專利名稱：一種畢赤酵母基因工程菌株及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表達蚯蚓纖溶酶基因的畢赤酵母基因工程菌株，同時還涉及制備畢赤酵母基因工程菌株的制備方法及在藥物開發(fā)中的應用。
背景技術：
蚯蚓，俗稱地龍，在我國已有數(shù)千年的應用歷史，可清熱、平肝、止喘、通絡，主治高熱狂躁、驚風抽搐等病癥。1983年日本H.Mihara首次發(fā)現(xiàn)正蚓科(Lumbrici dae)蚯蚓水提物有直接溶解纖維蛋白及纖溶酶原激活作用，其活性成分稱為纖溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme，EFE)，又稱蚓激酶。
目前已有多種蚯蚓纖溶酶制劑應用于臨床，主要為各種膠囊制劑，都是從蚯蚓腸腔和體液中提取的，如普恩復、百奧、博洛克，溶栓膠囊等，多用在心腦血管疾病方面。
傳統(tǒng)的蚯蚓纖溶酶膠囊制劑應用于臨床有一定的療效，但也存在明顯的缺陷，首先是成分復雜，不能靜脈注射，而口服給藥作用緩慢，因而不能應用于治療急性心、腦血管栓塞疾??；其次膠囊制作工藝復雜，生產(chǎn)受蚯蚓養(yǎng)殖季節(jié)、周期的限制，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量不穩(wěn)定；從蟲體中分離純化纖溶酶工藝煩瑣，產(chǎn)品中可能含有各種小分子多肽或其它化學物質(zhì)，可能引起機體的過敏反應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種畢赤酵母菌株Pichia pastoris X-33(pPIC6A-EFE)，該菌株可以表達產(chǎn)生基因工程纖溶酶，該菌成本低，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)方便，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備畢赤酵母菌株的方法，該方法操作簡便，溶解圈清晰，易于觀察，重復性好。
本發(fā)明還涉及基因工程纖溶酶在溶栓藥物中的用途，可用于制備治療栓塞性心血管疾病的口服藥劑，還可用于生產(chǎn)具有預防血栓疾病、有益心血管健康的保健品。
本發(fā)明所涉及的蚯蚓纖溶酶來自正蚓科粉正蚓屬，在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的核苷酸序列及其制備方法，該方法是以正蚓科粉正蚓屬蚯蚓總RNA為模板，用特異性寡核苷酸引物，經(jīng)反轉錄PCR方法得到纖溶酶基因cDNA。粉正蚓購于華中農(nóng)業(yè)大學，基因測序結果表明cDNA由747核苷酸組成，5′端至3′端序列為正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)acatggaacttcctcccggaacaaaaattgtcggaggaattgaagctagaccatacgagttcccatggcaggtgtccgtgtccgaaggaaatcttccgattcccatttctgcggaggtagcatcatcaacgatcgttgggttgtctgcgctgctcactgcatgcagggagaggcccccgctctggtttcattggtcgtgggtgagcacgacaggagtgcagcgagtacagtacgtcagactcatgacgttgatagcatcttcgttcacgaggactacaacacaaataccctagagaacgacgtttctgtcatcaagacatctgttgccatcactttcgacatcaacgttggtccaatctgcgccccagatccggctaacgactacgtctaccgtaagagccagtgttccggatggggaactatcaattcaggtggaatctgctgtcccaacgttctgcgatacgtgacgctgaatgacacaaccaaccaatactgcgaagatgtatacccactaaattcaatctacgacgatatgatttgcgcgtcggacaacactgggggtaacgacagagactcctgccagggtgactccggcggccctctgagcgtcaaggatggtagtggaatcttcagcctgattggtattgtgtcttggggaattggttgcgcttctggctatccaggagtctactcccgcgtcggattccatgctgcatggatcaccgacatcatcaccaacaactaaaccg其中3-740位核苷酸是基因編碼的成熟肽序列，即纖溶酶蛋白序列，741-743位是終止密碼子TAA。該基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的氨基酸序列(SEQ ID No.2)MELPPGTKIVGGIEARPYEFPWQVSVRRKSSDSHFCGGSIINDRWVVCAAHCMQGEAPALVSLVVGEHDRSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNTNTLENDVSVIKTSVAITFDINVGPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGICCPNVLRYVTLNDTTNQYCEDVYPLNSIYDDMICASDNTGGNDRDSCQGDSGGPLSVKDGSGIFSLIGIVSWGIGCASGYPGVYSRVGFHAAWITDIITNN本發(fā)明涉及的纖溶酶蛋白分子量為26.4kD，等電點為4.5，富含甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸和天冬氨酸。其生物化學特性還有①熱穩(wěn)定性纖溶酶60℃加熱30分鐘后，酶活性沒有明顯降低，65℃以上酶活性開始下降，85℃加熱30分鐘酶活性完全喪失，②酸穩(wěn)定性纖溶酶在pH1～11間酶活性沒有明顯變化，pH低于1或高于11時，酶活性明顯下降，最佳纖溶反應的pH值范圍較寬，在7～10之間。
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的制備及克隆到大腸桿菌(E.coli)的方法，該方法包括擴增引物合成，蚯蚓總RNA提取，mRNA的反轉錄，目的基因的PCR擴增、目的基因片段的回收、目的基因片段克隆入載體、蚯蚓纖溶酶cDNA序列測定。
(1)擴增引物合成根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的蚯蚓纖溶酶cDNA序列設計PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物(p1)長18個核苷酸ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物(P2)長19個核苷酸ATCACCAACAACTAAACCG。
