專利名稱：一種用于治療性功能障礙的α－MSH類似物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療性功能障礙的α-MSH類似物和該類似物C端為酰氨化的衍生物以及這些類似物的制備方法，還涉及含有上述多肽的用于治療性功能障礙的藥物組合物。
背景技術(shù)：
性功能障礙，包括男性性功能障礙和女性性功能障礙，是影響面很廣的醫(yī)學(xué)病癥。性功能障礙的病因有精神型、器質(zhì)型以及混合型。緊張、抑郁、器質(zhì)性疾病如循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、動(dòng)脈硬化、糖尿病、高血壓和高膽固醇等均會(huì)導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致性功能障礙。
在臨床治療上，根據(jù)不同的病因主要采取藥物治療和輔助器械治療?，F(xiàn)在常用的藥物有西地那非、瓦地那非等，這些藥物均是PDE5抑制劑，它致使環(huán)腺苷酸(cAMP)在體內(nèi)維持及升高致勃起所需濃度。這些藥物是通過擴(kuò)張動(dòng)脈血管和降低靜脈排出量作用的。治療性功能障礙還可以通過向陰莖海綿體注射罌粟堿和尿道給藥等方式治療。輔助器械常用負(fù)壓吸引裝置等。然而這些治療措施并不理想，急需找到一種新的治療方法。
α-MSH(a-促黑素細(xì)胞激素)是一種具有如下化學(xué)式的線狀十三肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val。它是一種能使黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素體的激素，能控制生物體皮膚和毛發(fā)的顏色?，F(xiàn)大量研究已證實(shí)它的受體分子在食欲和性喚起中起著重要的作用(Wessells H.et al.，J Urology 160389-393(1998))。其中與性喚起相關(guān)聯(lián)是中心4肽序列His-Phe-Arg-Trp(Hadley M.E.et al，PigmentCell Res.，vol.9213-234(1996))。在許多的相關(guān)研究中，如促黑細(xì)胞素和促腎上腺皮質(zhì)激素，His-Phe-Arg-Trp是核心序列。
促腎上腺皮質(zhì)激素的受體是MC1-R到MC5-R。其中MC3-R和MC4-R被認(rèn)為在人的腦部表達(dá)。大量研究認(rèn)為His-Phe-Arg-Trp引起勃起的機(jī)理與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，它與MC3-R和/或MC4-R相結(jié)合(Haskell-Luevano C.et al.，Journal of Medical Chemistry，vol.402133-39(1997)；Schioth H.B.et al.，British Joural of Pharmacology，vol.12475-82(1998))。
本發(fā)明的申請(qǐng)人通過長期大量的研究發(fā)現(xiàn)了一種α-MSH的類似物以及其C端為酰氨的衍生物，它能夠有效治療性功能障礙，因此為性功能障礙疾病提供了一種新的治療藥物和治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供一種用于治療性功能障礙的α-MSH類似物多肽，該多肽是包含Ac-Nle-cyclo(-Asp-His-D-Phe-Arg-Trg-Lys)-OH(SEQ ID NO1)的多肽或其類似物或衍生物；該多肽優(yōu)選的衍生物是C端為酰氨的衍生物Ac-Nle-cyclo(-Asp-His-D-Phe-Arg-Trg-Lys)-NH2(SEQ ID NO2)本發(fā)明的另一方面提供制備本發(fā)明用于治療性功能障礙的α-MSH類似物多肽及其類似物或衍生物的方法，優(yōu)選是固相化學(xué)合成方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于治療性功能障礙的藥物組合物，其包含至少一種α-MSH類似物多肽及藥學(xué)上可接受的藥用載體，該α-MSH類似物多肽選自包含SEQ ID NO1的多肽或其類似物或其衍生物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備本發(fā)明用于治療性功能障礙的藥物組合物的方法，將本發(fā)明的選自包含SEQ ID NO1的多肽或其類似物或其衍生物與藥學(xué)上可接受的藥用載體混合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含SEQ ID NO1的多肽及其類似物或衍生物在制備用于治療性功能障礙的藥物組合物的用途，這里指的性功能障礙包括男性性功能障礙和女性性功能障礙。
