專利名稱：用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物及其施用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)動物養(yǎng)殖領域，尤其涉及一種可有效降低甲殼類動物，特別是蝦蟹類動物的病毒感染發(fā)生率，且可作為預防及/或治療病毒感染的組合物與方法。
背景技術：
隨著人工養(yǎng)殖技術的發(fā)展，以及市場需求與高獲利，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已成長為一種重要的生產(chǎn)行業(yè)。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FoodAgriculture Organism，F(xiàn)AO)研究指出，由于全世界海洋水產(chǎn)捕獲量減少以及人口快速增加，因此未來陸上水產(chǎn)養(yǎng)殖需求將大量提升，以彌補海洋水產(chǎn)捕獲量的不足。2001年全世界蝦產(chǎn)量為127萬噸，其中草蝦就占了61萬噸。
然而，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖場的環(huán)境污染問題，以及一些無法或難以控制的微生物感染，特別是病毒感染問題，在病毒感染的蔓延及無法控制的情況下，導致全世界養(yǎng)殖業(yè)者均面臨束手無策、產(chǎn)量大減的困境。因此如何有效克服病毒感染問題，是刻不容緩的課題。
一般來說，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者基于經(jīng)濟效率上的考慮，皆期望養(yǎng)殖場可于高密度下進行養(yǎng)殖，藉以于相同養(yǎng)殖單位面積下獲取較高的經(jīng)濟利益。但由于由病原體所造成的感染十分嚴重，加上環(huán)境污染的問題，致使養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物有很高的死亡率。例如，養(yǎng)殖的甲殼類動物(例如，蝦與蟹)極易受到病毒的感染，且甲殼類動物大都會受到相同病毒的威脅，一但發(fā)生病毒感染即會于甲殼類動物間互相傳染(例如，感染蟹的病毒傳染給蝦)，并會造成極高的死亡率。
以最受歡迎的海鮮食品之一-蝦子，舉例來說，養(yǎng)殖業(yè)者會于懷孕的雌蝦產(chǎn)卵后，將蝦卵收集起來，之后以氯消毒(chlorinated)并以水清洗。約12-18小時后，位于孵化池中的受精卵會孵化出蝦子的無節(jié)幼蟲(nauplii)，接著進入五個時期的生長階段，分別為水蚤狀幼蟲(zoea)期、糠蝦期幼蟲(mysis)期、后期幼蟲(postlarvae)期、幼蝦(juvenile)期及成蝦期。蝦子的養(yǎng)殖期間一但感染疾病，通常會造成全部或大部分的蝦子生病或死亡，致使蝦子的生產(chǎn)被迫終止，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者莫大的損失。
已知有約20種病毒與蝦子疾病有關，例如傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal hematopoietic necrosis virus，IHHNV)、對蝦桿狀病毒(baculovirus penaei，BP)、中腸腺壞死桿狀病毒(baculoviral midgut GI and necrosis virus，BMN)、草蝦桿狀病毒(monodon baculovirus，MBV)、肝胰腺類微小病毒(hepatopancreaticparvo-like virus，HPV)、腸呼吸道病毒(reo-like virus)、桃拉病毒(Taura syndrome virus)、黃頭病毒(yellow head virus，YHV)，以及白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)等。然而，這些疾病卻難以藉由已知的水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物來處理，例如硫酸銅、高錳酸鉀(potassium permanganate)、福爾馬林(formalin)、孔雀石綠(malachitegreen)、羥四環(huán)霉素(oxytetracycline)、碘仿(iodoform I-500)、呋喃藥物(furyl drug)或磺胺劑(sulfa drug)等。而且上述藥物尚有容易引起藥物殘留或是引起抗藥菌產(chǎn)生的問題。此外，從已感染病毒的病蝦檢體中常會被檢驗出帶有兩種或兩種以上之病毒，即所謂的混合感染(mixed infection)，此種狀況使得蝦子的病毒感染防治問題變得更加的復雜與困難(Diseases of Aquatic Organisms，48，p233-236，2002；FishPathology，35(1)，1-10，2000；Fish Pathology 24(2)，p89-100，1989)。
為解決存在于甲殼類動物間嚴重的病毒感染問題，先前已有人提出多種的解決方法，來提高甲殼類動物對病毒的抵抗能力，藉以增加甲殼類動物的養(yǎng)殖存活率。例如，Manohar等人于美國第US 6,440,466號專利中揭示一種含有多種植物萃取物，用以處理水產(chǎn)動物的病毒或細菌疾病的組合物。另外，Laramore于美國第US 6,705,556號專利中則揭示一種用以誘發(fā)水產(chǎn)動物對病毒感染耐受性的組合物及方法，其是將包含有失去活性的(inactivated)白斑綜合癥病毒的病毒顆粒的組合物投入包含有幼蝦的水溶液中，藉以使幼蝦暴露于該組合物下，以達到增加幼蝦對病毒感染耐受性的目的。但此種誘發(fā)幼蝦對病毒感染耐受性所得的效果并不佳，因幼蝦免疫系統(tǒng)不是很健全時，此種處理方式并無法使幼蝦獲得足夠保護，且誘發(fā)幼蝦產(chǎn)生足夠的免疫反應需要時間，并無法立即獲得想要的治療效果。為獲得較為直接的治療效果，有人提出直接使用可與病毒表面蛋白反應的多株抗體，藉以提高水產(chǎn)動物對抗病毒的能力，例如Van Hulten等人曾揭示使用多株抗體對抗白斑綜合癥病毒，藉以使蝦子不會為白斑綜合癥病毒所感染。Van Hulten等人所揭示的方法是以肌肉注射的方式將多株抗體注入蝦子體內(Van Hulten et al.White spotsyndrome virus envelop protein VP28 is involved in the systemicinfection of shrimp.2001；Virplogy 285，228-233)。然而，對蝦子進行肌肉注射是一件極為費時費力的工作，因此這種方法并不適合用于養(yǎng)殖培養(yǎng)。