思是由抗體單臂的VL和VH區(qū)構成的片段；dAb意思是由VH構成的片段(Ward等，1989，Nature 341544-546)。如這里所使用的，單鏈抗體(scFv)意思是一種抗體，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對，通過能使它們成為單一蛋白鏈的合成接頭形成單價分子(Bird等，1988，Science 242423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。如這里所使用的，雙抗體意思是雙特異抗體，其中在單一多肽鏈上表達VH和VL區(qū)，但使用非常短不允許在相同鏈上的兩個區(qū)之間配對的接頭，因此迫使這兩個區(qū)與另一鏈的互補區(qū)配對并生成兩個抗原結合位點(見，例如，Holliger，等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；和Poljak等，1994，Structure 21121-1123)。
通常用于獲得抗體的可應用的方法在現(xiàn)有技術中是已知的。制備抗KIM-1抗體的有用的方法和材料的綜述，見，例如，Harlow等，1988，Antibodies，A Laboratory Manual；Yelton，等，1981，Ann.Rev.Biochem.，50657-80.；和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology(NewYorkJohn Wiley & Sons)?？筀IM-1抗體的抗原結合特性可通過本領域普通技術人員進行測定，使用多種常規(guī)方法中的任何一種，包括，例如，放射免疫測定法、免疫印跡試驗和ELISA。生產本發(fā)明抗體的其它技術包括體外將淋巴細胞暴露于KIM-1多肽，或者篩選在噬菌體或類似載體上的抗體庫。見，例如，Huse等，1989.Science，2461275-1281。
載體本發(fā)明提供包括編碼KIM-1多肽的核酸的載體。載體和可操作地連接到本發(fā)明的核酸上的表達調控序列的選擇依賴于所期望的功能特性，例如，蛋白表達，以及將被轉化的宿主細胞。本發(fā)明的載體可能至少能指導復制或插入到宿主染色體中，優(yōu)選也能表達包含在rDNA分子中的結構基因。
對于調控可操作地連接的編碼序列表達有用的表達控制元件在現(xiàn)有技術中是已知的。實例包括，但不限于，可誘導的啟動子、組成型啟動子、分泌信號、和其它調控元件。當使用可誘導啟動子時，其可被控制，例如，通過其營養(yǎng)狀態(tài)的改變、或者溫度、宿主細胞培養(yǎng)基的改變。
載體包括原核復制子，即，具有能指導原核宿主細胞中染色體外的重組DNA分子自主復制和維持的DNA序列，如用其轉化的細菌宿主細胞。這種復制子在現(xiàn)有技術中是公知的。另外，包括原核復制子的載體也可包括其表達賦予可檢測的標記如藥物抗性的基因。細菌藥物抗性基因典型的是那些賦予氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因。
包括原核復制子的載體可進一步包括用于指導編碼基因序列在細菌宿主細胞中表達的原核的或噬菌體啟動子。在含有用于插入本發(fā)明的DNA片段的方便的限制性酶切位點的質粒載體中典型地提供與細菌宿主相容的啟動子序列。這種載體質粒的實例是pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRadLaboratories)、pPL和pKK223(Pharmacia)。任何合適的原核宿主都可用于表達編碼本發(fā)明蛋白的重組DNA分子。
真核細胞表達載體在現(xiàn)有技術中是已知的并可買到。典型地，這種載體含有用于插入所期望的DNA片段的方便的限制性酶切位點。示范性載體包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pML2d(InternationalBiotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)。
真核細胞表達載體可包括可選擇性的標記，例如，藥物抗性基因。優(yōu)選的藥物抗性基因賦予新霉素抗性，即，新霉素磷酸轉移酶(neo)基因(Southern等，1982，J.Mol.Anal.Genet.1327-341)。
為了表達抗體或抗體片段，將編碼部分或全長輕和重鏈的DNAs插入到表達載體中。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的游離基因等。選擇表達載體和表達控制序列與所使用的表達宿主細胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到獨立的載體中。在一些實施方案中，兩種基因被插入到相同的表達載體中。
方便的載體是編碼有功能的完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的載體。優(yōu)選地，如上所述，限制性酶切位點進行改造使得任何VH或VL序列可被容易地插入和表達。在這種載體中，剪接通常發(fā)生在插入的J區(qū)中的剪接供體位點和前述人C區(qū)的剪接受體位點之間，也在位于人CH外顯子內的剪接區(qū)上。聚腺苷酸化和轉錄終止發(fā)生在編碼區(qū)的天然染色體位點下游。重組體表達載體也可編碼便于從宿主細胞中分泌抗體鏈的信號肽。
用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選的調控序列包括在哺乳動物細胞中指導蛋白高水平表達的病毒元件，如來源于逆轉錄病毒LTRs、巨細胞病毒(CMV)(如CMVV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒，(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多形瘤的啟動子和增強予以及強哺乳動物啟動子如天然免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子。病毒調控元件及其序列的進一步描述，見，例如，Stinski的美國專利No.5,168,062，Bell等的美國專利No.4,510,245和Schaffner的美國專利No.4,968,615。
重組表達載體可攜帶調控載體在宿主細胞中復制的序列(例如，復制的起點)和可選擇的標記基因?？蛇x擇的標記基因便于載體被引入到其中的宿主細胞的選擇(見，例如，美國專利Nos.4,399,216，4,634,665和5,179,017，所有都是Axel等的專利)。例如，典型地可選擇的標記基因在載體被引入的宿主細胞中賦予對藥物，如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。優(yōu)選的可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于使用氨甲蝶呤選擇/擴增dhfr-宿主細胞)和neo基因(用于G418選擇)。
編碼KIM-1多肽和抗-KIM-1抗體的核酸，以及包含這些核酸分子的載體，可用于轉化合適的宿主細胞。將外源DNA引入到哺乳動物中的方法在現(xiàn)有技術中是公知的，包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸包裹到脂質體中、以及DNA直接顯微注射到細胞核內。另外，核酸分子可通過病毒載體被引入到哺乳動物細胞中。
宿主細胞的轉化可通過適于所用載體和宿主細胞的常規(guī)方法進行。關于原核宿主細胞的轉化，可采用電穿孔和鹽處理法(Cohen等，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110-2114)。關于脊椎動物細胞的轉化，可以采用電穿孔、陽離子脂質或鹽處理法(見，例如，Graham等，1973，Virology 52456-467；Wigler等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761373-1376)。
宿主細胞可以是原核的或真核的。優(yōu)選的真核宿主細胞包括，但不限于，酵母和哺乳動物細胞。有用的真核宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(ATCC登記號No.CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH-3T3(ATCC登記號No.CRL1658)，以及幼倉鼠腎細胞(BHK)?？捎米魉拗饔糜诒磉_的哺乳動物細胞系在現(xiàn)有技術中是已知的，包括許多可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的永生細胞系。除了別的以外，這些包括，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞，以及許多其它細胞系。
使用已知技術可提高生產細胞系表達多肽。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)通常在某種情況下用于提高表達。見，例如，歐洲專利Nos.0216846、0256055、和0323997以及歐洲專利申請No.89303964.4。
制劑包含KIM-1多肽、抗KIM-1抗體、或抗KIM-1抗體的抗原結合片段的組合物可含有適當?shù)乃帉W上可接受的載體。例如，他們可含有賦形劑和/或輔料，便于將活性化合物加工成預定用于輸送到作用位點的制劑。用于腸胃外給藥的合適的制劑包括水溶型活性化合物的水溶液，例如，水溶性鹽。此外，活性化合物的懸液可作為適當?shù)挠托宰⑸鋺乙菏┯谩：线m的親脂性溶劑和載體包括脂肪油，例如，芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如，乙基油酸酯或甘油三酯。水性注射懸液可含有增加懸液粘性的物質，包括，例如，羧甲纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖?？蛇x擇地，懸液也可含有穩(wěn)定劑。也可使用脂質體包封本發(fā)明的分子用于遞送到細胞或胞間隙內。示范性的藥學上可接受的載體是生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、水、鹽、磷酸緩沖鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等。在一些實施方案中，組合物包括等張劑，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。在一些實施方案中，組合物包括藥學上可接受的物質如潤濕劑或者少量輔助物質如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其提高活性成分擱置期或效力。
本發(fā)明的組合物可以各種形式，包括，例如，液體、半固體和固體劑型，如液體溶液(例如，可注射的和難熔(infusible)的溶液)、分散體或懸液。優(yōu)選的形式根據(jù)打算施用的方式和治療應用的不同。在一些實施方案中，組合物是可注射或不熔的液體形式，如類似于那些用于人被動免疫的組合物。
組合物可被制成溶液、微乳劑、分散體、脂質體，或其它適于高藥物濃度的有序結構。可通過將溶于適當溶劑的活性成分以所需量與以上列舉的成分中的一種或其組合混合，根據(jù)需要，隨后過濾滅菌制備無菌注射液。通常，通過將活性物質結合到無菌載體中制備分散體，其中無菌載體含有堿性分散劑和來自以上列舉的那些中的所必需的其它成分。就用于制備無菌可注射液的無菌粉末來說，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，產生活性成分的粉末，向先前無菌過濾的溶液中加上任何另外期望的成分，可維持溶液的適當流動性，例如，通過使用包衣如卵磷脂，通過保持所需顆粒的大小，以及通過使用表面活性劑。通過在組合物中包括延遲吸收的物質，例如，單硬脂酸鹽和明膠，可延長可注射的組合物的吸收。
在一些實施方案中，活性成分是用控制釋放的制劑或裝置制成。這樣的制劑和裝置的實例包括植入物、經皮貼劑、以及微囊包埋遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾模锵嗳莸木酆象w，例如，乙烯乙烯基乙酸酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯，以及聚乳酸。制備這種制劑和裝置的方法在現(xiàn)有技術中是已知的。見，例如，Sustained and Cofzttolled Release Drug DeliverySystems，1978，J.R.Robinson，編，Marcel Dekker，Inc.，New York。
也可將補充的活性化合物結合到化合物中。在一些實施方案中，KIM-1多肽、抗KIM-1抗體或其片段與第二種免疫調制劑同時施用，所述第二種免疫調節(jié)劑例如，BAFF-R-Ig、LTJ3-R-Ig、CTLA4-Ig、抗CD40L、或抗-CD20單克隆抗體。
可調整劑量方案以提供所期望的最佳反應。例如，可以施用單劑，可隨著時間施用幾個分開的劑量，或者劑量可由治療情況的緊急所指示按比例減少或增加。制備給藥容易的劑量單位形式的腸胃外組合物是有利的，如這里所使用的劑量單位形式一致是指完全分散的單位，作為單位劑量適于將被治療的哺乳動物受試者，每個單位與所需要的藥學載體結合，含有經計算產生期望治療效果的預定量的活性化合物。
在一些實施方案中，KIM-1的治療有效劑量是0.1到100mg/kg。在一些實施方案中，治療有效劑量是0.5到50mg/kg。在一些實施方案中，治療有效劑量是1.0到10mg/kg，例如，約5mg/kg。也可通過體外測量適當(治療)時期包被靶細胞(KIM-1或KIM-1受體陽性細胞，根據(jù)修飾劑的不同)所需的修飾劑濃度的實驗，評價有效劑量的決定。FACS和ELISA受體配體結合試驗可用于監(jiān)視細胞包被反應?；谶@些體外結合試驗的結果，可選擇適宜修飾劑濃度的范圍。
通過與藥學上可接受的無毒輔料或載體混合，可將本發(fā)明的分子制成藥物組合物。這種組合物可被制成用于腸胃外給藥，特別是以液體溶液或懸液的形式。組合物可以單位劑型施用，并可通過任何合適的方法制備。這些方法在現(xiàn)有技術中是已知的。例如，見，Remngton′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA 1980)。
液體劑型包括藥學可接受的溶液、乳劑、微乳液，和懸液。除了活性化合物，液體劑型可含有惰性成分包括水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐脂、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯、及其混合物。
可通過在可降解的聚合物如聚交酯-聚乙醇酸交酯(polyactide-polyglycolide)中形成藥物的微囊包埋的基質，制備可注射的貯存制劑。根據(jù)藥物與聚合物的比率，及所用聚合物的特性，可以控制藥物釋放的速率。其它示范性的生物可降解的聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。貯存可注射的制劑也可通過將藥物陷入與身體組織相容的脂質體或微乳劑中制備。
實施例本發(fā)明通過以下列試驗實例進一步闡述。實施例僅用作說明目的，不應當被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內容。
實施例1人KIM-1胞外域-Fc構建體(pHI105)將人KIM-1的胞外域(1-290殘基)融合到人IgG1的Fc部分(鉸鏈，CH2，CH3)并克隆到pEAG347(一種Biogen哺乳動物表達質粒)中。該質粒含有用于組成型表達的串聯(lián)啟動子和用于穩(wěn)定表達細胞系的氨甲喋呤選擇的二氫葉酸還原酶基因。編碼的融合多肽的氨基酸序列如下1 102030405060MHPOVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNG708090 100 110 120IVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITV130 140 150 160 170 180SLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVPTTMTVS190 200 210 220 230 240TTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGA250 260 270 280 290 300IRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGVDKTHT 310 320 330 340 350 360PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT370 380 390 400 410 420KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY430 440 450 460 470 480TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK490 500 510 518LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK信號序列用下劃線表示。Fc鉸鏈用方框表示。
實施例2人KIM1ECD粘蛋白Δ-Fc(pHI100)將編碼與人IgG1 Fc部分(鉸鏈，CH2，CH3)融合的人KIM-1 1-129殘基的DNA克隆到pEAG347(一種Biogen哺乳動物表達質粒)中，其含有用于組成型表達的串聯(lián)啟動子和用于穩(wěn)定表達細胞系的氨甲喋呤選擇的二氫葉酸還原酶基因。編碼的融合多肽的氨基酸序列如下102030405060MHPOVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNG708090 100 110 120IVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITV130 140 150 160 170 180SLEIVPPKVVDKTHT PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED190 200 210 220 230 240PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA250 260 270 280 290 300PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN310 320 330 340 350YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK實施例3人KIM1ECD-6個組氨酸(pVB602)將人KIM-1的細胞外域(1-290殘基)融合到包括6個組氨酸殘基重復的短C-末端肽[VEHHHHHH]并克隆到pCA125中，一種BIOGEN哺乳動物表達質粒，含有用于在哺乳動物中短暫組成型表達的CMV啟動子。編碼的融合多肽的氨基酸序列如下
