專利名稱：抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠應(yīng)用于殺滅細(xì)菌，治療內(nèi)毒素血癥，用于植物病原菌防治的一種抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子。
背景技術(shù)：
革蘭氏陰性(G-)桿菌膿毒癥和休克是導(dǎo)致臨床病人死亡的主要原因之一，特別是伴有嚴(yán)重內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS；endotoxin，ET)血癥的G-桿菌的感染，病死率達(dá)50-80％。而針對(duì)內(nèi)毒素血癥的治療，臨床上由于缺乏特異性的治療藥物，目前尚無有效措施，僅限于對(duì)癥處理和抗菌藥物，從而導(dǎo)致感染性疾病的死亡率居高不下，因此研究其發(fā)病機(jī)理并尋找有效的治療措施一直是臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。
近年來，隨著對(duì)G-桿菌感染研究的深入，存在于G-桿菌外膜上內(nèi)毒素的作用日益受到重視。LPS被認(rèn)為是膿毒癥休克病人死亡原因--失控性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)和代償性抗炎癥綜合征(Compensatory anti-inflammatory responsesyndrome，CARS)的啟動(dòng)子。進(jìn)入血中的內(nèi)毒素其主要生物學(xué)作用包括以下幾個(gè)方面(①與巨噬細(xì)胞接觸后能誘生、釋放多種炎癥介質(zhì)如TNF、IL-1等，通過這些介質(zhì)直接或間接發(fā)揮局部及全身效應(yīng)。②同時(shí)內(nèi)毒素分子亦可與多種組織、實(shí)質(zhì)細(xì)胞結(jié)合直接導(dǎo)致細(xì)胞操作。③激活凝血、纖溶、補(bǔ)體系統(tǒng)，誘發(fā)DIC。④作用于α-受體，促使腎上腺兒茶酚胺分泌，導(dǎo)致微循環(huán)障礙、血漿外滲，直至發(fā)生休克以及其它如發(fā)熱、白細(xì)胞減少、Shwartzman反應(yīng)等。在復(fù)雜的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中，分別針對(duì)TNF、IL-1等各種炎癥因子的調(diào)控措施也不斷提出，但結(jié)果令人失望，其主要原因在于各種不同的炎癥因子相互作用密不可分，僅針對(duì)某個(gè)或數(shù)個(gè)細(xì)胞因子并不能解決問題。因此抓住矛盾的主要方面---LPS，尋找解決問題的突破點(diǎn)意義重大。
已有的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素存在于G-桿菌的細(xì)胞膜上，其主要化學(xué)成分為脂多糖。其基本構(gòu)成為O-特異性側(cè)鏈、核心多糖、類脂A三部分。其中類脂A是毒素的活性中心。主要生物學(xué)作用為刺激單核—吞噬細(xì)胞系統(tǒng)誘生、釋放多種炎癥介質(zhì)如TNF、IL-1、IL-6等，通過這些介質(zhì)啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)并直接或間接發(fā)揮局部及全身效應(yīng)。
近十余年來，國(guó)際上針對(duì)G-桿菌感染所伴隨的內(nèi)毒素血癥及SIRS的防治研究，主要是針對(duì)抗內(nèi)毒素核心糖脂(Lipid A)的多抗、單抗、各種抗細(xì)胞因子抗體及受體拮抗劑，如抗TNF抗體、抗白細(xì)胞介素I(IL-1)抗體、抗IL-6抗體以及NO拮抗劑等。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，上述制劑對(duì)膿毒癥所致的臟器損傷均表現(xiàn)出不同的保護(hù)作用，但在臨床試驗(yàn)研究中都因療效不確切而未獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，普遍認(rèn)為結(jié)合力弱、特異性差、用藥時(shí)機(jī)選擇不當(dāng)是導(dǎo)致開發(fā)失敗的主要原因。
殺菌性/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability increasing protrin，BPI)是一種存在于人及哺乳動(dòng)物PMN嗜天青顆粒中的帶正電荷的陽性蛋白質(zhì)，分子量約55kDa，由456個(gè)氨基酸組成，具有殺滅G-細(xì)菌和中和LPS的能力，是目前最有希望成為應(yīng)用于臨床的制劑，受到國(guó)外眾多學(xué)者和制藥企業(yè)的關(guān)注。目前已證實(shí)BPI對(duì)許多G-細(xì)菌包括大腸桿菌屬、綠膿桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、奈瑟氏菌屬等發(fā)揮殺菌作用；BPI還可與G-細(xì)菌胞膜上的LPS特異結(jié)合，抑制游離LPS的活性。BPI N-末端1-199個(gè)氨基酸殘基片段(BPI23)具有完整BPI的全部生物活性，其變構(gòu)體BPI21除具有BPI23的生物活性外，對(duì)部份G+球菌如耐藥金葡菌、鏈球菌具有殺菌活性，并且結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。由美國(guó)研制的重組BPI23/21已進(jìn)入臨床研究，初步臨床研究表明BPI可明顯降低血內(nèi)細(xì)菌數(shù)、改善心臟指數(shù)、動(dòng)脈氧分壓、血壓、降低血漿內(nèi)毒素水平、提高動(dòng)物生存率。國(guó)外重組BPI23(rBPI23，見1992，Infect.Immun.604754-4761)及其突變體(rBPI21)的開發(fā)研究已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果證明，rBPI23和rBPI21對(duì)嚴(yán)重G-細(xì)菌感染有顯著療效。由于細(xì)菌感染和LPS血癥的治療需要絕對(duì)數(shù)量的藥物中和內(nèi)毒素和殺死細(xì)菌，因此rBPI23和rBPI21臨床用藥量較大，而目前的生產(chǎn)工藝依然采用細(xì)胞發(fā)酵的方法，導(dǎo)致成本居高不下，市場(chǎng)難以推廣。所以，篩選和發(fā)現(xiàn)新型的高活性、特異性強(qiáng)的殺菌和中和LPS的藥物成為各國(guó)科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。
中國(guó)專利申請(qǐng)94191894和94194835涉及殺菌性通透性增強(qiáng)蛋白的功能區(qū)的生物活性肽及其應(yīng)用，其中公開了具有的氨基酸序列為人殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)(BPI)功能區(qū)的氨基酸序列或其亞序列的肽，以及該序列的變異體或其亞序列，它們具有至少一種BPI的生物學(xué)活性，如肝素結(jié)合、肝素中和、LBS結(jié)合、LPS中和或殺菌活性，并提供了用于各種治療用途的肽和該肽的藥用組合物。同時(shí)，中國(guó)專利申請(qǐng)01104591公開了通過計(jì)算機(jī)模擬、篩選出的新型BPI模擬肽的變異體及其序列，它們都具有LPS中和或殺菌活性。盡管對(duì)內(nèi)毒素的研究較多，但臨床上尚無一種能夠安全有效地用于治療內(nèi)毒素血癥的藥物。因此，將重點(diǎn)放在中和內(nèi)毒素上從而達(dá)到降低感染死亡率的目的具有非常重要的意義。
在細(xì)胞生物學(xué)及臨床藥學(xué)等研究領(lǐng)域，許多親水性蛋白、多肽及寡聚核苷酸因其獨(dú)特、高效的生物學(xué)活性而被看作是研究活細(xì)胞生命行為的理想工具。多年來，生物學(xué)家們致力于探索將這些工具分子導(dǎo)入活細(xì)胞中的有效方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)有許多肽可不需要任何膜蛋白受體的協(xié)助而穿過細(xì)胞質(zhì)膜(見1991，Proc Natl Acad Sci USA，88(5)1864-1868)；另有一種肽可攜帶親水性大分子穿過血腦屏障，使得“親水性大分子難以通過血腦屏障”這一長(zhǎng)期以來困擾著科學(xué)家們的難題有了重大突破(見Science，1999，2851569-1572)。這些重要發(fā)現(xiàn)為將來親水性蛋白、寡肽及寡核苷酸應(yīng)用于藥學(xué)、基因治療、細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域開辟了一條新的道路。現(xiàn)在，這類具有細(xì)胞生物膜穿透功能的肽被稱為穿膜肽(cell-penetrating peptides)。它們是一類多肽分子，長(zhǎng)度為幾個(gè)至幾十個(gè)氨基酸不等，目前正不斷受到人們的關(guān)注。
技術(shù)內(nèi)容通過目前已知來源于艾滋病毒的轉(zhuǎn)錄活化因子—Tat(含86-102個(gè)氨基酸殘基)與已知的具有殺菌和中和內(nèi)毒素活性的的BPI模擬肽(中國(guó)專利申請(qǐng)01104591)相連接，并結(jié)合各種化學(xué)修飾，設(shè)計(jì)并篩選出新型的具有更強(qiáng)的具有殺菌和中和內(nèi)毒素活性的變構(gòu)肽。其設(shè)計(jì)思想是BPI模擬肽是通過改變肽分子與LPS的親和力來增加其生物學(xué)活性；比較而言，在現(xiàn)有BPI分子上的改造增加活性的結(jié)果有限。Tat49-57片段對(duì)于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)是最有效的最小片段；迄今為止，有十多種來源于Tat的短肽顯示出可穿過不同細(xì)胞質(zhì)膜的功能。其機(jī)理主要是其兩性特征，穿膜肽可與帶有負(fù)電荷的磷脂或糖脂結(jié)合，且穿膜肽分子中的色氨酸殘基可在脂質(zhì)雙分子層膜誘導(dǎo)反向微團(tuán)的形成(1996，J Biol Chem 271(30)18188-18193)。這些機(jī)理提示，穿膜肽可能具有和LPS結(jié)合的強(qiáng)大能力，畢竟LPS的主要活性成分是脂質(zhì)A。因此，我們?cè)O(shè)想通過穿膜肽和BPI模擬肽的連接，增加其對(duì)LPS的親合能力并結(jié)合其他化學(xué)修飾方法來變構(gòu)BPI模擬肽，以設(shè)計(jì)和篩選出具有更強(qiáng)殺菌和中和LPS活性的多肽分子。
基于此，我們選取中國(guó)授權(quán)專利01104591.4設(shè)計(jì)的66個(gè)具有抗菌/抗內(nèi)毒素和中和LPS活性的BPI模擬肽BNEP9901315KTKGG WLIQL FHKK作為母體分子(BNEP)，對(duì)其碳端(C-terminal，C-端)、氮端(N-端，N-terminal)進(jìn)行化學(xué)修飾，并采用多肽固相合成法、液相合成方法以及這兩種方法的組合，合成具有下列通式的一系列多肽衍生物；R1-BNEP-X(R3)n其中R1可以是H或R2CO；R2可以是C1-C17烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；這些基團(tuán)上可含有下述取代基NH2，CO2H，CO2R4，CONHR5，CONR6R7。
BNEP的肽序?yàn)镵TKGGWLIQLFHKK；X可以是O或NH或N；R3可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R4可以是H，或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R5可以是H，或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R6，R7可以是C1-C6烷基或雜環(huán)或環(huán)烴；n可以是1或2。
選取具有穿膜效應(yīng)(cell penetrating effect)的盡可能短的穿膜肽(CMT)RKKRRQRRR or YGRKKRRQRRR作為另一活性部位(CMT)，BNEP與CMT這兩種活性部位直接相聯(lián)或經(jīng)其它化學(xué)結(jié)構(gòu)分子聯(lián)結(jié)，共同組成母體，并對(duì)其C-端、N-端進(jìn)行化學(xué)修飾，得到具有下列通式的系列衍生物R1-BNEP-CMT-X(R3)n其中R1可以是H或R2CO等；R2可以是C1-C17烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；這些基團(tuán)上可含有下述取代基NH2，CO2H，CO2R4，CONHR5，CONR6R7；BNEP的肽序?yàn)镵TKGGWLIQLFHKK；CMT的肽序?yàn)镽KKRRQRRR或YQRKKRRQRRRX可以是O或NH或N；R3可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R4可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R5可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R6R7可以是C1-C6烷基或雜環(huán)或環(huán)烴；n可以是1或2；R1-CMT-BNEP-X(R3)n其中R1可以是H或R2CO等；R2可以是C1-C17烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；這些基團(tuán)上可含有下述取代基NH2，CO2H，CO2R4，CONHR5，CONR6R7；CMT的肽序?yàn)镽KKRRQRRR或YGRKKRRQRRRBNEP的肽序?yàn)镵TKGGWLIQLFHKK；X可以是O或NH或N；R3可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R4可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R5可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R6，R7可以是C1-C6烷基或雜環(huán)或環(huán)烴；n可以是1或2。
