本發(fā)明涉及一種用于調(diào)節(jié)受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞數(shù)量水平的方法。本發(fā)明還涉及一種用于治療受試者中t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病的方法。本發(fā)明還涉及pd-1h激動(dòng)劑或拮抗劑在制備用于調(diào)節(jié)受試者的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞數(shù)量水平的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及pd-1h激動(dòng)劑或拮抗劑在制備用于治療受試者中t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)是cd4⁺t細(xì)胞的一個(gè)亞群，其具有從維持自身耐受性到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)程度的廣泛功能。treg不是終末分化的細(xì)胞，并且可以在炎癥期間被轉(zhuǎn)化為其他cd4⁺t細(xì)胞亞群(包括th1和th17)。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子foxp3在功能性定向調(diào)節(jié)性t細(xì)胞譜系的建立中起重要作用。foxp3⁺treg細(xì)胞可以通過tgf-β分為胸腺衍生的天然treg細(xì)胞(ntreg)和誘導(dǎo)型treg細(xì)胞(itreg)，tgf-β調(diào)節(jié)itreg細(xì)胞的分化和胸腺衍生的ntreg穩(wěn)定。在外周，itreg細(xì)胞的分化主要是由微環(huán)境驅(qū)動(dòng)的。例如，炎性細(xì)胞因子ifn-γ和il-4抑制tgf-β誘導(dǎo)的itreg細(xì)胞，而il-6在tgf-β存在下引導(dǎo)th17細(xì)胞分化。因此，treg細(xì)胞的可塑性可決定正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)的方向并控制炎癥，如在幾種小鼠模型(包括結(jié)腸炎模型、急性移植物抗宿主病(gvhd)模型和哮喘模型)中所顯示的。

pd-1h(也稱為gi24、dies1、b7-h5、vista和dd1)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族分子，其還在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的分化以及細(xì)胞凋亡中扮演多種作用。pd-1h在造血細(xì)胞(如t細(xì)胞、nk細(xì)胞、單核細(xì)胞、nk細(xì)胞和dc)上組成型表達(dá)(b細(xì)胞除外)。不同于ctla-4敲除(ko)小鼠(其快速發(fā)展淋巴增殖性表型和致命的全身性自身免疫性疾病)，pd-1h缺乏癥具有更加溫和的表型：pd-1hko幼鼠具有正常數(shù)量的t細(xì)胞、nk細(xì)胞、b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，而更老的小鼠經(jīng)歷自發(fā)的t細(xì)胞活化，當(dāng)小鼠老齡化時(shí)，觀察到記憶細(xì)胞水平增加和脾臟增大。此外，如加速的cona誘導(dǎo)的急性肝炎和gvhd中所示，pd-1h缺陷型小鼠對(duì)急性炎癥和對(duì)抗原的免疫應(yīng)答更敏感。pd-1h已在幾個(gè)體外和體內(nèi)研究中被證明分別作為配體或受體在專職抗原呈遞細(xì)胞(apc)和t細(xì)胞中起作用。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，pd-1h激動(dòng)型單克隆抗體已被證明是各種類型的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫抑制劑，而拮抗性mab顯示為免疫刺激劑。雖然pd-1h的反受體尚未被鑒定，但最近的一項(xiàng)研究表明，pd-1h/dd1α可以通過血友病性相互作用(hemophilicinteraction)介導(dǎo)其作用。

早期研究表明，pd-1h在treg上組成型表達(dá)，其后幾項(xiàng)研究表明其在treg功能調(diào)節(jié)中的作用。pd-1hig融合蛋白在體外能夠在tgf-β存在下促進(jìn)小鼠和人cd4⁺t細(xì)胞中的foxp3⁺itreg的誘導(dǎo)。在b16-ova腫瘤模型中，pd-1hmab的給藥降低了腫瘤抗原特異性itreg細(xì)胞的分化。該結(jié)果被解釋為通過該mab阻斷pd-1h與其推定的反受體之間的相互作用。然而，一個(gè)不同的pd-1h激動(dòng)型mab(mh5a)被證明可以在體外促進(jìn)tgf-β誘導(dǎo)的treg細(xì)胞，并且輸注mh5a可抑制小鼠模型中g(shù)vhd的進(jìn)展，并且伴隨著itreg的擴(kuò)增。雖然這些數(shù)據(jù)表明pd-1h在treg誘導(dǎo)和功能中的可能作用，但尚未闡明pd-1h是否對(duì)treg細(xì)胞具有直接作用。更重要的是，pd-1h對(duì)treg細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的機(jī)制尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)小鼠中pd-1h的遺傳消融阻斷了初始t細(xì)胞向foxp3⁺誘導(dǎo)型treg細(xì)胞(itreg)的分化，淋巴器官中itreg明顯減少。pd-1h的這種效應(yīng)對(duì)于itreg是高度特異性的，因?yàn)樵谀c相關(guān)組織中的天然產(chǎn)生的itreg和tgf-β體外誘導(dǎo)的itreg都降低，而天然treg(ntreg)的生成保持正常。然而，itreg和ntreg的抑制功能不受pd-1h缺失的影響。除了生成量降低，pd-1h缺陷型itreg還可以在炎癥環(huán)境中迅速轉(zhuǎn)化為cd4⁺t輔助細(xì)胞1或t輔助細(xì)胞17。這些結(jié)果表明，通過促進(jìn)其分化并防止其轉(zhuǎn)化為其他cd4⁺t細(xì)胞亞群，pd-1h可維持itreg細(xì)胞數(shù)量水平。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)操縱treg來控制炎癥具有重要意義。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的細(xì)胞水平方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑在制備用于調(diào)節(jié)受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的細(xì)胞水平的藥物組合物中的用途。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病的方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑在制備用于治療受試者中的t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病的藥物組合物中的用途。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，pd-1h激動(dòng)劑的施用導(dǎo)致受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞水平升高。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，pd-1h拮抗劑的施用導(dǎo)致受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的水平降低。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述施用是靜脈內(nèi)給藥。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，pd-1h激動(dòng)劑是抗pd-1h的激動(dòng)型單克隆抗體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，pd-1h拮抗劑選自靶向pd-1h編碼多核苷酸的dsrna、sirna和shrna的反義寡聚體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述受試者是人。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病包括炎癥、自身免疫疾病和癌癥。

本發(fā)明證明pd-1h在炎性環(huán)境中抑制itreg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為th1和th17細(xì)胞，至少部分是由于其在維持foxp3表達(dá)和itreg表型中的作用導(dǎo)致的。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)調(diào)節(jié)treg生長和功能具有重要意義。同時(shí)，如先前所示，pd-1h抑制初始t細(xì)胞的激活以限制t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，它促進(jìn)免疫應(yīng)答期間itreg的生長和轉(zhuǎn)化。除了調(diào)節(jié)早期t細(xì)胞活化外，pd-1h似乎通過調(diào)節(jié)treg水平參與t細(xì)胞耐受性的調(diào)節(jié)。因此，pd-1h途徑可能作為一種新的靶標(biāo)而被用來在炎癥、自身免疫疾病和癌癥中控制和操縱的t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。