(2)蚯蚓總RNA提取取3～5條蚯蚓成體，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，放在鋪有濕濾紙的平皿中饑餓過夜，使其盡可能的吐盡體內(nèi)的泥沙。再次用DEPC水清洗干凈后，在液氮中研磨成粉末狀，按照QIAGEN公司RNeasyR Mini Kit的產(chǎn)品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存于-80℃，以備用。
(3)反轉錄合成cDNA第一條鏈按照Promega公司的ReverseTranscription Reaction試劑盒說明書進行，以Oligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈。反應條件為42℃1小時；95℃5分鐘；3℃5分鐘。
(4)目的基因的PCR擴增按照Reverse Transcription Reaction試劑盒中給出的PCR反應體系參數(shù)進行PCR反應。其反應參數(shù)為95℃預變性4分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，20個循環(huán)；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，10個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。
(5)目的基因片段的回收按照上海華舜生物工程公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段。
(6)目的基因片段克隆入載體回收的PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉化感受態(tài)細胞大腸桿菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是包含本發(fā)明涉及基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。
(7)蚯蚓纖溶酶cDNA序列測定提取質(zhì)粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測序引物為M13啟動子引物。正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因核苷酸的序列測定結果蚯蚓纖溶酶cDNA序列長747個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌噙核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-185、C-197、G-189；T-176?；虺墒祀男蛄袨榈?-740位核苷酸，編碼246個氨基酸，其余核苷序列為非編碼區(qū)。該蛋白質(zhì)cDNA成熟肽終止密碼子位于基因第741-743位，終止密碼為TAA。
本發(fā)明的技術要點之一是表達纖溶酶基因的畢赤酵母基因工程菌株的構建及誘導表達。
畢赤(Pichia)酵母表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種高效的真核表達系統(tǒng)，它具有以下優(yōu)點(1)表達量高，因為畢赤酵母生長速度快，而且表達載體使用的是強啟動子——乙醇氧化酶啟動子，外源蛋白表達量很高。(2)穩(wěn)定性好，由于該系統(tǒng)的表達載體在酵母中不是以自主復制的質(zhì)粒存在，而是通過同源重組穩(wěn)定的整合在酵母染色體上，所以構建的工程菌株十分穩(wěn)定。(3)活性高。外源蛋白在畢赤酵母中分泌表達的最大好處就是能夠進行蛋白質(zhì)翻譯后加工，包括二硫鍵的形成、蛋白質(zhì)折疊及糖基化等。與啤酒酵母等其他一些真核表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母對外源蛋白糖基化更接近于哺乳動物的糖基化，因此畢赤酵母表達的糖蛋白被認為更適宜用于人體。(4)便于工業(yè)化生產(chǎn)。畢赤酵母有現(xiàn)成的、成熟的發(fā)酵技術進行擴大培養(yǎng)，而且畢赤酵母表達系統(tǒng)可以利用甲醇作為唯一碳源生長，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)方便，成本低，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明涉及的蚯蚓纖溶酶來源于粉正蚓(Lumbricus rubellus)，該片段共有741bp，編碼246個氨基酸。本發(fā)明構建了一株畢赤酵母基因工程菌株，通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)得到基因工程纖溶酶蛋白，纖維蛋白平板法證明了該蛋白具有溶解纖維蛋白的生物活性。
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種構建基因工程菌株、菌株為畢赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC 6A-EFE)，CCTCC M204004。在畢赤酵母菌中表達蚯蚓纖溶酶基因的方法，該方法是用pPIC 6A載體(Invitrogen公司)在畢赤酵母X-33中表達蚯蚓纖溶酶基因，包括(1)蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增(2)PCR產(chǎn)物克隆至T載體；(3)穿梭表達質(zhì)粒的構建；(4)表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構建，其步驟如下(1)蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增以含有纖溶酶基因的T載體質(zhì)粒為模板，根據(jù)EFE成熟肽和表達載體pPIC6A上的克隆位點設計引物，上游引物PIGAATTCGCATGGAACTTCCTCCCG(下劃線處為內(nèi)切酶EcoRI位點)，下游引物P2TCTAGACGGTTTAGTTGTTGGTGAT(下劃線處為內(nèi)切酶XbaI位點)。
(2)PCR產(chǎn)物克隆至T載體回收PCR產(chǎn)物中的基因片段，并克隆于pGEM-T載體，將該重組載體(pGEM-T-EFE2)轉入大腸桿菌JM109中。