102030405060MHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNG708090 100 110 120IVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITV130 140 150 160 170 180SLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVPTTMTVS190 200 210 220 230 240TTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGA250 260 270 280 290IRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGVEHHHHHH實施例4小鼠KIM-1-Fc融合物將兩側為NotI和SalI位點的PCR擴增的小鼠kim-1的胞外域與人IgG1Fc(作為SalI-NotI片段從EAG409中分離的)融合，并克隆到Ebna 293細胞表達載體CH269(構建體PEM073-6)和CHO細胞表達載體pV90(構建體PEM078-1)。SalI位點位于kim1和Fc的連接處。最終用于融合的ORF的核苷酸序列如下(SalI位點在上面的實例中)atgaatcagattcaagtcttcatttcaggcctcatactgcttctcccaggcactgtggattcttatgtggaagtaaagggggtagtgggtcaccctgtcacacttccatgtacttactcaacatatcgtggaatcacaacgacatgttggggccgagggcaatgcccatcttctgcttgtcaaaatacacttatttggaccaatggacatcgtgtcacctatcagaagagcagtcggtacaacttaaaggggcatatttcagaaggagatgtgtccttgacgatagagaactctgttgagagtgacagtggtctgtattgttgtcgagtggagattcctggatggtttaatgatcagaaagtgaccttttcattgcaagttaaaccagagattcccacacgtcctccaacaagacccacaactacaaggcccacagctacaggaagacccacgactatttcaacaagatccacacatgtaccaacatcaatcagagtctctacctccactcctccaacatctacacacacatggactcacaaaccagaacccactacattttgtccccatgagacaacagctgaggtgacaggaatcccatcccatactcctacagactggaatggcactgcgacatcctcaggagatacctggagtaatcacactgaagcaatccctccagggaagccgcagaaaaaccctactaagggcGTCGACaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcccgggaaatga
ukim-1胞外域-人Fc的翻譯序列如下。由SalI位點貢獻的兩個連接氨基酸用粗體顯示MNQIQVFISGLILLLPGTVDSYVEVKGVVGHPVTLPCTYSTYRGITTTCWGRGQCPSSACQNTLIWTNGHRVTYQKSSRYNLKGHISEGDVSLTIENSVESDSGLYCCRVEIPGWFNDQKVTFSLQVKPEIPTRPPTRPTTTRPTATGRPTTISTRSTHVPTSIRVSTSTPPTSTHTWTHKPEPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPTDWNGTATSSGDTWSNHTEAIPPGKPQKNPTKGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK實施例5小鼠SRBC模型中KIM-1-Fc融合物嚙齒動物對綿羊紅細胞(SRBC)的免疫反應依賴于感受態(tài)T細胞與APCs和B細胞的相互作用。因此，抗SRBC應答對于檢查淋巴細胞和APC上的細胞蛋白在免疫反應的發(fā)育和成熟中的作用是一種有用的模型。在小鼠中抗SRBC應答由產生IgM和產生各種IgG同種型構成，包括高水平的IgG1同種型，也見到相當水平的IgG2a和IgG2b。IgG1被認為是由Th2介導的免疫反應驅動的同種型，其特點是表達如IL-4、IL-5和IL-13的細胞因子。IgG2a和IgG2b同種型更具有Th1驅動的免疫反應的特征，與IL-12的表達有關。最后，IgG3同種型是不依賴T的免疫反應的典型。在抗SRBC應答中表現(xiàn)所有4種同種型。
抗SRBC應答的過程是在小鼠用KIM-1-Ig融合蛋白(mKIM-1-Ig)處理以阻斷在T細胞上的依賴KIM-1的活性之后。在攻擊前的那一天(D-1)用150ugs/小鼠mKIM-1-Ig處理小鼠，在第0天用100μl溶于PBS的10％SRBC溶液(Colorado血清公司)攻擊，然后用150μg mKIM-1-Ig在第3和6天再次處理。在免疫后第7、14、21和30天，給小鼠放血采集血清樣品，使用血細胞凝集試驗獲得抗SRBC抗體效價。這種試驗依賴于抗體交聯(lián)和聚集(“凝集”)SRBC的能力，基于它們的五聚體結構(對于IgM)或基于出現(xiàn)第三種抗獨特型抗血清(對于Ig類)。
簡言之，方案如下。將血清樣品適當稀釋(1∶15到1∶200)，根據(jù)被測定的同種型和反應的時間而不同，然后使用從Corning(Costar#3795)獲得的96孔試驗板以1∶2步驟(in 1∶2 steps)滴定。對于IgM試驗，一式兩份分析血清樣品。向孔中加入25μl溶于葡萄糖-PBS(G-PBS)的10％SRBC，允許凝集反應在37℃進行1小時。對于Ig試驗，將血清樣品加到平板內并一式三份稀釋。將25山在G-PBS中稀釋的1％2-巰基乙醇(Sigma)加到每個血清樣品系列中，然后將平板在培養(yǎng)基在37℃孵育30分鐘。這是破壞將IgM五聚體結合在一起的所有二硫鍵，因此消除任何IgM背景。然后，將25μl溶于G-PBS的10％SRBC溶液，和25μl在G-PBS中1∶250稀釋的抗獨特型抗血清(羊抗-鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、或IgG3，所有都來自Southern Biotechnology Associates)加入到每一式三份中的前兩份以交聯(lián)所存在的那個亞型的抗SRBC IgGs。將每一式三份中的第3個孔留下來不被交聯(lián)，用作2-巰基乙醇處理后可能殘存的任何殘余IgM活性的對照。平板在37℃孵育1小時。所有分析平板留下來在4℃過夜，在評分和照相前以穩(wěn)定得到的血細胞凝集。記下所有效價作為得到陽性凝集讀數(shù)的最后一次稀釋。
將用mKIM-1-Ig處理對抗SRBC反應的效果與未用SRBC攻擊，或用SRBC攻擊但給予抗CD40L、非特異性多克隆hIgG，或PBS的對照組小鼠比較。與預期的一樣，未被攻擊和抗CD40L處理的小鼠沒有抗SRBC反應。給予SRBC和施用PBS或hIgG的小鼠對被檢驗的Ig的所有類型都有強烈的抗體效價。用mKIM-1-Ig處理的小鼠則相反，非常顯著和特異性缺乏IgG1抗SRBC同種型。在使用小鼠Balb/c系的2個獨立試驗中，檢測到IgG1抗SRBC的水平顯著缺乏(圖3和4)。誘導抗SRBC反應后7天，在用mKIM-1-Ig處理的小鼠中IgG1效價平均低于對照處理的小鼠70％。到誘導抗SRBC反應后14天，IgG1效價減少超過85％。在使用小鼠C57B1/6系的一個實驗中觀察到類似的缺乏(圖5)。Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠被認為在它們的免疫反應中具有不同的傾向性，Balb/c小鼠的特點是具有主要地Th2介導的應答，C57B1/6小鼠具有主要地Th1介導的應答。因此，在這些小鼠品系中，小鼠KIM-1-Ig融合蛋白阻斷產生IgG1同種型的能力超越了品系中固有的Th傾向性。令人驚奇地，mKIM-1-Ig處理的影響延續(xù)到再次應答，對隨后的SRBC攻擊沒有由記憶B細胞產生IgG1(圖6和7)。
實施例6移植物抗宿主病(GVHD)在小鼠中使用親本細胞移入F1細胞的移植方案模擬GVHD。小鼠DBA2系的脾細胞被靜脈注射到(DBA2×C57B1/6)F1小鼠中，其被稱為B6D2F1。注入的脾細胞構成移植物，DBA2小鼠是該移植物的供體。接受移植物的F1小鼠是宿主。在移植物中存在的供體T細胞將宿主細胞上的一半MHC標記(單倍型)識別為外源標記，因為它們來源于其它品系，C57B1/6親代。這誘導供體T細胞抗宿主反應，導致GVHD。當DBA/2親本脾細胞注射到B6D2F1宿主中時，發(fā)生慢性GVHD。相反，當C57B1/6脾細胞注射到B6D2F1宿主中時，發(fā)生急性GVHD。雖然仍不清楚什么機理負責使用這兩種注射方案所產生的顯著不同的疾病結果，但是相信在DBA/2脾細胞移植物中含有的細胞所表達的細胞因子有助于產生慢性GVHD，而在C57B1/6脾細胞移植物中含有的細胞所表達的細胞因子有助于產生急性GVHD。干擾T細胞與抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞、巨噬細胞、B細胞APC)相互作用的試劑有效地阻斷急性和慢性GVHD。
KIM-1拮抗劑在慢性GVHD的小鼠模型中減輕免疫反應的發(fā)展。阻斷慢性GVHD的能力包括對B細胞活化和增殖的影響，以及對產生所分泌的IgG的影響。小鼠腹膜內(ip)用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理，對照處理，或者留下來不被處理。4小時后，小鼠接受從DBA/2小鼠中分離的1×108脾細胞，靜脈內(iv)給予0.5ml注射劑。靜脈注入的DBA/2脾細胞構成同種移植物。給予移植物后2、4和6天，小鼠再次用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理或者用對照處理。另外對照組的小鼠接受1×108B6D2F1脾細胞，其在B6D2F1受體中不能誘導疾病?？蛇x擇地，未移植的和未處理的B6D2F1小鼠用作對照。給予移植物后第14天處死小鼠，檢查疾病的證據(jù)。
未處理的移植物受體小鼠表現(xiàn)多種指示產生慢性GVHD的癥狀。脾腫大，或者脾臟增大，是供體T細胞和宿主B細胞被活化的證據(jù)，經歷多克隆擴增，細胞數(shù)量急劇增加。細胞表面蛋白如B細胞亞型上的CD69的出現(xiàn)指示B細胞活化。CD4+和CD8+T細胞的L-選擇蛋白分子的喪失是T細胞活化的證據(jù)。Ig分子，如IgG類、IgA、和IgE，分泌進入血清，或者在體外細胞培養(yǎng)物試驗中，指示B細胞被活化，并已轉換了它們的Ig種類。在這點上，抗自身Ig出現(xiàn)在血清中或在體外細胞培養(yǎng)物試驗顯示產生的Ig具有不適當?shù)淖陨砜乖R別。最后，可測量存活作為不同治療方案的結果。用KIM-1拮抗劑(例如，KIM-1-Ig)的治療阻斷慢性GVHD的發(fā)展，如表現(xiàn)為脾腫大程度減少、淋巴細胞群的多克隆擴增減少、指示淋巴細胞活化的細胞表面標記減少或消失、Ig分泌減少、和/或死亡率降低。
我們將對照小鼠與未被處理的同種移植物-受體小鼠比較，檢查GVHD期間脾腫大、B細胞活化和Ig分泌的程度。在這些實驗中，抗CD40L mAbMR1用作陽性對照，因為先前顯示阻斷CD40L/CD40相互作用是干擾慢性GVHD發(fā)生的有效方法(Durie等，1994，J.Clin.Invest.941333-1338)。為了研究受用KIM-1拮抗劑處理影響的細胞群，對從移植物注射后14天的受體小鼠中獲取的脾細胞進行FACS分析。從每組3-4只小鼠中分離和匯集脾細胞。受體B細胞的活化是定義慢性GVHD的特征。在經受慢性GVHD的小鼠中，少量但容易看得見的比例的B200+B細胞表達活化標志物CD69。因此，CD69表達作為疾病程度的衡量標準。也測量不同處理組小鼠的脾細胞培養(yǎng)物中的總IgG，因為B細胞所表達的CD69指示它們的活化狀態(tài)。
在小鼠模型中，疾病的發(fā)展依賴于Th2細胞因子IL4，可通過用抗-IL4mAb處理被阻斷。這種處理阻止宿主B細胞的擴增，以及伴隨的Ig產生過多。GVHD的發(fā)展可以多種方式進行。通過脾指數(shù)測量供體T細胞和宿主B細胞群的擴增，所述脾指數(shù)是脾重量與體重的比，對對照(無病的)小鼠標準化。使用B細胞活化標記的分析測量患病小鼠中B細胞的活化。最后，B細胞活化的效果可在循環(huán)(例如，在血清中)中或由疾病誘發(fā)后數(shù)周收獲的宿主脾細胞培養(yǎng)物所產生的Ig的水平中看到。在患病動物中循環(huán)的Ig將含有抗自身抗體。最終，患病動物死于由于累積的Ig沉積所導致的腎或其它器官衰竭，因此是否存活是疾病活動的相關衡量標準。
實施方案7SCID-hu小鼠模型可在SCID-hu小鼠中研究人免疫反應。例如，SCID小鼠腹膜內注射2-5×107人外周血單個核細胞，這些細胞存在于腸道中一段時間并發(fā)揮功能，以及對抗原攻擊起反應。用人PBLs重建NOD-SCID小鼠，這些小鼠具有另外的優(yōu)點，人細胞(T、B、APC)播種到脾內，可支持系統(tǒng)免疫反應。在Berney等，2001，Transplantation 72133-140中討論了合適的模型。免疫反應的其它模型使用SCID/米色小鼠，包括PBLs或胎兒細胞(fetal cells)與胎兒腸系膜淋巴結的共移植以提供對免疫反應的支持(Carballido等，2000，Nat.Med.6103-106)。
用從破傷風類毒素(TT)免疫的人供體中分離的外周血單個核細胞(PBMCs)重建SCID-hu或NOD-SCID-hu小鼠。這樣重建的SCID-hu小鼠具有定居于各種區(qū)室包括腹膜中的人細胞。這樣重建的NOD-SCID-hu小鼠具有存在于各種區(qū)室包括位于它們的次級淋巴器官內，如脾中的人T細胞。在這些重建的小鼠中，通過用與TT、或與TT的抗原部分、或與脂質體、或者與含有TT的脂質體偶聯(lián)的抗原免疫誘發(fā)初次免疫反應。這樣重建并被攻擊的小鼠對抗原(例如，NP、DNP、KLH、OVA、HIVgp120或其部分、黑色素瘤相關抗原GD2、羊粘蛋白等許多例子)產生高效價(＞1∶1000)Ig。一些實例存在于Ifverson等，1995，Immunology 84111-116中。這樣重建并隨后用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理的小鼠對抗原攻擊不產生高效價。
在其它的方法中，SCID-hu小鼠是用人胎兒骨、胸腺、皮膚碎片、以及腸系膜淋巴結(MLN)重建。MLN的出現(xiàn)足以支持對TT-免疫的強烈的免疫反應(而且，因為所有的供體組織都是胎兒的，所以這嚴格地說是初次免疫反應)。在Carballido等，2000，Nat.Med.6103-106中詳細討論了這種模型。TT免疫導致人淋巴細胞增殖和活化，以及由B細胞分泌IgM和IgG。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理重建的SCID小鼠一旦受到TT攻擊則減少人淋巴細胞增殖、活化、以及免疫球蛋白的分泌。
在這些模型，或其它類似NOD-SCID-hu或SCID-hu模型的修飾中，在疾病背景中測量再次免疫反應，例如，遲發(fā)型超敏反應(DTH)。在這種情況中在用TT免疫的個體的PBMCs重建的SCID或NOD-SCID小鼠的爪墊中給予TT攻擊，在反應中測量爪墊的腫脹。DTH反應依賴于重建的小鼠循環(huán)中出現(xiàn)的人記憶T細胞。這種模型也可被用于檢測移植病人中供體組織可能發(fā)生的排斥，與在“trans vivo”模型中一樣。在Carrodeguas等，1999，Hum.Immunol.60640-651中討論了這類方法的一個實例。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理這樣重建的小鼠預防DTH反應。在SCID小鼠中人疾病反應的其它模型包括在小鼠中轉移自身免疫病人的脾細胞或PBMCs，其中它們繼續(xù)表達免疫球蛋白和疾病的其它標志物(見Martino和Grinaldim 1997，在Immunology Methods Manual，vol 3.Lefkovits，編，Academic Press，San Diego)。在從病人中轉移自身免疫細胞前，用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理這些小鼠，減少免疫球蛋白和或自身免疫病變的其它標志物的表達。
非常有價值的利用SCID小鼠的方法包括將疾病組織異種移植到受體小鼠上。例如，從牛皮癬或特應性皮炎病人中轉移皮膚的方法是這些疾病廣泛使用的模型。特應性皮炎是Th2介導的細胞免疫疾病，其可在SCID小鼠中通過將PBMCs和皮膚的活檢物一起轉移到受體小鼠中模擬。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理這些小鼠防止細胞的累積和局部的細胞因子分泌，其是皮膚移植物中淋巴細胞和效應細胞(嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞，等)活化的證據(jù)。這是在供體病人中預防皮炎有效的證據(jù)。
實施例8.特應性疾病的其它鼠模型在小鼠中建立過敏反應、哮喘、氣道超敏反應(AHR)，和其它特應性疾病的有用模型。例如，過敏性皮炎是通過用抗原使外皮致敏誘導。在一個實例中，抗原是卵白蛋白(OVA)。對這種致敏的Th2反應表現(xiàn)為在皮膚中出現(xiàn)嗜酸粒細胞、Th2細胞因子在皮膚中的局部表達、以及對吸入抗原引起的氣道超敏反應(AHR)。首先用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理的OVA致敏的小鼠的皮膚中沒有嗜酸粒細胞，并且Th2細胞因子的水平降低。重復致敏的小鼠產生OVA特異性IgE，并且在體外用OVA刺激后它們的脾細胞分泌Th2細胞因子IL-4和IL-5。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理時，Th2免疫反應的這些現(xiàn)象被阻止?？蛇x擇地，可用i.p.注射抗原(第0天)對小鼠(例如，BALB/c小鼠)致敏，然后3周后(一次)和四周后(3次例如26、27、28天)通過鼻內給予抗原再次攻擊。這產生肺高反應性(AHR)，其通過Th2細胞因子如IL-13介導。一旦用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理會阻斷這種Th2免疫反應。
使用OVA特異性TCR轉基因模型(DO 11.10)，我們誘導OVA特異性免疫反應，然后將Th2 OVA特異性T細胞轉移到初始受體(naive recepients)，其然后用OVA氣霧劑攻擊。這些小鼠迅速發(fā)生抗原特異性AHR。當小鼠在OVA氣霧劑攻擊前用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理會阻斷這種反應。
乙酰甲膽堿(methacholine)氣霧劑治療誘導肺募集嗜酸粒細胞，導致小鼠AHR。用KIM-1拮抗劑或修飾劑治療小鼠阻止了AHR的產生。
實施例9膠原誘導的關節(jié)炎在關節(jié)炎的這種鼠模型中，使用膠原觸發(fā)T細胞介導的B細胞活化和產生自身抗體，其攻擊關節(jié)，導致類似類風濕性關節(jié)炎的情況。在小鼠的各種品系中這種反應被高效價的IgG1控制。尤其是，在由于遺傳缺陷導致缺少IL-12的小鼠(IL-12敲除小鼠IL-12-/-)中IgG1效價非常高，這些抗體有效地介導關節(jié)破壞。