附圖說明

圖1.pd-1h在foxp3⁺itreg細(xì)胞的新生成中的作用。(a)從wtot-ii或pd-1hkoot-ii小鼠純化的初始t細(xì)胞首先用5μmcfse標(biāo)記，隨后以2×10⁶/小鼠i.v.轉(zhuǎn)移至b6小鼠。24小時(shí)后，在飲用水中喂食1.5％ova，喂養(yǎng)5天。通過流式細(xì)胞儀在代表性小鼠中分析門控cd4⁺cfse⁺vβ5.1/5.2tcr⁺上的foxp3頻率。(b，c)實(shí)驗(yàn)概要，每個(gè)符號(hào)代表單個(gè)小鼠(n＝5)。所顯示的數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖2.pd-1h對(duì)itreg的轉(zhuǎn)化和功能的影響。(a)腸道相關(guān)淋巴器官中itreg的天然發(fā)育中的pd-1h缺失。通過在流式細(xì)胞術(shù)中用特異性抗體來表征細(xì)胞表面cd25和細(xì)胞內(nèi)foxp3表達(dá)，從而測定腸系膜淋巴結(jié)(mln)、payer氏集合淋巴結(jié)(pp)和固有層(lp)中cd25⁺foxp3⁺treg細(xì)胞的百分比。pd-1hko小鼠及其同窩wt仔鼠(每組n＝5)用于分析。左圖表示來自每組的配對(duì)單個(gè)小鼠，右圖是一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的總結(jié)(每組中n＝5)。(b)腸道相關(guān)淋巴器官中cd25⁺foxp3⁺treg的絕對(duì)數(shù)。(c)itreg的體外誘導(dǎo)。在存在或不存在5ng/mltgf-β的情況下，用抗-cd3/cd28刺激來自wt和pd-1hko小鼠的cd4⁺cd25^-cd62l^hi初始t細(xì)胞3-5天。通過細(xì)胞內(nèi)染色測定cd25⁺foxp3⁺細(xì)胞的頻率。(d，e)itreg抑制功能的體外評(píng)價(jià)。如上所述，誘導(dǎo)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始cd4⁺t細(xì)胞成為foxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞。從b6小鼠中純化初始cd8⁺t細(xì)胞或cd4⁺t細(xì)胞，用cfse標(biāo)記并與分選的gfp⁺itreg細(xì)胞在存在抗cd3的情況下以指定的treg/teff細(xì)胞比率共培養(yǎng)。通過與沒有添加itreg細(xì)胞的孔進(jìn)行比較來確定包含itreg細(xì)胞時(shí)csfe的減少量。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。僅teff：沒有抗cd3刺激的t細(xì)胞；對(duì)照：具有抗cd3的teff細(xì)胞，不含有itreg細(xì)胞。(f)通過在流式細(xì)胞儀上門控cd4⁺foxp3(gfp⁺)來測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達(dá)。

圖3.細(xì)胞因子環(huán)境對(duì)pd-1h介導(dǎo)itreg細(xì)胞轉(zhuǎn)化缺陷的影響。(a)在沒有pd-1h的情況下誘導(dǎo)itreg細(xì)胞的細(xì)胞因子譜。如上所述，將初始t細(xì)胞在體外誘導(dǎo)為itreg，并在第4天收集培養(yǎng)上清液，通過小鼠th1/th2/th17cba試劑盒測定細(xì)胞因子水平。(b)在培養(yǎng)開始時(shí)向培養(yǎng)物中加入ifn-γ和il4的中和mab以從wt或pd-1hko初始t細(xì)胞體外誘導(dǎo)itreg細(xì)胞。培養(yǎng)3-5天后評(píng)價(jià)cd25⁺foxp3⁺細(xì)胞。呈現(xiàn)的結(jié)果來自一對(duì)小鼠。(c)來自(b)的數(shù)據(jù)的柱狀圖，數(shù)據(jù)來自一組5只小鼠。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖4.pd-1h對(duì)eae模型中itreg細(xì)胞穩(wěn)定性的影響。(a)來自wt或ko的cd45.2⁺foxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞在體外誘導(dǎo)后通過細(xì)胞分選獲得。將1×10⁶個(gè)wt或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞i.v.轉(zhuǎn)移到cd45.1b6小鼠(n＝4或5每組)中，再用mog35-55肽免疫。對(duì)照小鼠用pbs接種。監(jiān)測eae疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度作為臨床評(píng)分(見方法部分)。*p<0.05，(雙向abova檢驗(yàn))。顯示的數(shù)據(jù)代表3次具有相似的結(jié)果和疾病表型的實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。(b，c)在eae誘導(dǎo)的第13天，門控脾臟和引流ln(dln)細(xì)胞中的cd45.2⁺cd4⁺，并分析foxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞。(d)計(jì)數(shù)來自eae小鼠的脾臟和dln中的cd45.2⁺foxp3⁺的絕對(duì)數(shù)量。(e)使用pma/離子霉素/bfa離體將第13天的eae小鼠脾臟和dln細(xì)胞再次刺激4小時(shí)。門控cd4⁺cd45.2⁺gfp⁺細(xì)胞，用細(xì)胞內(nèi)染色分析ifn-γ⁺或il-17⁺表達(dá)。顯示的數(shù)據(jù)來自代表性的一對(duì)小鼠。(f)在4只或5只小鼠組中顯示的(e)中的數(shù)據(jù)的圖表。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖5.pd-1h促進(jìn)itreg細(xì)胞的定型。(a)在第13天分析來自eae模型中各組的所轉(zhuǎn)移的itreg細(xì)胞(cd45.2⁺cd4⁺門控)。用具有特異性mab的pstat3或pstat5對(duì)脾臟細(xì)胞和dln細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。(b)與a相同，但轉(zhuǎn)移的itreg細(xì)胞上stat3和stat5的磷酸化以繪圖值顯示。(c)通過亞硫酸氫鹽測序確定cns2區(qū)域的dna甲基化狀態(tài)。每條線代表一個(gè)克隆(一個(gè)dna鏈)；空心圓，非甲基化引物；實(shí)心圓，甲基化引物。

圖6.pd-1h影響itreg細(xì)胞的從頭分化。(a)將wt和koot-iit細(xì)胞(cd25^-t細(xì)胞)分別轉(zhuǎn)移到宿主小鼠中。轉(zhuǎn)移的ot-iit細(xì)胞在轉(zhuǎn)移前用cfse標(biāo)記。該圖顯示了cfse的稀釋和foxp3誘導(dǎo)。(b)wt(cd45.1/cd45.2)初始o(jì)t-iit細(xì)胞和ko(cd45.2)ot-ii初始t細(xì)胞以1:1的比例混合并共轉(zhuǎn)移到宿主小鼠(cd45.1)。用1.5％ova口服飼養(yǎng)宿主小鼠后，分析mln和pp，并通過細(xì)胞內(nèi)染色測定foxp3的頻率。(c)計(jì)數(shù)所示器官中的foxp3⁺t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。

圖7.pd-1h調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞環(huán)境中itreg細(xì)胞的分化。(a)將來自wt小鼠(cd45.2)和pd-1hko小鼠(cd45.1)的初始cd4⁺cd62l^hit細(xì)胞以1:1的比例混合，將總共2百萬個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到rag1ko小鼠(n＝4)并在20天后測定foxp3上調(diào)。該圖顯示轉(zhuǎn)移前后wt和kocd4⁺t細(xì)胞比例的變化。通過細(xì)胞內(nèi)染色測定foxp3+細(xì)胞的頻率。(b)計(jì)數(shù)來自rag1ko小鼠的所示器官中的cd25⁺foxp3⁺t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。(c)分析轉(zhuǎn)移的初始cd4⁺t細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在pma/離子霉素/bfa存在下，將來自所示器官的細(xì)胞體外活化4小時(shí)，然后通過細(xì)胞內(nèi)染色進(jìn)行分析。所顯示的數(shù)據(jù)代表2次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

圖8.pd-1h對(duì)ntreg細(xì)胞的產(chǎn)生和抑制功能起著重要作用。(a)使用foxp3的細(xì)胞內(nèi)染色和cd25的細(xì)胞表面染色，通過流式細(xì)胞術(shù)測定脾臟和ln中cd25⁺foxp3⁺ntreg的百分比。使用來自wt和pd-1hko小鼠的六周齡同窩出生小鼠(n＝5)。計(jì)數(shù)脾臟和ln中foxp3⁺cd25⁺t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。(b)通過流式細(xì)胞儀上門控cd4⁺foxp3(gfp⁺)測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的ntreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達(dá)。(c)對(duì)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的foxp3(gfp⁺)ntreg進(jìn)行分選，并在存在絲裂霉素c處理的脾細(xì)胞及抗cd3抗體的情況下以不同的treg/teff比率與cfse標(biāo)記的cd8⁺teff細(xì)胞共培養(yǎng)3天。通過流式細(xì)胞術(shù)測定cfse稀釋度。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖9.pd-1h決定了骨髓嵌合小鼠中treg細(xì)胞的水平。(a)將來自cd45.1wt小鼠和cd45.2小鼠的總數(shù)為1000萬各混合骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)移到亞致死性輻射處理的小鼠(cd45.1/cd45.2)中。重構(gòu)后10周分析小鼠。顯示wt和kot細(xì)胞的門控策略。(b)通過細(xì)胞內(nèi)染色測定所示器官中的foxp3頻率。(c)脾臟中的foxp3頻率，并顯示foxp3⁺細(xì)胞和foxp3^-細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。所顯示的數(shù)據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的其中一個(gè)。