此外，該篇文獻中并未提及如何處理或預防具有高流行率的幼蝦病毒感染。另外，在Lee等人依專利合作條約(Patent CooperationTreaty，PCT)申請的WO 03/070258專利申請中，揭示一種以免疫蛋黃體(IgY)來大量生產(chǎn)對抗白斑綜合癥病毒的抗體，通過將蝦子白斑綜合癥病毒的抗原(失活性的病毒、減毒的病毒或病毒蛋白)施用于雞或鴨等動物，使其產(chǎn)生免疫反應，之后于該雞或鴨所排出的蛋中進一步分離出所需的抗體。雖然此種方法可生產(chǎn)出所要的抗體，但此種方式所獲得的蛋中所含有的抗體量并不穩(wěn)定，且自蛋中分離出抗體十分費時與費力。此外，在Hulten等人依專利合作條約申請WO 01/09340的專利申請中，則揭示了白斑綜合癥病毒的特異性病毒蛋白(VP19，VP24，VP26與VP28)，此病毒蛋白可用以生成能辨識該病毒蛋白并與其反應的抗體，以及含有該病毒蛋白的疫苗。另外，該申請還揭示了將該病毒蛋白注入兔子體內以產(chǎn)生多株抗體，并將此多株抗體施用于蝦子以提高其對抗病毒的能力。本技術領域的技藝者均了解多株抗體對抗病毒的效果并不如單株抗體，且多株抗體除會與目標病毒反應外，亦同時會引不必要的免疫反應。
因此，本發(fā)明致力于提供一種用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物及其施用方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于預防及/或治療病毒感染的組合物，以控制甲殼類動物的病毒感染率。該組合物包含至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體。本發(fā)明所述組合物可用于制備醫(yī)藥組合物、營養(yǎng)劑組合物、飼料添加劑或飼料組合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由融合瘤細胞株，通過生物反應器或注入老鼠腹部的方式，有效地大量生產(chǎn)該單株抗體的方法。
其中，上述甲殼類動物尤指蝦或蟹。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種用以治療及/或預防蝦子病毒感染的方法，其通過將包含至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體的組合物，根據(jù)蝦子的不同生長時期，分別與一介質混合后施用于該蝦子，其中該介質為養(yǎng)殖用水或飼料。例如(a)將種母蝦浸泡于一含有該組合物的溶液中；(b)將受精卵浸泡于一含有該組合物的溶液中；(c)將無節(jié)幼蟲浸泡于一含有該組合物的溶液中；(d)將水蚤狀幼蟲浸泡于一含有該組合物的溶液中，及喂食含有該組合物的飼料組合物于該水蚤狀幼蟲；(e)將糠蝦期幼蟲浸泡于一含有該組合物的溶液中，及喂食含有該組合物的飼料組合物于該糠蝦期幼蟲；(f)將后期幼蟲浸泡于一含有該組合物的溶液中，及喂食含有該組合物的飼料組合物于該后期幼蟲；(g)給幼蝦施用一包含該組合物的飼料組合物；以及(h)給成蝦施用一包含該組合物的飼料組合物。
本發(fā)明所述的單株抗體較佳為可對抗感染甲殼類動物病毒的單株抗體，該病毒選自傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、草蝦桿狀病毒、肝胰腺類微小病毒、腸呼吸道病毒、桃拉病毒、黃頭病毒，及白斑綜合癥病毒所組成的族群。本發(fā)明的組合物較佳為包含至少一種可用以對抗上述病毒的單株抗體，更佳為包含至少兩種以上單株抗體的復合式組合物，以增加該組合物治療及/或預防蝦子病毒感染的效果。當組合物中包含兩種或兩種以上單株抗體時，此兩種或兩種以上單株抗體可為用以對抗同一種病毒或不同種病毒的抗體。其中較佳為不同種病毒的抗體，以有效對抗蝦子的多種病毒混合感染狀況，從而增加蝦子的存活率。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種用以制造可供作為預防及/或治療藥劑，以控制甲殼類動物病毒感染的組合物的步驟，該組合物包含至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體，其中該單株抗體可由生物反應器(bioreactor)大量培養(yǎng)一種可產(chǎn)生該單株抗體的融合瘤細胞株(hybridoma cell)，之后收集培養(yǎng)上清液來獲得。用大型培養(yǎng)槽大規(guī)模生產(chǎn)該抗體時，該生物反應器的體積較佳為1公升以上。另一種大量生產(chǎn)單株抗體的方式，是將可產(chǎn)生該單株抗體的融合瘤細胞株注入老鼠腹部，以誘發(fā)生成腫瘤，然后再以針頭收集含有高濃度抗體的老鼠腹水，通常每只老鼠可取得約15毫升左右的腹水。由本發(fā)明所揭示的方法，可經(jīng)濟、有效的大量生產(chǎn)出所需的單株抗體。


熟習相關技藝者可通過下列較佳實施例及參閱所附圖式而了解本發(fā)明內容，所附圖式如下圖1為傳染性皮下及造血組織壞死病毒的VP37基因PCR片段，長約1038bp。
圖2為大腸桿菌BL21 pLysS內表達VP37的SDS PAGE電泳膠片照相圖。欄1及欄2分別顯示將pET28a-vp37轉型入BL21 pLysS菌株內后進行表達，其中欄2為添加IPTG的表達量。箭頭指出VP37重組蛋白于膠體上的位置。
圖3為抗白斑綜合癥病毒(WSSV)VP28抗體針對白斑綜合癥病毒顆粒檢體及VP28重組蛋白的西方墨點法測試。欄1為經(jīng)過CsCl不連續(xù)梯度超高速離心所純化的WSSV病毒顆粒；欄2為vp28重組蛋白；欄3為蛋白質分子量標記(protein marker)。箭頭處所指即為WSSV VP28蛋白。本圖顯示為抗白斑綜合癥病毒VP28抗體經(jīng)1∶2000倍稀釋所進行的實驗。
圖4為蝦飼料分別浸泡病蝦萃取液、白斑綜合癥病毒單株抗體以及病蝦萃取液加白斑綜合癥病毒單株抗體后的喂食測試結果統(tǒng)計圖；-◆-白斑綜合癥病毒單株抗體-▲-病蝦萃取液+白斑綜合癥病毒單株抗體-■-病蝦萃取液圖5為大蝦(蝦體大小3.92±0.28cm，平均體重0.45克/只)的浸泡喂食試驗結果統(tǒng)計圖；-◆-白斑綜合癥病毒單株抗體-▲-病蝦萃取液+白斑綜合癥病毒單株抗體-■-病蝦萃取液圖6為中蝦(蝦體大小3.32±0.32cm，平均體重0.25克/只)的浸泡喂食試驗結果統(tǒng)計圖；以及-◆-白斑綜合癥病毒單株抗體-▲-病蝦萃取液+白斑綜合癥病毒單株抗體-■-病蝦萃取液圖7為小蝦組(蝦體大小2.48±0.29cm，平均體重0.15克/只)的浸泡喂食試驗結果統(tǒng)計圖。
-◆-白斑綜合癥病毒單株抗體-▲-病蝦萃取液+白斑綜合癥病毒單株抗體-■-病蝦萃取液圖8為HTWC對蝦子感染病毒后的處理效果。
-◆-對照組，感染病毒不喂食添加抗體-▲-感染病毒一天后，開始喂食添加抗體-■-感染病毒三天后，開始喂食添加抗體-●-感染病毒五天后，開始喂食添加抗體-*-感染病毒七天后，開始喂食添加抗體具體實施方式
