專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改善的免疫調(diào)節(jié)功能的經(jīng)修飾的CpG寡聚脫氧核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有改善的免疫調(diào)節(jié)功能的經(jīng)修飾的CpG寡聚脫氧核苷酸(ODN)。特別地，本發(fā)明涉及修飾的CpG ODN，它是由連續(xù)的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷(dT)序列偶聯(lián)到具有免疫調(diào)節(jié)功能的CpG ODN的3′-末端而制備出來(lái)的，它能導(dǎo)致脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和外周單核細(xì)胞改善的免疫活性，因此，能被有效地用作預(yù)防和治療乙型肝炎疫苗的佐劑，或用作抗癌劑。
背景技術(shù)：
脊椎動(dòng)物能夠抑制其基因組DNA序列中CpG二核苷酸的表達(dá)，或使表達(dá)的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化(Krieg，Ann.Rev.Immunol.，2002，20，709；McClelland&Ivarie，Nucleic Acids Res.1982，23，78)。與此同時(shí)，微生物的CpG二核苷酸能以正常的速率被表達(dá)并且不被甲基化，因此利用脊椎動(dòng)物和微生物之間表達(dá)CpG二核苷酸水平的差異就能檢測(cè)脊椎動(dòng)物中的微生物感染。
通過(guò)Toll樣受體9(TLR9)，一種模式識(shí)別受體，微生物基因組DNA可以被樹(shù)突細(xì)胞或表達(dá)TLR9的B細(xì)胞所識(shí)別，并且最終激活宿主細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng)。先天免疫系統(tǒng)被賦予了去除癌細(xì)胞的機(jī)制，以及抗微生物或寄生蟲(chóng)感染的自我防御機(jī)制，因此通過(guò)適當(dāng)修飾CpG ODN，有望開(kāi)發(fā)出能誘免疫系統(tǒng)抗癌活性的抑癌免疫佐劑。
利用CpG ODN活化免疫系統(tǒng)的研究在過(guò)去幾十年中已經(jīng)取得了積極的進(jìn)展。參照CpG二核苷酸為中心，CpG ODN在5′和3′末端都含有至少四個(gè)堿基，CpG ODN的免疫活性由其堿基序列表征。CpG ODN可被劃分為2個(gè)組，K型和D型。K型CpG ODN刺激脊髓系細(xì)胞和B細(xì)胞從而導(dǎo)致它們?cè)鲋郴蚍置诿庖咔虻鞍譓或IL-6(Klinman等，Microbes Infect.，2002，897-901)。另一方面，D型CpG ODN活化單核細(xì)胞使之分化成樹(shù)突細(xì)胞或者刺激天然殺傷細(xì)胞分泌IL-6(Klinman等，Eur.J.Immunol.，2002，32，2617-22；Gursel等，J.Leukoc.Biol.，71，813-20，2002)。另外，D型CpG ODN活化B220+樹(shù)突細(xì)胞以產(chǎn)生IFN-α，而TLR9+B220+樹(shù)突細(xì)胞釋放IL-12以應(yīng)答D型CpG ODN。這些結(jié)果表明有幾個(gè)途徑可以通過(guò)刺激特定免疫細(xì)胞增強(qiáng)CpG ODN的免疫活性(Hemmi等，J Immunol.，2003，170，3059-3064；Kerkman等，J.Immunol.，2003，170，4465-4474)。
已經(jīng)有各種類(lèi)型的CpG ODN被設(shè)計(jì)出來(lái)以改變病理狀態(tài)，如感染，自身免疫疾病和癌癥。其中，開(kāi)發(fā)抗癌免疫治療性CpG ODN的策略可以依賴于主要由CpGODN刺激的效應(yīng)細(xì)胞。為了利用CpG ODN增加細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，以下兩個(gè)方法被普遍使用。
第一個(gè)方法是通過(guò)活化天然或?qū)ｉT(mén)的樹(shù)突細(xì)胞從而增加局部或系統(tǒng)免疫性。癌細(xì)胞下調(diào)其抗原遞呈能力以逃避宿主細(xì)胞的免疫監(jiān)視系統(tǒng)，而使宿主的細(xì)胞毒性T細(xì)胞不能識(shí)別它們從而能夠在宿主細(xì)胞中存活下來(lái)。為解決該問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一種方法，即用癌抗原中的強(qiáng)免疫原性肽和CpG ODN免疫佐劑一起免疫宿主。通過(guò)該方法，有著高抗原遞呈活性的樹(shù)突細(xì)胞能夠吸收癌抗原肽，并且在被CpG ODN活化時(shí)導(dǎo)致活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞。然后活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠有效地消滅癌細(xì)胞。有報(bào)道說(shuō)，該方法能夠殺死來(lái)自小鼠的RMA(Stern等，J.Immunol.，2002，168，6099-6105)。IFN-γ在這些免疫應(yīng)答中起著重要的作用。盡管這不是通過(guò)樹(shù)突細(xì)胞活化實(shí)現(xiàn)的，但其仍能夠以與樹(shù)突細(xì)胞通過(guò)呈遞CpGODN 2006直接作用于B細(xì)胞同樣的機(jī)理，激活抗癌免疫性并且增加能誘導(dǎo)B和T細(xì)胞相互作用的共刺激因子的表達(dá)(Jahrsdorfer等，J.Leukoc.Biol.，2001，69，81-88)。