圖10.pd-1h激動(dòng)型mab輕微促進(jìn)itreg細(xì)胞的分化。(a)從wtfoxp3(gfp)小鼠中分離初始t細(xì)胞，隨后在tgf-β存在下用對(duì)照小鼠igg或mam82用預(yù)包被的抗cd3刺激4天。通過流式細(xì)胞術(shù)分析cd25⁺foxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞。(b)顯示不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)的itreg細(xì)胞。顯示的結(jié)果來自3個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖11.在eae模型中用wt或pd-1hkoitreg細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，受試者中cd4⁺th1和th17細(xì)胞的分析。(a)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始t細(xì)胞如上所述在體外分化成itreg細(xì)胞。將ifn-γ和il-4中和mab加入到培養(yǎng)物中以促進(jìn)itreg的產(chǎn)生。分離foxp3(gfp⁺)細(xì)胞，通過facs評(píng)估純度。(b，c)在轉(zhuǎn)移itreg細(xì)胞的eae模型中的受試者cd45.1⁺cd4⁺t細(xì)胞通過pma/離子霉素/bfa離體再刺激。通過門控cd45.2^-cd4⁺t細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)染色測定受試者cd4⁺t細(xì)胞的ifn-γ⁺或il-17⁺細(xì)胞。來自代表性的一對(duì)小鼠的數(shù)據(jù)顯示在(b)中，顯示的數(shù)據(jù)的曲線圖來自4或5只小鼠的組(c)。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖12.pd-1h缺乏的itreg細(xì)胞不能保留其抑制功能和foxp3表達(dá)。(a)單獨(dú)或與來自wt或ko小鼠的cd45.2⁺foxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移cd25^-cd45rb^hicd45.1t細(xì)胞后不同時(shí)間的rag1ko宿主小鼠的重量(每組n＝5)(見方法)。轉(zhuǎn)移后受體小鼠的體重變化被標(biāo)準(zhǔn)化至其在轉(zhuǎn)移前的初始體重。*p<0.05，(雙向abova檢驗(yàn))。(b)誘導(dǎo)結(jié)腸炎后(第10周，n＝5)，rag1ko宿主小鼠的結(jié)腸組織h&e染色(標(biāo)尺：100μm)和臨床評(píng)分(c)。(d，e，f)分析來自rag1ko宿主小鼠的脾臟和dln中cd45.2treg細(xì)胞中foxp3⁺t細(xì)胞的百分比，并根據(jù)比例和活細(xì)胞計(jì)數(shù)foxp3⁺cd45.2t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。(g)流式細(xì)胞術(shù)分析來自rag1ko小鼠的所示器官中cd45.2treg細(xì)胞中ifn-γ和il-17的表達(dá)。用pma/離子霉素/bfa在體外刺激脾細(xì)胞和dln細(xì)胞4小時(shí)，并染色以測定細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子。(h)(g)中的數(shù)據(jù)總結(jié)，每個(gè)點(diǎn)代表一只小鼠。(i)流式細(xì)胞術(shù)分析來自rag1ko宿主小鼠的所示器官中的teff細(xì)胞(cd45.1)中ifn-γ和il-17的表達(dá)。用pma/離子霉素/bfa在體外刺激脾細(xì)胞和dln細(xì)胞4小時(shí)，并染色以測定細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子。顯示的數(shù)據(jù)代表2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的其中一個(gè)。

具體實(shí)施方式

定義

在本發(fā)明中，術(shù)語“治療”是指療法上的以及預(yù)防性的措施，其阻止或減緩對(duì)象發(fā)生不期望的生理學(xué)改變或病癥，例如哮喘發(fā)作或癌癥進(jìn)展。有利或期望的臨床效果包括，但不限于，癥狀的緩解、疾病程度的降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定化(即不惡化)、疾病進(jìn)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的減輕或緩和以及疾病的部分或全部治愈，不論上述效果是否可檢測到?！爸委煛币部芍概c不治療相比生存期延長。需要治療的對(duì)象包括已患有該疾病或病癥的對(duì)象，以及有可能患有該疾病或病癥的對(duì)象，或要預(yù)防該疾病或病癥的對(duì)象。

“對(duì)象”或“患者”、“個(gè)體”是指任何期望進(jìn)行診斷、預(yù)后或治療的對(duì)象，特別是哺乳動(dòng)物對(duì)象。哺乳動(dòng)物包括人、家畜、農(nóng)畜、動(dòng)物園動(dòng)物、競技動(dòng)物或?qū)櫸铮绻?、貓、幾?nèi)亞豬、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。本文所稱的對(duì)象優(yōu)選是人。

本文所用的術(shù)語“有治療需要的患者”或“有治療需要的對(duì)象”包括因施用本發(fā)明用于例如檢測、診斷和/或治療用途的多肽或其組合物而受益的對(duì)象，如哺乳動(dòng)物對(duì)象。

本文所用的術(shù)語“激動(dòng)劑”是指任何能夠增加pd-1h的水平和/或活性的試劑。例如，術(shù)語“激動(dòng)劑”是指使能夠使pd-1h的表達(dá)和/或活性增加至少10％或更多(例如10％或更多、50％或更多、100％或更多、200％或更多、500％或更多、1000％或更多)的試劑。pd-1h的激動(dòng)劑的非限制性例子可包括pd-1h多肽或其激動(dòng)劑片段以及編碼pd-1h多肽的核酸。

如本文所用，術(shù)語“拮抗劑”是指降低pd-1h的水平和/或活性的任何試劑。拮抗劑是與特定蛋白(例如配體)競爭結(jié)合另一種蛋白質(zhì)(例如受體)的化合物。這種結(jié)合通常誘導(dǎo)被競爭性拮抗劑阻斷的特異性生物反應(yīng)或作用。拮抗劑具有親和力但對(duì)其同源結(jié)合蛋白沒有功效，并且結(jié)合將破壞相互作用并抑制這種同源蛋白的功能。拮抗劑通過結(jié)合至任何同源蛋白(或在適用情況下受體)上的活性(正位體＝正確的位置)位點(diǎn)或變構(gòu)(＝其他位置)位點(diǎn)來調(diào)節(jié)其作用，或者它們可能在通常不涉及的獨(dú)特結(jié)合位點(diǎn)相互作用。

本發(fā)明使用反義低聚物和類似物質(zhì)用于調(diào)節(jié)編碼pd-1h的核酸分子的功能或作用。這通過提供與編碼pd-1h的一種或多種核酸分子特異性雜交的寡核苷酸來實(shí)現(xiàn)。如本文所用，術(shù)語“靶核酸”和“編碼pd-1h的核酸分子”被用于方便地包括編碼pd-1h的dna、從該dna轉(zhuǎn)錄的rna(包括前mrna和mrna或其部分)，以及衍生自這些rna的cdna。本發(fā)明的低聚物與其靶核酸的雜交通常稱為“反義”。因此，被認(rèn)為包括在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中的優(yōu)選機(jī)理在本文中稱為“反義抑制”。這種反義抑制通?；诠押塑账徭溁蜴湺蔚幕跉滏I的雜交，使得至少一個(gè)鏈或鏈段被切割、降解或以其它方式不可操作。在這方面，目前優(yōu)選靶向特異性核酸分子及其用于這種反義抑制的功能。在一些實(shí)施方案中，反義寡聚物選自dna寡核苷酸、rna寡核苷酸(例如microrna)和嵌合寡核苷酸。例如，反義寡聚物選自dsrna、sirna和shrna。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種調(diào)節(jié)對(duì)象的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的細(xì)胞水平的方法，包括向有此需要的對(duì)象施用治療有效量的pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑或包含pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供上述pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑在調(diào)節(jié)對(duì)象的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的細(xì)胞水平的方法中的應(yīng)用。