本發(fā)明將參考下列的實施例做進一步的說明，這些實施例并不限制本發(fā)明前面所揭示的內容。熟習本發(fā)明的技藝者，可做些許改良與修飾，但仍不脫離本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明提供了一種可用于預防及/或治療病毒感染的組合物，以控制甲殼類動物的病毒感染。該組合物包含至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體。本發(fā)明所述的組合物可通過浸泡或喂食的方式施用于甲殼類動物。本發(fā)明在此還提供了一種方便且經(jīng)濟，用以治療感染及/或預防感染的方法。
本發(fā)明前述的甲殼類動物較佳為養(yǎng)殖于高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖場中的甲殼類動物，更佳為遭受嚴重感染的甲殼類動物，且無任何已知的方法可以處理的。其中，該甲殼類動物較佳為蝦或蟹。
本發(fā)明所述的感染與病原體有關，例如原核生物(prokaryotes)或真核生物(eukaryotes)。其中，該感染較佳為與病毒有關，且更佳為該病毒是選自傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、草蝦桿狀病毒、肝胰腺類微小病毒、腸呼吸道病毒、桃拉病毒、黃頭病毒，及白斑綜合癥病毒所組成的族群。
本發(fā)明所述的單株抗體為可與上述病原體(例如，感染的病毒)專一性相結合的單株抗體。
本發(fā)明所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，可依需要制備成各種形式的產(chǎn)品，只要不破壞所含的單株抗體，皆可被應用于本發(fā)明中，在此并沒有特別的限制。例如，被制成醫(yī)藥組合物、營養(yǎng)劑組合物、飼料添加劑，或飼料組合物，但并不僅限于此。
本發(fā)明所述的醫(yī)藥組合物，包含至少一種可與病毒專一性相結合的有效劑量的單株抗體。在此“有效劑量”是指能提供足以使甲殼類動物得以對抗病毒感染的劑量，其會因單株抗體種類、給藥方式、給藥時間、養(yǎng)殖溫度、以及甲殼類動物的年齡與健康狀況的不同而有所差異。
本發(fā)明所述的營養(yǎng)劑組合物或飼料添加劑組合物，是包含至少一種可與病毒專一性相結合的有效劑量的單株抗體，其可與營養(yǎng)劑或飼料一同進行喂食，能有效的治療及/或預防水產(chǎn)養(yǎng)殖場中的甲殼類動物的病毒感染，以提高養(yǎng)殖存活率并增加產(chǎn)量。在此“有效劑量”是指能提供足以使甲殼類動物得以對抗病毒感染的劑量，其會因單株抗體種類、給藥方式、給藥時間、養(yǎng)殖溫度、以及甲殼類動物的年齡與健康狀況的不同而有所差異。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種用以治療及/或預防蝦子病毒感染的方法，其是在蝦子的特定成長時期，將含有至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體的組合物與一介質混合后施用于蝦子，其中該介質包含養(yǎng)殖用水與飼料。該特定生長時期是指種母蝦期、受精卵期、無節(jié)幼蟲期、水蚤狀幼蟲期、糠蝦期幼蟲期、后期幼蟲期、幼蝦期或成蝦期。做為本發(fā)明治療及/或預防蝦子病毒感染的方法的實施例，例如(1)在種母蝦階段將種母蝦定期2至3天，移至含有本發(fā)明所述的組合物的預設池子中，浸泡一給定時間后，再將種母蝦移回育種池。
(2)在受精卵階段產(chǎn)卵后8-10小時收集該受精卵以氯消毒(chlorinated)后，再以干凈的海水經(jīng)多次水洗。之后，將該受精卵移至孵化池并浸泡于干凈的海水中。將本發(fā)明所述的組合物加入干凈的海水中并注入孵化池中。
(3)在無節(jié)幼蟲階段無節(jié)幼蟲會于產(chǎn)卵后約12-18小時于孵化池中孵化。由于在蛻變過程(metamorphosis)中無節(jié)幼蟲可自卵黃獲得足夠的營養(yǎng)供給，因此于此階段中無需額外供給飼料。因此，本發(fā)明所述的組合物是直接被加入干凈的海水中，用以浸泡無節(jié)幼蟲。
(4)在水蚤狀幼蟲階段水蚤狀幼蟲開始會攝食飼料。一般來說，飼料會包含3-5μm的浮游植物(phytoplankton)、牡蠣的受精卵，以及人工浮游生物(plankton)。此時，將本發(fā)明所述的組合物，可以浸泡的方式直接加入干凈的海水中，或是加入飼料中施用于水蚤狀幼蟲。
(5)在糠蝦期幼蟲階段糠蝦期幼蟲所食用的飼料通常包含浮游植物、人工浮游生物、豐年蝦無節(jié)幼蟲(artemia nauplii)，及輪蟲(rotifera)。此時，將本發(fā)明所述的組合物，以浸泡的方式直接加入干凈的海水中，或是加入飼料中施用于糠蝦期幼蟲。
(6)在后期幼蟲階段后期幼蟲所食用的飼料通常包含浮游植物、人工浮游生物，及豐年蝦。此時，將本發(fā)明所述的組合物，以浸泡的方式直接加入干凈的海水中，或是加入飼料中施用于后期幼蟲。
(7)在幼蝦階段幼蝦所食用的飼料通常包含人工飼料、大豆肉、牡蠣、魚肉，及蝦肉。此時，本發(fā)明所述的組合物是被直接加入飼料中施用于幼蝦。
(8)在成蝦階段成蝦會持續(xù)長大直到被販賣至市場。在此階段中，飼料通常包含人工飼料、大豆肉、牡蠣、魚肉及蝦肉。此時，將本發(fā)明所述的組合物直接加入飼料中施用于成蝦。
上述方法中，也可直接使用本發(fā)明所述的單株抗體替代包含單株抗體的組合物。
本發(fā)明所述方法的步驟可以連續(xù)執(zhí)行或是當有需要時才執(zhí)行，其中以從受精卵至成蝦的每一個階段中皆進行處理為較佳。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，提供了一種方便且有效的治療及/或預防蝦子感染的方法。以此提高其存活率，進而使得蝦子的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)量獲得大幅的提升。
本發(fā)明所述的單株抗體可通過任何已知方法或熟習本技術領域者所知悉的方法而制備。作為本發(fā)明的一實施例，單株抗體可通過融合瘤細胞技術來制備。例如，使用已知病毒的表達蛋白(例如，套膜蛋白)或病毒顆粒作為抗原，注入老鼠動物體內產(chǎn)生抗體，再以融合瘤技術進行選殖，以篩選出本發(fā)明所述的可產(chǎn)生抗特定病毒抗原的單株抗體的融合瘤細胞。之后，僅需使用此融合瘤細胞通過生物反應器或注入老鼠腹部，即可快速且大量的制備所需的高效價單株抗體。根據(jù)本發(fā)明所述的單株抗體的制造方法所制得的單株抗體，無須經(jīng)進一步的分離處理，即可直接使用，由此可有效減少單株抗體的生產(chǎn)成本。