R1-BNEP-Z-CMT-X(R3)n其中R1可以是H或R2CO等；R2可以是C1-C17烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；這些基團(tuán)上可含有下述取代基NH2，CO2H，CO2R4，CONHR5，CONR6R7；BNEP的肽序?yàn)镵TKGGWLIQLFHKK；CMT的肽序?yàn)镽KKRRQRRR或YGRKKRRQRRRZ可以是HN-(CH2)m-CO，HN-(CHR8)m-CO，m＝1-8，R8為烷基，芐基，芳香基，芳雜環(huán)；多肽；X可以是O或NH或N；R3可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R4可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R5可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R6，R7可以是C1-C6烷基或雜環(huán)或環(huán)烴；n可以是1或2。
R1-CMT-Z-BNEP-X(R3)n其中R1可以是H或R2CO等；R2可以是C1-C17烷基，芐基，芳香基，芳雜環(huán)；這些基團(tuán)上可含有下述取代基NH2，CO2H，CO2R4，CONHR5，CONR6R7；BNEP的肽序?yàn)镵TKGGWLIQLFHKK；CMT的肽序?yàn)镽KKRRQRRR或YGRKKRRQRRRZ可以是HN-(CH2)m-CO，HN-(CHR8)m-CO，m＝1-8，R8為烷基，芐基，芳香基，芳雜環(huán)；多肽；X可以是O或NH或N；R3可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R4可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R5可以是H或C1-C6烷基或芐基或芳香基或芳雜環(huán)；R6，R7可以是C1-C6烷基或雜環(huán)或環(huán)烴；n可以是1或2。
必要時(shí)將它們環(huán)化得到環(huán)肽。這些變構(gòu)肽的特點(diǎn)是R1-BNEP-XRn3系列多肽衍生物，具有BNEP的基本特性，又有修飾肽的新特點(diǎn)，期望得到殺菌及中和內(nèi)毒素活性增強(qiáng)的新藥物；R1-BNEP-CMT-X(R3)n，R1-CMT-BNEP-X(R3)n，R1-BNEP-Z-CMT-X(R3)n，R1-CMT-Z-BNEP-X(R3)n，既保留BNEP的殺菌及中和內(nèi)毒素活性，又可有效地將多肽、蛋白質(zhì)分子及DNA片段等通過無受體介導(dǎo)、無耗能的方式導(dǎo)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞并定位于胞質(zhì)及細(xì)胞核的能力(穿膜肽CMT的特性)，從而盡早發(fā)揮BNEP的生物效應(yīng)。
上述抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子可以表現(xiàn)為多肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽類，諸如三氟醋酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、磺酸鹽、氨基酸鹽等。
上述抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子可以表現(xiàn)為多肽的鏈中或端位環(huán)肽。
上述抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子可以表現(xiàn)為各種多肽的鏈中或端位環(huán)肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽類，諸如三氟醋酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、磺酸鹽、氨基酸鹽等。
本發(fā)明的抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子的制法如下1.母體肽樹脂合成通法稱取適量Fmoc-AA-Wang樹脂或其它多肽合成氨基酸樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，or DCM/DMF)溶脹，以10％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。
按照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的氨基酸序列依次稱取適量的Fmoc-氨基酸于適宜的容器中，加入適量DMF溶解，然后加入偶聯(lián)劑(如TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt，DIC/HOBt，DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，etc)和適量氮甲基嗎啉或二異丙基乙胺的DMF溶液。偶聯(lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌肽樹脂；加入20％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。按照多肽固相化學(xué)合成方法依照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體的氨基酸序列從C端開始依次進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)，如此循環(huán)完成整個(gè)抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的肽鏈，得到母體肽樹脂；充分洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素肽衍生物樹脂，置凍干機(jī)中凍干，備用。
2.衍生物制備依據(jù)修飾基團(tuán)的不同，采用不同的合成方法，制備得到全保護(hù)的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽衍生物，得到的粗肽經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)純化得精肽，精肽成鹽，質(zhì)譜鑒定和HPLC檢查純度，進(jìn)行生物活性鑒定。
2.1氮端?；；噭┖芏?，最常見的試劑組合有(RCO)2O/pyridine；RCO2H/activatingreagent(激活劑)。常見的激活劑有DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt，DIC/HOBt，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，DIC/HOSu，PyBOP/HOSu。
將抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，orDCM-DMF)溶脹，抽干，加入20％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除肽樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。加入?；噭┑腄MF溶液，攪拌或通氮?dú)饣蛘袷?，控溫。偶?lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素肽衍生物樹脂，置凍干機(jī)中凍干。加入適量裂解液，攪拌，反應(yīng)2-5小時(shí)，無水乙醚沉降，離心；加入無水乙醚，攪勻，離心，重復(fù)6次。加水或50％醋酸水溶液，凍干。HPLC純化，成鹽或凍干，質(zhì)譜儀測(cè)分子量，HPLC檢查純度及離子含量。
2.2取代肽酰胺將抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，DCM-DMF，THF，THF/DMF)溶脹，抽干。加入胺基化試劑的DMF溶液，攪拌或通氮?dú)?，控溫。酰胺化完成后，抽濾，除去反應(yīng)液，以DMF、MeOH、THF、Et2O依次洗滌，濾液合并，旋蒸至干或置凍干機(jī)中凍干。加入適量裂解液，攪拌，反應(yīng)2-5小時(shí)，無水乙醚沉降，離心；加入無水乙醚，攪勻，離心，重復(fù)6次。加水或50％醋酸水溶液，凍干。HPLC純化，成鹽或凍干，質(zhì)譜儀測(cè)分子量，HPLC檢查純度及離子含量。
2.3肽酯將抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，DCM-DMF，THF，THF-DMF)溶脹，抽干。加入酯化試劑的DMF溶液，攪拌或通氮?dú)?，控溫。酯化完成后，抽濾，除去反應(yīng)液，以DMF、MeOH、THF、Et2O依次洗滌，濾液合并，旋蒸至干或置凍干機(jī)中凍干。加入適量裂解液，攪拌，反應(yīng)2-5小時(shí)，無水乙醚沉降，離心，重復(fù)6次。加水或50％醋酸水溶液，凍干。HPLC純化，成鹽或凍干，質(zhì)譜儀測(cè)分子量，HPLC檢查純度及離子含量。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的生物活性研究本發(fā)明還通過測(cè)定本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽對(duì)部分人源病菌的體外殺菌活性、體外拮抗內(nèi)毒素活性(對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用)、體外對(duì)幾種農(nóng)業(yè)致病菌的抑制活性，以便研究其用于G-細(xì)菌感染、人內(nèi)毒素血癥治療以及植物病原菌防治，以便探索既能殺菌又能中和內(nèi)毒素的新藥物。
體外試驗(yàn)表明，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽在體外對(duì)金葡ATCC 25923、金葡318MRS、金葡321、金葡453、金葡464、金葡465、表葡370、表葡372、大腸ATCC 25922、大腸249、大腸339、大腸355、大腸405、大腸467、綠膿耐藥、328綠膿406、綠膿433、綠膿451等細(xì)菌均有不同程度的殺菌活性；在體外，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽對(duì)LPS在體外均具有不同程度中和作用，不同的衍生物對(duì)LPS的中和作用存在差異，對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞腫瘤TNF-α的分泌具有不同程度的抑制作用，可以用于治療G-細(xì)菌感染和人內(nèi)毒素血癥。不同衍生物對(duì)水稻白葉枯病菌、細(xì)菌性條斑病菌的抑制作用不同。本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽可以輔以藥用稀釋劑、佐劑及載體制成藥用組合物，如片劑、粉劑、丸劑、溶液或懸浮劑，通過口含、注射或其他方式給藥，用于治療G-細(xì)菌感染和內(nèi)毒素血癥以及植物病原菌防治；本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽還可與其他藥物復(fù)合，用于治療G-細(xì)菌感染和內(nèi)毒素血癥以及植物病原菌防治。
本發(fā)明所述抗菌/抗內(nèi)毒素肽衍生物在于制備殺滅細(xì)菌藥物和治療內(nèi)毒素血癥以及植物病原菌防治藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽作為稀釋劑、佐劑及載體用于治療G-細(xì)菌感染和人內(nèi)毒素血癥以及植物病原菌防治。
至少兩個(gè)相同或不同的本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽相連成一個(gè)肽，用于治療G-細(xì)菌感染和內(nèi)毒素血癥以及植物病原菌防治。
另外，至少兩個(gè)相同或不同的本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽相連成一個(gè)肽，可以作為稀釋劑、佐劑及載體用于治療G-細(xì)菌感染以及植物病原菌防治。