在一些實(shí)施方式中，該pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑或其藥物組合物以腸胃外方式給藥，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮或皮內(nèi)給藥。

在某些實(shí)施方案中，pd-1h激動(dòng)劑的施用導(dǎo)致受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞水平的增加，例如itreg細(xì)胞的擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，施用pd-1h拮抗劑導(dǎo)致受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞水平降低。在一些實(shí)施方案中，itreg細(xì)胞的水平降低伴隨著th1和/或th17細(xì)胞的產(chǎn)生增加。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或減輕t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病的方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑或包含pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑的藥物組合物。本文使用的術(shù)語“t細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病”是指與t細(xì)胞免疫相關(guān)的疾病或病癥，包括炎癥、自身免疫性疾病和癌癥。

組合物

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含治療有效量的pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物可用于調(diào)節(jié)受試者中誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的水平。pd-1h激動(dòng)劑或pd-1h拮抗劑可以在合適的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中制備。

本文使用的術(shù)語“載體”包括任何或所有的溶劑、分散介質(zhì)、載體、包衣、稀釋劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸附延緩劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這些用于藥物活性成分的介質(zhì)和試劑的使用在本領(lǐng)域是已知的。除非已知任何常規(guī)介質(zhì)或試劑不能與該活性成分配伍，否則本發(fā)明預(yù)期可在組合物中使用任何上述載體。

“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)施用至人體時(shí)不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)或類似的不期望的反應(yīng)的分子和成分。本領(lǐng)域已知如何制備包含作為活性組分的蛋白的水性組合物。通常，這些組合物被制備成注射劑，例如液態(tài)溶液或懸浮液；也可以制備成適于在注射之前配制成溶液或懸浮液的固體形式。

實(shí)施例

材料和方法

小鼠：8周齡的c57bl/6(b6)小鼠購自中山大學(xué)動(dòng)物供應(yīng)中心。b6背景的pd-1h-ko小鼠已有報(bào)道。轉(zhuǎn)基因品系cd45.1、ot-ii、foxp3(gfp)、rag1ko均購自thejacksonlaboratory。pd-1hko和野生型(對(duì)照小鼠)的同窩小鼠由pd-1h雜合子產(chǎn)生并保持在相同的條件下。將foxp3(gfp)小鼠和ot-ii小鼠分別與pd-1hko小鼠回交，產(chǎn)生pd-1h缺陷型foxp3(gfp)報(bào)道小鼠和pd-1h缺陷型ot-ii小鼠。將小鼠保持在特定的無病原體設(shè)施中，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照“國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”進(jìn)行，經(jīng)中山大學(xué)科學(xué)調(diào)查委員會(huì)批準(zhǔn)(廣東，中國)。

抗體、試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)分析：對(duì)于小鼠pd-1h的細(xì)胞表面染色，使用mh5a(倉鼠抗小鼠pd-1h)，之后使用抗倉鼠igg-pe(ebioscience)；倉鼠igg(ebioscience)被用作同種型對(duì)照。pd-1h激動(dòng)劑mab克隆mam82(小鼠抗小鼠igg1)已有描述。所有其他熒光標(biāo)記的抗體包括cd4、cd25、cd44、cd69、foxp3、tcrvβ5.1/5.2、p-stat3、p-stat5、ctla-4、lag-3、gitr、iocs、cd45.1和cd45.2從ebioscience和bdpharmingen購買。對(duì)于中和試驗(yàn)，從r&dsystem購買抗-ifn-γ(克隆xmg1.2)、抗il-4(克隆11b11)，抗il-6(克隆mp5-20f3)中和抗體。根據(jù)bd的cytofix/cytoperm試劑盒手冊(cè)進(jìn)行foxp3和其他細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)染色。使用小鼠th1/th2/th17cba試劑盒(bdbioscience)進(jìn)行細(xì)胞因子分析。小鼠pan-t分離試劑盒、cd8⁺t細(xì)胞分離試劑盒、cd4⁺t細(xì)胞分離試劑盒、cd25微珠試劑盒和初始cd4⁺t細(xì)胞分離試劑盒購自miltenyibiotec(cambridge，ma)。使用bdfacsverse(bdbiosciences)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，并使用flowjo軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。

細(xì)胞分選和純化：收集脾臟和ln的單細(xì)胞懸浮液，使用初始cd4⁺t細(xì)胞分離試劑盒(miltenyibiotec)分離初始的cd4⁺cd25^-cd44^locd62^hit細(xì)胞。對(duì)于foxp3(gfp)敲入小鼠，在使用cd4⁺t細(xì)胞分離試劑盒純化后，通過facsaria(bdbiosciences)對(duì)cd4⁺cd25^-foxp3(gfp)t細(xì)胞和cd4⁺cd25⁺foxp3(gfp⁺)t細(xì)胞進(jìn)行分選。在所示的實(shí)驗(yàn)中，使用cd4⁺t細(xì)胞分離試劑盒首先富集cd4⁺t細(xì)胞，然后使用cd25微珠試劑盒(miltenyibiotec)去除cd25⁺t細(xì)胞，得到cd4⁺cd25^-t細(xì)胞。使用該方法分選的細(xì)胞的純度通常大于95％。

itreg細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化：使用結(jié)合至平板的抗cd3(克隆2c11，2μg/ml，ebioscience)和可溶性抗cd28(1μg/ml)在存在或不存在重組tgf-β(5ng/ml，r&dsystems)和il-2(5ng/ml，peprotech)的情況下在體外刺激分選的cd4⁺cd25^-foxp3(gfp^-)t細(xì)胞3-5天。然后通過流式細(xì)胞儀基于gfp的表達(dá)或foxp3的細(xì)胞內(nèi)染色分析foxp3⁺treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在所示實(shí)驗(yàn)中，在用抗cd3(1μg/ml)包被平板之后，將細(xì)胞在包被pd-1h激動(dòng)劑mam82(10μg/ml)的平板中培養(yǎng)。對(duì)于細(xì)胞因子中和實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)開始時(shí)向孔中加入10μg/ml的il-4、il-6和ifn-γ的mab。在所示時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)的上清液進(jìn)行細(xì)胞因子分析。

treg細(xì)胞的抑制試驗(yàn)：按之前文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行treg細(xì)胞抑制功能試驗(yàn)。簡言之，首先用1μmcfse(lifetechnologies)標(biāo)記初始cd8⁺t細(xì)胞(在一些實(shí)驗(yàn)中使用cd4⁺初始t細(xì)胞)，隨后在存在作為飼養(yǎng)細(xì)胞的1×10⁵絲裂霉素c處理的同基因脾細(xì)胞的情況下以1×10⁵共同培養(yǎng)細(xì)胞。在u底96孔板中以指定的比例向培養(yǎng)物加入或不加入treg細(xì)胞并培養(yǎng)72小時(shí)，隨后加入抗小鼠cd3(1μg/ml)以進(jìn)行刺激。通過cfse稀釋法測定t細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)物中加入可溶性小鼠對(duì)照igg或pd-1h激動(dòng)劑mam82(10μg/ml)。在這些情況下，飼養(yǎng)細(xì)胞是pd-1hko脾細(xì)胞。