另一個(gè)方法是通過(guò)活化天然殺傷細(xì)胞來(lái)增加先天免疫性。通過(guò)從外界引入癌抗原活化樹(shù)突細(xì)胞可能會(huì)激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，但必須是在MHC I類(lèi)分子表面存在癌抗原，從而在細(xì)胞毒性T細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性?？墒?，在許多情況下，在癌細(xì)胞表面存在的癌抗原太少以至于不能從細(xì)胞毒性T細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性，因此通過(guò)活化樹(shù)突細(xì)胞來(lái)消除癌細(xì)胞的方法經(jīng)常無(wú)效。為了克服這種局限，有人建議激活無(wú)論在癌細(xì)胞表面是否有癌抗原都能表現(xiàn)細(xì)胞毒性的天然殺傷細(xì)胞。另外，活化的天然殺傷細(xì)胞激活單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致不依賴抗原的抗癌免疫系統(tǒng)的活化。據(jù)報(bào)道，在使用以上方法的小鼠腫瘤模型中，CpG ODN 1584給藥可體內(nèi)阻止NK敏感性B16.F1黑素瘤的轉(zhuǎn)移，而注射CpG ODN 1826可在體內(nèi)有效防止NK抗性的EL4淋巴瘤(Ballas等，J.Immunol.，2001，167，4878-4886)。另外，誘導(dǎo)出BALB/C小鼠中的C26結(jié)腸癌腫塊后，直接把ODN 1826注射進(jìn)發(fā)生腫瘤的損傷處，可顯著縮減腫瘤的大小。該數(shù)據(jù)顯示近腫瘤的CpG ODN單獨(dú)治療可產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答和先天效應(yīng)機(jī)制，似乎共同作用可以克服免疫系統(tǒng)對(duì)生長(zhǎng)中的腫瘤的非應(yīng)答性。(Heckelsmiller等，J.Immunol.，2002，169，3892-3899)。相反的，用CpG ODN單獨(dú)治療的方法難以在體內(nèi)消除鼠38C13 B細(xì)胞淋巴瘤?？墒?，假如用CpG ODN處理38C13淋巴瘤抗原特異性單克隆抗體，活化的天然殺傷細(xì)胞能夠通過(guò)運(yùn)用抗體依賴的細(xì)胞毒性來(lái)高效地清除38C13淋巴瘤(Woodridge等，Blood，1997，89，2994-2998)。
與此同時(shí)，抗原或其等價(jià)物和CpG ODN作為免疫刺激劑一起使用能夠誘導(dǎo)出抗癌的體液免疫。Tras tuzumab和rituximab是已知商品化的對(duì)HER-2蛋白特異性的單克隆抗體，HER-2蛋白分別過(guò)量表達(dá)于癌細(xì)胞和非Hodgkins B細(xì)胞淋巴瘤。最近，用CpG ODN加腫瘤抗原特異性抗體的聯(lián)合治療在臨床前期證實(shí)了有效的腫瘤抗性，而且現(xiàn)在正進(jìn)入臨床試驗(yàn)期。(Jahrsdorfer等，Sem.Oncol.，2003，30.476-482)。
由于核苷酸序列在5’和3’末端處含CpG二核苷酸，CpG ODN具有強(qiáng)先天免疫活性。但由于CpG ODN本身是野生型的結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)DNA分子的結(jié)構(gòu)沒(méi)有區(qū)別，它并不顯示出任何細(xì)胞毒性。然而，CpG ODN中有一個(gè)缺陷，即由于其野生型結(jié)構(gòu)，它在體內(nèi)易于降解，從而導(dǎo)致免疫活性的半衰期降低。盡管增加每天CpGODN的劑量有可能克服這一缺陷，但是并不經(jīng)濟(jì)。據(jù)報(bào)道，在合成CpG ODN時(shí)，將作為DNA分子骨架的磷酸二酯鍵改變?yōu)榱虼姿狨ユI，CpG ODN的免疫活性增大10至100倍(Sester等，J.Immnol.，2000，165，4165-4173)。可是，該方法帶來(lái)的問(wèn)題是由于骨架的改變導(dǎo)致對(duì)免疫細(xì)胞細(xì)胞毒性效果的改變以及CpG免疫活性的改變。因此，對(duì)于CpG ODN結(jié)構(gòu)修飾來(lái)說(shuō)，還不清楚該方法是否是最優(yōu)化的。
CpG ODN顯示出物種特異性，且相比于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，還沒(méi)有報(bào)道CpG ODN在人類(lèi)中顯示出更高的免疫活性。另外，由于CpG ODN的作用機(jī)制仍未知，因此很難針對(duì)人免疫細(xì)胞開(kāi)發(fā)出有效的免疫治療性CpG ODN。結(jié)果，罕有CpG ODN用于臨床試驗(yàn)。這些局限使相對(duì)于現(xiàn)有CpG ODN有更高免疫刺激活性或更低副作用的CpGODN的開(kāi)發(fā)成為必需。