在兩個部位通過皮內注射溶于完全弗氏完全佐劑的膠原處理小鼠對每只耳朵給予少量膠原，以及對兩肩之間的皮膚給予少量膠原。3周后小鼠用溶于鹽的可溶性膠原強化，使用腹腔內途徑。1周內，通過用卡鉗測量關節(jié)的腫脹和通過測量抗體效價評估關節(jié)損害。在病程發(fā)展過程中小鼠的治療改善了疾病評分。尤其是，在疾病開始之前的那一天用0.1-1mg/kg的KIM-1拮抗劑或修飾劑處理，隨后進行治療，將會阻止疾病發(fā)展，通過關節(jié)腫脹的減輕和免疫球蛋白效價的降低來評價。這是治療中的預防性治療。
誘導后，以及加強前，用KIM-1拮抗劑的治療改善疾病發(fā)展，通過關節(jié)腫脹的減輕和免疫球蛋白滴度的降低評價。這是治療中的治療性治療。強化注射后用KIM-1拮抗劑或修飾劑的治療阻止疾病發(fā)展，通過關節(jié)腫脹的減輕和免疫球蛋白效價降低來評價。這是治療的治療過程。
實施例10狼瘡的小鼠模型在NZB/W模型中，NZB系的小鼠與NZW系的小鼠交配，隨著時間推移，F(xiàn)1后代產生狼瘡樣疾病。疾病的表現(xiàn)包括產生自身抗體和類風濕因子。由于產生大量的Ig和RF造成腎中Ig沉積，導致隨著時間降低腎的功能，可通過尿中的蛋白尿來測量。
NZB/W F1后代在5月齡左右開始出現(xiàn)疾病的癥狀，此時伴有中等蛋白尿評分(PU為2)。到9月齡時小鼠將達到最大值PU＝4，將開始死于腎臟衰竭的結果。另一個稱做SNF1(SWR×NZB F1雜交)的模型具有類似的動態(tài)過程。
在疾病發(fā)病前用0.1-1mg/kg的KIM-1拮抗劑處理小鼠，隨后進行治療。這阻止了疾病的發(fā)展，通過PU評分，和/或通過測量血清中免疫球蛋白的效價，和/或通過脾增生的免疫組織化學分析，和/或通過腎臟中腎小球結構中的免疫復合物沉積和變化的免疫組織化學分析來測量。
在誘導疾病后用KIM-1拮抗劑的治療，例如在第5個月時，但在疾病嚴重之前(即，PU＝2-3)，改善了疾病的發(fā)展或逆轉了疾病的損害。這可通過PU評分，和/或通過測量血清中免疫球蛋白的效價，和/或通過脾增生的免疫組織化學分析，和/或通過腎臟中腎小球結構中的免疫復合物沉積和變化的免疫組織化學分析來測量。
在疾病嚴重之后(PU＝3-4)用KIM-1拮抗劑的治療可阻止疾病發(fā)展或逆轉疾病損害。這可通過PU評分，和/或通過測量血清中免疫球蛋白的效價，和/或通過脾增生的免疫組織化學分析，和/或通過腎臟中腎小球結構中的免疫復合物沉積和變化的免疫組織化學分析來測量。
實施例11混合淋巴細胞反應(MLR)小鼠MLR試驗和KIM-1的拮抗作用。根據(jù)以下方法進行混合淋巴細胞反應(MLR)使用無菌技術從C57B16和Balb/c小鼠中分離脾，粗略地研磨以釋放淋巴細胞，然后用低張液(Gey′s液)處理以裂解紅細胞。剩余細胞通過細胞濾器(BD Falcon，Bedford，MA USA)從殘余組織中分離，然后用無菌的，無熱原的PBS洗滌，以及離心沉淀細胞。再次在PBS溶液中重懸細胞，再次沉淀，然后重懸浮于完全RPMI培養(yǎng)基中。計數(shù)細胞并根據(jù)需要進行稀釋。Balb/c淋巴細胞用作刺激細胞，因此，在使用前將這些細胞在3000RAD照射。
為了建立試驗，將刺激細胞加入到孔中，隨相對于效應細胞數(shù)量的比率而改變(2×105/孔)。培養(yǎng)基補充20μg/ml大鼠抗KIM-1抗體，或KIM-1-Ig融合蛋白以及對照Ig融合蛋白，如指示的。在3個相同的平板中建立培養(yǎng)物，每個實驗條件用每個平板中的3個孔代表。一個平板使用MTS測定(CellTiter 96，Promega，Madison，WIUSA)用于產生細胞增殖數(shù)據(jù)。其它平板用于收集上清液樣品用于細胞因子分析。ELISAs(Pierce Endogen，Rockford，ILUSA或)用于測量培養(yǎng)物上清液中的mIFNγ、mTNF、和mIL-2的水平。來自增殖試驗和ELISAs的標準誤小于10％，圖中已經被省略。注意到培養(yǎng)物中IFNγ與陽性對照值有大的偏差，而IL-2和TNF的水平在陽性對照和處理組之間沒有顯著性差異。因此，IL-2和TNF數(shù)據(jù)已被省略；顯示每個代表性實驗的IFNγ和細胞增殖的數(shù)據(jù)。
用大鼠抗小鼠KIM-1mAbs 3A2.5和1H9.11處理MLR培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ的水平(圖8)。這種效果對IFNγ是特異性的，因為觀察到分泌到上清液中的I1-2或TNF的水平沒有減少。這種效果不是由于在這些培養(yǎng)物中細胞數(shù)量減少，因為細胞增殖試驗顯示在培養(yǎng)物中活細胞的數(shù)量是相似的(圖9)。
用KIM-1-Ig融合蛋白處理MLR培養(yǎng)物顯著減少分泌到上清液中的IFNγ水平(圖10)。這種效果對于IFNγ是特異性的，因為注意到分泌到上清液中的IL-2或TNF水平沒有減少(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這中效果不是由于在這些培養(yǎng)物中細胞數(shù)量減少，因為細胞增殖試驗顯示在用KIM-1-Ig融合蛋白處理的培養(yǎng)物中活細胞數(shù)量與未被處理的對照非常相似(圖11)。
人MLR試驗和KIM-1的拮抗作用。根據(jù)以下方法進行混合淋巴細胞反應(MLR)使用Ficoll梯度離心法從正常人供體獲得的全血中分離出外周血單個核細胞。細胞然后用無菌的，無熱原的PBS洗滌，離心沉淀細胞。再次在PBS溶液中重懸細胞，再次沉淀，然后在完全RPMI培養(yǎng)基中重懸。計數(shù)細胞并根據(jù)需要進行稀釋。JY細胞(ATCC，Bethesda，MD USA)用作刺激細胞，因此，在使用前將這些細胞在10000RAD照射。
為了建立試驗，將刺激細胞加入到孔中，隨相對于效應細胞數(shù)量的比率而改變(2×105/孔)。培養(yǎng)基補充20μg/ml小鼠抗KIM-1抗體，如指示的。在3個相同的平板中建立培養(yǎng)物，每個實驗條件用每個平板中的3個孔代表。一個平板使用MTS測定(CellTiter 96，Promega，Madison，WIUSA)用于產生細胞增殖數(shù)據(jù)。其它平板用于收集上清液樣品用于細胞因子分析。ELISAs(Pierce Endogen，Rockford，IL USA或R+D Systems，Minneapolis，MNUSA)用于測量培養(yǎng)物上清液中的hIFNγ、hTNF、和hIL-2的水平。來自增殖試驗和ELISAs的數(shù)值的標準誤小于10％，圖中已經被省略。觀察到培養(yǎng)物中IFNγ與陽性對照值有大的偏差，而IL-2和TNF的水平在陽性對照和處理組之間沒有顯著性差異。TNF數(shù)據(jù)已被省略。顯示這個代表性實驗的I1-2、IFNγ和細胞增殖的數(shù)據(jù)。
用小鼠抗人KIM-1 mAbs AUF1和AKG7處理MLR培養(yǎng)物顯著減少分泌到上清液中的IFNγ的水平(圖12A)。這種效果對IFNγ是特異性的，因為注意到分泌到上清液中的I1-2或TNF的水平沒有減少(圖12B)。這種效果不是由于在這些培養(yǎng)物中細胞數(shù)量減少，因為細胞增殖試驗顯示培養(yǎng)物中的活細胞的數(shù)量是相似的(圖13)。
實施例12小鼠炎癥性腸病(IBD)模型可溶型KIM-1-Ig融合蛋白在實驗小鼠的IBD模型中能影響癥狀的進程或嚴重程度。在這種模型中，使用DSS慢性刺激大腸(結腸)，導致產生炎癥。已知在小鼠模型和在病人中促炎介質如IFNγ、TNF、和I1-12對于IBD的產生和嚴重程度很重要(Egger等，2000，Digestion 62240-248；Monteleone等，2000，Ann.Med.32552-560；Bouma等，2003，Nat.Rev.Immunol.3521-533)。如上所述，MLR數(shù)據(jù)提示對KIM-1的調節(jié)可影響產生促炎介質如IFNγ。因此，在體內檢驗KIM-1-修飾劑。假設KIM-1-Ig融合蛋白通過干擾一種或多種配體與在細胞上所表達的KIM-1之間的相互作用起作用，所述細胞如活化的淋巴細胞或其它免疫細胞。
在小鼠中使用葡聚糖硫酸鈉(DSS)模型誘導IBD(Copper等，1993，Lab.Invest.69238-249)。提供溶于無菌蒸餾水的4.5％DSS(ICN Biomedicals，Aurora OH USA)溶液作為飲用水源。也對小鼠進行腹瀉程度評分(1軟便，2稀便，3明顯水便，4嚴重失禁)以及使用ColoScreen玻片(Helena Labs，Beaumont TX USA)對便中是否出現(xiàn)血評分(0無，1血)。少量，但可檢測到的血給予中間分0.5。在第0、2、和5天腹膜內給予小鼠200μgs KIM-1-Ig融合蛋白或多克隆hIgG對照(SandImmune，Sandoz，Geneva Switzerland)。在第8天，換掉DSS水，給予正常飲用水。繼續(xù)監(jiān)控體重和臨床評分直到第12天實驗結束。
在IBD誘導期間(第0、2、和5天)小鼠的治療對累積的體重丟失和疾病評分有顯著影響，直到并包括第8天。因此，小鼠被取消DSS水并回到正常飲用水，監(jiān)控它們的恢復。如體重丟失的程度(圖14)和它們的臨床評分(腹瀉和出血；圖15A)所示，在第0、2、和5天接受KIM-1-Ig融合蛋白的小鼠在第11天(進入恢復期的3天)一直較為健康。在KIM-1-Ig治療群體中極少的小鼠在便中出現(xiàn)血(圖15B)。
這些數(shù)據(jù)提示在體內KIM-I的調節(jié)在急性炎癥過程中有保護作用，所述急性炎癥如DSS對腸粘膜損傷后出現(xiàn)的炎癥。這些結果提示KIM-1拮抗劑將在其它急性或慢性炎癥背景中有效，例如，在類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬和胰腺炎中。
其它實施方案在下列權利要內。
權利要求
1.一種抑制在T細胞和參與哺乳動物免疫反應的第二細胞之間信號傳遞的方法，包括(a)鑒定從患免疫疾病或病癥的哺乳動物或準備用于組織移植的哺乳動物中選出的哺乳動物；和(b)向該哺乳動物施用從下組中選出的有效量的KIM-1拮抗劑(i)包括KIM-1Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(ii)抗KIM-1抗體；和(iii)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
2.權利要求1的方法，其中第二細胞是抗原呈遞細胞(APC)。
3.權利要求1的方法，其中T細胞是活化的T細胞。
4.權利要求1的方法，其中T細胞是輔助T細胞。
5.權利要求4的方法，其中輔助細胞T是Th2細胞。
6.權利要求1的方法，其中T細胞是移植的、供體T細胞。
7.權利要求1的方法，其中APC是選自單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞或B細胞。
8.權利要求1的方法，其中APC呈遞自身抗原。
9.權利要求1的方法，其中多肽進一步包括KTM-1粘蛋白區(qū)。
10.權利要求1的方法，其中多肽進一步包括異源部分。
11.權利要求10的方法，其中異源部分選自免疫球蛋白(Ig)部分、血清白蛋白部分、靶向部分、報告分子部分、和便于純化的部分。
12.權利要求11的方法，其中異源部分是Ig部分。
13.權利要求12的方法，其中Ig部分是Fc部分。
14.權利要求1的方法，其中所述多肽結合到聚合物上。
15.權利要求14的方法，其中聚合物選自聚亞烷基二醇、糖聚合物或多肽。
16.權利要求15的方法，其中聚合物是聚亞烷基二醇。
17.權利要求16的方法，其中聚亞烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
18.權利要求17的方法，其中聚合物的平均分子量是從2,000Da到30,000Da。
19.權利要求18的方法，其中聚合物的平均分子量是從5,000Da到20,000Da。
20.權利要求19的方法，其中聚合物的平均分子量是約10,000Da。
21.一種抑制哺乳動物中B細胞活化的方法，包括使B細胞與選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑接觸(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體，或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
22.權利要求21的方法，其中B細胞的活化是通過活化的T細胞介導。
23.權利要求22的方法，其中活化的T細胞是Th2細胞。
24.權利要求22的方法，其中活化的T細胞是移植的、供體T細胞。
25.一種抑制哺乳動物中產生抗一種或者多種抗原的抗體亞型的方法，包括施用選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包含括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
26.權利要求25的方法，其中抗體是IgG類。
27.權利要求26的方法，其中抗體是IgG1亞類。
28.權利要求27的方法，其中在哺乳動物的免疫系統(tǒng)首次識別所述一種或多種抗原前的30分鐘和30天之間向哺乳動物施用有效量的多肽。
29.權利要求28的方法，其中一種或多種抗原是同種抗原。
30.權利要求28的方法，其中一種或多種抗原是自身抗原。
31.權利要求28的方法，其中哺乳動物的免疫系統(tǒng)首先識別一種或多種抗原作為表位在自身免疫疾病病程中傳播過程的一部分。
32.一種在自身免疫性疾病中抑制表位傳播的方法，包括施用選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞漿區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
33.一種治療Th2細胞介導的疾病的方法，包括施用選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
34.權利要求33的方法，其中Th2細胞介導的疾病選自重癥肌無力、自體免疫溶血性貧血、查加斯病、格雷夫斯病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、韋格納肉芽腫、結節(jié)性多動脈炎、急驟進展性新月體性腎小球腎炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)或系統(tǒng)性狼瘡性腎炎(SLE)。
35.一種抑制GVHD的方法，包括施用選自如下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
36.一種多肽，包括KIM-1Ig區(qū)和Fc部分，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)。
37.一種在哺乳動物中抑制淋巴細胞分泌IFN-γ的方法，包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
38.一種治療哺乳動物炎性疾病或病癥的方法，包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
39.權利要求38的方法，其中炎性疾病或病癥是炎癥性腸病。
40.權利要求38的方法，其中炎性疾病或病癥是急性或慢性炎癥。
41.權利要求4的方法，其中輔助T細胞是Thl細胞。
全文摘要
公開了使用KIM－1拮抗劑抑制T細胞和第二細胞，例如抗原呈遞細胞之間信號傳遞。這種抑制有益于治療疾病，包括各種自身免疫性疾病和移植物抗宿主病。也公開了使用KIM－1拮抗劑抑制哺乳動物中淋巴細胞或其它免疫細胞分泌IFN－γ。對IFN－γ的抑制有益于治療炎性疾病或病癥，例如，炎癥性腸病。
文檔編號A61K47/48GK1835769SQ200380110061
公開日2006年9月20日 申請日期2003年12月29日 優(yōu)先權日2002年12月30日
發(fā)明者保羅·D·倫納特 申請人:比奧根艾迪克Ma公司
技術領域：
本發(fā)明領域為藥學、免疫學、分子生物學和蛋白質化學。
背景技術：
KIM-1(腎損傷分子-1)是I型細胞膜糖蛋白(Ichimura等，1998，J.Biol.Chem.2734135-4142)。KIM-1的胞外部分(胞外結構域)包含一個6個-半胱氨酸免疫球蛋白樣區(qū)和以粘蛋白樣O-糖基化蛋白為特征的富含T/SP的區(qū)域。粘蛋白區(qū)就像柄一樣從細胞表面向外延伸Ig樣區(qū)(Jentoft，1990，TrendsBiochem.Sci.15291-294)。KIM-1已被定為甲型肝炎病毒的受體(Kaplan等，1996，EMBO J.154282-4296；WO 96/04376；美國專利No.5,622,861)。已發(fā)現(xiàn)了兩種KIM-1剪接變體，一種主要存在于肝臟(Feigelstock，1998，J.Virol.726621-6628)，另一種主要存在于腎臟(Ichimura等，supra)。
KIM-1是稱作TIM(T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域)家族的基因家族中的一員。除了KIM-1，人至少有另外兩種TIM基因家族的成員。一個成員被克隆并被最初稱作“200基因”(WO200073498)，但隨后稱作TIM-3。另一個成員被克隆并被稱作“基因58”(WO99/38881)。
KIM-1作為腎臟損傷的臨床診斷標志物吸引了人們的興趣(Bailly等，2002，J.Biol.Chem.27739739-39748；Han等，2002，Kidney Intl.62237-244)。已報道KIM-1的小鼠同系物(TIM-1)存在于被認為與氣道高反應性的發(fā)生相關的遺傳基因座內(McIntire等，2001，Nature Immunology 21109)。已報道一種叫做TIM-2的小鼠蛋白在體內抗原特異性T細胞的產生中起作用(Kumanogoh等，2002，Nature 419629-633)。稱作TIM-3的小鼠蛋白與小鼠免疫反應的調控有關(Monney等，2002.Nature 415536-541)。
發(fā)明概述已經發(fā)現(xiàn)用KIM-1拮抗劑治療哺乳動物改變T細胞與其它免疫系統(tǒng)細胞之間的相互作用，例如，樹突細胞、單核巨噬細胞、和B細胞，從而能強烈抑制IgG對抗原的反應。另外，已發(fā)現(xiàn)這種治療幾乎消除了在對隨后用抗原的攻擊反應中由記憶B細胞產生IgG1。另外，已發(fā)現(xiàn)阻斷KIM-1與其受體的結合減少在混合淋巴細胞應答(MLR)試驗中由參與抗原應答的免疫細胞分泌IFN-γ?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供在自身免疫性疾病和哺乳動物免疫系統(tǒng)的其它病癥中治療性調節(jié)免疫功能的方法。
本發(fā)明提供抑制哺乳動物中T細胞和第二細胞，例如，抗原遞呈細胞(APC)之間信號傳遞的方法。該方法包括鑒定哺乳動物，例如，患有免疫疾病或病癥的動物，或者準備接受組織移植的動物；以及給予哺乳動物有效量的下列各種KIM-1拮抗劑中的一種(a)包括KIM-1 Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；和(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