口服耐受小鼠模型：根據(jù)公開的方案進(jìn)行foxp3⁺itreg細(xì)胞的全新生成。簡言之，如前所述，從ot-ii小鼠(或pd-1hkoot-ii小鼠)中分離初始cd4⁺cd25^-t細(xì)胞，并在過繼轉(zhuǎn)移前用5μmcfse標(biāo)記。向wtb6小鼠靜脈內(nèi)注射2×10⁶個(gè)細(xì)胞。24小時(shí)后，將籠中飲用水連續(xù)5天替換為1.5％ova溶液(v級(jí)；sigma-aldrich)。在第6天，收集腸系膜ln和pp，通過流式細(xì)胞術(shù)利用foxp3的細(xì)胞內(nèi)染色測定tcr特異性foxp3⁺treg細(xì)胞。

骨髓嵌合體：將來自wt(cd45.1)和pd-1hko小鼠(cd45.2)的脛骨和股骨的骨髓以1:1的比例混合，并將總共1×10⁷個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到亞致死性輻射處理的(6gy)同源wt小鼠(cd45.1/cd45.2)。重構(gòu)10周后分析所示器官。通過細(xì)胞內(nèi)染色測定foxp3⁺細(xì)胞的頻率。

eae疾病模型：按文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型。簡言之，將7-8周齡雌性小鼠s.c.免疫在完全弗氏佐劑(difco)中的200μgmog35-55(lifetechnologies)。在免疫后第0天和第2天，給小鼠腹腔注射在500μlpbs中的400ng百日咳毒素(listbiologicallabs)。對(duì)于過繼轉(zhuǎn)移，在第0天，進(jìn)行免疫前，靜脈注射1×10⁶個(gè)wtfoxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞。wt小鼠靜脈注射相同體積的pbs(鹽水)作為對(duì)照。每天觀察小鼠，以0-5的等級(jí)確定臨床評(píng)分(盲法)：0＝健康；1＝拖尾；2＝拖尾和后肢無力；3＝后肢癱瘓；4＝所有后肢癱瘓和前肢無力；5＝垂死狀態(tài)。對(duì)于從eae小鼠獲得的細(xì)胞的間接體內(nèi)分析，收集每組的脾和dln，并且用pma/離子霉素/bdgolgiplug再次刺激細(xì)胞懸浮液4小時(shí)。使用細(xì)胞內(nèi)染色評(píng)估ifn-γ和il-17的水平，并通過facs(bdcytofix/cytoperm試劑盒)分析。

慢性結(jié)腸炎的t細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型：簡言之，如上所述制備和分選來自wt和pd-1hko小鼠的foxp3⁺itreg細(xì)胞。通過腹膜內(nèi)，將同源cd4⁺cd45rb^hit細(xì)胞(cd45.1,4×10⁵)和或不和2x10⁵itreg細(xì)胞(cd45.2)一起共注射到rag1ko小鼠。每周稱重一次小鼠，10周后，收集結(jié)腸組織，用h&e進(jìn)行組織染色。收集脾臟和mln細(xì)胞，并使用pma/離子霉素/bfa離體活化4小時(shí)，然后分析細(xì)胞因子產(chǎn)量。

dna甲基化分析：分離foxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞，用dneasyblood&tissuekit(qiagen)純化基因組dna。使用ezdna甲基化-金試劑盒(zymo研究)進(jìn)行dna的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。使用文獻(xiàn)報(bào)道的引物組擴(kuò)增foxp3增強(qiáng)子的cns2區(qū)，并將t/a克隆到pmd18-t載體(clonetech)中。對(duì)每組10個(gè)插入的質(zhì)粒進(jìn)行純化和測序，并通過biqanalyzer2.0分析甲基化結(jié)果。

圖表和統(tǒng)計(jì)分析：圖形和數(shù)據(jù)分析是使用graphpad軟件生成。進(jìn)行非配對(duì)studentt檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。圖中的誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(se)。對(duì)于疾病進(jìn)展，使用雙因素方差分析(*p<0.05)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

結(jié)果

pd-1h對(duì)于treg細(xì)胞的全新生成是必需的

發(fā)明人首先探索了pd-1h在口服耐受模型中的作用，在該模型中口服給予雞卵清蛋白(ova)顯示能夠促進(jìn)itreg細(xì)胞在外周血中的擴(kuò)增和全新生成。將ot-iitcr轉(zhuǎn)基因小鼠與pd-1hko小鼠回交得到新的koot-ii品系。從wtot-ii或koot-ii小鼠的脾細(xì)胞中純化cd4⁺t細(xì)胞，并去除cd25⁺t細(xì)胞(以避免ntreg污染)，隨后轉(zhuǎn)移到wtb6小鼠中。小鼠隨后在飲用水中連續(xù)5天加入1.5％ova(圖1a)。與之前公開的結(jié)果一致，foxp3⁺v5.1/5.2⁺ot-ii細(xì)胞可以在包括腸系膜淋巴結(jié)(mln)和派耶氏集合淋巴結(jié)(pp)的腸道相關(guān)淋巴器官中檢測到，而在脾臟、外周ln和椎板固有層(lp)中可檢測到較少的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)，表明腸道相關(guān)淋巴器官對(duì)ova的treg反應(yīng)。在不存在pd-1h的情況下，盡管mln和pp中wt和koot-ii細(xì)胞基于cfse稀釋度的分裂速度相當(dāng)(圖6a)但與wtot-ii相比，mln和pp中的foxp3⁺v5.1/5.2⁺ot-ii細(xì)胞顯著降低(圖1b和1c)。當(dāng)將初始wtot-ii細(xì)胞和koot-ii細(xì)胞共轉(zhuǎn)移到ova喂養(yǎng)小鼠中時(shí)，觀察到了類似的結(jié)果(圖6b和6c)。我們發(fā)現(xiàn)在相同的宿主小鼠中，與共轉(zhuǎn)移的wtot-ii細(xì)胞相比，ot-ii細(xì)胞上的pd-1h缺乏導(dǎo)致foxp3⁺t細(xì)胞的分化受損(圖6b和6c)。我們的研究結(jié)果表明pd-1h的喪失影響體內(nèi)ova特異性itreg細(xì)胞的誘導(dǎo)。

將初始cd4⁺t細(xì)胞轉(zhuǎn)移到淋巴球減少癥小鼠可實(shí)現(xiàn)其穩(wěn)態(tài)增殖，該作用可以上調(diào)foxp3的表達(dá)，并且這些foxp3⁺itreg細(xì)胞在體外獲得抑制功能。為了確定pd-1h是否影響該過程，將來自wt(cd45.1)和ko(cd45.2)小鼠的初始cd4⁺t細(xì)胞以1:1的比例混合，并轉(zhuǎn)移到rag1ko小鼠中。3周后分析指示器官中cd25⁺foxp3⁺t細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)數(shù)量(圖7)。我們發(fā)現(xiàn)kocd4⁺t細(xì)胞的總數(shù)比脾臟中的wtcd4⁺t細(xì)胞增加了兩倍多(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，與wtcd4⁺t細(xì)胞相比，在脾、ln和mln中發(fā)現(xiàn)kocd4⁺t細(xì)胞中的cd25⁺foxp3⁺itreg細(xì)胞的顯著更低。此外，盡管在脾臟中未觀察到明顯變化，但cd4⁺t細(xì)胞上的pd-1h損失也導(dǎo)致在ln和mln中比wtcd4⁺t細(xì)胞數(shù)量少的foxp3⁺itreg細(xì)胞(圖7b)。此外，與淋巴細(xì)胞環(huán)境中的wtcd4⁺t細(xì)胞相比，我們發(fā)現(xiàn)回收的kocd4⁺t細(xì)胞產(chǎn)生顯著更高的ifn-γ和il-17細(xì)胞因子(圖7c)。我們得出結(jié)論，pd-1h是foxp3⁺itreg細(xì)胞從頭生成所必需的。

pd-1h是itreg細(xì)胞的擴(kuò)增是必需的，但非其產(chǎn)生和功能所必需

pd-1hko小鼠在胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中顯示出正常數(shù)量的ntreg細(xì)胞。此外，pd-1hko小鼠中ntreg細(xì)胞的表型和抑制功能也與wt同窩小鼠相似(圖8)。這些發(fā)現(xiàn)與以前的觀察結(jié)果一致，即幼年pd-1hko小鼠沒有明顯的自身免疫樣表型。因此，pd-1h似乎對(duì)于淋巴器官中ntreg的發(fā)育和功能成熟不是必需的。

