一株產(chǎn)揮發(fā)性抑菌氣體的拮抗菌的篩選、鑒定及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一株產(chǎn)揮發(fā)性抑菌氣體的拮抗菌株12a及其在防治果蔬病害中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的拮抗菌株12a為死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)，保藏號為CGMCC No.12179。本發(fā)明的拮抗菌株12a是在未施用化肥農(nóng)藥的肥城桃園中采集桃樹根際土壤分離獲得的，其發(fā)酵液中產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌氣體對桃褐腐病(Monilinia fructicola)具有強(qiáng)拮抗作用，同時(shí)對鏈格孢菌(Alternaria mali)引起的蘋果褐斑病、由長喙殼菌(Ceratocystis fimbriata Ellis.Et Halsted)引起的甘薯黑斑病、由青霉菌(Penicillium italicum Wehmer)引起的柑橘青霉病和由細(xì)交鏈格孢(Alternaria alternata)引起的冬棗黑斑病也有明顯的抑制作用，可以有效防治多種果蔬病害，是一種生防效果好、無污染、防治范圍廣、安全生態(tài)的生物防治潛力菌株，有廣闊的市場應(yīng)用前景。CGMCC No.1217920160304
【專利說明】
一株產(chǎn)揮發(fā)性抑菌氣體的拮抗菌的篩選、鑒定及應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物和生物防治領(lǐng)域中的一種拮抗菌的篩選、鑒定和應(yīng)用，特別是 涉及產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌氣體的菌液熏蒸在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 果蔬采后病害導(dǎo)致的巨大損失已成為全球性的問題。目前，控制果蔬采后病害的 主要手段是使用化學(xué)殺菌劑，雖然取得較好的防治效果，但是長期使用化學(xué)殺菌劑，使病菌 產(chǎn)生了抗藥性，降低了藥劑的防病效果，最終導(dǎo)致化學(xué)殺菌劑的使用劑量及其化學(xué)殘留量 大大加重，對人類的健康威脅也加大。因此，迫切需要尋求一些新的、安全高效的防腐技術(shù)， 來逐步減少化學(xué)殺菌劑在采后果蔬上的使用。
[0003] 借鑒采前作物病害生物防治的思路，人們提出了果蔬采后病害生物防治的設(shè)想。 生物防治具有不污染環(huán)境、無農(nóng)藥殘毒、不產(chǎn)生抗藥性、處理費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的 廣泛關(guān)注。利用拮抗菌控制果蔬采后病害的研究工作始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過10多年的研 究已從實(shí)驗(yàn)室走向商業(yè)化應(yīng)用，許多研究都證明利用拮抗微生物來控制病害是一項(xiàng)具有潛 力的新興技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)通過研究拮抗菌對采后果蔬病原菌和病害的抑制作用，為實(shí)現(xiàn)安全 無毒的果蔬采后保鮮提供新方法。
[0004] 從土壤中分離篩選出拮抗菌株通過菌液中產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌氣體熏蒸的方法來 有效防治果蔬采后病害的技術(shù)并不多見，該方法簡便高效，可減少采后病害帶來的巨大損 失，有利于在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株能夠產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌氣體的拮抗菌株12a，經(jīng)16S rDNA 序列比對鑒定為死谷芽孢桿菌(Bacillus vailismortis)，該菌株已于2016年03月04日在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行了保存登記，保存地址為北京市北辰 西路1號院3號，保藏號為CGMCC No. 12179,建議分類命名為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis)。用該菌株體外產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體控制多種常見的果蔬采后病害，具有安全 高效、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007] 本發(fā)明的拮抗菌株12a的分離篩選方法為：