T細胞可以是活化的T細胞，例如，輔助T細胞。其可以是Th2細胞或Th1細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中T細胞是被移植的，供體T細胞。APC可以是，但不限于，單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、或者B細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中，APC呈遞自身抗原。
優(yōu)選地，KIM-1拮抗劑是可溶性的多肽，其除了KIM-1 Ig區(qū)外可包括KIM-1粘蛋白區(qū)。在一些實施方案中多肽包括異源部分(heterologous moity)，例如，免疫球蛋白(Ig)部分，血清白蛋白部分，靶向部分，報告分子部分，多聚化部分，以及便于純化的部分。優(yōu)選的異源部分是Ig部分如Fc部分。
在一些實施方案中，KIM-1拮抗劑是與如聚亞烷基二醇、糖聚合物、或多肽的聚合物偶聯(lián)的多肽。優(yōu)選的聚合物是聚亞烷基二醇，特別優(yōu)選聚乙二醇(PEG)。聚合物的平均分子量優(yōu)選從2,000Da到30,000Da，優(yōu)選從5,000Da到20,000Da.，例如，約10,000Da。
本發(fā)明提供抑制哺乳動物中B細胞活化的方法，例如，通過活化的T細胞如Th2細胞。該方法包括使B細胞或其它APC與有效量的KIM-1拮抗劑接觸，或者T細胞，如果拮抗劑是抗KIM-1抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，活化的T細胞是被移植的，供體T細胞。
本發(fā)明提供在哺乳動物中抑制產生抗體如IgG的亞型的方法，所述亞型例如，對一種或多種抗原具有反應性的IgG1。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。在一些實施方案中，在哺乳動物的免疫系統(tǒng)首次識別一種或多種抗原前30分鐘和30天之間施用有效量的KIM-1拮抗劑?？乖瓰橥N抗原或自身抗原，根據(jù)被治療的疾病、障礙或情況不同。
本發(fā)明提供在自身免疫性疾病中抑制疾病復發(fā)的方法。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供在自身免疫性疾病中抑制表位擴散的方法。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供治療Th2細胞介導的疾病的方法，例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、查加斯病(Chagas’disease)、格雷夫斯病(Graves’disease)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、韋格納肉芽腫(Wegener′sgranulomatosis)、結節(jié)性多動脈炎(polyarteritis nodosa)、急驟進展性新月體性腎小球腎炎(rapidly progressive crescentic glomerulonephritis)、或移植物抗宿主病(GVHD)、哮喘、特應性皮炎(atopic dermatitis)、特應性疾病(atopydisorders)如氣道高反應性疾病(airway hyperresponsive disease)和氣道應激綜合征(airway distress syndromes)。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供抑制GVHD的方法。該方法包括在移植前30分鐘和30天之間施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供抑制哺乳動物中由淋巴細胞分泌IFN-γ的方法。該方法包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供抑制Th1 T細胞效應子功能的活化，因此抑制在炎性情況中細胞免疫應答。這種炎性情況的實例是炎癥性腸病(inflammatory boweldisease)。該方法包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
本發(fā)明提供治療哺乳動物炎性疾病或病癥的方法，例如，炎癥性腸病如克隆病(Crohn′s disease)、潰瘍性結腸炎、以及回腸炎。該方法包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
如這里使用的，“抗KIM-1抗體”指抗體，例如IgG分子，其特異性結合全長KIM-1多肽的細胞外部分。
如這里使用的，“全長的人KIM-1多肽”意思是全部SEQ ID NO1或全部SEQ ID NO2的多肽。這兩種多肽代表人KIM-1基因的剪接變體。
如這里使用的，“異源部分(heterologous moiety)”意思是不以全長KIM-1多肽出現(xiàn)的氨基酸序列。
如這里使用的，“KIM-1拮抗劑”意思是(a)包括KIM-1 Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或者(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段，每一個均阻斷、抑制、或干擾天然存在的KIM-1的生物學活性。
如這里使用的，“KIM-1融合蛋白”意思是包括融合到異源部分上的KIM-1部分的融合蛋白。
如這里使用的，“KIM-1片段”意思是全長KIM-1多肽的生物活性片段。
如這里使用的，“KIM-1多肽”意思是單獨的KIM-1部分或包括KIM-1部分的融合蛋白。
如這里使用的，“KIM-1 Ig區(qū)(domain)”意思是SEQ ID NO1中的一部分，其氨基端是29-36位氨基酸，其羧基端是105-107位氨基酸。
如這里使用的，“KIM-1粘蛋白區(qū)”意思是SEQ ID NO1中的一部分，其氨基端是126-130位氨基酸，其羧基端是255-274位氨基酸。
如這里使用的，“KIM-1跨膜區(qū)”意思是SEQ ID NO1的290-311位氨基酸部分。
如這里使用的，“KIM-1胞質區(qū)”意思是SEQ ID NO1的312-334位氨基酸，或SEQ ID NO2的312-359位氨基酸。
除非另外定義，這里所使用的所有專業(yè)和科學術語具有與發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。為避免沖突，本說明書，包括定義，將決定。所有這里提及的出版物、專利和其它參考資料并入作為參考。
盡管可在本發(fā)明的實踐或檢驗中使用與這里所描述的那些相似或等同的方法和材料，但是下面描述了優(yōu)選的方法和材料。材料、方法和實例只是用來說明的，并不打算用來限制。本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將從詳細的描述和從權利要求中顯而易見。
附圖的簡要描述
圖1(現(xiàn)有技術)是人KIM-1多肽的兩個天然存在的剪接變體的圖示。這兩個氨基酸序列從1到323殘基完全相同。信號序列(1-20位殘基)用下劃線標出。跨膜區(qū)(290-311位殘基)用雙下劃線標出。
圖2(現(xiàn)有技術)是359個氨基酸的人KIM-1剪接變體的圖示。信號序列和跨膜區(qū)用黑色陰影表示。Ig區(qū)中的半胱氨酸殘基用“C”表示。倒置的三角形表示N-聚糖(glycan)附著點。TSP富集區(qū)，其對應于粘蛋白區(qū)，用加寬的陰影表示。
圖3是總結在接受綿羊紅細胞初次攻擊的Bal b/c小鼠第14天測得的免疫球蛋白效價的直方圖(實驗1)。
圖4是總結在接受綿羊紅細胞初次攻擊的Bal b/c小鼠第14天測得的免疫球蛋白效價的直方圖(實驗2)。
圖5是總結在接受綿羊紅細胞初次攻擊的C57B1/6小鼠第7天測得的免疫球蛋白效價的直方圖。
圖6是總結在被允許從初次攻擊(圖3)完全恢復后，接著被再次攻擊的實驗1的小鼠中測得的免疫球蛋白效價的直方圖。在再次攻擊后第3天測量免疫球蛋白效價。
圖7是總結在被允許從初次攻擊(圖4)完全恢復后，接著被再次攻擊的實驗2的小鼠中測得的免疫球蛋白效價的直方圖。在再次攻擊后第3天測量免疫球蛋白效價。
圖8是總結在小鼠MLR培養(yǎng)物中IFNγ產量數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后收獲上清液并用于測量IFNγ水平。在孵育期間用mAbs 3A2和1H9處理培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ的水平。
圖9是總結小鼠MLR培養(yǎng)物中細胞增殖數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后向培養(yǎng)物中加入活體染料(vital dye)，允許顯色1-4個小時。在3天培養(yǎng)期間用抗KIM-1抗體處理培養(yǎng)物不影響細胞增殖。
圖10是總結小鼠MLR培養(yǎng)物中IFNγ產量數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后收獲上清液并用于測量IFNγ水平。在孵育期間用KIM-1-Ig融合蛋白處理培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ的水平。
圖11是總結小鼠MLR培養(yǎng)物中細胞增殖數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的Balb/c脾細胞用于刺激C57B16小鼠的脾細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后向培養(yǎng)物中加入活體染料，允許顯色1-4個小時。在3天培養(yǎng)期間用KIM-1-Ig融合蛋白處理培養(yǎng)物不影響細胞增殖。
圖12A和12B是總結人MLR培養(yǎng)物中IFNγ產量數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的JY細胞用于刺激正常人供體的外周血單個核細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后收獲上清液并用于測量IFNγ和IL-2水平。在孵育期間用mAbs AUF1和AKG7處理培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ水平(圖12A)，而IL-2的水平保持不變(圖12B)。
圖13是總結人MLR培養(yǎng)物中細胞增殖數(shù)據(jù)的直方圖。輻射過的JY細胞用于刺激正常人供體的外周血單個核細胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后向培養(yǎng)基中加入活體染料，允許顯色1-4個小時。在6天培養(yǎng)期間用抗人KIM-1單克隆抗體處理培養(yǎng)物不顯著影響細胞增殖。
圖14是總結在小鼠中誘發(fā)炎癥性腸病后體重丟失數(shù)據(jù)的直方圖。將雌性Balb/c小鼠暴露于葡聚糖硫酸鈉(DSS)。8天后，將小鼠改回到凈水(plainwater)飼養(yǎng)并允許從DSS暴露中恢復。3天后，稱小鼠的重量。將重量換算成實驗開始時重量的百分比。用KIM-1-Ig融合蛋白治療賦予小鼠顯著的保護，如體重記分增加所示。每組有10只小鼠。均數(shù)的等值檢驗得到＞p＝0.0001的統(tǒng)計學意義。
圖15A和15B是總結在小鼠中誘發(fā)炎癥性腸病后臨床記分數(shù)據(jù)的直方圖。3天恢復期后，評價小鼠腹瀉和便中出現(xiàn)血的情況。用KIM-1-Ig融合蛋白治療的小鼠的記分顯著高于未治療或對照-Ig治療組(圖15A)。這部分由于在糞粒中出現(xiàn)血的小鼠顯著減少(圖15B)。均數(shù)等值檢驗(means equivilencetests)得到未經治療的對照組的臨床記分與KIM-1-Ig治療組相比的差異的顯著值(p＝0.05)。
發(fā)明詳述天然人KIM-1基因編碼含有334個氨基酸或359個氨基酸(SEQ ID NO1)的多肽(圖1)，根據(jù)剪接變異不同，其至少是部分組織依賴性的。兩個序列都包括信號序列、Ig區(qū)、粘蛋白區(qū)、跨膜區(qū)、以及胞質區(qū)。
使用可溶的，二聚化的，KIM-1胞外結構域-Fc融合蛋白(每個單體含有小鼠KIM-1胞外結構域和人Fc部分)和公認的動物模型(小鼠SRBC應答)，本發(fā)明人獲得了哺乳動物免疫反應的意義深遠的改變。不打算被理論束縛，本發(fā)明人將所觀察到的結果解釋為表明該融合蛋白作為KIM-1拮抗劑起作用，并且這種拮抗作用干擾KIM-1介導的T細胞和APCs之間的信號傳遞相互作用。這種干擾的下游效應包括哺乳動物免疫反應的有用調節(jié)。這種調節(jié)可用于治療自身免疫性疾病以及其它疾病和障礙，其中免疫系統(tǒng)通過T細胞毒性或者通過免疫球蛋白應答攻擊不恰當?shù)陌?。免疫系統(tǒng)調節(jié)將有利于的疾病或病癥的實例包括，但不限于，關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(也稱為SLE或狼瘡)，以及移植物抗宿主疾病(GVHD)。
在本發(fā)明的方法中，可溶的KIM-1拮抗劑多肽或KIM-1封閉抗體(或結合抗原的抗體片段)可以作為預制成的多肽直接施用?？蛇x擇地，其可通過核酸載體(編碼和表達該多肽)間接施用。無論哪種方法，結果都是拮抗KIM-1介導的對T細胞的效應，包括T細胞活化和刺激T細胞增殖。這種位于T細胞上的對KIM-1的拮抗作用可直接通過阻斷T細胞自身的破壞作用達到期望的治療效果。另外，這種拮抗作用可間接地達到期望的治療效果，通過阻斷活化的T細胞介導的B細胞的活化作用，因而減少有害抗體的產生。
在不同的疾病中，包括自身免疫性疾病和某種類型的病原感染，損害由自身抗體應答引起，即，產生識別自身抗原的抗體。本發(fā)明提供通過干擾T細胞的活化和分化來減少這種損害的方法和分子。這反過來干擾活化的T細胞介導的B細胞活化，其干擾由B細胞產生和分泌的特異性免疫球蛋白，例如，IgG1。因此，以自身抗體應答為特征的任何疾病或病癥均可通過使用本發(fā)明的方法和分子治療。
當治療某種自身免疫性疾病時，暴露于抗原，以及免疫系統(tǒng)應答都是短暫的。這導致產生緩解期(remissions)，在緩解期施用有效量的KIM-1拮抗劑將抑制隨后對一種或多種抗原的免疫反應的再活化。本發(fā)明可以這種方法阻止疾病復發(fā)。當治療某種自身免疫性疾病時，哺乳動物的免疫系統(tǒng)首先識別一或多種抗原作為自身免疫疾病病程中表位傳播過程的一部分。
一旦移植，在移植物抗宿主病(GVHD)中許多損害直接由在宿主內被活化(對宿主抗原的應答)的供體T細胞的作用所致，例如在骨髓移植中。由于其能干擾T細胞活化，本發(fā)明有益于抑制GVHD。除了活化的供體T細胞的直接作用的損害，在GVHD中也有由抗體介導的成分。因為這種抗體介導的成分依賴供體T細胞的活化，其活化產生自身抗體的B細胞，因此本發(fā)明減少自身抗體介導的損害，以及在GVHD中細胞免疫介導的損害。
抗體介導的自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE；lupus)是一種TH-2介導的自身免疫障礙，以高水平的針對細胞內抗原如雙鏈DNA，單鏈DNA，和組蛋白的自身抗體為特征?？紤]到這些特點，系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為可根據(jù)本發(fā)明治療的自身免疫性疾病的例子。
適合依據(jù)本發(fā)明治療的其它器官特異性或系統(tǒng)性自身免疫性疾病的實例包括重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、查加斯病、格雷夫斯病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、韋格納肉芽腫，結節(jié)性多動脈炎和急驟進展性新月體性腎小球腎炎。見，例如，Benjamini等1996，Immunology，A Short Course，Third Ed.(Wiley-Liss，New York)。另外，類風濕性關節(jié)炎(RA)，曾被認為由細胞毒性T細胞的細胞毒活性介導，現(xiàn)已知具有B細胞和/或抗體成分(Leandro等，2002，Ann.Rheum.Dis.，61863-866；De Vita等，ArthritisRheum.462029-2033；Tsuji等，2002，J.Exp.Med.1961277-1290)，因此適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
對一些致病性感染劑的正常免疫反應引起有害的自身抗體應答。一個例子是查加斯病，一種在慢性感染了克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)的人和試驗動物中形成的炎性心肌病?？棺陨砜贵w存在于查加斯病病人的血清中(Bach-Elias等，1998，Parasitol.Res.84796-799；Tibbetts，等，1994，J.Immunol.1521493-1499)，因此這種疾病適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
由感染產生的自身抗體破壞細胞的另一個例子是特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，其中自身抗體導致血小板破壞(通過補體或具有Fc或C3b受體的吞噬細胞)并可導致出血。ITP適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
移植物抗宿主病(GVHD)GVHD作為可使用本發(fā)明的方法進行治療的T細胞介導的疾病的例子。當供體T細胞把宿主抗原識別為外源抗原時，引起GVHD。GVHD，常常是骨髓移植(BMT)病人的致命性結果，可以是急性的或慢性的。GVHD的急性和慢性型分別作為產生抗原特異性Th1和Th2應答的例子。急性GVHD在骨髓移植后頭兩個月內發(fā)生，特點是供體細胞毒性T細胞介導的對皮膚、腸、肝臟，和其它器官的損害。慢性GVHD似乎較晚(移植后100天)，特點是免疫球蛋白(Ig)產生過多，包括自身抗體，和由Ig沉積所致的對皮膚、腎臟，和其它器官的損害。將近90％的急性GVHD繼續(xù)發(fā)展成慢性GVHD。慢性GVHD似乎是Th2 T細胞介導的疾病(De Wit等，1993，J.Immunol.150361-366)。急性GVHD是Th1介導的疾病(Krenger等，1996，Immunol.Res.1550-73；Williamson等，1996，J.Immunol.157689-699)。T細胞細胞毒是急性GVHD的特點。可在好多方面看到供體抗宿主細胞毒性的后果。首先，宿主淋巴細胞被迅速破壞，結果經歷急性GVHD的小鼠受到極度地免疫抑制。其次，供體淋巴細胞移入并在宿主脾臟中擴增，它們的細胞毒活性可在體外通過利用表達可被供體細胞識別(作為外源抗原)的宿主抗原的細胞系直接測量。第三，由于另外的組織和細胞群被破壞，因此該病成為致命的。