圖1-1、本發(fā)明的部分BNEP變構(gòu)肽對(duì)枯草桿菌的抑制作用圖。
圖1-2、本發(fā)明的部分BNEP變構(gòu)肽對(duì)細(xì)菌性條斑病的抑制作用圖。
圖1-3、本發(fā)明的部分BNEP變構(gòu)肽對(duì)水稻白葉枯病菌的抑制作用圖。
圖2、本發(fā)明的BNEP1#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖3、本發(fā)明的BNEP3#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖4、本發(fā)明的BNEPCMT-04-2多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖5、本發(fā)明的BNEP6#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖6、本發(fā)明的BNEPCMT-03-2a多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖7、本發(fā)明的BNEPCMT-04-2a多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖8、本發(fā)明的BNEP9#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖9、本發(fā)明的BNEP10#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖10、本發(fā)明的BNEP11#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖11、本發(fā)明的BNEP24#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖12、本發(fā)明的BNEPCMT-03多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖13、本發(fā)明的BNEP26#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖14、本發(fā)明的BNEP27#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖15、本發(fā)明的BNEP31#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖16、本發(fā)明的BNEP50#多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
圖17、本發(fā)明的polymyxin對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用圖。
實(shí)施例下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的優(yōu)選實(shí)施例是用于描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1本實(shí)施例涉及Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625的合成，用以說明本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的合成與純化方法。
1.Fmoc-BNEP-Ahx-CMT-030625肽樹脂的合成稱取2.420g(0.5mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-Wang Resin-030620倒入合成柱中，加入35mL DCM-DMF(1∶2，v/v)溶脹。30min后抽出溶劑，以15mL 30％六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，15min后用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。稱取1.301g Fmoc-Arg(Pbf)-OH于100mL錐形瓶中，加入10mL DMF溶解，分批加入0.780gTBTU、0.328g HOBt和35mL 25％二異丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮檢測(cè)反應(yīng)過程。偶聯(lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌肽樹脂；加入20％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。按照類似的方法，投入3mmol的后續(xù)Fmoc保護(hù)的氨基酸、4mmol TBTU及4mmolHOBt，繼續(xù)偶聯(lián)。反應(yīng)完成后，脫除Fmoc，洗滌，依照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體的氨基酸序列從C端開始依次進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)，如此循環(huán)完成整個(gè)抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的肽鏈，得到母體肽樹脂；充分洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素肽衍生物樹脂，置凍干機(jī)中凍干，得肽樹脂3.5g。
取出1g肽樹脂，加入30mL DCM，溶脹，30min后抽干，加入20mL 30％六氫吡啶的DMF溶液脫除肽樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。常規(guī)裂解[裂解劑(Reagent R)TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，15mL；室溫，3小時(shí)]，無水乙醚多次沉降得粗肽BNEP-Ahx-CMT-CP-030625-S-W 403mg，粗肽純度87.53％，MALDI-TOF-MS3119.3；證明母體合成成功。
2.Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625的合成2.5g Fmoc-BNEP-Ahx-CMT-030625肽樹脂，加入35mL 30％哌啶的DMF溶液脫除肽樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。脫去Fmoc保護(hù)基后，取出1.691g(0.35mmol)BNEP-Ahx-CMT-030625樹脂，加入20mL DMF，滴入含有0.945mL(40eq.)Ac2O、1.6mL(80eq.)Pyridine的10mL DMF溶液對(duì)N-端進(jìn)行乙酰化，攪拌，控溫。茚三酮檢測(cè)，3h樹脂已透明，表明乙?；瓿?。除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625肽樹脂，抽干，稱重得2.503g乙?；臉渲?br> 3.Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625肽樹脂裂解2.503g Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625肽樹脂，加入35mL裂解劑R，攪拌，室溫反應(yīng)3.5小時(shí)，400mL無水乙醚沉降，離心；加入150mL無水乙醚，攪勻，離心，重復(fù)4次。加50％醋酸水溶液55mL，冷凍干燥得Ac-BNEP-Ahx-CMT-CP-0306251023mg，收率92.5％，HPLC純度80.15％，MALDI-TOF-MS 3161.4。證明衍生物合成成功，得到具有下列肽序的產(chǎn)物其修飾基及肽序?yàn)镃H3CO-KTKGGWLIQLFHKK-NH(CH2)5CO-RKKRRQRRR-OH4.Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625粗肽純化Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625粗肽，加少量無熱原純水使粗肽充分溶解，得到0.5mg/mL濃度的樣品溶液，經(jīng)針式濾器過濾(0.45μm有機(jī)濾膜)，收集濾液，按下述色譜條件純化。
儀 器Dionex P680分析柱Vydac反相C18 201SP54(4.6mm×150mm)流動(dòng)相AH2O+0.1％TFA BACN流 速5mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)214nm洗脫梯度30％ACN→38％ACN 20minHPLC純化，得精肽Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625354.7mg，收率45.0％。
實(shí)施例2本實(shí)施例涉及本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的乙酰化合成。
乙酰化通法肽樹脂以30％左右哌啶脫去Fmoc保護(hù)基后，以DMF、DCM、MeOH等充分洗滌。加入適量DMF溶脹樹脂，慢慢滴加乙酸酐(Ac2O)-吡啶的DCM溶液，通氮，室溫反應(yīng)。茚三酮監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完成后抽濾、常規(guī)洗滌、真空干燥。選定方法裂解，得粗肽；HPLC法純化，凍干，得純品。質(zhì)量檢驗(yàn)(純度、含量)，質(zhì)譜測(cè)分子量。
1.Ac-CMT-BNEP(15)按照乙?；ǚ?，Ac-CMT-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。裂解均是在Reagent R中添加TES 2mL，裂解時(shí)間為170min。
Table 2 preparative conditions and results of Ac-CMT-BNEP-040321