(3)穿梭表達質(zhì)粒的構建提取重組載體pGEM-T-EFE2，用EcoRI和XbaI雙酶切以得到目的片段EFE；同樣酶切pPIC6A空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化。將去磷酸化后的線性化的pPIC6A空載體與雙酶切后得到的EFE在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，以得到重組表達載體pPIC6A-EFE，將該重組載體轉入大腸桿菌JM109中進行擴增。
(4)表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構建；a.穿梭表達質(zhì)粒的線形化提取重組質(zhì)粒pPIC6A-EFE，用SacI酶切成線性，同樣酶切空質(zhì)粒pPIC6A作為對照。
b.轉化方法參考Invitrogen公司表達載體說明書利用生化方法將線性化的重組質(zhì)粒pPIC6A-EFE和空質(zhì)粒pPIC6A轉化X-33酵母菌株，在含有殺稻瘟素(Blasticidin)300mg/ml的YPD(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天，直到有單菌落出現(xiàn)。
c.篩選陽性轉化子挑取10-20個單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30℃，250rpm搖床培養(yǎng)直至對數(shù)生長晚期，提取基因組進行重組子的PCR鑒定。引物為Invitrogen公司表達載體提供的通用引物，其序列為上游GACTGGTTCCAATTGACAAGC，下游GCAAATGGCATTCTGACATCC，鑒定的陽性克隆命名為Pichia pastoris X-33(pPIC6A-EFE)，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為CCTCC M204004，本發(fā)明的技術要點之二是基因工程纖溶酶蛋白的誘導表達與活性測定。
在畢赤酵母中有兩個編碼乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，可以利用甲醇作為唯一碳源快速生長，而當培養(yǎng)基中存在其他碳源時，AOX基因不表達。在畢赤酵母工程菌株中，外源基因被克隆至AOX1啟動子控制下，因此必須以甲醇作為誘導劑，同時也是唯一碳源來實現(xiàn)外源蛋白的高效表達，在誘導表達時，應補充甲醇以維持其0.5％的含量。
在本發(fā)明的實施例中提供了一種畢赤酵母工程菌株誘導表達的方法，可用于畢赤酵母工程菌株誘導表達的培養(yǎng)基包括但不僅限于下列培養(yǎng)基MGY、MM、BMM、BMMY，各種培養(yǎng)基的配置方法為本技術領域人員非常熟悉的方法，可以通過參考相關文獻獲得詳情。
畢赤酵母工程菌株誘導表達方法如下挑取重組菌的單菌落到20mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃、250rpm培養(yǎng)進行活化；16個小時后取10ml活化后的菌液轉接500ml MGY液體培養(yǎng)基30℃、250rpm培養(yǎng)增濃；增濃24小時后的菌液經(jīng)離心收集菌體(1500g、10分鐘、4℃)；將收集到的菌體重懸于1000ml MM液體培養(yǎng)基進行誘導表達，每24h添加甲醇至終濃度為0.5％；誘導96h后離心收集菌體(30000g、20分鐘、4℃)，菌體采用玻璃珠破碎法制備蛋白質(zhì)抽提物用于活性測定。
當前尚無蚯蚓纖溶酶活性測定的國家標準，當前的測定方法只能參考其它溶栓藥物的活性測定方法。比如尿激酶活性的氣泡上升法和測定蝮蛇抗栓酶的精氨酸脂酶法(TAME)法，但這兩種方法均不適用測定蚯蚓纖溶酶，因為纖溶酶具有纖維蛋白溶酶原激活劑和蛋白水解酶的作用，在溶解血栓時能發(fā)揮這兩種功能，而且該酶的溶酶活性顯著大于激酶活性。
纖維蛋白平板法能夠客觀地表示出纖溶酶溶栓的能力。血纖維蛋白平板中含有纖維蛋白溶酶原，在纖溶酶的激酶作用下轉變?yōu)槔w維蛋白溶酶。加之應纖溶酶的溶酶作用，使血纖維蛋白發(fā)生水解作用，變成可溶性的小分子肽和氨基酸，從而使加樣處平板形成半透明溶圈，并根據(jù)圈的大小確定酶的活性單位。在一定范圍內(nèi)，平板溶圈大小與濃度程線形關系，因此測定纖維蛋白平板的活性可看成纖溶酶和激活酶的雙重作用。而運用基因工程的方法則可以通過簡單的發(fā)酵大量獲得纖溶酶，分離純化工藝簡單，產(chǎn)品純度高，成本底。該方法具有操作簡單，溶解圈清晰、易于觀察，重復性好等優(yōu)點。
在本發(fā)明的一個實施例中提供一種纖維蛋白平板法測定纖溶酶的生物學活性的方法，通過活性測定，本發(fā)明的基因工程菌株發(fā)酵液的活性單位超過2,900,000U/L。
本發(fā)明所涉及的基因工程蛋白在醫(yī)療、衛(wèi)生、保健類藥物的研發(fā)領域中具有廣泛的用途，可用于制備治療栓塞性心血管疾病的片劑、栓劑等，還可用于生產(chǎn)具有預防血栓疾病、有益心血管健康的保健品。
與傳統(tǒng)的蚯蚓纖溶酶膠囊制劑相比，本發(fā)明所涉及的基因工程藥物有如下優(yōu)點(1)膠囊制作工藝復雜，需要人工大量養(yǎng)殖蚯蚓，從蟲體中分離純化纖溶酶工藝煩瑣，產(chǎn)品中可能含有各種小分子多肽或其它化學物質(zhì)，可能引起機體的過敏反應。而運用基因工程的方法則可以通過簡單的發(fā)酵大量獲得纖溶酶，分離純化工藝簡單，產(chǎn)品純度高，成本底；(2)生物提取的溶栓類藥物在生產(chǎn)過程中，需活性炭吸附，主要是用來脫色、吸附熱源、除雜質(zhì)和助濾。本發(fā)明所涉及的基因工程蛋白純度高，品質(zhì)純粹、無熱原，避免脫炭過程和活性炭對環(huán)境的污染，生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明生產(chǎn)的基因工程纖溶酶可以與藥學上可以接受的載體(如賦形劑、填充劑、吸收促進劑等)混合，或者與其它藥物混合使用，可以按照藥學領域的常規(guī)方法將其制成所需的劑型。
上述以基因工程纖溶酶為主要活性成分的藥物或其它生物制品，其制作過程或方法為該技術領域人員所熟悉，生產(chǎn)過程應依照國家相關的法律、法規(guī)進行，包括《中華人民共和國藥典》(國家藥典委員會，2000)和《中國生物制品規(guī)程》(中國生物制品標準化委員會，2000)。
在本發(fā)明的實施例中，提供了一種制備基因工程纖溶酶溶栓藥物制劑的方法，并且在動物模型中進行了溶栓的試驗，結果表明本發(fā)明所涉及的基因工程纖溶酶有良好的溶栓作用，這些都可以作為例證說明本發(fā)明說涉及的基因工程纖溶酶在溶栓藥物中的用途。
一種基因工程菌株，畢赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC6A-EFE)保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2004年1月12日保藏編號CCTCC NoM204004。