慢性GVHD由抗體介導的宿主組織和細胞的破壞所致，被稱為“SLE樣”GVHD。表現(xiàn)包括自身抗體形成、各種器官中Ig沉積(腎臟、肝臟)、皮疹、淋巴增生、Sjgren樣損害、硬皮病樣損害、多動脈炎，和其它病變。這種疾病部分是由自身抗體形成介導?？紤]到前面的原因，慢性GVHD適于根據(jù)本發(fā)明的治療。
其它Th2相關疾病特應性疾病的特點是免疫系統(tǒng)細胞，包括活化的T細胞和APC，表達細胞因子、趨化因子和其它分子，這些分子以Th2應答為特征，如IL-4、IL-5和IL-13細胞因子。因而這種特應性疾病可用拮抗產生Th2應答的方法來治療，如本發(fā)明的KIM-1拮抗劑。特應性疾病包括哮喘、氣道高反應性和應激性綜合癥，以及如特應性皮炎的病變。本發(fā)明提供抑制特應性疾病的方法。該方法包括施用有效量的KIM-1拮抗劑。
由活化的淋巴細胞、APC和促炎細胞因子介導的炎性疾病和病癥在小鼠和人模型系統(tǒng)中使用混合淋巴細胞反應試驗(MLR)，本發(fā)明人已經證明阻斷KIM-1結合其受體，例如，使用抗KIM-1單克隆抗體或KIM-1-Ig融合蛋白，減少由應答細胞分泌的IFNγ。因此，KIM-1拮抗劑可用于治療由IFNγ介導的任何疾病或病癥。
IFNγ是免疫反應中關鍵的細胞因子。它對炎癥和免疫進程的發(fā)展和程度有多向性(pleotropic)影響(Boehm等1997，Ann Rev Immunol 15749-795)。IFNγ產量的缺乏降低抗病毒和細菌的應答并且減弱炎癥反應。使用KIM-1拮抗劑可有助于降低IFBγ產量過度或不適當?shù)募膊≈械腎FNγ產量。這種疾病或病癥的例子包括自身免疫性疾病、結腸炎和慢性炎癥。
IFNγ是T細胞活化和B細胞應答的關鍵成分。它影響T細胞效應細胞發(fā)育(例如，通過與IL-4交叉調控)和B細胞的活化(例如，通過對MHC介導的抗原遞呈作用和B7分子表達的調控)。IFNγ是Th1 T細胞介導的免疫反應的關鍵成分。IFNγ顯著影響其它免疫系統(tǒng)成分，如巨噬細胞和中性粒細胞。它刺激它們活化并釋放有毒的效應分子。
IFNγ對組織固有細胞類型(resident cell types)有強烈的影響。內皮由IFNγ活化。當用IFNγ刺激時，患病組織中的固有細胞，例如，類風濕性關節(jié)炎中的滑膜細胞，分泌TNF和其它細胞因子，MCP-1和其它趨化因子，以及有毒的效應分子如氧化氮。所有這些由IFNγ介導的后面的功能在炎癥期間影響細胞運輸?shù)浇M織中。
如在實施例5(下面)中所示，阻斷KIM-1結合其受體將在SRBC模型系統(tǒng)中減少或消除IgG1生成。在MLR試驗中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)阻斷KIM-1結合其受體將減少由淋巴細胞產生的IFNγ。不打算被理論束縛，注意到IgG1產量的降低和IFNγ產量的降低可能代表KIM-1阻斷的兩種單獨的效應，可能無直接聯(lián)系。因此，當根據(jù)本發(fā)明使用KIM-1拮抗劑用于調節(jié)免疫功能時，KIM-1拮抗劑可通過兩種單獨的作用機理提供有益的效果。
融合蛋白和偶聯(lián)多肽本發(fā)明的一些實施方案包括KIM-1拮抗劑多肽，其中KIM-1部分融合到異源部分上形成KIM-1融合蛋白。KIM-1融合蛋白，與單獨的KIM-1部分相反，可用于完成各種目的。這些目的包括，例如，增加血清半衰期，提高生物利用率，在體內靶向特異性器官或組織類型，提高重組體表達效率，提高宿主細胞分泌，以及易于純化。根據(jù)將要獲得的目的，異源部分可以是惰性的或者是有生物學活性。同樣地，其可選擇與KIM-1部分是穩(wěn)定地融合或是可裂解的，在體外或在體內裂解。完成不同的目的的異源部分是本領域中公知的。
作為表達KIM-1融合蛋白的可選擇的方法，所選擇的異源部分可預先形成并用化學方法偶聯(lián)到KIM-1部分上。在絕大多數(shù)情況中，所選擇的異源部分，無論融合或偶聯(lián)到KIM-1部分上將起相似的功能。因此，在下面異源氨基酸序列的討論中，除非另有說明，應當理解異源序列可以融合蛋白的形式或作為化學偶聯(lián)物被連接到KIM-1部分上。
藥學上有活性的多肽如KIM-1多肽常常顯示在體內被迅速清除，需要很大劑量以便在體內獲得治療性有效濃度。另外，小于約20kDa的多肽可能經過腎小球濾過，其有時導致腎中毒?？墒褂孟鄬π〉亩嚯娜鏚IM-1片段的融合或結合以減少或避免這種腎中毒的危險。已知各種異源氨基酸序列，即，多肽部分或“載體”，用于提高治療性多肽的體內穩(wěn)定性，即，血清半衰期。
由于其半衰期長，在體內分布廣，沒有酶或免疫功能，因此基本上全長的人血清白蛋白(HSA)，或HSA片段，是優(yōu)選的異源部分。通過應用如那些在Yeh等，1992，Proc.Natl.Acad Sci.USA，891904-1908和Syed等，1997，Blood 893243-3252中所教導的方法和材料，HSA可被用于形成顯示藥學活性的KIM-1融合蛋白或偶聯(lián)物，其由于KIM-1部分顯示體內穩(wěn)定性顯著增加，例如，高出10倍到100倍。優(yōu)選地，將HSA的N-末端融合到KIM-1部分的C-末端。由于HSA是一種天然分泌的蛋白質，因此當融合蛋白在真核表達系統(tǒng)，例如，在哺乳動物中生產時，可利用HAS信號序列獲得KIM-1融合蛋白分泌到細胞培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的一些實施方案使用KIM-1多肽，其中KIM-1部分融合到Fc區(qū)上，即，Ig重鏈恒定區(qū)的C-末端。KIM-1-Fc融合潛在的優(yōu)點包括可溶性、體內穩(wěn)定性，和多價位，例如，二聚。使用的Fc區(qū)可以是IgA、IgD、或IgG的Fc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3)。可選擇地，其可以是IgE或IgM Fc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3-CH4)。優(yōu)選IgG的Fc區(qū)，例如，IgG1 Fc區(qū)或IgG4 Fc區(qū)。用于構建和表達編碼Fc融合的DNA的材料和方法在本領域中是已知的，可以應用，不用過多試驗就可獲得KIM-1融合體。
優(yōu)選地，構建有方向的KIM-1-Fc融合，其中KIM-1部分形成融合蛋白的氨基末端部分。構建和表達具有這種方向的Fc融合的例子，見，例如，Wallner等，美國專利No.5,547,853(pSAB152)。可選擇地，可構建具有相反方向的融合，即，其中KIM-1部分形成融合的羧基末端部分。這種方向的例子和討論，見，例如，Lo等，美國專利No.5,541,087。
本發(fā)明的一些實施方案使用根據(jù)Lo等，美國專利No.5,541,087，通過構建KIM-1免疫融合(immunofusin)DNA獲得的KIM-1融合蛋白。免疫融合DNA包括編碼分泌盒的多核苷酸。分泌盒包括編碼(以5’到3’方向)信號序列的序列，免疫球蛋白Fc區(qū)和融合到分泌盒3’端的KIM-1部分。DNA可在宿主細胞中以高水平表達，宿主細胞高效地產生和分泌融合蛋白。不需要溶解宿主細胞就可以從培養(yǎng)基中收集所分泌的免疫融合物。
在一些實施方案中，該DNA序列在KIM-1部分和異源部分之間編碼蛋白酶剪切位點。剪切位點提供用于所編碼的融合蛋白的蛋白酶性剪切，因此將Fc區(qū)從靶蛋白中分離。有用的蛋白酶剪切位點包括蛋白酶如胰蛋白酶、纖溶酶或腸激酶K識別的氨基酸序列。
KIM-1多肽構建體可被整合到可復制的表達載體中。有用的載體包括線性核酸、質粒、噬菌粒、粘粒等。一種示范性的表達載體是pSAB152(Wallner等，美國專利No.5,547,853)。另一種示范性的表達載體是pdC，其中免疫融合DNA的轉錄被置于在人巨細胞病毒的增強子和啟動子的控制下(Lo等，1991，Biochim.Biophys.Acta 1088712；和Lo等，1998，Protein Engineering11495-500)?？捎镁幋aKIM-1多肽的DNA轉化或轉染適當?shù)乃拗骷毎⒂糜贙IM-1多肽的表達和分泌。優(yōu)選的宿主細胞包括永生的雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Hela細胞，以及COS細胞。
完全完整的，野生型Fc區(qū)顯示效應子功能在根據(jù)本發(fā)明的Fc融合蛋白中正常地是不必要的和不希望的。因此，在KIM-1-Fc融合蛋白的構建中優(yōu)選從Fc區(qū)刪除某些結合位點。例如，由于不必與輕鏈的共表達，因此重鏈的蛋白結合位點，Bip(Hendershot等，1987，Immunol.Today 8111-114)，從IgE的Fc區(qū)中刪除，這樣這個位點不干擾融合蛋白的有效分泌。同樣地，在Fc區(qū)中存在的負責結合免疫球蛋白輕鏈的半胱氨酸殘基應當被刪除或用另外的氨基酸取代，這樣當其以免疫融合物形式產生時，這些半胱氨酸殘基不干擾Fc區(qū)的正確折疊。跨膜區(qū)序列，如那些在IgM中存在的序列，應當被刪除。
優(yōu)選IgG1 Fc區(qū)。可選擇地，免疫球蛋白γ的其它亞類(γ-2，γ-3和γ-4)的Fc區(qū)可在分泌盒中使用。優(yōu)先在分泌盒中使用的免疫球蛋白γ-1的IgG1 Fc區(qū)包括絞鏈區(qū)(至少部分)、CH2區(qū)、和CH3區(qū)。在一些實施方案中，免疫球蛋白γ-1的Fc區(qū)是刪除CH2的Fc，其包括部分絞鏈區(qū)和CH3區(qū)，但不包括CH2區(qū)。Gillies等，1990，Hum.Antibod.Hybridomas，147描述了刪除CH2的Fc。在一些實施方案中，使用IgA、IgD、IgE、或IgM的Fc區(qū)。
KIM-1-Fc融合蛋白可構建成幾種不同的構型。在一種構型中KIM-1部分的C-末端直接融合到Fc部分的N-末端。在輕微不同的構型中，短接頭，例如，2-10個氨基酸，在KIM-1部分的C-末和Fc部分的N-末端之間結合到融合物中。這種接頭提供構象的彈性，其在一些情況中可提高生物學活性。如果在Fc部分中保留足夠長的鉸鏈區(qū)部分，那么KIM-1-Fc融合將二聚化，因此形成二價分子。單體Fc融合物的同源群將產生單特異性的、二價二聚體。兩種具有不同特異性的單體Fc融合物的混合將產生雙特異性的、二價二聚體。
可使用現(xiàn)有技術中已知的方法構建KIM-1偶聯(lián)物。許多含有相應的氨基反應基和巰基反應基的交聯(lián)劑中的任何一種均可用于將KIM-1連接到血清白蛋白上。合適接頭的實例包括插入巰基反應性-馬來酰亞胺的胺反應性交聯(lián)劑。這些包括，例如，SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS、或GMBS。其它合適的接頭插入巰基反應性-鹵代乙酸基團。這些包括，例如，SBAP、SIA、SIAB，提供保護性或非保護性硫醇用于與巰基反應產生可還原鍵的是SPDP、SMPT、SATA、或SATP，所有這些都可以買到(例如，Pierce Chemicals)。本領域的技術人員可類似地設想用另外的策略將KIM-1N-末端與血清白蛋白連接。
本領域中的技術人員可生產對血清白蛋白的偶聯(lián)物，其不靶向KIM-1多肽的N-末端或血清白蛋白上的巰基部分。例如，可使用基因工程技術生產KIM-1白蛋白融合物，其中KIM-1部分在其氨基末端(N-ter)、羧基末端(C-ter)，或在兩端與血清白蛋白基因融合。
KIM-1多肽的其它衍生物包括修飾的KIM-1或其片段與其它蛋白或多肽的共價或聚合偶聯(lián)物，如通過在重組體培養(yǎng)物中合成作為另外的N-末端或C末端。例如，結合肽在蛋白的N-末端區(qū)可以是信號(或前導)多肽序列，其在翻譯同時或翻譯后(co-translationally or post-translationally)指導蛋白從其合成位點轉移到其細胞膜或細胞壁內外的功能位點(例如，酵母α因子的前導區(qū))。KIM-1多肽可被融合到異源肽上以易于純化或KIM-1部分的鑒定(例如，組氨酸/KIM-1融合物)。KIM-1部分也可被連接到Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO)上(Hopp等，1988，Biotechnology 61204)。這個序列具有高抗原性并提供被特異性單克隆抗體可逆性結合的表位。所以，它易于所表達的重組體蛋白的分析和純化。這個序列被牛粘膜腸激酶在緊接Asp-Lys配對后面的殘基處特異性切割。
使用采用基因融合構建體的表達系統(tǒng)以提高蛋白在細菌中的產量。使用正常情況下以非常高的水平表達的細菌蛋白作為融合蛋白的氨基末端融合配偶體，有助于確保信息有效的轉錄和翻譯，以及在一些情況中確保融合蛋白的分泌和溶解(Smith等，1988 Gene 6731；Hopp等，supra；La Vallie等，1993，Biotechnology 11187)。
偶聯(lián)的聚合物(不同于多肽)本發(fā)明的一些實施方案包括KIM-1多肽，其中一種或多種聚合物結合(共價連接)到KIM-1多肽上。適與這種偶聯(lián)的聚合物的實例包括如多肽(上面所討論的)、糖聚合物和聚亞烷基二醇鏈。典型地，但不是必須地，將聚合物結合到KIM-1多肽上用于提高以下一種或多種特性可溶性，穩(wěn)定性，或生物利用率。
用于與KIM-1多肽結合的優(yōu)選的聚合物種類是聚亞烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是優(yōu)選的聚亞烷基二醇。與單獨的KIM-1多肽相比，PEG部分，例如，1-6PEG聚合物，可與每種KIM-1多肽共價結合以提高血清半衰期。PEG部分是無抗原性并且基本上是生物學惰性。在本發(fā)明的實踐中使用的PEG部分可以是分枝的或不分枝的。
附著到KIM-1多肽上的PEG部分的數(shù)量和單個PEG鏈的分子量可變化?？偟膩碚f，聚合物的分子量越高，附著到多肽上的聚合物鏈就越少。優(yōu)選地，PEG的平均分子量從2kDa到100kDa。更優(yōu)選地，平均分子量從5kDa到20kDa，最優(yōu)選8-12kDa。
聚合物，例如，PEG，可通過多肽上的任何合適的，暴露的活性基團連接到KIM-1多肽上。暴露的活性基團可以是，例如，N末端氨基或內部賴氨酸殘基的ε氨基，或兩者?？墒褂锰烊淮嬖诘馁嚢彼釟埢糜谶@種目的，或者可將賴氨酸殘基人工改造到KIM-1氨基酸序列內。活化的聚合物可在KIM-1多肽上的任何游離氨基處反應和共價連接。游離的羧基、適當活化的羰基、羥基、胍基、咪唑、被氧化的碳水化合物部分和KIM-1的巰基(如果可利用)也可以用作聚合物附著的反應基團。
優(yōu)選地，在結合反應中，根據(jù)多肽濃度不同，每摩爾多肽使用約1.0到約10摩爾活化的聚合物。通常，所選的比值代表使反應最大而損害KIM-1部分的期望的藥理學活性的副反應(常常是非特異的)最小之間的平衡。優(yōu)選地，保留KIM-1多肽生物學活性的至少50％，最優(yōu)選地幾乎100％保留。
可使用常規(guī)的化學方法將聚合物結合到KIM-1多肽上。例如，聚亞烷基二醇部分可被偶聯(lián)到KIM-1多肽的賴氨酸ε氨基上。連于賴氨酸側鏈的鍵可用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯如PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)。合適的聚亞烷基二醇部分包括，例如，羧甲基-NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、醛、環(huán)氧化物、羰基咪唑、和PNP碳酸鹽(酯)。這些試劑可買到?？捎昧硗獾陌贩磻訮EG接頭取代琥珀酰亞胺基部分。這些包括，例如，異硫氰酸鹽(酯)、硝基苯基碳酸鹽(酯)、環(huán)氧化物、和苯并三唑碳酸鹽(酯)。優(yōu)選的條件是使選擇性和程度或反應達到最大。這種反應條件的最優(yōu)化是在本領域普通技術人員掌握之內。
可通過現(xiàn)有技術中已知的任何PEG化反應進行PEG化。見，例如，F(xiàn)ocuson Growth Factors，34-10，1992；公開的歐洲專利申請EP 0 154 316和EP 0401 384。可使用與活性聚乙二醇分子(或類似有活性的水溶性聚合物)酰化反應或烷基化反應進行PEG化。
通過?；腜EG化通常包括使有活性的聚亞烷基二醇的酯衍生物反應。任何活性PEG分子均可用于PEG化。優(yōu)選的活化PEG酯是PEG酯化形成的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。如這里所使用的，“?；卑ㄔ谥委熜缘鞍缀退芫酆衔锶鏟EG之間的下列類型的連接酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。見，例如，Bioconjugate Chem.5133-140，1994。應當選擇反應參數(shù)以避免將破壞或滅活KIM-1多肽的溫度，溶劑和pH的條件。
優(yōu)選地，連接鍵是酰胺。優(yōu)選地，至少最終產物的95％是單、二，或三PEG化的。然而，根據(jù)所使用的特異性反應條件不同，可以不同量形成某些具有更高程度PEG化的種類?？蛇x擇地，純化的PEG化的種類從混合物，特別是未反應的種類中分離，通過常規(guī)的純化方法，包括，例如，透析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析、以及電泳。
通過烷基化的PEG化通常包括使PEG的末端醛衍生物與KIM-1在還原劑存在時反應。另外，可操縱反應條件以利于基本上僅在KIM-1的N-末端的α-氨基上PEG化(即，單-PEG化的蛋白)。在單PEG化或聚PEG化的情況中，PEG基團優(yōu)選通過-CH2-NH-基團附著到蛋白上。特別關于-CH2-基團，這種類型的鍵被稱為“烷基”鍵。
通過還原性烷基化以產生單PEG化產物的衍生化作用，利用不同種類的可用于衍生化作用的伯氨基基團(賴氨酸對N-末端)的差異反應性。反應是在允許利用賴氨酸殘基的ε-氨基和蛋白N-末端的α-氨基之間的pKa差異的pH下完成。通過這種選擇性的衍生化作用，控制含有活性基團如醛的水溶性聚合物附著到蛋白上與聚合物的結合主要發(fā)生在蛋白的N-末端，沒有發(fā)生對其它活性基團如賴氨酸側鏈氨基的有意義的修飾。在酰化和烷基化方法中使用的聚合物分子可從上述水溶性聚合物中選擇。應當修飾所選擇的聚合物以具有單一活性基團，如用于?；幕钚怎セ蛘哂糜谕榛娜Y果聚合的程度可被控制到本方法所提供的程度。示范性的活性PEG醛是聚乙二醇丙醛，其是水溶性的，或單C1-C10烷氧基或其芳氧基衍生物(見，美國專利No.5,252,714)。聚合物可以是分枝的或不分枝的。對于酰化反應，所選擇的聚合物應當具有單一活性酯基。對于還原性烷化，所選擇的聚合物應當具有單一活性醛基。通常，將不會從天然存在的糖基殘基中選擇水溶性聚合物，因為這些通常由哺乳動物重組表達系統(tǒng)更方便地制備。
制備PEG化的KIM-1的方法通常包括步驟(a)在使分子附著到一個或多個PEG基團的條件下，使KIM-1蛋白或多肽與聚乙二醇(如PEG的活性酯或醛衍生物)反應，以及(b)獲得反應產物?？偟膩碚f，基于已知的參數(shù)和期望的結果將一步步決定?；磻淖罴逊磻獥l件。例如，PEG蛋白的比例越大，聚PEG化產物的百分率就越高。
還原性烷基化以產生基本上均一(homogeneous)的單聚合物/KIM-1群通常包括以下幾步(a)在還原性烷基化反應條件下，在適于在KIM-1的氨基末端的α-氨基的pen-nit選擇性修飾的pH，使KIM-1多肽與活性PEG分子反應；以及(b)獲得反應產物。