[0008] 1、在未施用化肥農(nóng)藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，做好一系列 的土壤稀釋液10-\ 10-2、10-3、10-4，用移液槍分別吸取10-2、10- 3、10-4土壤稀釋液0. lmL加到 NA培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器涂勻，標(biāo)明編號，放置一小時(shí)后將培養(yǎng)皿反轉(zhuǎn)，于37°C中培 養(yǎng)。
[0009] 2、從培養(yǎng)的第二天起，根據(jù)菌落形態(tài)等特點(diǎn)挑選細(xì)菌單菌落，分別移接到NA培養(yǎng) 基上，培養(yǎng)48h后用于后續(xù)試驗(yàn)。經(jīng)純化的菌株于NA斜面培養(yǎng)基上，4°C保存。
[0010] 3、采用平板對扣法篩選拮抗菌。在PDA平板中央接種桃褐腐菌菌餅，在NA平板中央 接種分離的細(xì)菌菌餅，將接有菌的培養(yǎng)皿去蓋、對扣(接有細(xì)菌的放在下方，接有桃褐腐菌 的放在上方）、密封，每個(gè)處理3皿。室溫下培養(yǎng)96h，以不接種細(xì)菌的平板作對照，測定其抑 菌率。篩選出對桃褐腐菌具有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌株12a。
[0011] 本發(fā)明的拮抗菌株12a在防治多種果蔬采后病害上的應(yīng)用的步驟包括：
[0012] 用振蕩培養(yǎng)48h的1000mL拮抗菌菌液熏蒸果實(shí)20~30min，將熏蒸過的果實(shí)取出室 溫放置，每果刺1個(gè)3mmX 3mmX 3mm的傷口，再分別接種1 X 104cfu/mL的相應(yīng)病原菌的孢子 懸浮液20yL，之后在20 ± 1°C貯藏觀察。
[0013] 上述的防治果蔬采后病害的應(yīng)用中，所述果實(shí)為肥城白里桃、元帥蘋果、砂糖橘、 甘薯蘇薯8號、沾化冬棗。
[0014] 上述的防治果蔬采后病害的應(yīng)用中，所述果實(shí)為處于生理成熟期，無機(jī)械傷害，無 病蟲害，大小均一的果實(shí)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 選用拮抗菌菌液產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌氣體熏蒸果實(shí)，此法操作簡單、安全性高、對果 疏無殘留毒性，具有很尚的應(yīng)用價(jià)值。
[0017] 在處理和貯藏中不使用任何有毒試劑，能高效防治多種果實(shí)采后病害，具有廣闊 的市場前景。
[0018] 提供一種新型、安全、高效的拮抗菌株，可用于肥城白里桃、砂糖橘、甘薯蘇薯8號 和沾化冬棗等多種果實(shí)采后病害的防治。 (四）
【附圖說明】
[0019] 圖1是基于菌株12a的16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0020]圖2為肥城白里桃未經(jīng)拮抗菌液熏蒸處理和經(jīng)拮抗菌菌液熏蒸處理后，貯藏第4天 的效果圖片。
[0021]圖3為砂糖橘未經(jīng)拮抗菌菌液熏蒸處理和經(jīng)拮抗菌菌液熏蒸處理后，貯藏第5天的 效果圖片。
[0022]圖4為沾化冬棗未經(jīng)拮抗菌菌液熏蒸處理和經(jīng)拮抗菌菌液熏蒸處理后，貯藏第5天 的效果圖片。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖表和【具體實(shí)施方式】來對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技 術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1:拮抗菌株12a的篩選
[0025] 在未施用化肥農(nóng)藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，做好1(^、10一2、 10一3和10- 4的土壤稀釋液，用移液槍分別吸取10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液O.lmL加到NA培 養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器涂勻，標(biāo)明編號，放置一小時(shí)后將培養(yǎng)皿反轉(zhuǎn)，于37°C中培養(yǎng)。從 培養(yǎng)的第二天起，根據(jù)菌落形態(tài)等特點(diǎn)挑選細(xì)菌單菌落，分別移接到NA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h 后用于后續(xù)試驗(yàn)。經(jīng)純化的菌株于ΝΑ斜面培養(yǎng)基上，4°C保存。