2.Ac-CMT-Ahx-BNEP(22)按照乙?；ǚǎ珹c-CMT-Ahx-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。裂解均是在Reagent R中添加TES 2mL，裂解時(shí)間為160min。
Table 3 preparative conditions and results of Ac-CMT-Ahx-BNEP-040321

1.841g Ac-CMT-Ahx-BNEP-030812-pr常規(guī)裂解，得到粗肽691mg，HPLC純度54.47％，MALDI-TOF-MS 3161.3；純化成鹽后得精肽66.6mg，純度98.0％；1.165gAc-CMT-Ahx-BNEP-030705-pr常規(guī)裂解，得到粗肽597mg，HPLC純度60.37％，MALDI-TOF-MS 3161.2；純化成鹽后得精肽93.3mg，純度98.0％；其修飾基及肽序?yàn)镃H3CO-RKKRRQRRR-NH(CH2)5CO-KTKGGWLIQLFHKK-OH3.Ac-BNEP-CMT(29)按照乙酰化通法，Ac-BNEP-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 4 preparative conditions and results of Ac-BNEP-CMT-040108

實(shí)施例3本實(shí)施例涉及本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的丁二酸單酰化合成。
丁二酸單酰化通法肽樹脂以30％左右哌啶脫去Fmoc保護(hù)基后，以DMF、DCM、MeOH等充分洗滌。以適量DMF溶脹樹脂，慢慢滴加丁二酸酐(Suc2O)或丁二酸酐-吡啶的DCM溶液，通氮，室溫反應(yīng)。茚三酮監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完成后抽濾、常規(guī)洗滌、真空干燥。選定方法裂解，得粗肽；HPLC法純化，凍干，得純品。質(zhì)量檢驗(yàn)(純度、含量)，質(zhì)譜測(cè)分子量。
1.Suc-CMT-BNEP(16)按照丁二酸單酰化通法，Suc-CMT-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。肽樹脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.2mL，裂解時(shí)間為230min。
Table 5 preparative conditions and results of Suc-CMT-BNEP-040321

其修飾基及肽序?yàn)镠OOC-CH2CH2CO-RKKRRQRRR-KTKGGWLIQLFHKK-OH2.Suc-BNEP-CMT按照丁二酸單?；ǚǎ琒uc-BNEP-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 6 preparative conditions-d results of Suc-BNEP-CMT-040108

3.Suc-BNEP-Ahx-CMT(37)按照丁二酸單酰化通法，Suc-BNEP-Ahx-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 7 preparative conditions and results of Suc-BNEP-Ahx-CMT-040108

4.Suc-CMT-Ahx-BNEP(51)按照丁二酸單?；ǚǎ琒uc-CMT-Ahx-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。裂解是在Reagent R中添加TES 1.2mL，裂解時(shí)間縮短為72min。
Table 8 preparative conditions and results of Suc-CMT-Ahx-BNEP-040321

其修飾基及肽序?yàn)镠OOC-CH2CH2CO-RKKRRQRRR-NH(CH2)5CO-KTKGGWLIQLFHKK-OH實(shí)施例4本實(shí)施例涉及本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的棕櫚酰化、硬脂?；铣伞?br> 硬脂酰、棕櫚酰化通法肽樹脂以15％左右哌啶脫去Fmoc保護(hù)基后，以DMF、DCM、MeOH等充分洗滌。以適量DMF溶脹樹脂，加入硬脂酸(stearic acid)或棕櫚酸(palmiticacid)、HBTU或TBTU或PyBOP、HOBt的DMF溶液，通氮，滴入TEA-DMF溶液，室溫反應(yīng)。茚三酮監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完成后抽濾、常規(guī)洗滌、真空干燥。選定方法裂解，得粗肽；HPLC法純化，凍干，得純品。質(zhì)量檢驗(yàn)(純度、含量)，質(zhì)譜測(cè)分子量確證。
1.C15H31CO-BNEP(5)按照通法，C15H31CO-BNEP-031020的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 9 preparative conditions and results of C15H31CO-BNEP-031020(TBTU method)

Table 10 preparative conditions and results ofC15H31CO-BNEP-031020(PyBOP method)

其修飾基及肽序?yàn)镃H3(CH2)14CO-KTKGGWLIQLFHKK-OH2.C17H35CO-BNEP(6)按照通法，C17H35CO-BNEP-040206的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 11 preparative conditions and results of C17H35CO-BNEP-040206(HBTU method)

Table 12 preparative conditions and results of C17H35CO-BNEP-040206(PyBOP method)