附圖1纖溶酶基因的PCR擴增結果泳道1為DNA分子量標準(λDNA/Hind III)；泳道2為反轉錄合成的cDNA第一條鏈；泳道3為纖溶酶基因的PCR擴增產(chǎn)物附圖2重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE的酶切鑒定結果泳道1為DNA分子量標準(λDNA/Hind III)；泳道2、3纖溶酶基因的PCR擴增產(chǎn)物，泳道4為DNA分子量標準(λDNA/EcoRI+HindIII)；泳道5為重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE用NotI和SalI雙酶切的結果；泳道6為重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE用SalI單酶切的結果；泳道7為重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE用SphI單酶切的結果。
附圖3重組表達載體pPIC6A-EFE的酶切鑒定結果泳道1為PCR分子量標準；泳道2為重組表達載體的PCR鑒定結果；泳道3為重組表達載體用EcoRI+XbaI雙酶切的結果；泳道4為重組表達載體用SacI單酶切的結果；泳道5為DNA分子量標準(λDNA/EcoRI+Hind III)附圖4纖維蛋白平板法測定纖溶酶的生物學活性a為基因工程纖溶酶蛋白法發(fā)酵上清液；b為10ul纖溶酶標準品(10000U/ml)；c為10ul對照菌pichiapastoris X-33(pPIC6A)發(fā)酵產(chǎn)物。
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，所有實施例中的培養(yǎng)基及分子生物學操作方法為本領域技術人員所熟悉，可以參考Sambrook等“分子克隆“(實驗室手冊，冷泉港，1989)等獲得詳情。
實施例1.蚯蚓纖溶酶的基因PCR擴增及克隆(1)擴增引物合成根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的蚯蚓纖溶酶cDNA序列設計PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物長18個核苷酸P1ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物長19個核苷酸P2ATCACCAACAACTAAACCG。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。
(2)蚯蚓總RNA提取取3～5條蚯蚓成體，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，放在鋪有濕濾紙的平皿中饑餓過夜，使其盡可能的吐盡體內(nèi)的泥沙。再次用DEPC水清洗干凈后，在液氮中研磨成粉末狀，按照QIAGEN公司RNeasyRMini Kit的產(chǎn)品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存于-80℃，以備用。
(3)反轉錄合成cDNA第一條鏈按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction試劑盒說明書進行，以Oligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈。具體操作步驟如下將以下試劑加入一個經(jīng)DEPC浸泡并滅菌處理過的PCR反應管中25mMMgCl2 12μl；緩沖液6μl；10mM dNTP 6μl；Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor 2μl； AVM 反轉錄酶4μl；Oligo(dT)20 6μl；蚯蚓總RNA 15μl；滅菌雙蒸水9μl。反應條件為42℃1小時 95℃5分鐘；3℃5分鐘。
(4)目的基因的PCR擴增取8μL反轉錄反應產(chǎn)物，按照Reverse Transcription Reaction試劑盒中給出的PCR反應體系參數(shù)進行PCR反應。反應組分為緩沖液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；mRNA反轉錄產(chǎn)物15μl；RT-PCR酶混合物2μl；滅菌雙蒸水5μl。其反應參數(shù)為95℃預變性4min；94℃變性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，20個循環(huán)；94℃變性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，10個循環(huán)；72℃再延伸10min。1％瓊脂糖檢測PCR結果，電泳結果如附圖1所示。
(5)目的基因片段的回收按照上海華舜生物工程公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段，其過程如下取30μlPCR反應產(chǎn)物加入1.4mlPB液(試劑盒提供)，混合物移入吸附柱中離心15秒，棄廢液；在吸附柱中加入400μlPB液，靜置1分鐘后，離心15秒，棄廢液；再加入500μlW1液(試劑盒提供)，離心15秒，棄廢液，重復一次；在吸附柱中加入300μlT1液(試劑盒提供)，靜置1分鐘后，離心30秒，收集離心液，貯存于-20℃。
(6)目的基因片段克隆入載體目的基因片段克隆入pUCm-T載體，該載體購自上海生工生物工程公司。反應組分如下PCR產(chǎn)物5μl；pUCm-T載體1μl；10×T4DNA連接酶緩沖液1μl；T4DNA連接酶1μl；去離子水2μl；總體積為10μl，4℃連接過夜。
感受態(tài)細胞的制備挑取單個JM109菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩3小時，待菌液OD值為0.6時，4℃5000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1MCaCl2懸浮，再5000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀以適量0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)6小時備用。