因?yàn)閕treg細(xì)胞主要在穩(wěn)定狀態(tài)或炎癥的腸道中產(chǎn)生，我們接下來考察pd-1h的缺乏是否影響itreg的產(chǎn)生和功能。雖然在pd-1hko小鼠和wt同窩出生小鼠中都發(fā)現(xiàn)了在mln和pp中的相似比例的foxp3⁺treg細(xì)胞，但pd-1hko小鼠的lp中的foxp3⁺細(xì)胞顯著更低，盡管foxp3⁺細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在不存在pd-1h的情況下不變(圖2a和2b)。當(dāng)pd-1hko/wt小鼠回交到foxp3(gfp)小鼠(其中g(shù)fp基因處于foxp3啟動(dòng)子的控制下)時(shí)，lp中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明在體內(nèi)不存在pd-1h的情況下，itreg細(xì)胞的分化具有缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們?cè)趐d-1hko小鼠中的發(fā)現(xiàn)，我們創(chuàng)建了混合骨髓嵌合體。將來自wt(cd45.1)和ko小鼠(cd45.2)的混合骨髓過繼轉(zhuǎn)移至被亞致死量輻射的b6小鼠。10周后分析指示器官中foxp3⁺細(xì)胞的頻率。我們發(fā)現(xiàn)kot細(xì)胞總數(shù)比wtt細(xì)胞增加了近兩倍(圖9a)。相比之下，kofoxp3⁺t細(xì)胞顯著低于外周器官中的wtt細(xì)胞和受體t細(xì)胞(圖9b和9c)。在嵌合小鼠的脾臟中，kofoxp3⁺t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量也低于wtt細(xì)胞，而foxp3^-效應(yīng)t細(xì)胞(teff)則更加劇烈地?cái)U(kuò)增(圖9c)。這些數(shù)據(jù)表明pd-1h對(duì)t細(xì)胞的活化和穩(wěn)態(tài)是共抑制的，但促進(jìn)體內(nèi)foxp3⁺treg細(xì)胞的發(fā)育。

接下來我們測試pd-1h的損失是否會(huì)影響體外itreg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。從wt和pd-1hko脾細(xì)胞純化得到初始cd4⁺cd25^-cd62l^hi細(xì)胞，并在tgf-β存在下用抗cd3/cd28刺激。從wt初始t細(xì)胞分化出的foxp3⁺itreg細(xì)胞的頻率顯著高于由ko初始t細(xì)胞分化出的foxp3⁺itreg細(xì)胞(圖2c)。綜上，我們得出結(jié)論，pd-1h對(duì)于itreg的從頭分化是必需的。

為了進(jìn)一步測試pd-1h損失是否影響itreg功能，如上所述在體外誘導(dǎo)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg細(xì)胞，并通過分選進(jìn)行純化。通過抗cd3刺激純化的cd4⁺cd25^-cd62l^hi初始t細(xì)胞產(chǎn)生teff。在受輻射的脾細(xì)胞(作為抗原呈遞細(xì)胞)及可溶性抗cd3的存在下，將wt或koitreg細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞以指定的treg/teff比共同培養(yǎng)3天。teff在共培養(yǎng)前被cfse標(biāo)記，并且使用降低的cfse稀釋液作為treg抑制的指標(biāo)。如圖2d和2e所示，來自wt和ko小鼠的itreg細(xì)胞以相當(dāng)?shù)幕钚砸种苩eff的增殖。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們未在wt與koitreg中發(fā)現(xiàn)激活標(biāo)記物cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos或pd-1的表達(dá)的顯著差異(圖2f)。因此，盡管對(duì)itreg的分化有影響，但pd-1h不影響itreg的抑制功能。

我們最后測試了pd-1h激動(dòng)劑mabmam82對(duì)itreg擴(kuò)增的影響。從wtfoxp3(gfp)敲入小鼠中分選初始t細(xì)胞，隨后在tgf-β存在下用抗cd3/cd28刺激。在刺激下測量gfp⁺cd25⁺itreg細(xì)胞的誘導(dǎo)。加入mam82輕微增加foxp3⁺cd25⁺itreg擴(kuò)增，盡管效果呈現(xiàn)中等水平(圖10a和10b)。然而，這種中等水平的作用可能是由于體外t細(xì)胞的細(xì)胞表面pd-1h的快速損失導(dǎo)致?？偠灾?，我們的數(shù)據(jù)表明，pd-1h是從初始t細(xì)胞產(chǎn)生itreg是必需的，但不影響其抑制功能。

pd-1h通過細(xì)胞因子調(diào)節(jié)itreg分化

之前文獻(xiàn)報(bào)道活化的pd-1hkocd4⁺t細(xì)胞比wtt細(xì)胞在體外產(chǎn)生更高水平的ifn-γ和il-17。此外，將來自wt和ko小鼠的初始t細(xì)胞共轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞小鼠導(dǎo)致ko與wtt細(xì)胞中的foxp3⁺t細(xì)胞減少并增加ifnγ⁺和il-17⁺細(xì)胞(圖7)。因此，細(xì)胞因子可能在不存在pd-1h的情況下調(diào)節(jié)itreg細(xì)胞的分化。為了驗(yàn)證該推測，首先用抗cd3/cd28刺激純化的cd4⁺t細(xì)胞，并收集培養(yǎng)的上清液用于細(xì)胞因子檢測。與我們以前的發(fā)現(xiàn)一致，與wtcd4⁺t細(xì)胞相比，活化的kocd4⁺t細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的ifn-γ和il-17(圖3a)。在tgf-β存在下，這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)一步增加，而tnf-α沒有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，pd-1hkocd4⁺t細(xì)胞產(chǎn)生更多il-4，伴隨tgf-β增加或不增加(圖3a)。因?yàn)檫@些細(xì)胞因子是由不同的cd4⁺t細(xì)胞亞群產(chǎn)生的，所以我們的發(fā)現(xiàn)支持pd-1h作為t輔助細(xì)胞的泛抑制劑。

將il-4和/或ifn-γ的中和mab加入到培養(yǎng)物中以利用這些細(xì)胞因子在誘導(dǎo)itreg細(xì)胞中的作用。如圖所示，與wt對(duì)照相比，中和il-4或ifn-γ部分恢復(fù)pd-1hkoitreg細(xì)胞的分化，而包含兩種mab恢復(fù)了大部分活性。作為對(duì)照，單獨(dú)或組合使用ifn-γ/il-4中和mab也可以增強(qiáng)itreg分化(圖3b和3c)。這些研究結(jié)果表明，在不存在pd-1h的情況下，受損的itreg分化至少部分地是由于t細(xì)胞改變細(xì)胞因子產(chǎn)生而導(dǎo)致的。

pd-1h的損失有助于在炎癥環(huán)境中itreg轉(zhuǎn)化為th17

隨后我們確定了pd-1h是否對(duì)已經(jīng)分化的itreg細(xì)胞有直接作用。建立鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型，以測試foxp3⁺itreg細(xì)胞的穩(wěn)定性。簡言之，如上所述產(chǎn)生wt或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細(xì)胞，并通過基于gfp陽性的流式細(xì)胞術(shù)(>97％foxp3⁺，圖11a)進(jìn)行分選。濃度為1×10⁶/小鼠的foxp3(gfp⁺)cd45.2⁺itreg細(xì)胞被靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移到cd45.1⁺b6免疫前小鼠中，其中轉(zhuǎn)移的wtitreg的數(shù)目不足以阻止eae進(jìn)展。然后用髓磷脂堿性蛋白質(zhì)免疫小鼠以誘導(dǎo)eae。在這種情況下，與對(duì)照相比，wtitreg細(xì)胞的轉(zhuǎn)移稍微延遲了疾病的發(fā)病。然而，pd-1hkoitreg細(xì)胞的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病(如臨床評(píng)分所示)，盡管在疾病高峰期沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖4a)。有趣的是，eae小鼠脊髓的h&e染色顯示kotreg轉(zhuǎn)移的小鼠和wttreg轉(zhuǎn)移的小鼠之間的淋巴細(xì)胞浸潤具有微小差異(數(shù)據(jù)未顯示)。然后我們分析了在疾病進(jìn)展期間轉(zhuǎn)移的treg細(xì)胞中foxp3表達(dá)的穩(wěn)定性。與wt小鼠的itreg相比，koitreg的foxp3頻率(gfp⁺)在脾臟和dln中都降低了50％以上(圖4b和4c)。此外，dln中kofoxp3⁺細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量與dln中的wtfoxp3⁺細(xì)胞相比顯著減少，盡管脾臟中foxp3⁺t細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)(圖4c)。因此，我們的研究結(jié)果表明了pd-1h在維持itreg表型和功能方面的作用。