3.C17H35CO-CMT-BNEP(17)按照硬脂?；ǚ?，C17H35CO-CMT-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。肽樹脂裂解是在Reagent R中添加TES 1.1mL，裂解時(shí)間為180min。
Tabl 13 preparative conditions and results of C17H35CO-CMT-BNEP-040321

其修飾基及肽序?yàn)镃H3(CH2)16CO-RKKRRQRRR-KTKGGWLIQLFHKK-OH4.C17H35CO-CMT-Ahx-BNEP(23)按照硬脂?；ǚ?，C17H35CO-CMT-Ahx-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。裂解是在Reagent R中添加TES 0.7mL，裂解時(shí)間為60min。
Table 14 preparative conditions and results of C17H35CO-CMT-Ahx-BNEP-040321

1.60g F-CMT-Ahx-BNEP-030812-pr硬脂?；蟮肅17H35CO-CMT-Ahx-BNEP-030812-pr 1.64g，常規(guī)裂解，得到粗肽681mg，HPLC純度89.58％，MALDI-TOF-MS 3385.6；純化成鹽后得精肽30.6mg，純度92.3％。
5.C15H31CO-BNEP-CMT(31)按照棕櫚酰化通法，C15H31CO-BNEP-CMT-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 15 preparative conditions and results of C15H31CO-BNEP-CMT-040108

其修飾基及肽序?yàn)镃H3(CH2)14CO-KTKGGWLIQLFHKK-RKKRRQRRR-OH6.C15H31CO-BNEP-Ahx-CMT(38)取肽樹脂BNEP-Ahx-CMT-030728-pr 2.3g(0.25mmol)對(duì)N端用棕櫚酸進(jìn)行修飾。按照棕櫚酸∶樹脂＝10∶1，TBTU/HOBt∶棕櫚酸＝0.6∶1的摩爾比投料，32℃反應(yīng)3h，茚三酮檢測(cè)，樹脂由淺黃色變?yōu)闊o色透明。從2.3g肽樹脂取出1.02g，加入22mL Reagent R，常規(guī)裂解。冷凍干燥得C15H31CO-BNEP-Ahx-CMT-CP-030728413mg，純度53.97％MALDI-TOF-MS 3357.7；HPLC純化后成鹽，得精肽64.5mg，純度99.7％。
C15H31CO-BNEP-Ahx-CMT-040108批次的制備條件及結(jié)果見下表。
Table 16 C15H31CO-BNEP-Ahx-CMT-040108

7.C17H35CO-BNEP-Ahx-CMT(39)操作同C15H31CO-BNEP-Ahx-CMT(38)。2.3g BNEP-Ahx-CMT-030728肽樹脂，32℃反應(yīng)18h，茚三酮監(jiān)測(cè)，樹脂由淺黃色變?yōu)闊o色透明。1.93g肽樹脂加入25mLReagent R，常規(guī)裂解。冷凍干燥得C17H35CO-BNEP-Ahx-CMT-CP-030728360mg，純度69.96％，MALDI-TOF-MS 3386.6；HPLC純化后成鹽，得精肽90.5mg，純度96.1％。
實(shí)施例5本實(shí)施例涉及本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的6-(N-芴甲酰)氨基己?；?br> 6-(N-芴甲酰)氨基己?；ǚ臉渲?0％左右哌啶脫去Fmoc保護(hù)基后，以DMF、DCM、MeOH等充分洗滌。以適量DMF溶脹樹脂，加入6-(N-芴甲酰)氨基己酸(Fmoc-Ahx-OH)、TBTU或PyBOP、HOBt的DMF溶液，通氮，滴入TEA-DMF溶液，室溫反應(yīng)。茚三酮監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完成后抽濾、常規(guī)洗滌、真空干燥。選定方法裂解，得粗肽；HPLC法純化，凍干，得純品。質(zhì)量檢驗(yàn)(純度、含量)，質(zhì)譜測(cè)分子量確證。
1.Fmoc-Ahx-BNEP(7)按照通法，F(xiàn)moc-Ahx-BNEP-040212的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 17 preparative conditions and results of F-Ahx-BNEP-040212

其修飾基及肽序?yàn)镕moc-NH(CH2)5CO-KTKGGWLIQLFHKK-OH2.Fmoc-Ahx-CMT-BNEP(19)按照6-(N-芴甲酰)氨基己?；ǚǎ現(xiàn)-Ahx-CMT-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。肽樹脂裂解是在Reagent R中添加TES 1.2mL，裂解時(shí)間為100min。
Table 18 preparative conditions and results of F-Ahx-CMT-BNEP-040321

3.Fmoc-Ahx-CMT-Ahx-BNEP(24)按照6-(N-芴甲酰)氨基己?；ǚ?，F(xiàn)-CMT-Ahx-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。肽樹脂裂解是在Reagent R中添加TES 1.2mL，裂解時(shí)間為100min。
Table 19 preparative conditions and results of F-Ahx-CMT-Ahx-BNEP-040321

4.Fmo-Ahx-BNEP-CMT(33)按照6-(N-芴甲酰)氨基己?；ǚ?，F(xiàn)-Ahx-BNEP-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 20 preparative conditions and results of F-Ahx-BNEP-CMT-040108

其修飾基及肽序?yàn)镕moc-NH(CH2)5CO-KTKGGWLIQLFHKK-RKKRRQRRR-OH5.Fmoc-Ahx-BNEP-Ahx-CMT(40)按照6-(N-芴甲酰)氨基己?；ǚ?，F(xiàn)-Ahx-BNEP-Ahx-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 21 preparative conditions and results of F-Ahx-BNEP-Ahx-CMT-040108

實(shí)施例6本實(shí)施例涉及本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的6-氨基己?；?br> 6-氨基己?；ǚò凑?-(N-芴甲酰)氨基己?；ǚ?，制備Fmoc-Ahx-peptideresin，25％左右哌啶脫去Fmoc保護(hù)基，DMF、DCM、MeOH等充分洗滌，得到Ahx-peptide resin。真空干燥后，選定方法裂解，得粗肽；HPLC法純化，凍干，得純品。質(zhì)量檢驗(yàn)(純度、含量)，質(zhì)譜測(cè)分子量確證。
1.Ahx-BNEP按照通法，Ahx-BNEP-031020的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 22 preparative conditions and results of Ahx-BNEP-031020

2.Ahx-CMT-BNEP(18)按照6-氨基己?；ǚ?，Ahx-CMT-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。肽樹脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.2mL，裂解時(shí)間為100min。
Table 23 preparative conditions and results of Ahx-CMT-BNEP-040321

3.Ahx-CMT-Ahx-BNEP(25)按照6-氨基己?；ǚǎ珹hx-CMT-Ahx-BNEP-040321的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。肽樹脂裂解是在Reagent R中添加TES 1.2mL，裂解時(shí)間為100min。
Table 24 preparative conditions and results of Ahx-CMT-Ahx-BNEP-040321

其修飾基及肽序?yàn)镠2N(CH2)5CO-RKKRRQRRR-HN(CH2)5CO-KTKGGWLIQLFHKK-OH4.Ahx-BNEP-CMT(32)按照6-氨基己酰化通法，Ahx-BNEP-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 25 preparative conditions and results ofAhx-BNEP-CMT-040108

5.Ahx-BNEP-Ahx-CMT(41)按照6-氨基己?；ǚǎ珹hx-BNEP-Ahx-CMT-040108的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見下表。
Table 26 preparative conditions and results of Ahx-BNEP-Ahx-CMT-040108