連接產(chǎn)物的轉化取上述連接產(chǎn)物5μl加入100μl感受態(tài)細胞冰浴60分鐘，42℃熱休克90秒，再置冰浴2分鐘，加入無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基0.9ml，37℃培養(yǎng)1小時，取200μl菌液加入40μl 20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及4μl 0.1M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混勻后涂含氨芐青霉素LB平皿，37℃培養(yǎng)16小時，挑取白色菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖檢測結果如圖2所示，其陽性克隆命名為pUCm-T-EFE。
質(zhì)粒DNA的快速小量制備挑取單菌落接種于4ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。菌液加入1.5ml離心管中，5000rpm離心8分鐘，棄上清、沉淀懸浮于15μl懸浮液(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mMEDTA，PH8.0)，加200μl裂解液(0.2MNaOH，1％SDS)，置冰浴5分鐘后，加150μl中和液(3.0MKAc，PH4.8)，冰浴10分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清加等體積酚/氯仿抽提一次，上清加2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10分鐘，沉淀物用70％乙醇洗1次，真空抽干加入20μl TE(10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0和1μl RNaseA 10mg/ml)，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> (7)蚯蚓纖溶酶cDNA序列測定提取質(zhì)粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成，測序引物為M13啟動子引物。
測定結果蚯蚓纖溶酶cDNA序列長747個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-185、C-197、G-189；T-176 (sequence No.1)，編碼246個氨基酸(sequence No.2)?；虺墒祀男蛄袨榈?-740位核苷酸，編碼246個氨基酸，其余核苷序列為非編碼區(qū)。該蛋白質(zhì)cDNA成熟肽終止密碼子位于基因第741-743位，終止密碼為TAA。根據(jù)蚯蚓溶纖酶cDNA序列推測的該蛋白質(zhì)等電點(IP)為4.15，蛋白質(zhì)為酸性。
實施例2.表達纖溶酶基因的畢赤酵母基因工程菌株的構建(1)蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增以pUCm-T-EFE質(zhì)粒為模板，根據(jù)EFE成熟肽和表達載體pPIC6A上的克隆位點設計引物，上游引物P1GAATTC GCA TGG AAC TTCCTC CCG(下劃線處為內(nèi)切酶EcoRI位點)，下游引物P2TCT AGACGG TTT AGT TGT TGG TGA T(下劃線處為內(nèi)切酶XbaI位點)。引物由上海Sangon生物工程公司合成，合成產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。反應組分為緩沖液2.5μl；25mM MgCl21.5μl；10mM dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；pUCm-T-EFE質(zhì)粒1μl；LA Taq DNA聚合酶2μl；滅菌雙蒸水19μl。其反應參數(shù)為95℃預變性4min；94℃變性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃再延伸10min。
(2)PCR產(chǎn)物克隆至T載體按照上海華舜生物工程公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段，擴增產(chǎn)物克隆于pGEM-T載體(Promega公司)得到重組載體pGEM-T-EFE2，將該重組載體轉入大腸桿菌JM109中。
(3)穿梭表達質(zhì)粒的構建提取重組載體pGEM-T-EFE2，用EcoRI和XbaI雙酶切以得到目的片段EFE；同樣酶切pPIC6A空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化。將去磷酸化后的線性化的pPIC6A空載體與雙酶切后得到的EFE在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，以得到重組表達載體pPIC6A-EFE，將該重組載體轉入大腸桿菌JM109中進行擴增。挑取白色菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖檢測結果如圖3所示。
(4)轉化畢赤酵母X-33方法參考Invitrogen公司表達載體說明書(Pichia expressionvectors for selection on blasticidin and purification of recombinant proteinsmanual)。
挑取畢赤酵母X-33單菌落于接種5毫升YPD培養(yǎng)基，30℃250rpm搖床培養(yǎng)過夜，按1％接種量接種200mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃250rpm搖床培養(yǎng)3-5小時，菌體濃度達到0.8-1.0，1500g離心10分鐘，沉淀用10ml滅菌雙蒸水重懸，1500g離心10分鐘，沉淀重懸于0.4ml 100mM的LiCl中并轉移至滅菌的1.5ml離心管中，12000g離心15秒，棄上清，加入0.16ml 0.1M的LiCl重懸，備用。
提取重組質(zhì)粒pPIC6A-EFE，用SacI酶切成線性，同樣酶切空質(zhì)粒pPIC6A作為對照。
取50μl上述感受態(tài)細胞，12000g離心15秒，用移液器小心吸取上清，按順序依次加入下列組分240μl 50％PEG；36μl 1M LiCl；25μl 2mg/ml鮭魚精DNA；50μl(5-10μg)線形化重組質(zhì)粒pPIC6A-EFE。以線形化空質(zhì)粒pPIC6A作為對照。劇烈震蕩一分鐘使完全混勻，30℃靜置30分鐘，42℃熱激20-25分鐘，6000-8000rpm離心15分鐘，沉淀用1mlYPD培養(yǎng)基重懸，30℃培養(yǎng)1-4小時，取25-100μl圖布于含有300μg/ml殺稻瘟素(Blasticidin)的YPD固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2-3天，直到有單菌落出現(xiàn)。