在本發(fā)明中，“SEQ ID NO1類似物”被定義為，與SEQ ID NO1相比較，具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代，刪除，轉(zhuǎn)換或增加的分子。
“SEQ ID NO1衍生物”被定義為如下一種分子，它具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO1類似物氨基酸序列，但是另外還具有化學(xué)修飾的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基。
用于本發(fā)明的多肽可通過固相化學(xué)合成法合成。多肽的固相化學(xué)合成法是本領(lǐng)域熟知的，可以在一般教科書的范圍內(nèi)找到，例如J.M.Stewart and J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nded.，Pierce Chemical Co.，Rockford，I11.(1984)、Dugas和Penney1981；Merrifield 1962；Stewart和Young 1969。多肽合成后用HPLC純化，純度達(dá)到95％以上，為白色粉末。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如口服給藥、經(jīng)皮給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給藥方式，可將本發(fā)明的多肽藥物組合物制成合適的劑型，其中包含至少一種有效劑量的本發(fā)明的多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的藥用載體。
適當(dāng)劑型的實(shí)例為片劑，膠囊，糖衣片劑，粒劑，口服溶液和糖漿，用于皮膚表面的油膏和藥貼，氣霧膠，鼻噴劑，以及可用于注射的無菌溶液等。
劑型中還可含有其它常規(guī)組分，如防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、乳化劑、增甜劑、著色劑、調(diào)味劑等等。
本發(fā)明的多肽溶液鼻噴劑溶液以藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在，可以是鹽酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等，最優(yōu)選乙酸鹽；乙酸鹽濃度范圍10mM至100mM，優(yōu)選地10mM乙酸鹽。本發(fā)明的多肽穩(wěn)定的PH范圍為4-7，最優(yōu)選地PH6.0～6.5。本發(fā)明多肽的最佳保存條件為0.9％生理鹽水中。本多肽濃度保存范圍為0.1mg/ml-10mg/ml，優(yōu)選地為3mg/ml。
本發(fā)明提供的溶液鼻噴劑溶液藥學(xué)組分包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括賦形劑和添加劑，如穩(wěn)定劑、保護(hù)劑和促吸收劑等。本發(fā)明涉及的賦形劑可以是明膠、羥基纖維素、氯化鈉和聚乙二醇，優(yōu)選地為氯化鈉；本發(fā)明涉及的保護(hù)劑可以是EDTA和苯甲烷銨，優(yōu)選地為苯甲烷銨；本發(fā)明多肽的促吸收劑可以是聚山梨酯-80、氮酮、羧甲基纖維素、9-十二烷基醚等，優(yōu)選地為氮酮。
優(yōu)選地，含有本發(fā)明多肽的鼻噴劑的藥學(xué)組分為0.9％氯化鈉，10mM乙酸鈉，pH值6.0，0.01％苯甲烷銨，0.5％氮酮，SEQ ID NO11mg/ml。用于治療男性(或女性)性功能障礙時(shí)，用藥用鼻噴霧泵每次100μl噴入鼻腔若有特殊治療要求，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種相伴使用有利于治療。