以下為制備傳染性皮下及造血組織壞死病毒和白斑綜合癥病毒單株抗體的實施例，同時就極易造成蝦子病毒感染的白斑綜合癥病毒舉例說明。通過本發(fā)明所述的融合瘤細胞HTWC28所制備出的白斑綜合癥病毒的套膜(envelope)蛋白VP28的單株抗體，可被直接加入至干凈的海水中，或混入飼料中喂食蝦子，由此即可有效控制蝦子受到病毒感染的狀況。
實施例一(1)制備白斑綜合癥病毒抗原解剖呈現(xiàn)白斑綜合癥癥狀的草蝦，取其肝胰臟和表皮，經(jīng)研磨后以0.45μm孔隙的濾膜過濾去雜質，再以不連續(xù)的氯化銫(CsCl)梯度20％、30％、40％氯化銫，溶于1X TNE緩沖液(20mM Tris Base，400mM氯化鈉，5mM EDTA，ph7.4)進行超高速離心(39,000rpm，18小時，4℃)，以萃取出白斑綜合癥病毒。
接著，將病毒萃取液以1/10X體積的溶解緩沖液(lysis buffer)(100mM Tris-HCl(ph8.0)，100mM EDTA，2.5％SDS)及100μg/ml之蛋白酶(proteinase k)，于55℃下作用24小時后，以苯酚/氯仿混合液(phenol/chloroform)萃取病毒的脫氧核糖核酸(DNA)。
接著，以已知的聚合酶鏈反應(PCR)技術，放大位于白斑綜合癥病毒DNA上可編碼出套膜(envelope)蛋白VP28的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。白斑綜合癥病毒的套膜(envelope)蛋白VP28包含615個核苷酸(SEQ IDNO1)，可編碼成204個胺基酸(SEQ ID NO2)，約28kDa。
接著，以已知洋菜膠電泳法純化前述PCR產(chǎn)物的核苷酸片段，并將其切割出。之后，將此核苷酸片段由接合酶(Ligase)接入pET28a載體內。此一重組質體，在此命名為pET28a-VP28。
將pET28a-VP28重組質體轉形(transform)至大腸桿菌BL21 pLysS菌株內，隨即進行VP28蛋白質的表達。將已通過轉形插入pET28a-VP28重組質體的BL21 pLysS菌株，于37℃下培養(yǎng)3小時后，加入0.5M異丙基硫代半乳糖吡喃苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，IPTG)以啟動蛋白質表達，再于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3小時，使其持續(xù)表達VP28蛋白質，最后以His-taq管柱純化VP28蛋白(抗原蛋白)。
(2)制備傳染性皮下及造血組織壞死病毒抗原解剖經(jīng)PCR反應證實感染傳染性皮下及造血組織壞死病毒的草蝦，取其肝胰臟，經(jīng)研磨后以0.45μm孔隙的濾膜過濾去雜質。此過濾液隨后以不連續(xù)CsCl梯度20％、30％、40％CsCl，溶于1X TNE(20mM TrisBase，400mM NaCl，5mM EDTA，ph7.4)，于4℃下以39k rpm之離心轉速離心18小時，進行超高速離心以萃取、純化病毒。
接著將病毒萃取液以1/10X體積的溶解緩沖液100mMTris-HCl(ph8.0)，100mM EDTA，2.5％SDS及100μg/ml的蛋白酶(proteinase k)，于55℃作用24小時后以苯酚/氯仿混合液萃取傳染性皮下及造血組織壞死病毒織的DNA。
接著，以已知聚合酶鏈反應(PCR)技術，放大位于傳染性皮下及造血組織壞死病毒DNA上可編碼出外殼(Capside)蛋白VP37的核苷酸序列，如圖1所示。傳染性皮下及造血組織壞死病毒的外殼蛋白VP37包含990個核苷酸(SEQ ID NO3)，可編碼成329個胺基酸(SEQ ID NO4)。
接著，以已知洋菜膠電泳法純化前述PCR產(chǎn)物的核苷酸片段，并將其切割出。之后，將此核苷酸片段通過接合酶(Ligase)接入pET28a載體內。此一重組質體，在此命名為pET28a-VP37。
將pET28a-VP37重組質體轉形(transform)至大腸桿菌BL21 pLysS菌株內，隨即進行VP37蛋白質的表達。將已通過轉形插入pET28a-VP37重組質體的BL21 pLysS菌株，于37℃下培養(yǎng)3小時后，加入0.5M異丙基硫代半乳糖吡喃苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，IPTG)以啟動蛋白質表達，再于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3小時，使其持續(xù)表現(xiàn)VP37蛋白質，如圖2所示。最后，以His-taq管柱純化VP37蛋白(抗原蛋白)。
(3)制備單株抗體選擇6-8周，健康BALB/C小鼠以佛氏完全佐劑(Freund’s completeaajuvant，F(xiàn)CA)乳化上述純化的抗原蛋白。之后，分別于每只小鼠腹腔中注射約100μg乳化后的抗原蛋白，2-3周后以佛氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)乳化抗原蛋白，同樣以腹腔進行注射。2-3周后重復佛氏不完全佐劑的免疫操作。再過一周后，于小鼠尾部靜脈采血，并以酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-link immunosorbentassay，ELISA)的方式測定小鼠血清效價。于最后一次加強免疫時，直接腹腔注射100μg的純化抗原蛋白，3-4天后進行細胞融合。
在進行細胞融合前，先將未經(jīng)上述免疫操作處理的BALB/C小鼠采血后犧牲，放入75％酒清中5分鐘。之后，于小鼠腹部以碘酒消毒，剪一小口撕開腹部皮膚，腹腔內注射5ml用胎牛血清配制的HAT選擇性培養(yǎng)基，吸出后再用5ml該HAT培養(yǎng)基稀釋，然后滴加到96孔ELISA板內，每孔1滴，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內過夜(飼養(yǎng)細胞)。
另外，將免疫好的小鼠采血后放入75％酒精中5分鐘后，取出脾臟用洗液(無血清RPMI1640培養(yǎng)基)沖洗。之后，將脾臟放在無菌銅網(wǎng)上，用滅菌的注射器反復抽吸，吸出上清液。之后，以1500rpm離心8分鐘，沉淀即為制備好的脾細胞。
將骨髓瘤細胞(SP2/0)及上述預先制備好的脾細胞用洗液作適當稀釋后計數(shù)，兩種細胞按1∶5的比例混合，接著以1500rpm離心8-10分鐘。去除上清液，緩慢加入1ml 50％的聚乙二醇作用1-2分鐘，再緩慢加入20-30ml洗液。以1500rpm離心8-10分鐘。去除上清液后，加入HAT培養(yǎng)液，新懸浮細胞，并輕輕混勻(融合瘤細胞懸浮液)。
在前述預先準備好飼養(yǎng)細胞的96孔板上，于每孔加入1-2滴融合瘤細胞懸浮液后，放置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后的第三天，每孔補加1滴HAT培養(yǎng)液，至第四天換液。