對于基本上均一的單聚合物/KIM-1群，還原性烷基化反應條件是那些允許水溶性聚合物部分選擇性附著到KIM-1的N-末端的條件。這種反應條件通常提供賴氨酸氨基和N-末端的α-氨基之間的pKa差異(pKa是50％的氨基被質子化，50％未被質子化的pH)。該pH也影響將使用的聚合物與蛋白的比?？偟恼f來，如果pH較低，將期望聚合物大大地超過蛋白(即，活性N-末端α-氨基越少，達到最佳條件所需要的聚合物就越多)。如果pH較高，聚合物蛋白的比值不必那樣大。(因為可利用的活性基團越多，需要的聚合物分子就越少)。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選的pH是在3-9的范圍，優(yōu)選3-6。
KIM-1多肽可包含標簽，例如，可隨后被蛋白酶解釋放的部分。因此，賴氨酸部分可被選擇性修飾，通過首先將修飾的組氨酸標簽與低分子量如將與賴氨酸和N-末端都反應的Traut′s試劑(Pierce)接頭反應，然后釋放組氨酸標簽。多肽然后將包含游離SH基，該SH基可被含有巰基活性頭部基團如馬來酰亞胺基、乙烯砜基、鹵代乙酸基團、游離的或被保護的SH的PEG選擇性修飾。
Traut′s試劑可以用將建立PEG附著的特異性位點的任何接頭取代。作為例子，Traut′s試劑可被SPDP、SMPT、SATA、或SATP(所有都可從Pierce買到)取代。類似地，可將蛋白與插入馬來酰亞胺(例如，SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS、或GMBS)、鹵代乙酸基團(SBAP、SIA、SIAB)、或乙烯砜基的胺反應性接頭反應，以及將最終的產物與含有游離SH基的PEG反應。對所使用的接頭的唯一限制是不能阻滯隨后N-末端標簽的去除。
在一些實施方案中，聚亞烷基二醇部分偶聯(lián)到KIM-1多肽的胱氨酸基團上。使用例如，馬來酰亞胺、乙烯砜基、鹵乙酸基團、和巰基可影響偶聯(lián)。
可選擇地，KIM-1多肽通過不穩(wěn)定的鍵結合到聚乙二醇上。該不穩(wěn)定的鍵可被切割，例如，生化水解、蛋白酶解、或巰基裂解。例如，該鍵可在體內(生理)條件下被切割。
可通過用于使生物活性材料與惰性聚合物反應的任何合適的方法進行該反應，優(yōu)選地在約pH 5-8，例如，pH 5，6，7，或8，如果活性基團位于N-末端的α-氨基。通常該過程包括制備活化的聚合物，然后使蛋白與活化的聚合物反應以產生適于制備制劑的可溶性蛋白。
在KIM-1多肽上的一個或多個位點可偶聯(lián)聚合物。例如，可將1，2，3，4或5個PEG部分附著到氨基末端。
抗KIM-1抗體根據(jù)本發(fā)明所使用的抗KIM-1抗體或其抗原結合片段可以是各種類型分子中的任何一種，包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化抗體、完全人抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、雙抗體(diabody)、Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2、Fv片段、Fd片段、dAb片段、以及含有互補決定區(qū)(CDR)的片段。
如這里所使用的Fd意思是由VH和CH1區(qū)構成的片段；Fv意思是由抗體單臂的VL和VH區(qū)構成的片段；dAb意思是由VH構成的片段(Ward等，1989，Nature 341544-546)。如這里所使用的，單鏈抗體(scFv)意思是一種抗體，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對，通過能使它們成為單一蛋白鏈的合成接頭形成單價分子(Bird等，1988，Science 242423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。如這里所使用的，雙抗體意思是雙特異抗體，其中在單一多肽鏈上表達VH和VL區(qū)，但使用非常短不允許在相同鏈上的兩個區(qū)之間配對的接頭，因此迫使這兩個區(qū)與另一鏈的互補區(qū)配對并生成兩個抗原結合位點(見，例如，Holliger，等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；和Poljak等，1994，Structure 21121-1123)。
通常用于獲得抗體的可應用的方法在現(xiàn)有技術中是已知的。制備抗KIM-1抗體的有用的方法和材料的綜述，見，例如，Harlow等，1988，Antibodies，A Laboratory Manual；Yelton，等，1981，Ann.Rev.Biochem.，50657-80.；和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology(NewYorkJohn Wiley & Sons)?？筀IM-1抗體的抗原結合特性可通過本領域普通技術人員進行測定，使用多種常規(guī)方法中的任何一種，包括，例如，放射免疫測定法、免疫印跡試驗和ELISA。生產本發(fā)明抗體的其它技術包括體外將淋巴細胞暴露于KIM-1多肽，或者篩選在噬菌體或類似載體上的抗體庫。見，例如，Huse等，1989.Science，2461275-1281。
載體本發(fā)明提供包括編碼KIM-1多肽的核酸的載體。載體和可操作地連接到本發(fā)明的核酸上的表達調控序列的選擇依賴于所期望的功能特性，例如，蛋白表達，以及將被轉化的宿主細胞。本發(fā)明的載體可能至少能指導復制或插入到宿主染色體中，優(yōu)選也能表達包含在rDNA分子中的結構基因。
對于調控可操作地連接的編碼序列表達有用的表達控制元件在現(xiàn)有技術中是已知的。實例包括，但不限于，可誘導的啟動子、組成型啟動子、分泌信號、和其它調控元件。當使用可誘導啟動子時，其可被控制，例如，通過其營養(yǎng)狀態(tài)的改變、或者溫度、宿主細胞培養(yǎng)基的改變。
載體包括原核復制子，即，具有能指導原核宿主細胞中染色體外的重組DNA分子自主復制和維持的DNA序列，如用其轉化的細菌宿主細胞。這種復制子在現(xiàn)有技術中是公知的。另外，包括原核復制子的載體也可包括其表達賦予可檢測的標記如藥物抗性的基因。細菌藥物抗性基因典型的是那些賦予氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因。
包括原核復制子的載體可進一步包括用于指導編碼基因序列在細菌宿主細胞中表達的原核的或噬菌體啟動子。在含有用于插入本發(fā)明的DNA片段的方便的限制性酶切位點的質粒載體中典型地提供與細菌宿主相容的啟動子序列。這種載體質粒的實例是pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRadLaboratories)、pPL和pKK223(Pharmacia)。任何合適的原核宿主都可用于表達編碼本發(fā)明蛋白的重組DNA分子。
真核細胞表達載體在現(xiàn)有技術中是已知的并可買到。典型地，這種載體含有用于插入所期望的DNA片段的方便的限制性酶切位點。示范性載體包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pML2d(InternationalBiotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)。
真核細胞表達載體可包括可選擇性的標記，例如，藥物抗性基因。優(yōu)選的藥物抗性基因賦予新霉素抗性，即，新霉素磷酸轉移酶(neo)基因(Southern等，1982，J.Mol.Anal.Genet.1327-341)。
為了表達抗體或抗體片段，將編碼部分或全長輕和重鏈的DNAs插入到表達載體中。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的游離基因等。選擇表達載體和表達控制序列與所使用的表達宿主細胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到獨立的載體中。在一些實施方案中，兩種基因被插入到相同的表達載體中。
方便的載體是編碼有功能的完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的載體。優(yōu)選地，如上所述，限制性酶切位點進行改造使得任何VH或VL序列可被容易地插入和表達。在這種載體中，剪接通常發(fā)生在插入的J區(qū)中的剪接供體位點和前述人C區(qū)的剪接受體位點之間，也在位于人CH外顯子內的剪接區(qū)上。聚腺苷酸化和轉錄終止發(fā)生在編碼區(qū)的天然染色體位點下游。重組體表達載體也可編碼便于從宿主細胞中分泌抗體鏈的信號肽。
用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選的調控序列包括在哺乳動物細胞中指導蛋白高水平表達的病毒元件，如來源于逆轉錄病毒LTRs、巨細胞病毒(CMV)(如CMVV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒，(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多形瘤的啟動子和增強予以及強哺乳動物啟動子如天然免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子。病毒調控元件及其序列的進一步描述，見，例如，Stinski的美國專利No.5,168,062，Bell等的美國專利No.4,510,245和Schaffner的美國專利No.4,968,615。
重組表達載體可攜帶調控載體在宿主細胞中復制的序列(例如，復制的起點)和可選擇的標記基因?？蛇x擇的標記基因便于載體被引入到其中的宿主細胞的選擇(見，例如，美國專利Nos.4,399,216，4,634,665和5,179,017，所有都是Axel等的專利)。例如，典型地可選擇的標記基因在載體被引入的宿主細胞中賦予對藥物，如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。優(yōu)選的可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于使用氨甲蝶呤選擇/擴增dhfr-宿主細胞)和neo基因(用于G418選擇)。
編碼KIM-1多肽和抗-KIM-1抗體的核酸，以及包含這些核酸分子的載體，可用于轉化合適的宿主細胞。將外源DNA引入到哺乳動物中的方法在現(xiàn)有技術中是公知的，包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸包裹到脂質體中、以及DNA直接顯微注射到細胞核內。另外，核酸分子可通過病毒載體被引入到哺乳動物細胞中。
宿主細胞的轉化可通過適于所用載體和宿主細胞的常規(guī)方法進行。關于原核宿主細胞的轉化，可采用電穿孔和鹽處理法(Cohen等，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110-2114)。關于脊椎動物細胞的轉化，可以采用電穿孔、陽離子脂質或鹽處理法(見，例如，Graham等，1973，Virology 52456-467；Wigler等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761373-1376)。
宿主細胞可以是原核的或真核的。優(yōu)選的真核宿主細胞包括，但不限于，酵母和哺乳動物細胞。有用的真核宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(ATCC登記號No.CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH-3T3(ATCC登記號No.CRL1658)，以及幼倉鼠腎細胞(BHK)?？捎米魉拗饔糜诒磉_的哺乳動物細胞系在現(xiàn)有技術中是已知的，包括許多可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的永生細胞系。除了別的以外，這些包括，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞，以及許多其它細胞系。
使用已知技術可提高生產細胞系表達多肽。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)通常在某種情況下用于提高表達。見，例如，歐洲專利Nos.0216846、0256055、和0323997以及歐洲專利申請No.89303964.4。
制劑包含KIM-1多肽、抗KIM-1抗體、或抗KIM-1抗體的抗原結合片段的組合物可含有適當?shù)乃帉W上可接受的載體。例如，他們可含有賦形劑和/或輔料，便于將活性化合物加工成預定用于輸送到作用位點的制劑。用于腸胃外給藥的合適的制劑包括水溶型活性化合物的水溶液，例如，水溶性鹽。此外，活性化合物的懸液可作為適當?shù)挠托宰⑸鋺乙菏┯谩：线m的親脂性溶劑和載體包括脂肪油，例如，芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如，乙基油酸酯或甘油三酯。水性注射懸液可含有增加懸液粘性的物質，包括，例如，羧甲纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖?？蛇x擇地，懸液也可含有穩(wěn)定劑。也可使用脂質體包封本發(fā)明的分子用于遞送到細胞或胞間隙內。示范性的藥學上可接受的載體是生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、水、鹽、磷酸緩沖鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等。在一些實施方案中，組合物包括等張劑，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。在一些實施方案中，組合物包括藥學上可接受的物質如潤濕劑或者少量輔助物質如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其提高活性成分擱置期或效力。
本發(fā)明的組合物可以各種形式，包括，例如，液體、半固體和固體劑型，如液體溶液(例如，可注射的和難熔(infusible)的溶液)、分散體或懸液。優(yōu)選的形式根據(jù)打算施用的方式和治療應用的不同。在一些實施方案中，組合物是可注射或不熔的液體形式，如類似于那些用于人被動免疫的組合物。
組合物可被制成溶液、微乳劑、分散體、脂質體，或其它適于高藥物濃度的有序結構。可通過將溶于適當溶劑的活性成分以所需量與以上列舉的成分中的一種或其組合混合，根據(jù)需要，隨后過濾滅菌制備無菌注射液。通常，通過將活性物質結合到無菌載體中制備分散體，其中無菌載體含有堿性分散劑和來自以上列舉的那些中的所必需的其它成分。就用于制備無菌可注射液的無菌粉末來說，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，產生活性成分的粉末，向先前無菌過濾的溶液中加上任何另外期望的成分，可維持溶液的適當流動性，例如，通過使用包衣如卵磷脂，通過保持所需顆粒的大小，以及通過使用表面活性劑。通過在組合物中包括延遲吸收的物質，例如，單硬脂酸鹽和明膠，可延長可注射的組合物的吸收。
在一些實施方案中，活性成分是用控制釋放的制劑或裝置制成。這樣的制劑和裝置的實例包括植入物、經皮貼劑、以及微囊包埋遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾模锵嗳莸木酆象w，例如，乙烯乙烯基乙酸酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯，以及聚乳酸。制備這種制劑和裝置的方法在現(xiàn)有技術中是已知的。見，例如，Sustained and Cofzttolled Release Drug DeliverySystems，1978，J.R.Robinson，編，Marcel Dekker，Inc.，New York。
也可將補充的活性化合物結合到化合物中。在一些實施方案中，KIM-1多肽、抗KIM-1抗體或其片段與第二種免疫調制劑同時施用，所述第二種免疫調節(jié)劑例如，BAFF-R-Ig、LTJ3-R-Ig、CTLA4-Ig、抗CD40L、或抗-CD20單克隆抗體。
可調整劑量方案以提供所期望的最佳反應。例如，可以施用單劑，可隨著時間施用幾個分開的劑量，或者劑量可由治療情況的緊急所指示按比例減少或增加。制備給藥容易的劑量單位形式的腸胃外組合物是有利的，如這里所使用的劑量單位形式一致是指完全分散的單位，作為單位劑量適于將被治療的哺乳動物受試者，每個單位與所需要的藥學載體結合，含有經計算產生期望治療效果的預定量的活性化合物。
在一些實施方案中，KIM-1的治療有效劑量是0.1到100mg/kg。在一些實施方案中，治療有效劑量是0.5到50mg/kg。在一些實施方案中，治療有效劑量是1.0到10mg/kg，例如，約5mg/kg。也可通過體外測量適當(治療)時期包被靶細胞(KIM-1或KIM-1受體陽性細胞，根據(jù)修飾劑的不同)所需的修飾劑濃度的實驗，評價有效劑量的決定。FACS和ELISA受體配體結合試驗可用于監(jiān)視細胞包被反應?；谶@些體外結合試驗的結果，可選擇適宜修飾劑濃度的范圍。
通過與藥學上可接受的無毒輔料或載體混合，可將本發(fā)明的分子制成藥物組合物。這種組合物可被制成用于腸胃外給藥，特別是以液體溶液或懸液的形式。組合物可以單位劑型施用，并可通過任何合適的方法制備。這些方法在現(xiàn)有技術中是已知的。例如，見，Remngton′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA 1980)。
液體劑型包括藥學可接受的溶液、乳劑、微乳液，和懸液。除了活性化合物，液體劑型可含有惰性成分包括水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐脂、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯、及其混合物。
可通過在可降解的聚合物如聚交酯-聚乙醇酸交酯(polyactide-polyglycolide)中形成藥物的微囊包埋的基質，制備可注射的貯存制劑。根據(jù)藥物與聚合物的比率，及所用聚合物的特性，可以控制藥物釋放的速率。其它示范性的生物可降解的聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。貯存可注射的制劑也可通過將藥物陷入與身體組織相容的脂質體或微乳劑中制備。
實施例本發(fā)明通過以下列試驗實例進一步闡述。實施例僅用作說明目的，不應當被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內容。