利用生化方法將線性化的重組質(zhì)粒pPIC6A-EFE和空質(zhì)粒pPIC6A轉化X-33酵母菌株(參考Pichia expression vectors for selection onblasticidin and purification of recombinant proteins manual，Invitrogen)。在含有Blasticidin s Hcl(300mg/ml)的YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天，直到有單菌落出現(xiàn)。
(5)篩選陽性轉化子挑取10-20個單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30℃，250rpm搖床培養(yǎng)直至對數(shù)生長晚期，提取基因組進行重組子的PCR鑒定。所得到的陽性重組子均為Mut+。
酵母基因組DNA制備方法取1.5ml培養(yǎng)液4000r/min離心10min。菌體用液氮碾磨破壁。加7ml DNA緩沖液(100m mol/L Tris-HCl，pH8.0，10m mol/L EDTA，1％SDS)?；靹颍?5℃保溫1h。10000r/min離心15min。上清用苯酚抽提2次，每次5000r/min離心7min。再用氯仿抽提1次，5000r/min離心7min。用2.5倍乙醇沉淀(加0.3mol/L醋酸鈉，pH 5.2)，10000r/min離心10min。70％乙醇洗，電吹風吹干。加TE或水懸浮，加RNase。
PCR鑒定方法引物為Invitrogen公司表達載體提供的通用引物，其序列為上游GACTGG TTCCAATTGACAAGC；下游GCAAATGGCATTC TGACATCC。PCR按常規(guī)方法進行，擴增條件為94℃45s，54℃ 1min，72℃ 1min，40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用用0.8％瓊脂糖檢測其大小是否正確。
實施例3.基因工程纖溶酶蛋白的誘導表達(1)挑取重組菌的單菌落入20mlYPD液體培養(yǎng)基(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，30℃、250rpm培養(yǎng)進行活化；
(2)16個小時后取10ml活化后的菌液轉接500ml MGY液體培養(yǎng)基(1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甘油)30℃、250rpm培養(yǎng)增濃；(3)增濃24小時后的菌液經(jīng)離心收集菌體(1500g、10min、4℃)；(4)將收集到的菌體用重懸于1000ml MM液體培養(yǎng)基(1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甲醇)進行誘導表達，每24h添加甲醇至終濃度為0.5％；(5)誘導96小時后離心收集菌體(30000g、20min、4℃)。
(6)在酵母消解酶緩沖液重懸菌體沉淀之前，測定壓緊細胞的體積，以下所有步驟均在4℃進行；(7)用1體積的玻璃珠破菌緩沖液(20mmol/L Tris-Cl，pH7.9，10mmol/L MgCl2，1m mol/L EDTA，5％甘油，1m mol/L DTT，0.3m mol/L硫酸銨，1m mol/L PMSF)重懸細胞；(8)用2體積的玻璃珠破菌緩沖液與細胞混合，加4體積冰冷的酸洗玻璃珠；(9)將細胞懸液轉移至合適大小的帶螺口的離心管中(懸液占離心管≤60％-70％的容積)，于4℃以最大速度下振蕩30～60s，將管置于冰上放置1～2min，重復3～5次，在顯微鏡下檢查破細胞的程度，繼續(xù)步驟10；(10)沉淀玻璃珠，輕輕倒出上清，加入2～4體積的玻璃珠破菌緩沖液，顛倒管5～10次，等玻璃珠沉淀后輕輕倒出上清，合并上清液；(11)合并的上清液于4℃，12000g離心60min，收集上清即為抽提液。長期貯存時，將其分成小份于液氮中快速冷凍，-80℃貯存。
實施例4.基因工程纖溶酶蛋白的活性測定采用纖維蛋白平板法測定基因工程纖溶酶的生物學活性，通過活性測定，發(fā)酵液的活性單位超過2.9E+06U/L。圖4為測定時的溶圈，檢測方法可參考郝蘇麗等的方法[郝蘇麗，沈佳，蚓激酶生物活性檢測方法的研究，中國藥事1996年第10卷第6期]，具體操作過程如下。
(1)鋪板取纖維蛋白原液(稱取纖維蛋白原適量。用Tris-HCl緩沖液配成每毫升中含4.2mg可凝蛋白的溶液)12.7ml，纖維蛋白溶酶原液(取纖維蛋白溶酶原用Tris-HCl緩沖液配成每毫升中含lu的溶液)0.67ml，瓊脂液(稱取瓊脂0.8g加Tris-HCl緩沖液100ml，加熱溶解，濾過)13.4ml.凝血酶液(取凝血酶用Tris-HCl緩沖液配成含70B.PU的溶液)0.67ml?；靹?，倒入直徑9cm的有機玻璃盤內(nèi)，室溫放置半小時。凝好的板均勻無氣泡，呈乳白色。
(2)點樣稱取纖溶酶標準品適量。用Trios-HCI緩沖液配成每毫升中含2200，110，550，270四個濃度。用微量注射器吸取10μl標準液點于板上。點與點間應留有一定間距，然后蓋上玻扳。置37℃恒溫培育18小時，去蓋，用游標卡尺測量其溶圈的垂直直徑，以兩直徑乘積為縱座標。標準品單位為橫座標，在雙對數(shù)座標紙上作圖繪制標準曲線或求回歸方程。供試品的濃度取在標準曲線范圍內(nèi)，以供試品溶圈垂直兩直徑乘積在纖溶酶標推曲線上查活力單位。
(3)檢測結果兩直徑乘積為縱座標，標準品單位為橫座標，回歸方程為lgY＝-1.334+0.479 lgX，Y為溶圈的垂直直徑積，單位為cm2，X為活性單位。結果表明，發(fā)酵液的活性單位為2.9E+06U/L。
實施例5.基因工程纖溶酶制備口服類溶栓藥物將基因工程發(fā)酵產(chǎn)物破碎(方法見實施例2)，然后收集上清，在緩沖液(23克甘氨酸/升，1.6克磷酸氫二鈉/升，0.55克磷酸二氫鈉/升，pH7.0)中透析，最后用超濾濃縮到每毫升含1毫克濃度，用0.22μm孔徑的膜過濾滅菌。濾液可直接最為口服水劑供病人服用，或者大約1毫升濾液(約300000活力單位)裝瓶，冷凍干燥，制成粉劑成品，使用時溫水溶解口服。
實施例6.基因工程纖溶酶蛋白制劑的應用——溶栓作用家兔頸外靜脈血栓法操作簡便，不需特殊儀器，在國內(nèi)外均有研究室采用，是研究藥物溶血栓作用的可行方法。該方法可參考[趙煒明，許超千，何樹莊，王玲，基因工程纖溶酶溶栓作用的實驗研究哈爾濱醫(yī)科大學學報，2002(36)3183-185][徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學.北京人民衛(wèi)生出版社，1982.][朱燕，何執(zhí)中，孫可迪，王少飛，基因工程纖溶酶對實驗性血栓的影響，中國藥科大學學報，2000，31(1)50～52。]