最后以ELISA篩選抗體分泌陽性的融合瘤細胞，以選殖出可產(chǎn)生抗上述抗原(VP28與VP37)的單株抗體的融合瘤細胞。
首先，用pH9.6的包被液0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液0.159％(w/v)碳酸鈉+0.293％(w/v)碳酸氫鈉稀釋經(jīng)純化后的上述抗原蛋白(VP28與VP37)，使?jié)舛冗_到10μg/ml，并于4℃下包被過夜。再以1％胎牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)于37℃下封閉1小時。之后，用洗液(磷酸鹽緩沖溶液，pH7.4)洗滌三次，每次3-5分鐘。從含有融合瘤細胞的孔中吸取100μl上清后，原孔內補加等量RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃下恒溫培養(yǎng)1-2小時。再用洗液洗滌三次，每次3-5分鐘。之后，于每孔中加入預先用抗體稀釋液稀釋好的抗鼠IgG酶標記的次級抗體各100μl，再于37℃下恒溫培養(yǎng)1-2小時。最后，再用洗液洗滌三次后，加入底物溶液鄰苯二胺(OPD)-過氧化氫混合溶液100μl，于室溫下避光30分鐘。待顯色后，于每孔滴加50μl終止液(2M硫酸溶液)，測定OD490值。陽性對照孔為免疫小鼠的血清(100倍稀釋)，陰性對照為骨髓瘤細胞(SP2/0)的血清。
以健康的Balb/c小鼠的腹水制備飼養(yǎng)細胞板。再將陽性孔中的融合瘤細胞稀釋至每100μl中含有一個細胞。然后，將稀釋的融合瘤細胞懸浮液滴入已鋪有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板內，每孔100μl。將培養(yǎng)板置入5％CO2溫箱37℃培養(yǎng)，三天左右換液一次，待細胞生長至8-10天時，檢測抗體，標出陽性孔，對所有的細胞孔換新液。換液2天后，再檢測，對兩次檢測都是陽性的孔再次選殖二次，直到所有的孔都為陽性，最后選擇OD值高、細胞活力好、只有一株細胞的孔，擴大培養(yǎng)。藉此，即可獲得能產(chǎn)生抗上述抗原蛋白(VP28與VP37)的單株抗體的融合瘤細胞株。
實施例二為測試實施例一中通過融合瘤細胞所分泌至培養(yǎng)基中的單株抗體的力價。在此將所收取含抗白斑綜合癥病毒的VP28抗原蛋白的單株抗體(以下簡稱HTWC)的培養(yǎng)液分別以1×10-2、2×10-2、1×10-3、2×10-3與1×10-4的稀釋倍數(shù)以西方墨點法(Western blot)進行檢測，藉以確認所得單株抗體的專一性與力價。
首先，將經(jīng)由SDS-PAGE分析的檢體以半濕式轉置器(The PantherTMSemidry Electroblotter)在120mA、70分鐘的條件下，轉置于尼龍膜(nylon paper)上。轉置后的尼龍膜置于阻隔緩沖液blocking buffer含有5％脫脂奶粉的TBST(20mM Tris-HCl、150mM NaCl，及0.05％Tween-20)中，在室溫下反應1小時。再以25ml的TBST溶液洗5分鐘，然后加入5ml含有初級抗體的阻隔緩沖液，在室溫中進行2小時雜合反應。再以25ml的TBST溶液洗5分鐘，然后加入5ml含有次級抗體的阻隔緩沖液，在室溫中進行1小時雜合反應。然后以25ml的TBST溶液洗10分鐘二次，再以25ml的TBS溶液(不含0.05％Tween-20的TBST)洗5分鐘三次。最后將尼龍膜置于含有0.5％氮藍四唑試劑(Nitro bluetetrazolium，NBT)與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯試劑(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，BCIP)的APB呈色劑(10ml)中，于室溫中進行呈色，待呈色后再以二次水清洗即可。
經(jīng)測試所得的結果顯示HTWC28可以精確且專一地偵測到重組白斑綜合癥病毒的rVP28抗原蛋白與純化白斑綜合癥病毒的VP28抗原蛋白。另外，經(jīng)由序列稀釋試驗，可得知由培養(yǎng)融合瘤細胞所產(chǎn)生的HTWC，其在西方墨點法上的力價可高達1×104以上，并具極高的專一性，結果如圖3所示。
實施例三取蝦體大小2.9±0.3cm，平均重量約0.16克/只的草蝦，每組取15只接受測試。飼養(yǎng)海水鹽度調整至16度(1.6％)。受試草蝦先分置于飼育箱(每組15只)，于2公升海水中飼養(yǎng)至隔夜，以令其適應新置環(huán)境。將已證實有白斑綜合癥病毒感染的病蝦的研磨萃取液、白斑綜合癥病毒單株抗體(HTWC)以及TNE緩沖液分別混合(待測液)以供飼料浸泡，其處理方式如下表所示病蝦萃取液 單株抗體TNE緩沖液第一組125μl 125μl第二組125μl 12μl第三組125μl 125μl接著，將混合均勻的待測液靜置于室溫(約23-25℃)下作用1小時。反應后的待測液分別加入0.1克飼料，混勻后于室溫下靜置1小時，令其吸附待測液。
受試草蝦在進行喂食試驗前先將飼養(yǎng)海水水量調整至500ml，并進行饑餓12小時。饑餓處理后隨即加入浸泡后的飼料喂食。喂食隔夜后補海水至2公升，進行一般性飼養(yǎng)。兩天后再進行相同處理一次。第一次喂食后即每天記錄存活蝦只數(shù)并進行統(tǒng)計。
經(jīng)測試21天后所得結果如圖4所示。由圖中所得結果可得知，于實驗第5天后，喂食浸泡病蝦萃液飼料的實驗組開始持續(xù)死亡，直至第18天后，其存活率剩33％。而喂食抗體與病蝦萃液加抗體的實驗組，其存活率雖略有下降，但仍維持在高達93％與80％以上。實驗結果顯示，有添加白斑綜合癥病毒單株抗體，可以多增加蝦子47-60％的存活率。
實施例四測試方式同實施例三，只是喂食的次數(shù)由實施例三的兩次改為連續(xù)喂食，即每次均喂食浸泡待測液后的飼料。第一次喂食后即每天記錄存活蝦只數(shù)并進行統(tǒng)計。
受試蝦體依生長期之不同分三組分別進行試驗。第一組草蝦的蝦體大小3.92±0.28cm，平均體重0.45克/只；第二組草蝦的蝦體大小3.32±0.32cm，平均體重0.25克/只；第三組草蝦的蝦體大小2.48±0.29cm，平均體重0.15克/只，測試方法采用連續(xù)喂食已浸泡待測液的飼料的試驗方式。第一次喂食后即每天記錄存活蝦只數(shù)并進行統(tǒng)計。
經(jīng)測試21天后所得的結果如圖5、圖6及圖7所示。由于受試蝦體依生長期不同而分成三組進行試驗，為敘述方便以下簡稱第一受試組為大蝦組(蝦體大小3.92±0.28cm，平均重量0.45克/只)參見圖5，第二受試組為中蝦組(蝦體大小3.32±0.32cm，平均重量0.25克/只)參見圖6，第三受試組為小蝦組(蝦體大小2.48±0.29cm，平均重量0.15克/只)參見圖7。由結果得知，大蝦組于實驗第16天后，喂食浸泡病蝦萃液飼料的實驗組才開始有顯著的死亡，直至21日，其存活率僅剩6.7％。而喂食抗體與病蝦萃液加抗體的實驗組，于實驗第18天后，其存活率也開始下降，但最終仍然分別有60％與73.3％之存活率。實驗結果顯示，有添加抗體較沒添加抗體的存活率高出約53％-66％。