在treg向其他cd4⁺t細(xì)胞亞群的可轉(zhuǎn)換性方面，我們的研究結(jié)果表明了itreg向包括th1和th17在內(nèi)的效應(yīng)性t細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)化(在eae中被認(rèn)為是致病性的)。為了驗(yàn)證這種可能性，用pma/離子霉素在第13天刺激來自宿主小鼠的脾臟和dln細(xì)胞4小時(shí)，使用細(xì)胞內(nèi)染色檢查cd45.2⁺cd4⁺門控細(xì)胞的gfp(foxp3表達(dá)的指標(biāo))、ifn-γ和il-17。與用wtitreg細(xì)胞轉(zhuǎn)移的小鼠相比，用pd-1hkoitreg細(xì)胞轉(zhuǎn)移的小鼠的脾臟和dln中觀察到轉(zhuǎn)化的th1樣細(xì)胞(ifn-γ⁺foxp3^-)的比例適度增加(圖4e)。然而，在這兩組小鼠中，轉(zhuǎn)化的th1樣細(xì)胞ifn-γ⁺細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量沒有顯著差異(圖4e)，表明itreg向th1的轉(zhuǎn)化非常少。然而，大部分pd-1hkoitreg細(xì)胞(脾臟中16.7％、dln中6.1％)轉(zhuǎn)化為il-17⁺細(xì)胞，并且從wtitreg細(xì)胞到il-17⁺細(xì)胞的轉(zhuǎn)化非常少(在脾臟和dln中均少于2％)(圖4e和4f)。使用相同的策略，我們分析了受試者cd4⁺t細(xì)胞(門控cd45.1⁺)，其顯示與wt或pd-1hkoitreg細(xì)胞轉(zhuǎn)移的兩組小鼠中ifn-γ⁺和il-17⁺細(xì)胞的相當(dāng)水平(圖11b和11c)。這些結(jié)果表明，pd-1h的損失促進(jìn)了itreg在炎性環(huán)境中轉(zhuǎn)化為th17樣細(xì)胞。因此，pd-1hkoitreg細(xì)胞部分促進(jìn)eae進(jìn)展的作用(圖4a)可能是炎癥環(huán)境中itreg轉(zhuǎn)化為th17的結(jié)果。

發(fā)明人還評(píng)估了pd-1hkotreg對(duì)慢性結(jié)腸炎t細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型的影響。如上所述制備wt和kofoxp3(gfp⁺)treg(cd45.2)，分別與同種cd45.1teff(cd45rb^hicd25^-cd4⁺)混合，并且隨后轉(zhuǎn)移到rag1ko小鼠中。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，即使單獨(dú)轉(zhuǎn)移cd45rbhiteff，我們也沒有觀察到疾病進(jìn)展期間明顯的體重減輕(圖12a)。然而，共轉(zhuǎn)移pd-1hkotreg/teff導(dǎo)致大量白細(xì)胞浸潤和結(jié)腸嚴(yán)重的組織損傷(通過h&e染色看出)，而wttreg/teff的共轉(zhuǎn)移顯示結(jié)腸組織沒有明顯的損傷(圖12b和12c)。為了確定pd-1hkotreg細(xì)胞減弱的抑制能力是否與foxp3表達(dá)的損失相關(guān)，我們?cè)u(píng)估了宿主rag1ko小鼠的脾臟和mln中的foxp3表達(dá)。與treg功能損失一致，與wttreg相比(脾臟17％，mln中為54％)，pd-1hkotreg中foxp3表達(dá)下調(diào)(脾臟11％，mln39％)(圖12d和12e)。然而，在pd-1hkotreg與wttreg共轉(zhuǎn)移小鼠之間，foxp3⁺t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量沒有顯著差異(圖12f)。此外，用pd-1hkotreg轉(zhuǎn)移的小鼠(脾臟為30.7％，mln為14.9％)比用wttreg(脾臟為7％，mln為3.95％)轉(zhuǎn)移的小鼠具有顯著更多的ifn-γ⁺細(xì)胞(圖12g)。最后，pd-1hkotreg(脾臟為13.3％，mln為9.8％)轉(zhuǎn)移后比wttreg(脾臟3.64％，mln為4.44％)轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)更多的il-17⁺t細(xì)胞(圖12g和12h)。在pd-1hkotreg/teff轉(zhuǎn)移和在wttreg/teff轉(zhuǎn)移之間未觀察到ifn-γ⁺和il-17⁺teff(cd45.1)在脾臟和mln中的差異(圖12i)。我們的研究結(jié)果表明，treg缺乏pd-1h導(dǎo)致treg快速轉(zhuǎn)化為其他可能促進(jìn)炎癥的效應(yīng)cd4細(xì)胞。因此，pd-1h對(duì)于維持treg細(xì)胞在炎癥下的抑制功能和foxp3的表達(dá)是必需的。

在pd-1hkoitreg細(xì)胞中stat3活性和foxp3增強(qiáng)子甲基化增加

stat5激活驅(qū)動(dòng)treg譜系定型，而stat3抑制foxp3表達(dá)并促進(jìn)th17細(xì)胞反應(yīng)。為了檢查pd-1h的損失是否形成了treg細(xì)胞中的stat通路，我們分析了eae模型中stat-5和stat-3的激活。pd-1hkoitreg細(xì)胞(高達(dá)47％的p-stat3)在eae小鼠的脾和dln中比wtitreg細(xì)胞表達(dá)顯著更高水平的磷酸化stat-3(p-stat3)。然而，在wt和pd-1hkoitreg細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)膒-stat5水平(圖5a和5b)，暗示stat3(而不是stat5)在pd-1h功能中的作用。

以前的研究表明，foxp3增強(qiáng)子的cns2(保守的非編碼dna序列2)區(qū)域的dna甲基化狀態(tài)對(duì)維持foxp3表達(dá)特別重要。我們?cè)诒景l(fā)明中確定了pd-1hkoitreg細(xì)胞中cns2區(qū)域的甲基化。如圖5c所示，體外誘導(dǎo)的wtitreg顯示cns2區(qū)域的幾乎一半被去甲基化(平均為40.8％)。然而，pd-1hkoitreg細(xì)胞的去甲基化顯著減少(平均17.5％)，foxp3增強(qiáng)子cns2區(qū)域的超甲基化平均為82.5％。這一觀察結(jié)果解釋了pd-1hkoitreg細(xì)胞在foxp3表達(dá)方面的不穩(wěn)定性?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，pd-1h缺乏對(duì)treg的分化和表型穩(wěn)定性具有顯著影響。