實(shí)施例7本實(shí)施例涉及本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的乙胺化。
乙胺解通法以DMF溶漲一定量肽樹脂，加入足量乙胺水溶液(70％EtNH2.H2O)，搖動(dòng)一段時(shí)間，室溫放置。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。抽濾，DMF洗滌，濾液合并?？販匦艚?，適宜溶劑溶解，再旋蒸至干；或者濃縮，加入無水乙醚，沉降完全后冷藏，倒出上清液，殘余固體以溶劑溶解，再次沉降、冷藏，過濾，干燥。如此得到的乙胺解全保護(hù)肽，選定方法裂解，得粗肽；HPLC法純化，凍干，得純品。質(zhì)量檢驗(yàn)(純度、含量)，質(zhì)譜測(cè)分子量確證。
1.Ac-Ahx-BNEP-NHEt(10)1.900g(0.80mmol)Ac-Ahx-BNEP-WR-040102，加入30mLDMF，搖勻后滴加19mL 70％EtNH2.H2O，搖動(dòng)一段時(shí)間，室溫放置。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。22℃、28h后，抽濾，DMF洗滌樹脂4次，濾液合并。50℃旋蒸近干，DCM溶解，再旋蒸至干，真空干燥得乙胺解全保護(hù)肽1.538g，收率66.7％。加入20mL經(jīng)典裂解試劑(Reagent RTFA/thioanisole/anisole/EDT，90∶5∶3∶2，v/v)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，沉降抽干得粗肽813mg；HPLC法純化，凍干，得純品137.4mg，純度87.84％。
其修飾基及肽序?yàn)镃H3CO-NH(CH2)5CO-KTKGGWLIQLFHKK-NHCH2CH32.BNEP-NHEt(11)1.496g(0.632mmol)Fmoc-BNEP-pr-031112-S-W，加入12mL DMF，搖勻后滴加16mL 70％EtNH2.H2O，搖動(dòng)一段時(shí)間，室溫放置。20℃、69h后，抽濾，DMF洗滌樹脂2次，濾液合并。50℃旋蒸近干，MeOH溶解，再旋蒸至干，真空干燥得去Fmoc乙胺解全保護(hù)肽1.208g，收率70.4％。加入20mL裂解試劑Reagent R于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2.5h，沉降抽干得粗肽491mg；HPLC法純化，凍干，得純品102.5mg，純度92.80％.
3.BNEP-CMT-NHEt(28)1.421g(0.449mmol)Fmoc-BNEP-CMT-Pr-040108-S-W，加入18mL DMF，搖勻后滴加18mL 70％EtNH2.H2O，搖動(dòng)一段時(shí)間，室溫放置。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。28℃50h后，抽濾，DMF洗滌樹脂2次，濾液合并。50℃旋蒸近干，MeOH溶解，再旋蒸至干，真空干燥得去Fmoc的乙胺解全保護(hù)肽1.30g，收率46.7％。加入26mL經(jīng)典裂解試劑(Reagent R)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，沉降抽干得粗肽1400mg(102.8％)；HPLC法純化，凍干，得純品172.7mg。
4.BNEP-Ahx-CMT-NHEt(42)1.476g(0.466mmol)Fmoc-BNEP-Ahx-CMT-WR-040102，加入14mL DMF，搖勻后滴加15mL 70％EtNH2.H2O，搖動(dòng)一段時(shí)間，室溫放置。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。22℃61h后，抽濾，DMF洗滌樹脂4次，濾液合并。50℃旋蒸近干，DCM溶解，再旋蒸至干，真空干燥得去Fmoc乙胺解全保護(hù)肽1.40g，收率47.5％。加入25mL經(jīng)典裂解試劑(Reagent R)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，沉降凍干得粗肽1500mg(102.2％)；HPLC法純化，凍干，得純品154.6mg，總收率10.5％。
其修飾基及肽序?yàn)镵TKGGWLIQLFHKK-NH(CH2)5CO-RKKRRQRRR-NHCH2CH3實(shí)施例8本實(shí)施例涉及本發(fā)明的部分抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽對(duì)部分人源病菌的抑制試驗(yàn)。
1.實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)所用菌株均為2004年1月～2004年2月第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床分離致病菌，由西南醫(yī)院檢驗(yàn)科分離并鑒定。其中金黃色葡萄球菌7株、銅綠假單胞菌7株、表皮葡葡球菌2株、大腸埃希菌7株、肺炎克雷伯菌4株，共計(jì)27株。用標(biāo)準(zhǔn)菌大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853作質(zhì)控菌。
2.培養(yǎng)基和試劑Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基(液體、固體)，中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品(批號(hào)010925)。
磷酸鹽緩沖液(PBS)磷酸氫二鉀8.17g，磷酸二氫鉀0.87g，加入蒸餾水1000ml，用0.1N NaOH調(diào)pH為6.0。
3.儀器多點(diǎn)接種儀(日本倉(cāng)光株式會(huì)社生產(chǎn))電子天平(Sartorius，德國(guó))pH計(jì)(Beckman 21，USA)可調(diào)移液器(eppendorf，USA)4.實(shí)驗(yàn)方法4.1供試液制備精密稱取1-10號(hào)待測(cè)多肽樣品于2ml容量瓶中，分別用pH6.0磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，配成主藥含量為3840mg/L儲(chǔ)備液。
4.2試驗(yàn)菌液制備實(shí)驗(yàn)前，從保存菌種的半固體培養(yǎng)基(或斜面)上取適量的菌苔，接種在MH培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)16～18h，再挑取新鮮的單個(gè)菌落接種在MH肉湯培養(yǎng)基中，于37℃增菌培養(yǎng)16～18h，取出，每管菌液用MH肉湯培養(yǎng)基分別稀釋為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(含菌量107-8CFU/ml)，保持菌液最終接種量為每點(diǎn)104-5CFU。
4.3最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定采用瓊脂二倍稀釋法，將藥物含量為3840mg/L的儲(chǔ)備液用pH6.0PBS倍比稀釋成系列濃度，分別取1ml放入直徑90mm的平皿中，加入14ml熔化的MH瓊脂培養(yǎng)基，混勻，即得主藥含量分別為256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125mg/L的系列瓊脂平皿，待瓊脂凝固后，用多點(diǎn)接種儀在含藥瓊脂平皿及空白瓊脂平皿表面點(diǎn)種細(xì)菌，37℃孵育24h觀察結(jié)果，未見細(xì)菌生長(zhǎng)的平皿內(nèi)的最小藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。
Table 27 BNEP衍生物對(duì)部分人源病菌的抑制試驗(yàn)(MICmg/L)