[0026] 采用平板對扣法篩選拮抗菌。在PDA平板中央接種桃褐腐菌菌餅，在NA平板中央接 種分離的細(xì)菌菌餅，將接有菌的培養(yǎng)皿去蓋、對扣(接有細(xì)菌的放在下方，接有桃褐腐菌的 放在上方）、密封，每個(gè)處理3皿。室溫下培養(yǎng)96h，以不接種細(xì)菌的平板作對照，測定其抑菌 率。其中，抑菌率（％ )=(對照菌落直徑-對峙菌落直徑)/對照菌落直徑X 100。結(jié)果表明，拮 抗菌12a對桃褐腐菌的的抑制效果最明顯，抑菌率可達(dá)80.23%。
[0027]經(jīng)過菌種鑒定后，對16S rDNA序列在ncbi核糖體數(shù)據(jù)庫上比對，選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn) 近不同的16S rDNA序列做系統(tǒng)發(fā)育樹，12a被鑒定為死谷芽孢桿菌，與Bacillus vallismortis NBRC 101236T(AB681417)有最高的同源性，同源性達(dá)99%以上。該菌株已于 2016年03月04日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行了保存登記，建議 分類命名為死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)，保存地址為北京市北辰西路1號院3 號。
[0028]實(shí)施例2:在防治桃褐腐病上的應(yīng)用
[0029]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液（對照下層無菌液），上層放置肥城白里桃，用凡士林密封罐蓋，熏蒸 20min后將果實(shí)取出。為使染菌量均一，每果刺1個(gè)3mmX3mmX3mm的傷口，再分別接種IX 104cfu/mL的桃褐腐菌的孢子懸浮液20yL，將上述處理的果實(shí)于20土 1°C保濕貯藏，每隔24h 測量病斑直徑，計(jì)算抑菌率，詳情見表1。每次每個(gè)處理20個(gè)果實(shí)，該試驗(yàn)重復(fù)三次。
[0030] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X100%
[0031] 實(shí)施例3:在防治蘋果黑斑病上的應(yīng)用
[0032]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置元帥蘋果，用凡士林密封罐蓋，熏蒸20min 后將果實(shí)取出。為使染菌量均一，每果刺1個(gè)3mm X 3mm X 3mm的傷口，再分別接種1 X 104cfu/ mL的蘋果鏈格孢菌的孢子懸浮液20yL，將上述處理的果實(shí)于20土 1°C保濕貯藏，每隔24h測 量病斑直徑，計(jì)算抑菌率，詳情見表1。每次每個(gè)處理20個(gè)果實(shí)，該試驗(yàn)重復(fù)三次。
[0033] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0034]實(shí)施例4:在防治柑橘青霉病上的應(yīng)用
[0035]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置砂糖橘，用凡士林密封罐蓋，熏蒸20min后 將果實(shí)取出。為使染菌量均一，每果刺1個(gè)3mmX3mmX3mm的傷口，再分別接種lX10 4cfu/mL 的柑橘青綠霉的孢子懸浮液20yL，將上述處理的果實(shí)于20±1°C保濕貯藏，每隔24h測量病 斑直徑，計(jì)算抑菌率，詳情見表1。每次每個(gè)處理8個(gè)果實(shí)，該試驗(yàn)重復(fù)三次。
[0036] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0037]實(shí)施例5:在防治甘薯黑斑病上的應(yīng)用
[0038]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置甘薯，用凡士林密封罐蓋，熏蒸30min后將 果實(shí)取出。每果刺3個(gè)3mmX 3mmX 3mm的傷口，再分別接種1 X 104cfu/mL的長卩彖殼菌的孢子 懸浮液20yL，將上述處理的果實(shí)于20土 1°C保濕貯藏，每隔24h測量病斑直徑，計(jì)算抑菌率， 詳情見表1。每次每個(gè)處理8個(gè)果實(shí)，該試驗(yàn)重復(fù)三次。
[0039] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0040]實(shí)施例6:在防治采后沾化冬棗褐斑病上的應(yīng)用
[0041 ]將保存的拮抗菌12a接種到lOOOmL NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置沾化冬棗，用凡士林密封罐蓋，熏蒸20min 后將果實(shí)取出。將上述處理的果實(shí)于20±1°C保濕貯藏，每天觀察一次，計(jì)算自然發(fā)病率，詳 情見表1。每次每個(gè)處理40個(gè)果實(shí)，該試驗(yàn)重復(fù)三次。
[0042] 表1拮抗菌12a對多種果蔬采后病害的控制效果
[0043]
[0044] 注:每一列的不同字母(a，b)表示同一種果蔬處理和對照間在P〈0.05水平上有顯 著性差異。