中蝦組于實驗第14天，喂食浸泡病蝦萃液飼料的實驗組開始大量死亡，直至實驗第19天，其存活率已降至0％。而喂食病蝦萃液加抗體的實驗組，雖然于實驗第18天后其存活率也持續(xù)下降，但止于60％。喂食抗體的對照組最終仍然維持在90％以上。實驗結果顯示，有添加抗體較沒添加抗體的存活率高出約60％-90％。
小蝦組的實驗結果與喂食兩次的實驗相似。于實驗第4天后，喂食浸泡病蝦萃液飼料的實驗組就開始持續(xù)死亡，直至第21天，其存活率降至20％。而喂食抗體與病蝦萃液加抗體的實驗組，其存活率均維持在80％以上。實驗結果顯示，有添加抗體則較沒添加抗體的存活率高出約60％左右。
由上述喂食試驗所得結果可以發(fā)現(xiàn)，無論試驗方法如何，喂食病蝦萃液飼料的實驗組都會持續(xù)且大量地死亡，而使存活率最后都降至30％以下，但是若有加入根據(jù)本發(fā)明所指出的單株抗體，則蝦子存活率相對均可增加47％-60％左右。
由上述活體試驗中均可以證實，根據(jù)本發(fā)明所研發(fā)的單株抗體能夠成功地結合病毒，并且抑制病毒持續(xù)擴散感染蝦體，相對地提高蝦群存活率達約47％以上。
實施例五為測試HTWC治療已感染病毒的蝦子的效果，在此選用蝦體大小2.16±0.28cm，平均重量0.14g/只的蝦子進行測試。每組蝦子數(shù)目為11只，分別以2公升的養(yǎng)殖用水進行養(yǎng)殖。
進行測試時，各組均喂食預先浸泡病蝦萃取液的飼料一天，早晚各一次。飼料浸泡條件為每次食量0.1g飼料加入250μl病蝦萃液，置于室溫中浸泡1小時。隔天為處理感染測試的第一天，將病蝦分成四組，分別于第一天、第三天、第五天與第七天喂食預先浸泡100倍力價的HTWC飼料兩次，浸泡條件為每次食量0.1g的飼料加入250μl待試的HTWC，置于室溫中浸泡1小時。除測試當天外，均喂食不經(jīng)處理的一般飼料。試驗期為21天，每天觀察并記錄受試蝦子的存活率。
實驗所得結果如圖8所示，不喂食HTWC浸泡飼料的對照組在試驗第五天開始持續(xù)死亡，直至21天時其存活率降至18.2％；感染第七天后才開始追加喂食HTWC浸泡飼料的實驗組，其存活率與對照組相似，最后同為降至18.2％。而分別于感染第三天與第五天后才開始追加喂食HTWC浸泡飼料的實驗組，其21天最終存活率則均維持在54.5％，雖然如此，第三天喂食試驗的死亡速率仍較第五天喂食試驗者為緩慢。感染第一天后即開始追加喂食含HTWC飼料的實驗組，于第十二天其存活率為90.9％，并且在實驗21天后其存活率仍高達72.7％。本實驗結果顯示，于感染第一天后，喂食含有HTWC飼料的蝦群，可相對地提高存活率達54.5％，并且在喂食病毒之后的第三與第七天喂食相同處理的飼料，仍可以提高36.3％的存活率，此實驗結果表示HTWC擁有良好的病毒感染處理效果。而且HTWC在處理病毒感染上有其時效性，進行處理的時間愈早其所獲得的效果愈好，也就是蝦群的存活率越高。
雖然，本發(fā)明已通過參考前述較佳實施例而揭露，熟悉本發(fā)明技術領域者可輕易的據(jù)此做些許的改變或修飾，但此將不脫離本發(fā)明申請專利范圍所界定的范疇。
序列表<110>漢德生物科技股份有限公司<120>用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物及其施用方法<150>US 60/514,036<151>2003-10-24<160>4<210>1<211>615<212>DNA<213>白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus)<400>1atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt 60gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac 120acagacaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt 180ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc 240aagatccgca atggaaagtc tgatgcacag atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc 300actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga 360acattcaagg tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg 420ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc 480gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca 540attgcagcta ccgccggtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc 600actgagaccg agtaa 615<210>2<211>204<212>PRT<213>白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus)<400>2Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile1 5 10 15Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr20 25 30Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn Met35 40 45Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr50 55 60Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile65 70 75 80Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala85 90 95Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val100 105 110Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr115 120 125Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn130 135 140Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro145 150 155 160Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr165 170 175Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met180 185 190Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu195 200