(1)制造頸動-靜脈旁路實驗模型將實驗兔用20％烏拉坦5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，背位固定，剝離氣管，插入一塑料套管(氣管分泌物多時可通過此套管吸出)，分離左側頸外靜脈和右側頸總動脈。在三段聚乙烯管中段放入一段長6cm的4號手術絲線，聚乙烯管內(nèi)充滿肝素生理鹽水溶液(50U/ml)用聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，由聚乙烯管準確注入肝素生理鹽水溶液(50U/ml)抗凝，然后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管內(nèi)，返回左頸外靜脈，形成頸動-靜脈旁路，維持3h后，取血，中斷血流，迅速取出絲線稱重。
(2)實驗分組及給藥途徑家兔36只，體重2.5士0.2kg，隨機分成6組，分別為模型組、生理鹽水對照組、基因工程纖溶酶小劑量組、基因工程纖溶酶中劑量組、基因工程纖溶酶大劑量組、尿激酶陽性對照組。
各組具體給藥途徑如下模型組所制造的頸動-靜脈旁路模型；生理鹽水對照組耳緣靜脈等體積注射生理鹽水；基因工程纖溶酶小劑量組耳緣靜脈注射基因工程纖溶酶1250U/kg；基因工程纖溶酶中劑量組耳緣靜脈注射基因工程纖溶酶2500U/kg；基因工程纖溶酶大劑量組耳緣靜脈注射基因工程纖溶酶5000U/kg；尿激酶陽性對照組耳緣靜脈注射尿激酶2×104U/kg。
給藥方法頸動-靜脈旁路模型建立后，生理鹽水對照組、基因工程纖溶酶小劑量組、中劑量組、大劑量組及尿激酶陽性對照組分別于旁路建立后15min給藥，觀察3h。
(3)溶栓作用采用兔動-靜脈旁路血栓形成模型，測定蚯蚓纖溶酶的溶栓作用(血栓濕重、干重)；心臟取血，測定蚯蚓纖溶酶對血漿纖維蛋白酶(FIB)、血漿優(yōu)球蛋白溶解時間(ELT)、纖維蛋白裂解產(chǎn)物(FDP)等生化指標的影響。
實驗結果見表1和表2。本實驗中基因工程纖溶酶中劑量組與大劑量組可使ELT顯著縮短，說明基因工程纖溶酶激活了纖溶系統(tǒng)。本實驗中基因工程纖溶酶小劑量組、中劑量組和大劑量組與模型組相比可明顯增加FDP含量，說明基因工程纖溶酶可使血液系統(tǒng)的纖溶活性增強。
在本實驗中，F(xiàn)IB沒有明顯的變化，表明基因工程纖溶酶不易產(chǎn)生出血的副反應。
表1基因工程纖溶酶對ETL FDP數(shù)值及FIB含量的影響ELT (min) FDP(ng·L-1)組別 FIB(g·L-1)＜120 ≥130 ＜5 5-20≥20模型組0 7.9 8.10 0 4.60±2.89生理鹽水組0 7.9 8.10 0 5.90±2.98基因工程纖溶酶小0 7.8 4.90 2.5 5.34±2.80☆劑量組(1250U/kg)基因工程纖溶酶中劑量組(2500U/kg) 4.1·4.1·1.1·4·3·3.75±1.84☆基因工程纖溶酶大5·3·1·1·6·3.00±1.93☆劑量組(5000U/kg)尿激酶組 5·3·0·1·7·2.60±1.02☆ELT，F(xiàn)DP均以例數(shù)計，經(jīng)秩和檢驗，·與生理鹽水組比較，均為ρ＜0.01；FIB含量經(jīng)q檢驗，☆與生理鹽水組比較ρ＜0.05。
表2基因工程纖溶酶對家兔體內(nèi)血栓形成的影響(x±S)組 別 例劑量濕重(ng) 干重(ng)抑制率數(shù) (％)模型組 870.25±2.04 22.01±1.83重理鹽水組885.31±3.61 28.25±1.02基因工程纖溶 81250U/kg63.58±9.60△△19.55±3.67△△24.5酶小劑量組基因工程纖溶 82500U/kg39.00±5.9··△△☆14.26±1.05··△△53.6酶中劑量組基因工程纖溶 85000U/kg29.49±4.58··△△12.21±2.01··△△65.3酶大劑量組尿激酶組 82×104U/kg 21.11±5.48··△△8.91±2.07··△△75.1··與模型組比較，ρ＜0.01；△△與生理鹽水組比較，ρ＜0.01；☆大、中、小劑量組比較ρ＜0.05。
SEQUENCE LISTINGNO1<110> 綠色生命實驗室有限公司<120> 一種畢赤酵母基因工程菌株及制備方法和應用<130> 正蚓科粉正蚓屬蚯蚓(Lumbricus rubellus)纖溶酶基因核苷酸序列<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 747<212> DNA<213> Lumbricus rubellus<220>
<221> cDNA<222> (3)..(740)<223>
<400> 1acatggaact tcctcccgga acaaaaattg tcggaggaat tgaagctaga ccatacgagt 60tcccatggca ggtgtccgtc cgaaggaaat cttccgattc ccatttctgc ggaggtagca120tcatcaacga tcgttgggtt gtctgcgctg ctcactgcat gcagggagag gcccccgctc180tggtttcatt ggtcgtgggt gagcacgaca ggagtgcagc gagtacagta cgtcagactc240atgacgttga tagcatcttc gttcacgagg actacaacac aaatacccta gagaacgacg300tttctgtcat caagacatct gttgccatca ctttcgacat caacgttggt ccaatctgcg360ccccagatcc ggctaacgac tacgtctacc gtaagagcca gtgttccgga tggggaacta420tcaattcagg tggaatctgc tgtcccaacg ttctgcgata cgtgacgctg aatgacacaa480ccaaccaata ctgcgaagat gtatacccac taaattcaat ctacgacgat atgatttgcg540cgtcggacaa cactgggggt aacgacagag actcctgcca gggtgactcc ggcggccctc600tgagcgtcaa ggatggtagt ggaatcttca gcctgattgg tattgtgtct tggggaattg660gttgcgcttc tggctatcca ggagtctact cccgcgtcgg attccatgct gcatggatca720ccgacatcat caccaacaac taaaccg747