本發(fā)明的藥物組合物中多肽的用量可以在一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，這取決于一些已知的因素，諸如病情嚴(yán)重程度，病人體重，劑型，所選用藥途徑。例如，本發(fā)明藥物組合物的鼻內(nèi)給藥范圍在1μg/kg到75μg/kg。
本發(fā)明的申請(qǐng)人通過大量研究發(fā)現(xiàn)用Nle置換具有氧化側(cè)鏈的Me t氨基酸使之與α-MSH比較更加穩(wěn)定；用D-Phe置換L-Phe使之活性增強(qiáng)；將Asp和Lys環(huán)化后，經(jīng)過試驗(yàn)，SEQ ID NO1及其C端為酰氨的衍生物在原有的基礎(chǔ)上更加穩(wěn)定。
本發(fā)明多肽的主要優(yōu)點(diǎn)在于提高了生物活性，增強(qiáng)了在體內(nèi)的穩(wěn)定性，使有效劑量降低，從而避免引起副作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1固相合成法合成SEQ ID NO1多肽SEQ ID NO1的多肽由標(biāo)準(zhǔn)的固相合成法合成，多肽以乙酸鹽的形式存在。
(1)在固相反應(yīng)器(美國CS生化公司，CS736型)中加入2.0克P-HMPA-AM(0.8毫摩爾/克)樹脂(吉爾生化有限公司)，用兩份20毫升二甲基甲酰氨洗滌，每次2分鐘。(2)加入20毫升二甲基甲酰氨機(jī)械震蕩10分鐘，在反應(yīng)器加入三倍的氨基酸衍生物Fmoc-Lys(Dnp)-OH(美國CS生化公司)和2.1毫升HOBt(吉爾生化有限公司)，震蕩2-3小時(shí)。(3)水合茚三酮檢測(cè)為陰性。(4)用4份二甲基甲酰氨20毫升洗滌產(chǎn)物，每次2分鐘。(5)加入20毫升20％哌啶/二甲基甲酰氨震蕩1分鐘，再加入20毫升20％哌啶/二甲基甲酰氨震蕩反應(yīng)30分鐘。(6)用4份二甲基甲酰氨20毫升洗滌產(chǎn)物，每次2分種。(7)用兩份15毫升二氯甲烷洗滌，每次1分鐘。(8)除去保護(hù)基Fmoc后，加入三倍于樹脂的氨基酸鏈接Fmoc-Trp(Boc)-OH(吉爾生化有限公司)和相同數(shù)量的HBTU(吉爾生化有限公司)，在20毫升二甲基甲酰氨中反應(yīng)3小時(shí)。(9)水合茚三酮檢測(cè)為陰性。(10)重復(fù)3到9步驟，依次鏈接剩下的氨基酸衍生物。在最后一個(gè)Fmoc-Nle-OH(SIGMA)鏈接上后，仍然用20％哌啶/二甲基甲酰氨除去保護(hù)基Fmoc。(11)用2倍的1∶1乙酸酐吡啶混合物在二氯甲烷中乙?；?12)充分干燥反應(yīng)產(chǎn)物，除去Lys和Asp的保護(hù)基后，加入二甲基甲酰氨和二苯磷酰基疊氮化物(SIGMA)，0℃攪拌該混合物，12℃下攪拌反應(yīng)過夜。(13)環(huán)化后，用4份20毫升二甲基甲酰氨洗滌，每次1分鐘。(14)2份15毫升二氯甲烷洗滌，每次2分鐘。(15)用標(biāo)準(zhǔn)三氟乙酸/二氯甲烷方法，并加入適量的硫基試劑裂解。
最終產(chǎn)物用乙醚沉淀，過濾。過濾產(chǎn)物用C18 HPLC純化，層析緩沖A液為5％乙腈和0.1％三氟乙酸，緩沖B液為80％乙腈和0.1％三氟乙酸，梯度0％-75％，12個(gè)柱體積。HPLC純化后用離子交換柱純化，層析緩沖A液為40毫摩爾乙酸鹽、PH值為6.2，緩沖B液為40毫摩爾乙酸鹽、PH值為6.2、0.8摩爾氯化鈉，梯度0％-100％，8個(gè)柱體積。
實(shí)施例2固相合成法合成SEQ ID NO2的多肽(1)在反應(yīng)器(美國CS生化公司，CS736型)中加入2.0克P-MBHA樹脂(0.7毫摩爾/克)(吉爾生化有限公司)和20毫升二甲基甲酰氨，機(jī)械震蕩10分鐘后加入三倍的Boc-Lys(2-C1-Z)(吉爾生化有限公司)和相同量的HOBt，在室溫機(jī)械震蕩反應(yīng)3小時(shí)。(2)水合茚三酮檢測(cè)。如果檢測(cè)結(jié)果為陽性再反應(yīng)1小時(shí)，如果仍為陽性用相當(dāng)于樹脂2倍的乙酸酐/吡啶/二氯甲烷(1∶1∶2 V/V)，室溫下反應(yīng)30分鐘，去除多余的氨基。(3)水合茚三酮檢測(cè)陰性。(4)用2份20毫升二氯甲烷洗滌產(chǎn)物每次1分鐘。(5)用30毫升50％三氟乙酸/二氯甲烷裂解除去保護(hù)基Boc，第一次處理5分鐘，第二次20分鐘。(6)用2份20毫升二氯甲烷洗滌產(chǎn)物每次1分鐘。(7)用兩份30毫升7％的二異丙乙胺/二氯甲烷中和產(chǎn)物，每次搖動(dòng)2分鐘。