本發(fā)明的結(jié)果表明，pd-1h是一種關(guān)鍵的細(xì)胞表面信號(hào)分子，通過兩種不同的機(jī)制控制誘導(dǎo)性treg的細(xì)胞數(shù)量水平。第一，從初始t細(xì)胞產(chǎn)生itreg需要pd-1h。這種作用主要是通過抑制炎性細(xì)胞因子(如ifn-γ、il-4和il-17)介導(dǎo)的。結(jié)果，響應(yīng)環(huán)境刺激的itreg的數(shù)量減少。盡管pd-1h不影響itreg在每個(gè)細(xì)胞水平的抑制功能，但itreg水平的減少可能最終會(huì)影響免疫反應(yīng)期間treg的整體抑制功能。第二，pd-1h信號(hào)傳導(dǎo)阻止在炎癥環(huán)境中將itreg轉(zhuǎn)化為th1和th17。這種作用可能是由于pd-1h對(duì)itreg細(xì)胞上的foxp3表達(dá)的直接調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致的。通過促進(jìn)itreg的產(chǎn)生和防止itreg轉(zhuǎn)化為th1和th17，pd-1h有助于在炎癥期間保持恒定的itreg水平。據(jù)我們所知，這是描述pd-1h的調(diào)解機(jī)制和控制調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的機(jī)制的第一次全面研究。

雖然pd-1h的共抑制功能已經(jīng)在早期研究中得到證實(shí)，但這種作用所依賴的機(jī)制尚未闡明。wang及其同事表明，在tgf-β存在下，pd-1hig部分促進(jìn)了itreg細(xì)胞的分化，這種作用可以在小鼠和人類cd4⁺t細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。此外，pd-1h的單克隆抗體降低腫瘤抗原特異性itreg細(xì)胞在體內(nèi)的分化。在這些研究中，pd-1h被認(rèn)為是一種配體，它與treg上的一個(gè)尚未鑒別的抑制性受體結(jié)合，以調(diào)節(jié)這種作用。我們使用pd-1h缺陷小鼠和pd-1h激動(dòng)劑mab的結(jié)果顯示pd-1h作為t細(xì)胞上的共抑制受體。還應(yīng)注意，pd-1h在抑制免疫應(yīng)答中的作用可能更復(fù)雜，并且可以通過多于一種單一機(jī)制起作用。我們最近的研究表明，pd-1h介導(dǎo)的對(duì)同種異體抗原的t細(xì)胞耐受性的抑制是由兩種不同的機(jī)制介導(dǎo)的：早期阻止細(xì)胞增殖和晚期誘導(dǎo)treg以維持移植物耐受性。在本發(fā)明中，我們揭示了pd-1h在控制treg細(xì)胞數(shù)量水平中的關(guān)鍵作用，這可能有助于誘導(dǎo)t細(xì)胞反應(yīng)的長期耐受

pd-1h對(duì)treg的影響是一個(gè)高度選擇性的事件。雖然pd-1h對(duì)于從初始t細(xì)胞產(chǎn)生itreg是必不可少的，但ntreg和itreg的抑制功能不受影響。特別是pd-1h對(duì)于通過自身抗原選擇的、胸腺來源的ntreg細(xì)胞的產(chǎn)生和抑制功能不是必需的(圖8)。這個(gè)結(jié)果可能部分解釋了為什么在年幼pd-1hko小鼠中沒有觀察到自發(fā)性自身免疫疾病或淋巴組織增生癥狀。然而，在初始小鼠中自發(fā)產(chǎn)生的itreg細(xì)胞明顯受到影響(圖2a)，這在先前在tgf-β和視黃酸存在下在活化的cd4+t細(xì)胞中觀察到過，并且該群體主要積聚在腸和皮膚中粘膜。

盡管發(fā)現(xiàn)foxp3⁺itreg細(xì)胞的頻率在腸內(nèi)降低，特別是在pd-1hko小鼠的lp中，但lp中foxp3⁺itreg的絕對(duì)數(shù)量沒有變化(圖2a)。這可能部分解釋了為什么pd-1hko小鼠不會(huì)在腸道中發(fā)展自發(fā)性致病性疾病。我們還在pd-1hko小鼠驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論，該小鼠與foxp3(gfp)小鼠(gfp表達(dá)在foxp3啟動(dòng)子控制下)交配而產(chǎn)生pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)。使用口服耐受模型進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，如前所述，該模型用于在體內(nèi)從體內(nèi)產(chǎn)生全新itreg細(xì)胞。與pd-1hko小鼠的腸道中的發(fā)現(xiàn)一致，pd-1h缺乏導(dǎo)致在mln和pp中抗原特異性foxp3⁺itreg細(xì)胞的全新生成受損(圖1a和1b)。此外，初始cd4⁺t細(xì)胞在tgf-β存在下體外轉(zhuǎn)化為itreg細(xì)胞進(jìn)一步證明pd-1h缺乏可減少itreg細(xì)胞的分化(圖2c)。最后，與wtitreg細(xì)胞相比，itreg細(xì)胞的pd-1h缺乏表現(xiàn)出相似的抑制功能，盡管treg/teff比值較高時(shí)可以發(fā)現(xiàn)微小的差異(圖2d和2e)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在淋巴細(xì)胞環(huán)境中，cd4⁺t細(xì)胞上pd-1h的損失導(dǎo)致平衡增殖后外周器官中foxp3⁺treg數(shù)量的減少，同時(shí)產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞，這進(jìn)一步阻礙了treg的體內(nèi)分化(圖7)。在骨髓嵌合小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的發(fā)現(xiàn)，造血來源的細(xì)胞上的pd-1h的損失導(dǎo)致骨髓細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)(數(shù)據(jù)未顯示)的更高的恢復(fù)，因此促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能阻礙外周treg細(xì)胞的數(shù)量水平(圖9)。因此，我們的研究結(jié)果支持pd-1h在產(chǎn)生itreg方面的高度選擇性作用。

treg不是終末分化的，并且itreg可以通過特異性細(xì)胞因子或炎癥環(huán)境轉(zhuǎn)化成th1或th17亞類。treg細(xì)胞的這種可塑性使得在慢性炎癥期間難以研發(fā)出治療策略。本發(fā)明表明，pd-1h對(duì)于treg譜系的標(biāo)志物foxp3的穩(wěn)定性是必需的，并保持了treg的表型。pd-1h的損失導(dǎo)致各種體外和體內(nèi)系統(tǒng)和模型中itreg的快速降低。我們的研究表明，在缺乏pd-1h的情況下，itreg細(xì)胞易于在炎癥狀態(tài)下重編程成為th17細(xì)胞，這可能解釋了pd-1hkoitreg的轉(zhuǎn)移不是抑制而是促進(jìn)eae疾病的觀察結(jié)果。在這個(gè)模型中，itreg主要轉(zhuǎn)化為th17，很少轉(zhuǎn)化為th1。pd-1h也可能影響itreg向th1的轉(zhuǎn)化，因?yàn)樵诓淮嬖趐d-1h的情況下，在cd4⁺t細(xì)胞中檢測到高水平的ifn-γ。有意思的是，我們的研究結(jié)果表明il-4水平也顯著增加，這些數(shù)據(jù)暗示pd-1h在控制th2中的可能作用。pd-1h在itreg向其他t細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化中的作用尚待闡明。

總之，本發(fā)明支持pd-1h在炎性環(huán)境中抑制itreg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為th1和th17細(xì)胞，至少部分是由于其在維持foxp3表達(dá)和itreg表型中的作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)調(diào)節(jié)treg生長和功能具有重要意義。同時(shí)，如先前所示，pd-1h抑制初始t細(xì)胞的激活以限制t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，它促進(jìn)免疫應(yīng)答期間itreg的生長和轉(zhuǎn)化。除了調(diào)節(jié)早期t細(xì)胞活化外，pd-1h似乎通過調(diào)節(jié)treg細(xì)胞數(shù)量水平參與t細(xì)胞耐受性的調(diào)節(jié)。因此，pd-1h途徑可能一種是在炎癥、自身免疫疾病和癌癥中控制和操縱t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫方面有希望的靶標(biāo)。

本發(fā)明雖然已針對(duì)具體實(shí)施方式做詳細(xì)的描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在所公開的實(shí)施例的基礎(chǔ)上對(duì)本發(fā)明做出修改和改進(jìn)而不違背本發(fā)明的精神，而這些改進(jìn)和修改仍屬于本發(fā)明的范圍。