[0045] 由表1可見，未經(jīng)拮抗菌12a菌液熏蒸的肥城白里桃、元帥蘋果、砂糖橘、甘薯蘇薯8 號和沾化冬棗在第2天發(fā)病率分別達(dá)到37.5%、10%、12.5%、20%和32.5%，而經(jīng)菌液熏 蒸處理的果實(shí)第3天才開始發(fā)病，而且發(fā)病率和病斑直徑顯著小于對照處理，有較高的抑菌 率，說明拮抗菌12a菌液熏蒸可以抑制桃褐腐病、砂糖橘青霉病、甘薯黑斑病和冬棗褐斑病 的發(fā)病率，抑制病斑擴(kuò)展，可以有效延緩采后病害的發(fā)生，減輕采后病害的侵染情況。
[0046] 綜上所述，本發(fā)明提供的可產(chǎn)生揮發(fā)性抑制氣體的拮抗菌對肥城桃褐腐病、柑橘 青綠霉病、甘薯黑斑病、沾化冬棗的采后病害均有較強(qiáng)的拮抗作用，可有效控制多種果實(shí)的 采后病害，在該領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株產(chǎn)揮發(fā)性抑菌氣體的拮抗菌株12a，經(jīng)16S rDNA鑒定為死谷芽孢桿菌(Bacillus vailismortis)。該菌株于2016年3月4日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌 種保藏中心進(jìn)行了登記和檢測，保藏號為:CGMCC No. 12179。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述拮抗菌株12a的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟:拮抗菌株 的分離純化和篩選。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述拮抗菌株12a的篩選方法，其特征在于，所述的拮抗菌的分離純 化包括:在未施用化肥農(nóng)藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，用移液槍分別吸 取不同濃度的土壤稀釋液加到NA培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器涂勻，標(biāo)明編號，放置一小時(shí) 后將培養(yǎng)皿反轉(zhuǎn)，于37°C中培養(yǎng)。從培養(yǎng)的第二天起，根據(jù)菌落形態(tài)等特點(diǎn)挑選細(xì)菌單菌 落，分別移接到NA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h后用于后續(xù)試驗(yàn)。經(jīng)純化的菌株于NA斜面培養(yǎng)基上，4 °C保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述拮抗菌株12a的篩選方法，其特征在于，所述的拮抗菌的篩選包 括:采用平板對扣的方法篩選拮抗菌。在I 3DA平板中央接種桃褐腐菌菌餅，在NA平板中央接 種分離的細(xì)菌菌餅，將接有菌的培養(yǎng)皿去蓋、對扣(接有細(xì)菌的放在下方，接有桃褐腐菌的 放在上方）、密封，每個(gè)處理6皿。室溫下培養(yǎng)96h，以不接種細(xì)菌的平板作對照，測定其抑菌 率。篩選出對桃褐腐菌具有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌株12a。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用，其特征在于，步 驟如下：用振蕩培養(yǎng)48h的1000 mL菌液產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體熏蒸果實(shí)20~30min后，進(jìn)行處理， 然后貯藏。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用，其特征在于，所述 處理步驟為將熏蒸過的果實(shí)取出室溫放置，每果刺1個(gè)3mmX3mmX3mm的傷口，再分別接種1 X IO5Cfu/mL的相應(yīng)病原菌的孢子懸浮液20yL。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用，其特征在于，所 述貯藏溫度為20±1°C。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用，其特征在于，所 述果蔬為肥城白里桃、元帥蘋果、砂糖橘、甘薯蘇薯8號和沾化冬棗。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用，其特征在于，所 述果蔬為處于生理成熟期，無機(jī)械傷害，無病蟲害，大小均一的果蔬。
【文檔編號】C12N1/02GK105907669SQ201610270739
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】石晶盈, 殷曉慧, 王慶國, 張暢
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)