實施例1人KIM-1胞外域-Fc構建體(pHI105)將人KIM-1的胞外域(1-290殘基)融合到人IgG1的Fc部分(鉸鏈，CH2，CH3)并克隆到pEAG347(一種Biogen哺乳動物表達質粒)中。該質粒含有用于組成型表達的串聯(lián)啟動子和用于穩(wěn)定表達細胞系的氨甲喋呤選擇的二氫葉酸還原酶基因。編碼的融合多肽的氨基酸序列如下1 102030405060MHPOVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNG708090 100 110 120IVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITV130 140 150 160 170 180SLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVPTTMTVS190 200 210 220 230 240TTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGA250 260 270 280 290 300IRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGVDKTHT 310 320 330 340 350 360PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT370 380 390 400 410 420KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY430 440 450 460 470 480TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK490 500 510 518LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK信號序列用下劃線表示。Fc鉸鏈用方框表示。
實施例2人KIM1ECD粘蛋白Δ-Fc(pHI100)將編碼與人IgG1 Fc部分(鉸鏈，CH2，CH3)融合的人KIM-1 1-129殘基的DNA克隆到pEAG347(一種Biogen哺乳動物表達質粒)中，其含有用于組成型表達的串聯(lián)啟動子和用于穩(wěn)定表達細胞系的氨甲喋呤選擇的二氫葉酸還原酶基因。編碼的融合多肽的氨基酸序列如下102030405060MHPOVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNG708090 100 110 120IVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITV130 140 150 160 170 180SLEIVPPKVVDKTHT PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED190 200 210 220 230 240PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA250 260 270 280 290 300PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN310 320 330 340 350YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK實施例3人KIM1ECD-6個組氨酸(pVB602)將人KIM-1的細胞外域(1-290殘基)融合到包括6個組氨酸殘基重復的短C-末端肽[VEHHHHHH]并克隆到pCA125中，一種BIOGEN哺乳動物表達質粒，含有用于在哺乳動物中短暫組成型表達的CMV啟動子。編碼的融合多肽的氨基酸序列如下
102030405060MHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNG708090 100 110 120IVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITV130 140 150 160 170 180SLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVPTTMTVS190 200 210 220 230 240TTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGA250 260 270 280 290IRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGVEHHHHHH實施例4小鼠KIM-1-Fc融合物將兩側為NotI和SalI位點的PCR擴增的小鼠kim-1的胞外域與人IgG1Fc(作為SalI-NotI片段從EAG409中分離的)融合，并克隆到Ebna 293細胞表達載體CH269(構建體PEM073-6)和CHO細胞表達載體pV90(構建體PEM078-1)。SalI位點位于kim1和Fc的連接處。最終用于融合的ORF的核苷酸序列如下(SalI位點在上面的實例中)atgaatcagattcaagtcttcatttcaggcctcatactgcttctcccaggcactgtggattcttatgtggaagtaaagggggtagtgggtcaccctgtcacacttccatgtacttactcaacatatcgtggaatcacaacgacatgttggggccgagggcaatgcccatcttctgcttgtcaaaatacacttatttggaccaatggacatcgtgtcacctatcagaagagcagtcggtacaacttaaaggggcatatttcagaaggagatgtgtccttgacgatagagaactctgttgagagtgacagtggtctgtattgttgtcgagtggagattcctggatggtttaatgatcagaaagtgaccttttcattgcaagttaaaccagagattcccacacgtcctccaacaagacccacaactacaaggcccacagctacaggaagacccacgactatttcaacaagatccacacatgtaccaacatcaatcagagtctctacctccactcctccaacatctacacacacatggactcacaaaccagaacccactacattttgtccccatgagacaacagctgaggtgacaggaatcccatcccatactcctacagactggaatggcactgcgacatcctcaggagatacctggagtaatcacactgaagcaatccctccagggaagccgcagaaaaaccctactaagggcGTCGACaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcccgggaaatga
ukim-1胞外域-人Fc的翻譯序列如下。由SalI位點貢獻的兩個連接氨基酸用粗體顯示MNQIQVFISGLILLLPGTVDSYVEVKGVVGHPVTLPCTYSTYRGITTTCWGRGQCPSSACQNTLIWTNGHRVTYQKSSRYNLKGHISEGDVSLTIENSVESDSGLYCCRVEIPGWFNDQKVTFSLQVKPEIPTRPPTRPTTTRPTATGRPTTISTRSTHVPTSIRVSTSTPPTSTHTWTHKPEPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPTDWNGTATSSGDTWSNHTEAIPPGKPQKNPTKGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK實施例5小鼠SRBC模型中KIM-1-Fc融合物嚙齒動物對綿羊紅細胞(SRBC)的免疫反應依賴于感受態(tài)T細胞與APCs和B細胞的相互作用。因此，抗SRBC應答對于檢查淋巴細胞和APC上的細胞蛋白在免疫反應的發(fā)育和成熟中的作用是一種有用的模型。在小鼠中抗SRBC應答由產生IgM和產生各種IgG同種型構成，包括高水平的IgG1同種型，也見到相當水平的IgG2a和IgG2b。IgG1被認為是由Th2介導的免疫反應驅動的同種型，其特點是表達如IL-4、IL-5和IL-13的細胞因子。IgG2a和IgG2b同種型更具有Th1驅動的免疫反應的特征，與IL-12的表達有關。最后，IgG3同種型是不依賴T的免疫反應的典型。在抗SRBC應答中表現(xiàn)所有4種同種型。
抗SRBC應答的過程是在小鼠用KIM-1-Ig融合蛋白(mKIM-1-Ig)處理以阻斷在T細胞上的依賴KIM-1的活性之后。在攻擊前的那一天(D-1)用150ugs/小鼠mKIM-1-Ig處理小鼠，在第0天用100μl溶于PBS的10％SRBC溶液(Colorado血清公司)攻擊，然后用150μg mKIM-1-Ig在第3和6天再次處理。在免疫后第7、14、21和30天，給小鼠放血采集血清樣品，使用血細胞凝集試驗獲得抗SRBC抗體效價。這種試驗依賴于抗體交聯(lián)和聚集(“凝集”)SRBC的能力，基于它們的五聚體結構(對于IgM)或基于出現(xiàn)第三種抗獨特型抗血清(對于Ig類)。
簡言之，方案如下。將血清樣品適當稀釋(1∶15到1∶200)，根據(jù)被測定的同種型和反應的時間而不同，然后使用從Corning(Costar#3795)獲得的96孔試驗板以1∶2步驟(in 1∶2 steps)滴定。對于IgM試驗，一式兩份分析血清樣品。向孔中加入25μl溶于葡萄糖-PBS(G-PBS)的10％SRBC，允許凝集反應在37℃進行1小時。對于Ig試驗，將血清樣品加到平板內并一式三份稀釋。將25山在G-PBS中稀釋的1％2-巰基乙醇(Sigma)加到每個血清樣品系列中，然后將平板在培養(yǎng)基在37℃孵育30分鐘。這是破壞將IgM五聚體結合在一起的所有二硫鍵，因此消除任何IgM背景。然后，將25μl溶于G-PBS的10％SRBC溶液，和25μl在G-PBS中1∶250稀釋的抗獨特型抗血清(羊抗-鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、或IgG3，所有都來自Southern Biotechnology Associates)加入到每一式三份中的前兩份以交聯(lián)所存在的那個亞型的抗SRBC IgGs。將每一式三份中的第3個孔留下來不被交聯(lián)，用作2-巰基乙醇處理后可能殘存的任何殘余IgM活性的對照。平板在37℃孵育1小時。所有分析平板留下來在4℃過夜，在評分和照相前以穩(wěn)定得到的血細胞凝集。記下所有效價作為得到陽性凝集讀數(shù)的最后一次稀釋。
將用mKIM-1-Ig處理對抗SRBC反應的效果與未用SRBC攻擊，或用SRBC攻擊但給予抗CD40L、非特異性多克隆hIgG，或PBS的對照組小鼠比較。與預期的一樣，未被攻擊和抗CD40L處理的小鼠沒有抗SRBC反應。給予SRBC和施用PBS或hIgG的小鼠對被檢驗的Ig的所有類型都有強烈的抗體效價。用mKIM-1-Ig處理的小鼠則相反，非常顯著和特異性缺乏IgG1抗SRBC同種型。在使用小鼠Balb/c系的2個獨立試驗中，檢測到IgG1抗SRBC的水平顯著缺乏(圖3和4)。誘導抗SRBC反應后7天，在用mKIM-1-Ig處理的小鼠中IgG1效價平均低于對照處理的小鼠70％。到誘導抗SRBC反應后14天，IgG1效價減少超過85％。在使用小鼠C57B1/6系的一個實驗中觀察到類似的缺乏(圖5)。Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠被認為在它們的免疫反應中具有不同的傾向性，Balb/c小鼠的特點是具有主要地Th2介導的應答，C57B1/6小鼠具有主要地Th1介導的應答。因此，在這些小鼠品系中，小鼠KIM-1-Ig融合蛋白阻斷產生IgG1同種型的能力超越了品系中固有的Th傾向性。令人驚奇地，mKIM-1-Ig處理的影響延續(xù)到再次應答，對隨后的SRBC攻擊沒有由記憶B細胞產生IgG1(圖6和7)。
實施例6移植物抗宿主病(GVHD)在小鼠中使用親本細胞移入F1細胞的移植方案模擬GVHD。小鼠DBA2系的脾細胞被靜脈注射到(DBA2×C57B1/6)F1小鼠中，其被稱為B6D2F1。注入的脾細胞構成移植物，DBA2小鼠是該移植物的供體。接受移植物的F1小鼠是宿主。在移植物中存在的供體T細胞將宿主細胞上的一半MHC標記(單倍型)識別為外源標記，因為它們來源于其它品系，C57B1/6親代。這誘導供體T細胞抗宿主反應，導致GVHD。當DBA/2親本脾細胞注射到B6D2F1宿主中時，發(fā)生慢性GVHD。相反，當C57B1/6脾細胞注射到B6D2F1宿主中時，發(fā)生急性GVHD。雖然仍不清楚什么機理負責使用這兩種注射方案所產生的顯著不同的疾病結果，但是相信在DBA/2脾細胞移植物中含有的細胞所表達的細胞因子有助于產生慢性GVHD，而在C57B1/6脾細胞移植物中含有的細胞所表達的細胞因子有助于產生急性GVHD。干擾T細胞與抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞、巨噬細胞、B細胞APC)相互作用的試劑有效地阻斷急性和慢性GVHD。
KIM-1拮抗劑在慢性GVHD的小鼠模型中減輕免疫反應的發(fā)展。阻斷慢性GVHD的能力包括對B細胞活化和增殖的影響，以及對產生所分泌的IgG的影響。小鼠腹膜內(ip)用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理，對照處理，或者留下來不被處理。4小時后，小鼠接受從DBA/2小鼠中分離的1×108脾細胞，靜脈內(iv)給予0.5ml注射劑。靜脈注入的DBA/2脾細胞構成同種移植物。給予移植物后2、4和6天，小鼠再次用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理或者用對照處理。另外對照組的小鼠接受1×108B6D2F1脾細胞，其在B6D2F1受體中不能誘導疾病?？蛇x擇地，未移植的和未處理的B6D2F1小鼠用作對照。給予移植物后第14天處死小鼠，檢查疾病的證據(jù)。
未處理的移植物受體小鼠表現(xiàn)多種指示產生慢性GVHD的癥狀。脾腫大，或者脾臟增大，是供體T細胞和宿主B細胞被活化的證據(jù)，經歷多克隆擴增，細胞數(shù)量急劇增加。細胞表面蛋白如B細胞亞型上的CD69的出現(xiàn)指示B細胞活化。CD4+和CD8+T細胞的L-選擇蛋白分子的喪失是T細胞活化的證據(jù)。Ig分子，如IgG類、IgA、和IgE，分泌進入血清，或者在體外細胞培養(yǎng)物試驗中，指示B細胞被活化，并已轉換了它們的Ig種類。在這點上，抗自身Ig出現(xiàn)在血清中或在體外細胞培養(yǎng)物試驗顯示產生的Ig具有不適當?shù)淖陨砜乖R別。最后，可測量存活作為不同治療方案的結果。用KIM-1拮抗劑(例如，KIM-1-Ig)的治療阻斷慢性GVHD的發(fā)展，如表現(xiàn)為脾腫大程度減少、淋巴細胞群的多克隆擴增減少、指示淋巴細胞活化的細胞表面標記減少或消失、Ig分泌減少、和/或死亡率降低。
我們將對照小鼠與未被處理的同種移植物-受體小鼠比較，檢查GVHD期間脾腫大、B細胞活化和Ig分泌的程度。在這些實驗中，抗CD40L mAbMR1用作陽性對照，因為先前顯示阻斷CD40L/CD40相互作用是干擾慢性GVHD發(fā)生的有效方法(Durie等，1994，J.Clin.Invest.941333-1338)。為了研究受用KIM-1拮抗劑處理影響的細胞群，對從移植物注射后14天的受體小鼠中獲取的脾細胞進行FACS分析。從每組3-4只小鼠中分離和匯集脾細胞。受體B細胞的活化是定義慢性GVHD的特征。在經受慢性GVHD的小鼠中，少量但容易看得見的比例的B200+B細胞表達活化標志物CD69。因此，CD69表達作為疾病程度的衡量標準。也測量不同處理組小鼠的脾細胞培養(yǎng)物中的總IgG，因為B細胞所表達的CD69指示它們的活化狀態(tài)。
在小鼠模型中，疾病的發(fā)展依賴于Th2細胞因子IL4，可通過用抗-IL4mAb處理被阻斷。這種處理阻止宿主B細胞的擴增，以及伴隨的Ig產生過多。GVHD的發(fā)展可以多種方式進行。通過脾指數(shù)測量供體T細胞和宿主B細胞群的擴增，所述脾指數(shù)是脾重量與體重的比，對對照(無病的)小鼠標準化。使用B細胞活化標記的分析測量患病小鼠中B細胞的活化。最后，B細胞活化的效果可在循環(huán)(例如，在血清中)中或由疾病誘發(fā)后數(shù)周收獲的宿主脾細胞培養(yǎng)物所產生的Ig的水平中看到。在患病動物中循環(huán)的Ig將含有抗自身抗體。最終，患病動物死于由于累積的Ig沉積所導致的腎或其它器官衰竭，因此是否存活是疾病活動的相關衡量標準。
實施方案7SCID-hu小鼠模型可在SCID-hu小鼠中研究人免疫反應。例如，SCID小鼠腹膜內注射2-5×107人外周血單個核細胞，這些細胞存在于腸道中一段時間并發(fā)揮功能，以及對抗原攻擊起反應。用人PBLs重建NOD-SCID小鼠，這些小鼠具有另外的優(yōu)點，人細胞(T、B、APC)播種到脾內，可支持系統(tǒng)免疫反應。在Berney等，2001，Transplantation 72133-140中討論了合適的模型。免疫反應的其它模型使用SCID/米色小鼠，包括PBLs或胎兒細胞(fetal cells)與胎兒腸系膜淋巴結的共移植以提供對免疫反應的支持(Carballido等，2000，Nat.Med.6103-106)。
用從破傷風類毒素(TT)免疫的人供體中分離的外周血單個核細胞(PBMCs)重建SCID-hu或NOD-SCID-hu小鼠。這樣重建的SCID-hu小鼠具有定居于各種區(qū)室包括腹膜中的人細胞。這樣重建的NOD-SCID-hu小鼠具有存在于各種區(qū)室包括位于它們的次級淋巴器官內，如脾中的人T細胞。在這些重建的小鼠中，通過用與TT、或與TT的抗原部分、或與脂質體、或者與含有TT的脂質體偶聯(lián)的抗原免疫誘發(fā)初次免疫反應。這樣重建并被攻擊的小鼠對抗原(例如，NP、DNP、KLH、OVA、HIVgp120或其部分、黑色素瘤相關抗原GD2、羊粘蛋白等許多例子)產生高效價(＞1∶1000)Ig。一些實例存在于Ifverson等，1995，Immunology 84111-116中。這樣重建并隨后用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理的小鼠對抗原攻擊不產生高效價。
在其它的方法中，SCID-hu小鼠是用人胎兒骨、胸腺、皮膚碎片、以及腸系膜淋巴結(MLN)重建。MLN的出現(xiàn)足以支持對TT-免疫的強烈的免疫反應(而且，因為所有的供體組織都是胎兒的，所以這嚴格地說是初次免疫反應)。在Carballido等，2000，Nat.Med.6103-106中詳細討論了這種模型。TT免疫導致人淋巴細胞增殖和活化，以及由B細胞分泌IgM和IgG。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理重建的SCID小鼠一旦受到TT攻擊則減少人淋巴細胞增殖、活化、以及免疫球蛋白的分泌。
在這些模型，或其它類似NOD-SCID-hu或SCID-hu模型的修飾中，在疾病背景中測量再次免疫反應，例如，遲發(fā)型超敏反應(DTH)。在這種情況中在用TT免疫的個體的PBMCs重建的SCID或NOD-SCID小鼠的爪墊中給予TT攻擊，在反應中測量爪墊的腫脹。DTH反應依賴于重建的小鼠循環(huán)中出現(xiàn)的人記憶T細胞。這種模型也可被用于檢測移植病人中供體組織可能發(fā)生的排斥，與在“trans vivo”模型中一樣。在Carrodeguas等，1999，Hum.Immunol.60640-651中討論了這類方法的一個實例。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理這樣重建的小鼠預防DTH反應。在SCID小鼠中人疾病反應的其它模型包括在小鼠中轉移自身免疫病人的脾細胞或PBMCs，其中它們繼續(xù)表達免疫球蛋白和疾病的其它標志物(見Martino和Grinaldim 1997，在Immunology Methods Manual，vol 3.Lefkovits，編，Academic Press，San Diego)。在從病人中轉移自身免疫細胞前，用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理這些小鼠，減少免疫球蛋白和或自身免疫病變的其它標志物的表達。