SEQUENCE LISTINGNO2<110> 綠色生命實驗室有限公司<120> 一種畢赤酵母基因工程菌株及制備方法和應用<130> 正蚓科粉正蚓屬蚯蚓(Lumbricus rubellus)纖溶酶基因氨基酸序列<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 246<212> PRT<213> Lumbricus rubellus<220><221> PEPTIDE<222> (1)..(246)<223>
<400>1Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg15 10 15Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp20 25 30Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys35 40 45Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val50 55 60Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala AIa Ser Thr Val Arg Gln Thr His
65 70 75 80Asp Val Asp Ser Ile Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Thr Asn Thr Leu85 90 95Glu Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Ser Val Ala Ile Thr Phe Asp100 105 110Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val115 120 125Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly130 135 140Ile Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Asp Thr Thr145 150 155 160Asn Gln Tyr Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn Ser Ile Tyr Asp Asp165 170 175Met Ile Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp Ser Cys180 185 190Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile195 200 205Phe Ser Leu Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly210 215 220Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Ala Trp Ile Thr225 230 235 240Asp Ile Ile Thr Asn Asn24權利要求
1.一種畢赤酵母基因工程菌株，其特征在于，該菌株為畢赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC 6A-EFE)，CCTCC M204004。
2.一種用于權利要求1所述的基因工程菌株的制備方法，該方法包括下列步驟A、蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增以含有纖溶酶基因的T載體質(zhì)粒為模板，根據(jù)EFE成熟肽和表達載體pPIC6A上的克隆位點設計引物；B、PCR產(chǎn)物克隆至T載體回收PCR產(chǎn)物中的基因片段，并克隆于pGEM-T載體，將該重組載體pGEM-T-EFE2轉入大腸桿菌JM109中；C、穿梭表達質(zhì)粒的構建提取重組載體pGEM-T-EFE2，用EcoR I和Xba I雙酶切以得到目的片段EFE；同樣酶切pPIC6A空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化，將去磷酸化后的線性化的pPIC6A空載體與雙酶切后得到的EFE在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，以得到重組表達載體pPIC6A-EFE，將該重組載體轉入大腸桿菌JM109中進行擴增；D、表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構建，提取重組質(zhì)粒pPIC6aA-EFE，用SacI酶切成線性，同樣酶切空質(zhì)粒pPIC6A作為對照，利用生化方法將線性化的重組質(zhì)粒pPIC6A-EFE和空質(zhì)粒pPIC6A轉化X-33酵母菌株，在含有殺稻瘟素300mg/ml的YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天，挑取10-20個單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30℃，250rpm搖床培養(yǎng)直至對數(shù)生長晚期，提取基因組進行重組子的PCR鑒定。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因工程菌株的制備方法，其特征在于表達載體pPIC 6A上的克隆位點設計引物為，上游引物GAATTC GCATGG AAC TTC CTC CCG，下游引物TCT AGA CGG TTT AGT TGTTGG TGA T。
4.一種基因工程纖溶酶在制備治療栓塞性心血管疾病的口服藥劑中的應用。
5.一種基因工程纖溶酶在生產(chǎn)具有預防血栓疾病、有益心血管健康的保健品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種畢赤酵母基因工程菌株及制備方法和應用，該菌株為Pichia pastoris X－33(pPIC 6A－EFE)，CCTCC M204004，首先是蚯蚓纖溶酶PCR擴增；其次是PCR產(chǎn)物克隆至T載體；第三是穿梭表達質(zhì)粒的構建；第四是表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構建。本發(fā)明操作簡單，溶解圈清晰，易于觀察，重復性好。
文檔編號A61K38/43GK1563353SQ20041003447
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權日2004年4月14日
發(fā)明者孟小林, 徐進平, 胡燕, 張俊杰, 魯偉, 王健, 孟海洋 申請人:綠色生命實驗室有限公司