(8)用4份20毫升二氯甲烷洗滌產(chǎn)物，每次1分鐘，(9)加入過量的3倍的Boc氨基酸衍生物(4.2毫摩爾)、2.4毫升1摩爾的HOBt(吉爾生化有限公司)和2.4毫升的1摩爾DDC(吉爾生化有限公司)，在20毫升二氯甲烷中將該混合物在室溫下震蕩3小時(shí)，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。(10)完成偶聯(lián)后(水合茚三酮陰性)用三份30毫升二氯甲烷洗滌產(chǎn)物，每次2分鐘。(11)用兩份40毫升二甲基甲酰氨洗滌，每次2分鐘。(12)重復(fù)3-11步驟，依次鏈接剩下的氨基酸衍生物，在最后一個(gè)Boc-Nle-OH(SIGMA)鏈接上后，仍然用50％三氟乙酸/二氯甲烷除去保護(hù)基Boc。用二氯甲烷和二甲基甲酰氨洗滌產(chǎn)物，(13)洗滌產(chǎn)物用2倍的1∶1乙酸酐吡啶混合物在二氯甲烷中乙?；?，充分干燥反應(yīng)產(chǎn)物。(14)除去Lys和Asp的保護(hù)基后，加入二甲基甲酰氨和二苯磷?；B氮化物(SIGMA)，0℃攪拌該混合物，12℃下攪拌過夜。(15)環(huán)化后洗滌產(chǎn)物。(16)用標(biāo)準(zhǔn)LoW-HighHF方法裂解，加入5毫升氟化氫、二甲基硫醚和對(duì)甲苯酚，三種試劑的比例為25∶65∶10，0℃反應(yīng)2小時(shí)。將氟化氫蒸發(fā)后又加入10毫升氟化氫、對(duì)甲苯酚和對(duì)甲硫酚(FLUKA)，三種試劑比例為95∶3.75∶1.25，0℃反應(yīng)1小時(shí)。將氟化氫蒸發(fā)后，最終產(chǎn)物用乙醚沉淀，過濾。
過濾產(chǎn)物用C18 HPLC純化，層析緩沖A液為5％乙腈和0.1％三氟乙酸，緩沖B液為80％乙腈和0.1％三氟乙酸，梯度0％-75％，12個(gè)柱體積。HPLC純化后用離子交換柱純化，層析緩沖A液為40毫摩爾乙酸鹽、PH值為6.2，緩沖B液為40毫摩爾乙酸鹽、PH值為6.2、0.8摩爾氯化鈉，梯度0％-100％，8個(gè)柱體積。
實(shí)施例3α-MSH類似物SEQ ID NO1及其C端為酰氨的衍生物SEQ ID NO2對(duì)小鼠性功能的影響。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠。實(shí)驗(yàn)試劑有SEQ ID NO1、α-MSH、Ac-[Nle4，D-Phe7]-α-MSH1-13NH2、、Ac-[Nle4，D-Phe7Lys10]-α-MSH4-10NH2、SEQ ID NO2(由例1和2提供的方法合成)。
以上五種試劑給藥方式為靜脈注射，給藥劑量為10μg/kg。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共五組大鼠，每組大鼠4只，每組大鼠靜脈注射以上五種試劑中的一種。注射后觀察0.5小時(shí)。注射α-MSH的大鼠勃起率為5％；注射Ac-[Nle4，D-Phe]-α-MSH1-13NH2的大鼠的勃起率為12％；注射Ac-[Nle4，D-Phe，Lys10]-α-MSH4-10NH2的大鼠的勃起率為17％；而注射在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2的大鼠勃起率為100％。
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用Nle置換具有氧化側(cè)鏈的Met氨基酸、用D-Phe置換L-Phe和將Asp和Lys環(huán)化后的α-MSH衍生物活性增強(qiáng)，其中SEQ ID NO1及其C端為酰氨的衍生物活性最強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1中。
表1a-MSH及其類似物在相同劑量下對(duì)大鼠勃起率的影響

實(shí)施例4制備含有以SEQ ID NO1多肽為活性成分的鼻噴劑1000ml加入9克氯化鈉，1.36克三水乙酸鈉，0.1ml苯甲烷銨，5ml氮酮，SEQ ID NO1多肽1000mg，補(bǔ)加水至1000ml，調(diào)節(jié)pH值至6.0，攪拌均勻。
含SEQ ID NO1多肽活性成分鼻噴劑各組分的終濃度為0.9％(m/v)氯化鈉，10mM乙酸鈉，0.01％(v/v)苯甲烷銨，0.5％(v/v)氮酮，SEQ ID NO1多肽(1mg/ml)。