本發(fā)明人設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單的方法來(lái)解決上述問(wèn)題。即，通過(guò)將連續(xù)的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷(dT)序列偶聯(lián)到CpG ODN的3′-末端來(lái)制備修飾的CpG ODN，從而改善脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和外周單核細(xì)胞的免疫活性，因此，它能有效地用作預(yù)防和治療乙型肝炎的疫苗佐劑，或用作抗癌劑。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有改善的免疫調(diào)節(jié)功能的經(jīng)修飾的CpG ODN。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含經(jīng)修飾的CpG ODN作為有效成分的疫苗佐劑或抗癌劑。
附圖簡(jiǎn)述從本發(fā)明的以下說(shuō)明并結(jié)合附圖將使本發(fā)明的上述和其他目的及特征變得清楚，其中

圖1顯示本發(fā)明的CpG ODN在體外是否誘導(dǎo)BALB/C小鼠巨噬細(xì)胞(A)和脾細(xì)胞(B)增殖的檢測(cè)結(jié)果；圖2a顯示本發(fā)明的CpG ODN在體外是否誘導(dǎo)Balb/c小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖2b顯示本發(fā)明的CpG ODN在體內(nèi)是否誘導(dǎo)BALB/C腹膜巨噬細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；M標(biāo)記物； 1未處理；20.6μg/ml KSK-1；30.6μg/ml KSK-2；40.6μg/ml KSK-7；50.6μg/ml KSK-12；60.6μg/ml KSK-13； 70.1μg/ml LPS圖3a顯示本發(fā)明的CpG ODN在體外是否誘導(dǎo)BALB/C小鼠脾細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖3b顯示本發(fā)明的CpG ODN在體內(nèi)是否誘導(dǎo)BALB/C小鼠脾細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；M標(biāo)記物； 10.6μg/ml CpG ODN；20.6μg/ml KSK-1；30.6μg/ml KSK-2；40.6μg/ml KSK-7；50.6μg/ml KSK-12；60.6μg/ml KSK-13； 70.1μg/ml LPS圖4a顯示本發(fā)明的CpG ODN是否誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的B7.2共刺激分子表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖4b顯示本發(fā)明的CpG ODN是否誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中的MHC I類(lèi)分子表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖5a顯示本發(fā)明的CpG ODN是否誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞中的B7.2共刺激分子表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖5b顯示本發(fā)明的CpG ODN是否誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞中的MHC I類(lèi)分子表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖6a顯示當(dāng)用本發(fā)明的CpG ODN處理脾細(xì)胞而增加脾細(xì)胞中所含的天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性時(shí)，易感于天然殺傷細(xì)胞的YAC-1細(xì)胞的溶胞水平；圖6b顯示當(dāng)用本發(fā)明的CpG ODN處理人外周血單核細(xì)胞而增加人外周血單核細(xì)胞中所含的天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性時(shí)，易感于天然殺傷細(xì)胞的K562細(xì)胞的溶胞水平；圖7顯示本發(fā)明的CpG ODN對(duì)長(zhǎng)有B16黑素瘤的小鼠的肺轉(zhuǎn)移抑制效果；圖8顯示各種CpG ODN在EL4轉(zhuǎn)移化-C57BL/6小鼠上的相對(duì)存活延長(zhǎng)效果的結(jié)果；以及圖9顯示由本發(fā)明的CpG ODN活化的天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性的結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種顯示免疫活性并含有CpG基序的修飾的CpG ODN，其中連續(xù)的dT序列偶聯(lián)到ODN的3′-末端。