<210>3<211>990<212>DNA<213>傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal hematopoietic necrosis virus)<400>3ATGTGCGCCG ATTCAACAAG AGCAAGCCCA AGGAAAAGAT CCAGGAGGGA TGCACATAAT 60GAAGACGAAG AACACGCCGA AGGATCAAGT GGACCAGACC CACACAGATG TCTACAATTC 120AATACTGGAG ACTCAATACA TATTACTTTC CAAACAAGAA GATACTTCGA ATTCGACGCT 180GCCAATGATG GAAACTTCGA CGGAAAAAAT TTATACTGCC TCcCACTACA TTGGATGAAC 240TTATATCTCT ATGGTCTAAA GAGCAGCGAC AGTTCAGCAA CAGAAACACA ACGATATAAG 300ATGGTAAAAT CAATGATGAA GACCTACGGA TGGAAAGTAC ATAAAGCAGG CGTAGTGATG 360CACTCGATGG TACCCCTTAT GAAAGACTTA AAAGTATCAG GAGGCACATC ATTTGAGACT 420CTCACATTTA CAGACACCCC ATATTTAGAA ATATTTAAGG ATACTACTGG ACTACATAAT 480CAACTATCAA CTAAGGAAGC CGACGTAACA TTGGCAAAAT GGATACAAAA TCCCCAACTT 540GTGACCGTAC AATCAACAGC AGCAAACTAT GAAGACCCAA TCCAACAATT TGGATTCATG 600GAACAAATGC GAACCGGTGA CAGAAAAGCC TATACAATCC ATGGTGACAC TAGAAATTGG 660TATGGCGGAG AAATACCAAC AACCGGACCC ACCTTCATCC CAAAATGGGG TGGTCAATTA 720AAATGGGACA AACCATCCCT TGGAAACCTA GTCTACCCAG CAGACCACCA TACAAACGAC 780TGGCAACAGA TCTTCATGAG AATGTCACCA ATCAAAGGAC CAAATGGAGA CGAACTTAAA 840CTTGGCTGCA GAGTACAAGC CGACTTCTTC CTACACCTAG AAGTACGACT CCCACCACAA 900GGATGTGTCG CAAGTTTGGG GATGTTACAA TATCTTCACG CACCATGTAC TGGACAACTT 960AACAAATGTT ATATTATGCA TACTAACTAA 990<210>4<211>329<212>PRT<213>傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal hematopoietic necrosis virus)<400>4Met Cys Ala Asp Ser Thr Arg Ala Ser Pro Arg Lys Arg Ser Arg Arg1 5 10 15Asp Ala His Asn Glu Asp Glu Glu His Ala Glu Gly Ser Ser Gly Pro20 25 30Asp Pro His Arg Cys Leu Gln Phe Asn Thr Gly Asp Ser Ile His Ile35 40 45Thr Phe Gln Thr Arg Arg Tyr Phe Glu Phe Asp Ala Ala Asn Asp Gly50 55 60Asn Phe Asp Gly Lys Asn Leu Tyr Cys Leu Pro Leu His Trp Met Asn65 70 75 80Leu Tyr Leu Tyr Gly Leu Lys Ser Ser Asp Ser Ser Ala Thr Glu Thr85 90 95Gln Arg Tyr Lys Met Val Lys Ser Met Met Lys Thr Tyr Gly Trp Lys100 105 110Val His Lys Ala Gly Val Val Met His Ser Met Val Pro Leu Met Lys115 120 125Asp Leu Lys Val Ser Gly Gly Thr Ser Phe Glu Thr Leu Thr Phe Thr130 135 140Asp Thr Pro Tyr Leu Glu Ile Phe Lys Asp Thr Thr Gly Leu His Asn145 150 155 160Gln Leu Ser Thr Lys Glu Ala Asp Val Thr Leu Ala Lys Trp Ile Gln165 170 175Asn Pro Gln Leu Val Thr Val Gln Ser Thr Ala Ala Asn Tyr Glu Asp180 185 190Pro Ile Gln Gln Phe Gly Phe Met Glu Gln Met Arg Thr Gly Asp Arg195 200 205Lys Ala Tyr Thr Ile His Gly Asp Thr Arg Asn Trp Tyr Gly Gly Glu
210 215220Ile Pro Thr Thr Gly Pro Thr Phe Ile Pro Lys Trp Gly Gly Gln Leu225 230 235 240Lys Trp Asp Lys Pro Ser Leu Gly Asn Leu Val Tyr Pro Ala Asp His245 250 255His Thr Asn Asp Trp Gln Gln Ile Phe Met Arg Met Ser Pro Ile Lys260 265 270Gly Pro Asn Gly Asp Glu Leu Lys Leu Gly Cys Arg Val Gln Ala Asp275 280 285Phe Phe Leu His Leu Glu Val Arg Leu Pro Pro Gln Gly Cys Val Ala290 295 300Ser Leu Gly Met Leu Gln Tyr Leu His Ala Pro Cys Thr Gly Gln Leu305 310 315 320Asn Lys Cys Tyr Ile Met His Thr Asn32權利要求