實(shí)施例5制備含有以SEQ ID NO2多肽為活性成分的鼻噴劑1000ml加入9克氯化鈉，1.36克三水乙酸鈉，0.1ml苯甲烷銨，5ml氮酮，SEQ ID NO2多肽1000mg，補(bǔ)加水至1000ml，調(diào)節(jié)pH值至6.0，攪拌均勻。
含SEQ ID NO2多肽活性成分鼻噴劑各組分的終濃度為0.9％(m/v)氯化鈉，10mM乙酸鈉，0.01％(v/v)苯甲烷銨，0.5％(v/v)氮酮，SEQ ID NO2多肽(1mg/ml).
用于治療男性(或女性)性功能障礙時(shí)，用鼻噴霧泵每次100μl噴入鼻腔。
通過上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。提供這些實(shí)施例，僅為了說明，而不是限制本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種用于治療性功能障礙的α-MSH類似物多肽，其特征在于該多肽是包含SEQ ID NO1的多肽或其類似物或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于該多肽具有SEQ ID NO1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于該多肽的衍生物是C端酰氨化的衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其特征在于該多肽的衍生物包含SEQ IDNO2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的多肽，其特征在于該多肽的衍生物具有SEQ IDNO2。
6.制備權(quán)利要求1-5多肽的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于權(quán)利要求1-5的多肽是通過固相合成的方法制備的。
8.一種用于治療性功能障礙的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包含至少一種α-MSH類似物多肽及藥學(xué)上可接受的藥用載體，該α-MSH類似物多肽選自包含SEQ ID NO1的多肽或其類似物或衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于該多肽具有SEQ IDNO1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于該多肽的衍生物是C端酰氨化的衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物，其特征在于該多肽的衍生物包含SEQ ID NO2。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其特征在于該多肽的衍生物具有SEQ ID NO2。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于這里指的性功能障礙包括男性性功能障礙和女性性功能障礙。
14.制備權(quán)利要求8-13藥物組合物的方法，其特征在于將權(quán)利要求1-5的多肽與藥學(xué)上可接受的藥用載體混合。
15.包含SEQ ID NO1的多肽及其類似物或衍生物在制備用于治療性功能障礙的藥物組合物的用途，這里指的性功能障礙包括男性性功能障礙如勃起功能障礙和女性性功能障礙。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其特征在于該藥物組合物通過多種給藥方式治療性功能障礙，包括皮下或肌肉注射，口服給藥如藥丸、膠囊，鼻噴劑等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療性功能障礙的α－MSH類似物AC－Nle－cyclo(－Asp－His－D－Phe－Arg－Trg－Lys)－OH(SEQ ID NO1)多肽及其C端為酰氨化的衍生物(SEQ ID NO2)，公開了合成上述多肽的方法，含有上述多肽的用于治療性功能障礙的藥物組合物及其制備方法，以及該藥物組合物在治療性功能障礙疾病，包括男性性功能障礙如勃起功能障礙和女性性功能障礙的用途。
文檔編號(hào)A61K38/08GK1563076SQ200410030758
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者李曉鵬, 周濤, 李明 申請(qǐng)人:西南生物工程產(chǎn)業(yè)化中試基地有限公司