實(shí)施例9本實(shí)施例涉及本發(fā)明的部分抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽對(duì)幾種農(nóng)業(yè)致病菌的抑制活性。
1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1部分變構(gòu)肽1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株枯草芽孢桿菌MIG1.22(Bacillus subtilis)細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas campestris)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)以上菌種全部由廣東省農(nóng)科院植保所提供。
1.1.3培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基精瓊脂粉(進(jìn)口分裝)15克，蛋白胨3克，葡萄糖3克，磷酸氫二鉀4克，去離子水1000ml，調(diào)pH＝7.0，121℃滅菌30分鐘。
Miller V-8碳酸鈣培養(yǎng)基V-8液200ml，碳酸鈣2克，瓊脂20克，去離子水800ml，先用金屬絲網(wǎng)過濾，再經(jīng)幾層紗布過濾兩次和脫脂棉過濾。最后經(jīng)過Buchner漏斗上Whatman 1號(hào)濾紙濾成清夜。用250ml三角瓶每瓶?jī)?nèi)盛95ml培養(yǎng)液，在121℃滅菌15分鐘。pH＝6.4-6.7。如配制固體培養(yǎng)基，每升液內(nèi)加瓊脂20克，供培養(yǎng)疫霉菌用。
PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200克，葡萄糖15克，瓊脂20克，去離子水1000ml。自然pH，121℃滅菌30分鐘。
協(xié)本氏馬鈴薯半合成培養(yǎng)基馬鈴薯300克，硝酸鈣0.5克，磷酸氫二鈉2克，蛋白胨5克，蔗糖15克，瓊脂18克，去離子水1000ml。自然pH，121℃滅菌30分鐘。
1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備303-DB型隔水式培養(yǎng)箱，南通科學(xué)儀器廠
XDD-84立式電熱壓力蒸汽消毒器，浙江紹興醫(yī)療器械廠BS200電子分析天平，德國(guó)賽多維斯公司1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1多肽溶液準(zhǔn)備按無菌操作將1-10號(hào)待測(cè)多肽用滅菌水稀釋至50mg/ml。
1.3.2紙片法用打孔器在定量濾紙上打孔，得到直徑5mm的圓形濾紙片，裝于培養(yǎng)皿中121℃滅菌30min備用。用移液槍每次取2.5μl浸濕濾紙片，然后將濾紙片靜置晾干，平鋪于已倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。檢測(cè)下一待測(cè)液之前注意換取槍頭。
1.3.3對(duì)枯草桿菌的抑制作用測(cè)定1.3.3.1枯草桿菌孢子懸液的制備將儲(chǔ)藏的枯草桿菌用劃線法接入裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的茄子瓶中，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，用無菌水100ml將枯草桿菌及其孢子洗入滅菌的250ml三腳瓶中，制成懸液。用水浴鍋將懸液于70℃保溫30min，滅殺營(yíng)養(yǎng)體，保留孢子。
1.3.3.2用紙片法測(cè)定抑菌圈直徑，每個(gè)樣品3次重復(fù)。用無菌水作為對(duì)照。
1.3.4對(duì)細(xì)菌性條斑病菌、白葉枯病菌抑制作用測(cè)定將培養(yǎng)基倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，冷凝后待用。用無菌水3ml洗在試管斜面上培養(yǎng)好的供試菌株，取0.2ml滴在培養(yǎng)基上，用滅過菌的涂布棒涂勻，待干后用紙片法測(cè)定抑菌圈半徑，用無菌水作為對(duì)照。
對(duì)細(xì)菌性條斑病菌和水稻白葉枯病菌抑制作用檢測(cè)用協(xié)本氏馬鈴薯半合成培養(yǎng)基。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過大量的試驗(yàn)，得到了一些初步結(jié)果，有的表現(xiàn)為良好的開發(fā)前景，部分不如人意?？傮w而言，BNEP衍生物的醋酸鹽，結(jié)果較為明確，而其三氟醋酸鹽，尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。
2.1對(duì)枯草桿菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同衍生物對(duì)枯草桿菌的抑制作用不同(見表1-1，圖1-1)。
Table 1-1不同衍生物對(duì)枯草桿菌生長(zhǎng)的抑制作用效果

2.2對(duì)細(xì)菌性條斑病菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同衍生物對(duì)細(xì)菌性條斑病菌的抑制作用不同(見表1-2，圖1-2)。
Table 1-2不同衍生物對(duì)細(xì)菌性條斑生長(zhǎng)的抑制作用效果

2.3對(duì)水稻白葉枯病菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同衍生物對(duì)水稻白葉枯病菌的抑制作用不同(見表1-3，圖1-3)。
Table 1-3不同衍生物對(duì)水稻白葉枯病菌生長(zhǎng)的抑制作用效果

3 BNEP及其衍生物對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的MIC/MBC測(cè)定3.1藥物和菌液的準(zhǔn)備A.藥物的準(zhǔn)備在無菌間分別用無菌水、PBS緩沖液將1-14號(hào)、13c-27號(hào)待測(cè)多肽樣品溶解配制成含量為2mg/ml母液(簡(jiǎn)稱藥液)。將已配制藥液進(jìn)行二倍遞減濃度稀釋(倍比稀釋法)，每個(gè)樣品作10個(gè)倍比稀釋濃度(2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.063，0.031，0.016，0.0078，0.0039mg/ml)，得儲(chǔ)存液，待用。
B.菌液的制備將供試菌在協(xié)本氏液體培養(yǎng)基中于28℃以220r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期OD600為0.5左右。用2×培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)濃度(105CFU/ml)。
細(xì)菌計(jì)數(shù)預(yù)實(shí)驗(yàn)將制備菌液用生理鹽水進(jìn)行10倍順序稀釋(10-1、10-2、10-3)，取0.1ml菌液至平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布棒輕輕將菌液攤開，培養(yǎng)24小時(shí)，數(shù)菌落數(shù)目。
3.2MIC測(cè)定以微量稀釋法進(jìn)行。在無菌間將每種藥物的10個(gè)倍比稀釋濃度儲(chǔ)存液(2mg/ml-3.9μg/ml)以微量加樣器依次加入經(jīng)滅菌的8×12孔U形96孔板內(nèi)，每孔75μl，然后接種75μl稀釋菌液，第11孔為菌對(duì)照孔(僅加液體培養(yǎng)基和菌液)，第12孔為多肽藥液對(duì)照孔(僅加多肽藥液)，28℃孵育24～48小時(shí)，在黑色背景下觀察結(jié)果。如加入指示菌的藥液孔仍為澄清，則該孔藥物有抗菌作用。以肉眼觀察同一行無菌生長(zhǎng)的最低濃度孔，定義為MIC(mg/ml)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
3.3MBC觀察藥物最低抑菌濃度以上未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)物，分別吸取100μl，移種至平皿瓊脂培養(yǎng)基上，28℃孵育24～48小時(shí)，直接觀察有無菌落形成。MBC定義為無菌落形成的最低藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
Table 1各肽對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的MIC，MBC


實(shí)施例10本實(shí)施例涉及本發(fā)明的部分抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用。
眾所周知，細(xì)胞受到內(nèi)毒素LPS攻擊時(shí)，會(huì)主動(dòng)應(yīng)激發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生一系列炎癥因子如腫瘤壞死因子TNF-a、白細(xì)胞介素IL-1，IL-2，IL-6，IL-8等。TNF-a的檢查，可考察BNEP衍生物多肽對(duì)LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用。
1.試驗(yàn)一1.1材料與主要儀器1.1.1合成肽送樣編號(hào)為1、3、4、CMT-04-2、6、CMT-03-2a、CMT-04-2a、9、10、11、CMT-03、17、18、19a、20b、21、22、23、24、25、26、27的BNEP衍生物多肽；1.1.2其它試劑細(xì)胞株THP-1/CD14細(xì)胞株由第一軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供；LPS 7261Sigma公司產(chǎn)品TNF-a檢測(cè)試劑盒eBioscience公司產(chǎn)品；多粘菌素B(polymyxin B sulfate，PB)購(gòu)自深圳晶美公司；IMDM培養(yǎng)液Invitrogen公司產(chǎn)品1.1.3主要儀器恒溫孵育箱Thermo Forma Model 311196孔細(xì)胞培養(yǎng)板Falcon酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(ELISA A450值測(cè)定儀)BIO-RAD Model 550倒置顯微鏡COIC XDS-1(重慶光學(xué)儀器廠)電子天平Sartorius BP61
移液槍GILSON1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞試驗(yàn)培養(yǎng)THP-1/CD14細(xì)胞，稀釋為1X105/孔鋪板，37℃、5％CO2孵育24h；吸去培養(yǎng)液，將上述編號(hào)的BNEP部分衍生物多肽以IMDM培養(yǎng)液稀釋為50、10、2、0.4ug/ml(注17號(hào)以后的合成肽稀釋為100、20、4、0.8ug/ml)，加入培養(yǎng)孔內(nèi)100ul/孔，孵育30min；將LPS 7261稀釋為200ng/ml，加入培養(yǎng)孔內(nèi)100ul/孔，設(shè)定對(duì)照組；37℃、5％CO2孵育6h后，吸取上清，離心，將上清按照試劑盒說明檢測(cè)TNF-a。
1.2.2TNF-a檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行。
1.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果合成肽抑制試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下依次為1、3、4、CMT-04-2、6、CMT-03-2a、CMT-04-2a、9、10、11、CMT-03、17、18、19a、20b、21、22、23、24、25、26、27。表中A行1、2、3、4列是1號(hào)肽濃度對(duì)應(yīng)于50、10、2、0.4ug/ml的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D行9、10、11、12列是17號(hào)肽濃度對(duì)應(yīng)于100、20、4、0.8ug/ml的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；H行5、6、7、8列是PB濃度對(duì)應(yīng)于50、10、2、0.4ug/ml的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；H-9、10為無肽對(duì)照孔。
Table 2 TNF-a檢測(cè)結(jié)果(OD450)
2.試驗(yàn)二2.1材料與主要儀器2.1.1合成肽送樣編號(hào)1、3、4、CMT-03-2a、CMT-04-2a、16、28-50號(hào)BNEP部分衍生物多肽；2.1.2其它試劑XTTMOLECULAR Probes公司產(chǎn)品；2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞試驗(yàn)培養(yǎng)THP-1/CD14細(xì)胞，稀釋為1X104/孔鋪板，37℃、5％CO2孵育24h；吸去培養(yǎng)液，將中和肽以IMDM培養(yǎng)液稀釋為50、25、12.5、6.25μg/ml，加入培養(yǎng)孔內(nèi)100ul/孔，孵育30min；將LPS 7261稀釋為200ng/ml，加入培養(yǎng)孔內(nèi)100μl/孔，設(shè)定對(duì)照組；37℃、5％CO2孵育6h后，吸取上清，離心，將上清按照試劑盒說明書檢測(cè)TNF-a。
2.2.2XTT檢測(cè)用IMDM稀釋XTT濃度為1mg/ml，過濾除菌，在上述去除上清的細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入IMDM培養(yǎng)基80μl及XTT 20μl，孵育6h，直接檢測(cè)450nm吸光度值。
2.2.3TNF-a檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行。
2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1抑制試驗(yàn)結(jié)果合成肽抑制試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下表中所列依次為1、3、4、CMT-03-2a、CMT-04-2a、16、28-50號(hào)合成肽，每個(gè)樣本均做4個(gè)梯度倍比稀釋。即A行的1、2、3、4列是編號(hào)為1的BNEP衍生物多肽，其濃度對(duì)應(yīng)于25、12.5、6.25、3.125μg/ml；A行的5、6、7、8列是編號(hào)為3的BNEP衍生物多肽，其濃度對(duì)應(yīng)于25、12.5、6.25、3.125μg/ml；B行的9、10、11、12列是編號(hào)為16的BNEP衍生物多肽，其濃度對(duì)應(yīng)于25、12.5、6.25、3.125μg/ml；其余依次類推。K行1-6號(hào)孔為無關(guān)肽對(duì)照組；L行1、2、3、4孔為多粘菌素B對(duì)照，濃度依次為100、50、25、5μg/ml，L行5、6號(hào)為無肽對(duì)照孔，L行7、8、9、10號(hào)為無關(guān)肽對(duì)照孔，L行11、12號(hào)為空白對(duì)照孔。
Table 3 TNF-a檢測(cè)