1.一種用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其包含至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體，該單株抗體由下列步驟所制得(1)取得能用以辨識該病毒的基因的核苷酸序列，該核苷酸序列能表達出該病毒的特異性抗原蛋白；(2)通過該核苷酸序列所表達的該特異性抗原蛋白或包含該特異性抗原蛋白的病毒顆粒制備融合瘤細胞；(3)篩選出能分泌出該單株抗體的融合瘤細胞，該單株抗體可專一性辨識該病毒并可與其反應；以及(4)通過該融合瘤細胞產(chǎn)生該單株抗體。
2.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該甲殼類動物為蝦或蟹。
3.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該病毒選自傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死性桿狀病毒、草蝦桿狀病毒、肝胰腺類微小病毒、腸呼吸道病毒、桃拉病毒、黃頭病毒，及白斑綜合癥病毒所組成的族群。
4.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該病毒為傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
5.如權利要求4所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該核苷酸序列用以表達VP37抗原蛋白，并具有如SEQ ID NO3所示的序列。
6.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該病毒為白斑綜合癥病毒。
7.如權利要求6所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該核苷酸序列用以表達VP28抗原蛋白，并具有如SEQ ID NO1所示的序列。
8.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中步驟(2)中制備融合瘤細胞時是使用骨髓瘤細胞(SP2/0)進行細胞融合。
9.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中步驟(3)是以ELISA法進行篩選的。
10.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中步驟(4)是通過生物反應器大量繁殖該融合瘤細胞以產(chǎn)生該單株抗體。
11.如權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中步驟(4)是通過將該融合瘤細胞注入哺乳動物腹部誘發(fā)生成腫瘤后，再自該哺乳動物的腹水中收集該單株抗體。
12.如權利要求11所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，其中該哺乳動物為老鼠。
13.一種用以降低蝦子病毒感染率的方法，其為將權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物，在該蝦子的特定生長時期，與一介質混合后施用于該蝦子。
14.如權利要求13所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該特定生長時期選自種母蝦期、受精卵期及無節(jié)幼蟲期所組成的族群。
15.如權利要求14所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該介質為養(yǎng)殖用水。
16.如權利要求13所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該特定生長時期選自水蚤狀幼蟲期、糠蝦期幼蟲期及后期幼蟲期所組成的族群。
17.如權利要求16所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該介質為養(yǎng)殖用水及飼料。
18.如權利要求13所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該特定生長時期選自幼蝦期及成蝦期所組成的族群。
19.如權利要求18所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該介質為飼料。
20.如權利要求13所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該病毒選自傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死性桿狀病毒、草蝦桿狀病毒、肝胰腺類微小病毒、腸呼吸道病毒、桃拉病毒、黃頭病毒，及白斑綜合癥病毒所組成的族群。
21.如權利要求13所述的用以降低蝦子病毒感染率的方法，其中該病毒為白斑綜合癥病毒。
22.一種用以降低甲殼類動物病毒感染率的醫(yī)藥組合物，其包含一有效劑量的權利要求1所述的用以降低該甲殼類動物病毒感染率的組合物，以及一藥學上可接受的載體。
23.一種用以降低甲殼類動物病毒感染率的飼料組合物，其包含權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物。
24.一種用以降低甲殼類動物病毒感染率的營養(yǎng)添加劑，其包含權利要求1所述的用以降低甲殼類動物病毒感染率的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用以降低甲殼類動物病毒感染的組合物，以有效預防及/或治療甲殼類動物的感染病癥，進而提高其存活率。該組合物包含至少一種可與病毒專一性相結合的單株抗體，該單株抗體可通過融合瘤細胞株以生物反應器或是注入老鼠腹部的方式來大量生產(chǎn)。該組合物可以治療藥劑、營養(yǎng)劑或飼料添加劑形式與飼料混合喂食，或是采用浸泡方式施用于甲殼類動物，以達到治療及/或預防甲殼類動物病毒感染的目的。
文檔編號A61P31/00GK1636596SQ20041008618
公開日2005年7月13日 申請日期2004年10月22日 優(yōu)先權日2003年10月24日
發(fā)明者陳智育, 隋婉君, 蔡昌晏, 楊泰鑫, 張銘傳 申請人:漢德生物科技股份有限公司