非常有價值的利用SCID小鼠的方法包括將疾病組織異種移植到受體小鼠上。例如，從牛皮癬或特應性皮炎病人中轉移皮膚的方法是這些疾病廣泛使用的模型。特應性皮炎是Th2介導的細胞免疫疾病，其可在SCID小鼠中通過將PBMCs和皮膚的活檢物一起轉移到受體小鼠中模擬。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理這些小鼠防止細胞的累積和局部的細胞因子分泌，其是皮膚移植物中淋巴細胞和效應細胞(嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞，等)活化的證據(jù)。這是在供體病人中預防皮炎有效的證據(jù)。
實施例8.特應性疾病的其它鼠模型在小鼠中建立過敏反應、哮喘、氣道超敏反應(AHR)，和其它特應性疾病的有用模型。例如，過敏性皮炎是通過用抗原使外皮致敏誘導。在一個實例中，抗原是卵白蛋白(OVA)。對這種致敏的Th2反應表現(xiàn)為在皮膚中出現(xiàn)嗜酸粒細胞、Th2細胞因子在皮膚中的局部表達、以及對吸入抗原引起的氣道超敏反應(AHR)。首先用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理的OVA致敏的小鼠的皮膚中沒有嗜酸粒細胞，并且Th2細胞因子的水平降低。重復致敏的小鼠產生OVA特異性IgE，并且在體外用OVA刺激后它們的脾細胞分泌Th2細胞因子IL-4和IL-5。用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理時，Th2免疫反應的這些現(xiàn)象被阻止?？蛇x擇地，可用i.p.注射抗原(第0天)對小鼠(例如，BALB/c小鼠)致敏，然后3周后(一次)和四周后(3次例如26、27、28天)通過鼻內給予抗原再次攻擊。這產生肺高反應性(AHR)，其通過Th2細胞因子如IL-13介導。一旦用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理會阻斷這種Th2免疫反應。
使用OVA特異性TCR轉基因模型(DO 11.10)，我們誘導OVA特異性免疫反應，然后將Th2 OVA特異性T細胞轉移到初始受體(naive recepients)，其然后用OVA氣霧劑攻擊。這些小鼠迅速發(fā)生抗原特異性AHR。當小鼠在OVA氣霧劑攻擊前用KIM-1拮抗劑或修飾劑處理會阻斷這種反應。
乙酰甲膽堿(methacholine)氣霧劑治療誘導肺募集嗜酸粒細胞，導致小鼠AHR。用KIM-1拮抗劑或修飾劑治療小鼠阻止了AHR的產生。
實施例9膠原誘導的關節(jié)炎在關節(jié)炎的這種鼠模型中，使用膠原觸發(fā)T細胞介導的B細胞活化和產生自身抗體，其攻擊關節(jié)，導致類似類風濕性關節(jié)炎的情況。在小鼠的各種品系中這種反應被高效價的IgG1控制。尤其是，在由于遺傳缺陷導致缺少IL-12的小鼠(IL-12敲除小鼠IL-12-/-)中IgG1效價非常高，這些抗體有效地介導關節(jié)破壞。
在兩個部位通過皮內注射溶于完全弗氏完全佐劑的膠原處理小鼠對每只耳朵給予少量膠原，以及對兩肩之間的皮膚給予少量膠原。3周后小鼠用溶于鹽的可溶性膠原強化，使用腹腔內途徑。1周內，通過用卡鉗測量關節(jié)的腫脹和通過測量抗體效價評估關節(jié)損害。在病程發(fā)展過程中小鼠的治療改善了疾病評分。尤其是，在疾病開始之前的那一天用0.1-1mg/kg的KIM-1拮抗劑或修飾劑處理，隨后進行治療，將會阻止疾病發(fā)展，通過關節(jié)腫脹的減輕和免疫球蛋白效價的降低來評價。這是治療中的預防性治療。
誘導后，以及加強前，用KIM-1拮抗劑的治療改善疾病發(fā)展，通過關節(jié)腫脹的減輕和免疫球蛋白滴度的降低評價。這是治療中的治療性治療。強化注射后用KIM-1拮抗劑或修飾劑的治療阻止疾病發(fā)展，通過關節(jié)腫脹的減輕和免疫球蛋白效價降低來評價。這是治療的治療過程。
實施例10狼瘡的小鼠模型在NZB/W模型中，NZB系的小鼠與NZW系的小鼠交配，隨著時間推移，F(xiàn)1后代產生狼瘡樣疾病。疾病的表現(xiàn)包括產生自身抗體和類風濕因子。由于產生大量的Ig和RF造成腎中Ig沉積，導致隨著時間降低腎的功能，可通過尿中的蛋白尿來測量。
NZB/W F1后代在5月齡左右開始出現(xiàn)疾病的癥狀，此時伴有中等蛋白尿評分(PU為2)。到9月齡時小鼠將達到最大值PU＝4，將開始死于腎臟衰竭的結果。另一個稱做SNF1(SWR×NZB F1雜交)的模型具有類似的動態(tài)過程。
在疾病發(fā)病前用0.1-1mg/kg的KIM-1拮抗劑處理小鼠，隨后進行治療。這阻止了疾病的發(fā)展，通過PU評分，和/或通過測量血清中免疫球蛋白的效價，和/或通過脾增生的免疫組織化學分析，和/或通過腎臟中腎小球結構中的免疫復合物沉積和變化的免疫組織化學分析來測量。
在誘導疾病后用KIM-1拮抗劑的治療，例如在第5個月時，但在疾病嚴重之前(即，PU＝2-3)，改善了疾病的發(fā)展或逆轉了疾病的損害。這可通過PU評分，和/或通過測量血清中免疫球蛋白的效價，和/或通過脾增生的免疫組織化學分析，和/或通過腎臟中腎小球結構中的免疫復合物沉積和變化的免疫組織化學分析來測量。
在疾病嚴重之后(PU＝3-4)用KIM-1拮抗劑的治療可阻止疾病發(fā)展或逆轉疾病損害。這可通過PU評分，和/或通過測量血清中免疫球蛋白的效價，和/或通過脾增生的免疫組織化學分析，和/或通過腎臟中腎小球結構中的免疫復合物沉積和變化的免疫組織化學分析來測量。
實施例11混合淋巴細胞反應(MLR)小鼠MLR試驗和KIM-1的拮抗作用。根據(jù)以下方法進行混合淋巴細胞反應(MLR)使用無菌技術從C57B16和Balb/c小鼠中分離脾，粗略地研磨以釋放淋巴細胞，然后用低張液(Gey′s液)處理以裂解紅細胞。剩余細胞通過細胞濾器(BD Falcon，Bedford，MA USA)從殘余組織中分離，然后用無菌的，無熱原的PBS洗滌，以及離心沉淀細胞。再次在PBS溶液中重懸細胞，再次沉淀，然后重懸浮于完全RPMI培養(yǎng)基中。計數(shù)細胞并根據(jù)需要進行稀釋。Balb/c淋巴細胞用作刺激細胞，因此，在使用前將這些細胞在3000RAD照射。
為了建立試驗，將刺激細胞加入到孔中，隨相對于效應細胞數(shù)量的比率而改變(2×105/孔)。培養(yǎng)基補充20μg/ml大鼠抗KIM-1抗體，或KIM-1-Ig融合蛋白以及對照Ig融合蛋白，如指示的。在3個相同的平板中建立培養(yǎng)物，每個實驗條件用每個平板中的3個孔代表。一個平板使用MTS測定(CellTiter 96，Promega，Madison，WIUSA)用于產生細胞增殖數(shù)據(jù)。其它平板用于收集上清液樣品用于細胞因子分析。ELISAs(Pierce Endogen，Rockford，ILUSA或)用于測量培養(yǎng)物上清液中的mIFNγ、mTNF、和mIL-2的水平。來自增殖試驗和ELISAs的標準誤小于10％，圖中已經被省略。注意到培養(yǎng)物中IFNγ與陽性對照值有大的偏差，而IL-2和TNF的水平在陽性對照和處理組之間沒有顯著性差異。因此，IL-2和TNF數(shù)據(jù)已被省略；顯示每個代表性實驗的IFNγ和細胞增殖的數(shù)據(jù)。
用大鼠抗小鼠KIM-1mAbs 3A2.5和1H9.11處理MLR培養(yǎng)物顯著降低分泌到上清液中的IFNγ的水平(圖8)。這種效果對IFNγ是特異性的，因為觀察到分泌到上清液中的I1-2或TNF的水平沒有減少。這種效果不是由于在這些培養(yǎng)物中細胞數(shù)量減少，因為細胞增殖試驗顯示在培養(yǎng)物中活細胞的數(shù)量是相似的(圖9)。
用KIM-1-Ig融合蛋白處理MLR培養(yǎng)物顯著減少分泌到上清液中的IFNγ水平(圖10)。這種效果對于IFNγ是特異性的，因為注意到分泌到上清液中的IL-2或TNF水平沒有減少(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這中效果不是由于在這些培養(yǎng)物中細胞數(shù)量減少，因為細胞增殖試驗顯示在用KIM-1-Ig融合蛋白處理的培養(yǎng)物中活細胞數(shù)量與未被處理的對照非常相似(圖11)。
人MLR試驗和KIM-1的拮抗作用。根據(jù)以下方法進行混合淋巴細胞反應(MLR)使用Ficoll梯度離心法從正常人供體獲得的全血中分離出外周血單個核細胞。細胞然后用無菌的，無熱原的PBS洗滌，離心沉淀細胞。再次在PBS溶液中重懸細胞，再次沉淀，然后在完全RPMI培養(yǎng)基中重懸。計數(shù)細胞并根據(jù)需要進行稀釋。JY細胞(ATCC，Bethesda，MD USA)用作刺激細胞，因此，在使用前將這些細胞在10000RAD照射。
為了建立試驗，將刺激細胞加入到孔中，隨相對于效應細胞數(shù)量的比率而改變(2×105/孔)。培養(yǎng)基補充20μg/ml小鼠抗KIM-1抗體，如指示的。在3個相同的平板中建立培養(yǎng)物，每個實驗條件用每個平板中的3個孔代表。一個平板使用MTS測定(CellTiter 96，Promega，Madison，WIUSA)用于產生細胞增殖數(shù)據(jù)。其它平板用于收集上清液樣品用于細胞因子分析。ELISAs(Pierce Endogen，Rockford，IL USA或R+D Systems，Minneapolis，MNUSA)用于測量培養(yǎng)物上清液中的hIFNγ、hTNF、和hIL-2的水平。來自增殖試驗和ELISAs的數(shù)值的標準誤小于10％，圖中已經被省略。觀察到培養(yǎng)物中IFNγ與陽性對照值有大的偏差，而IL-2和TNF的水平在陽性對照和處理組之間沒有顯著性差異。TNF數(shù)據(jù)已被省略。顯示這個代表性實驗的I1-2、IFNγ和細胞增殖的數(shù)據(jù)。
用小鼠抗人KIM-1 mAbs AUF1和AKG7處理MLR培養(yǎng)物顯著減少分泌到上清液中的IFNγ的水平(圖12A)。這種效果對IFNγ是特異性的，因為注意到分泌到上清液中的I1-2或TNF的水平沒有減少(圖12B)。這種效果不是由于在這些培養(yǎng)物中細胞數(shù)量減少，因為細胞增殖試驗顯示培養(yǎng)物中的活細胞的數(shù)量是相似的(圖13)。
實施例12小鼠炎癥性腸病(IBD)模型可溶型KIM-1-Ig融合蛋白在實驗小鼠的IBD模型中能影響癥狀的進程或嚴重程度。在這種模型中，使用DSS慢性刺激大腸(結腸)，導致產生炎癥。已知在小鼠模型和在病人中促炎介質如IFNγ、TNF、和I1-12對于IBD的產生和嚴重程度很重要(Egger等，2000，Digestion 62240-248；Monteleone等，2000，Ann.Med.32552-560；Bouma等，2003，Nat.Rev.Immunol.3521-533)。如上所述，MLR數(shù)據(jù)提示對KIM-1的調節(jié)可影響產生促炎介質如IFNγ。因此，在體內檢驗KIM-1-修飾劑。假設KIM-1-Ig融合蛋白通過干擾一種或多種配體與在細胞上所表達的KIM-1之間的相互作用起作用，所述細胞如活化的淋巴細胞或其它免疫細胞。
在小鼠中使用葡聚糖硫酸鈉(DSS)模型誘導IBD(Copper等，1993，Lab.Invest.69238-249)。提供溶于無菌蒸餾水的4.5％DSS(ICN Biomedicals，Aurora OH USA)溶液作為飲用水源。也對小鼠進行腹瀉程度評分(1軟便，2稀便，3明顯水便，4嚴重失禁)以及使用ColoScreen玻片(Helena Labs，Beaumont TX USA)對便中是否出現(xiàn)血評分(0無，1血)。少量，但可檢測到的血給予中間分0.5。在第0、2、和5天腹膜內給予小鼠200μgs KIM-1-Ig融合蛋白或多克隆hIgG對照(SandImmune，Sandoz，Geneva Switzerland)。在第8天，換掉DSS水，給予正常飲用水。繼續(xù)監(jiān)控體重和臨床評分直到第12天實驗結束。
在IBD誘導期間(第0、2、和5天)小鼠的治療對累積的體重丟失和疾病評分有顯著影響，直到并包括第8天。因此，小鼠被取消DSS水并回到正常飲用水，監(jiān)控它們的恢復。如體重丟失的程度(圖14)和它們的臨床評分(腹瀉和出血；圖15A)所示，在第0、2、和5天接受KIM-1-Ig融合蛋白的小鼠在第11天(進入恢復期的3天)一直較為健康。在KIM-1-Ig治療群體中極少的小鼠在便中出現(xiàn)血(圖15B)。
這些數(shù)據(jù)提示在體內KIM-I的調節(jié)在急性炎癥過程中有保護作用，所述急性炎癥如DSS對腸粘膜損傷后出現(xiàn)的炎癥。這些結果提示KIM-1拮抗劑將在其它急性或慢性炎癥背景中有效，例如，在類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬和胰腺炎中。
其它實施方案在下列權利要內。
權利要求
1.一種抑制在T細胞和參與哺乳動物免疫反應的第二細胞之間信號傳遞的方法，包括(a)鑒定從患免疫疾病或病癥的哺乳動物或準備用于組織移植的哺乳動物中選出的哺乳動物；和(b)向該哺乳動物施用從下組中選出的有效量的KIM-1拮抗劑(i)包括KIM-1Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(ii)抗KIM-1抗體；和(iii)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
2.權利要求1的方法，其中第二細胞是抗原呈遞細胞(APC)。
3.權利要求1的方法，其中T細胞是活化的T細胞。
4.權利要求1的方法，其中T細胞是輔助T細胞。
5.權利要求4的方法，其中輔助細胞T是Th2細胞。
6.權利要求1的方法，其中T細胞是移植的、供體T細胞。
7.權利要求1的方法，其中APC是選自單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞或B細胞。
8.權利要求1的方法，其中APC呈遞自身抗原。
9.權利要求1的方法，其中多肽進一步包括KTM-1粘蛋白區(qū)。
10.權利要求1的方法，其中多肽進一步包括異源部分。
11.權利要求10的方法，其中異源部分選自免疫球蛋白(Ig)部分、血清白蛋白部分、靶向部分、報告分子部分、和便于純化的部分。
12.權利要求11的方法，其中異源部分是Ig部分。
13.權利要求12的方法，其中Ig部分是Fc部分。
14.權利要求1的方法，其中所述多肽結合到聚合物上。
15.權利要求14的方法，其中聚合物選自聚亞烷基二醇、糖聚合物或多肽。
16.權利要求15的方法，其中聚合物是聚亞烷基二醇。
17.權利要求16的方法，其中聚亞烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
18.權利要求17的方法，其中聚合物的平均分子量是從2,000Da到30,000Da。
19.權利要求18的方法，其中聚合物的平均分子量是從5,000Da到20,000Da。
20.權利要求19的方法，其中聚合物的平均分子量是約10,000Da。
21.一種抑制哺乳動物中B細胞活化的方法，包括使B細胞與選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑接觸(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體，或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
22.權利要求21的方法，其中B細胞的活化是通過活化的T細胞介導。
23.權利要求22的方法，其中活化的T細胞是Th2細胞。
24.權利要求22的方法，其中活化的T細胞是移植的、供體T細胞。
25.一種抑制哺乳動物中產生抗一種或者多種抗原的抗體亞型的方法，包括施用選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包含括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
26.權利要求25的方法，其中抗體是IgG類。
27.權利要求26的方法，其中抗體是IgG1亞類。
28.權利要求27的方法，其中在哺乳動物的免疫系統(tǒng)首次識別所述一種或多種抗原前的30分鐘和30天之間向哺乳動物施用有效量的多肽。
29.權利要求28的方法，其中一種或多種抗原是同種抗原。
30.權利要求28的方法，其中一種或多種抗原是自身抗原。
31.權利要求28的方法，其中哺乳動物的免疫系統(tǒng)首先識別一種或多種抗原作為表位在自身免疫疾病病程中傳播過程的一部分。
32.一種在自身免疫性疾病中抑制表位傳播的方法，包括施用選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞漿區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
33.一種治療Th2細胞介導的疾病的方法，包括施用選自以下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
34.權利要求33的方法，其中Th2細胞介導的疾病選自重癥肌無力、自體免疫溶血性貧血、查加斯病、格雷夫斯病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、韋格納肉芽腫、結節(jié)性多動脈炎、急驟進展性新月體性腎小球腎炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)或系統(tǒng)性狼瘡性腎炎(SLE)。
35.一種抑制GVHD的方法，包括施用選自如下的有效量的KIM-1拮抗劑(a)包括KIM-1Ig區(qū)，缺乏跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)的多肽；(b)抗KIM-1抗體；或(c)抗KIM-1抗體的抗原結合片段。
36.一種多肽，包括KIM-1Ig區(qū)和Fc部分，缺少跨膜區(qū)和KIM-1胞質區(qū)。
37.一種在哺乳動物中抑制淋巴細胞分泌IFN-γ的方法，包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
38.一種治療哺乳動物炎性疾病或病癥的方法，包括向哺乳動物施用有效量的KIM-1拮抗劑。
39.權利要求38的方法，其中炎性疾病或病癥是炎癥性腸病。
40.權利要求38的方法，其中炎性疾病或病癥是急性或慢性炎癥。
41.權利要求4的方法，其中輔助T細胞是Thl細胞。
全文摘要
公開了使用KIM－1拮抗劑抑制T細胞和第二細胞，例如抗原呈遞細胞之間信號傳遞。這種抑制有益于治療疾病，包括各種自身免疫性疾病和移植物抗宿主病。也公開了使用KIM－1拮抗劑抑制哺乳動物中淋巴細胞或其它免疫細胞分泌IFN－γ。對IFN－γ的抑制有益于治療炎性疾病或病癥，例如，炎癥性腸病。
文檔編號A61K47/48GK1835769SQ200380110061
公開日2006年9月20日 申請日期2003年12月29日 優(yōu)先權日2002年12月30日
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