2.3.2XTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性XTT法檢測(cè)各肽對(duì)THP-1/CD14細(xì)胞的毒性，是在TNF-a檢測(cè)之后進(jìn)行的，因此下表的編號(hào)、所對(duì)應(yīng)的肽，與上表相同。
Table 4 XTT法檢測(cè)細(xì)胞活性


結(jié)合上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果考察，編號(hào)為1、3、4、CMT-03-2a、CMT-04-2a的5個(gè)短肽對(duì)THP-1/CD14細(xì)胞無毒性作用，且可抑制LPS7261的作用，符合前期的試驗(yàn)結(jié)論。編號(hào)為39、48、50的三個(gè)短肽可明顯抑制LPS刺激THP-1/CD14細(xì)胞分泌TNF-a的作用(見附圖)。
權(quán)利要求
1.抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，R1-BNEP-X(R3)n。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，R1-BNEP-CMT-X(R3)n。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，R1-CMT-BNEP-X(R3)n
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，R1-BNEP-Z-CMT-X(R3)n
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，R1-CMT-Z-BNEP-X(R3)n
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中所述的任一抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于表現(xiàn)為多肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽類。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中所述的任一抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于表現(xiàn)為多肽的鏈中或端位環(huán)肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的任一抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于表現(xiàn)為各種多肽的鏈中或端位環(huán)肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽類。
9.權(quán)利要求1至5中所述的任一抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子的合成方法，其特征在于(1)母體肽樹脂合成通法稱取適量Fmoc-AA-Wang樹脂或其它多肽合成氨基酸樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，or DCM-DMF)溶脹，以10％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。按照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的氨基酸序列依次稱取適量的Fmoc-氨基酸于適宜的容器中，加入適量DMF溶解，然后加入偶聯(lián)劑(如TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt，DIC/HOBt，DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，etc)和適量氮甲基嗎啉或二異丙基乙胺的DMF溶液。偶聯(lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌肽樹脂；加入20％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。按照多肽固相化學(xué)合成方法依照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體的氨基酸序列從C端開始依次進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)，如此循環(huán)完成整個(gè)抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽的肽鏈，得到母體肽樹脂；充分洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素肽衍生物樹脂，置凍干機(jī)中凍干，備用。(2)衍生物制備依據(jù)修飾基團(tuán)的不同，采用不同的合成方法，制備得到全保護(hù)的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽衍生物，得到的粗肽經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)純化得精肽，精肽成鹽，質(zhì)譜鑒定和HPLC檢查純度，進(jìn)行生物活性鑒定。(2.1)氮端?；；噭┖芏?，最常見的試劑組合有(RCO)2O/pyridine，RCO2H/activatingreagent(激活劑)。常見的激活劑有DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt，DIC/HOBt，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，DIC/HOSu，PyBOP/HOSu。將抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，orDCM-DMF)溶脹，抽干，加入20％-50％六氫吡啶的DMF溶液脫除肽樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。加入?；噭┑腄MF溶液，攪拌或通氮?dú)饣蛘袷?，控溫。偶?lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素肽衍生物樹脂，置凍干機(jī)中凍干。加入適量裂解液，攪拌，反應(yīng)2-5小時(shí)，無水乙醚沉降，離心；加入無水乙醚，攪勻，離心，重復(fù)6次。加水或50％醋酸水溶液，凍干。HPLC純化，成鹽或凍干，質(zhì)譜儀測(cè)分子量，HPLC檢查純度及離子含量。(2.2)取代肽酰胺將抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，DCM-DMF，THF，THF-DMF)溶脹，抽干。加入胺基化試劑的DMF溶液，攪拌或通氮?dú)猓販?。酰胺化完成后，抽濾，除去反應(yīng)液，以DMF、MeOH、THF、Et2O依次洗滌，濾液合并，旋蒸至干或置凍干機(jī)中凍干。加入適量裂解液，攪拌，反應(yīng)2-5小時(shí)，無水乙醚沉降，離心；加入無水乙醚，攪勻，離心，重復(fù)6次。加水或50％醋酸水溶液，凍干。HPLC純化，成鹽或凍干，質(zhì)譜儀測(cè)分子量，HPLC檢查純度及離子含量。(2.3)肽酯將抗菌/抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM，DMF，DCM-DMF，THF，THF-DMF)溶脹，抽干。加入酯化試劑的DMF溶液，攪拌或通氮?dú)?，控溫。酯化完成后，抽濾，除去反應(yīng)液，以DMF、MeOH、THF、Et2O依次洗滌，濾液合并，旋蒸至干或置凍干機(jī)中凍干。加入適量裂解液，攪拌，反應(yīng)2-5小時(shí)，無水乙醚沉降，離心，重復(fù)6次。加水或50％醋酸水溶液，凍干。HPLC純化，成鹽或凍干，質(zhì)譜儀測(cè)分子量，HPLC檢查純度及離子含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子及其合成方法。其主要特征在于一種抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，R
文檔編號(hào)A61P31/04GK1724566SQ200410028159
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2004年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
發(fā)明者楊大成, 范莉, 謝文林, 袁建成, 徐宏, 姚志勇, 李紅玲, 陳翠柳, 楊東暉, 肖光夏 申請(qǐng)人:深圳市翰宇生物工程有限公司, 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院