另外，本發(fā)明提供經(jīng)修飾的CpG ODN作為免疫佐劑或抗癌劑的應(yīng)用。
在下文中將詳述本發(fā)明。
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的CpG ODN，它由將連續(xù)的dT序列偶聯(lián)到具有免疫調(diào)節(jié)功能的CpG ODN的3′一末端制備出來(lái)，其導(dǎo)致增強(qiáng)脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和外周單核細(xì)胞的免疫活性，因此，它能有效地用作預(yù)防和治療乙型肝炎的疫苗佐劑，或用作抗癌劑。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“ODN”是指具有11至26個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的、能夠激活免疫應(yīng)答的寡聚脫氧核苷酸。特別的，術(shù)語(yǔ)“CpG ODN”是指具有CpG基序(5’-嘌呤嘌呤CpG嘧啶嘧啶-3’)的、顯示出免疫調(diào)節(jié)功能的寡聚脫氧核苷酸。術(shù)語(yǔ)“連續(xù)的dT序列”是指通過(guò)磷酸二酯鍵連續(xù)偶聯(lián)至少4個(gè)胸腺嘧啶脫氧核糖核酸到CpG ODN上的形式。
本發(fā)明中使用的CpG ODN是由MetaBion(德國(guó))人工合成的，其中所有的磷酸二酯鍵由硫代磷酸酯鍵代替。合成的CpG ODN經(jīng)過(guò)HPLC(高壓液相層析)和NAP純化過(guò)程以保持高純度，然后以冷凍干燥狀態(tài)供給。本發(fā)明中使用的CpG ODN核苷酸序列如表1所示。
表1
當(dāng)由天然磷酸二酯鍵形成ODN骨架時(shí)，其在體內(nèi)核酸酶的攻擊下易于降解。為了使有抗癌免疫活性的CpG ODN能展現(xiàn)適當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?，必須是增加其劑量或改變其結(jié)構(gòu)以避免被上述核酸酶攻擊。本發(fā)明的CpG ODN具有由硫代磷酸酯鍵形成的骨架結(jié)構(gòu)，因此能避免核酸酶的攻擊，而延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期?？墒?，當(dāng)進(jìn)行CpG ODN體內(nèi)給藥時(shí)，可能在由硫代磷酸酯鍵本身造成的非特異免疫應(yīng)答中產(chǎn)生安全性問(wèn)題。因此本發(fā)明檢驗(yàn)了硫代磷酸酯鍵的安全性，通過(guò)用氫氧化鋁及其他諸如衍生于小鼠CHO細(xì)胞的gDE2t等抗原一起預(yù)處理，然后施用50μg具有硫代磷酸酯鍵的CpG ODN。結(jié)果顯示在小鼠注射位置沒(méi)有發(fā)現(xiàn)諸如肉芽腫和壞死等的異常，因此證明了具有硫代磷酸酯鍵的CpG ODN的安全性。
本發(fā)明的CpG ODN使骨髓系細(xì)胞活化而分泌炎癥前的和Th1型的細(xì)胞因子，并且最終增加抗癌免疫性。通過(guò)使用諸如U-937，RAW264.7和THP-1等骨髓細(xì)胞系初步篩選出CpG ODN候選物。由于上述細(xì)胞系可以由本發(fā)明的CpG ODN靶向的原始細(xì)胞系產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答，本發(fā)明的發(fā)明人檢測(cè)了本發(fā)明的CpG ODN對(duì)新鮮鼠脾細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示CpG ODN顯著增加了TNF-α，IL-6，IL-12和IFN-γmRNA的表達(dá)水平并且上調(diào)了巨噬細(xì)胞表面的MHC II類(lèi)和B7.2蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果顯示，與在小鼠脾細(xì)胞和人外周血單核細(xì)胞中的天然殺傷細(xì)胞的對(duì)照活性相比，本發(fā)明的CpG ODN有更好的抗癌免疫活性。
因此，本發(fā)明的CpG ODN能被有效地用作疫苗佐劑，特別用于預(yù)防和治療乙型肝炎。在此，優(yōu)選分別以50至5000μg/kg體重范圍內(nèi)的劑量，以2至4周的間隔，用誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原和CpG ODN給藥兩次或三次。另外，CpG ODN與抗原的比例優(yōu)選在5∶1至4∶1的范圍內(nèi)?？乖梢詥为?dú)免疫或者與作為藥學(xué)可接受疫苗佐劑的氫氧化鋁一起免疫，并且可以通過(guò)肌內(nèi)注射或皮下注射給藥。
以下實(shí)施例的給出僅為示例的目的，它們不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的范圍實(shí)施例實(shí)施例1制備3′-末端具有連續(xù)dT序列的CpG ODN本發(fā)明所用的CpG ODN是由MetaBion(德國(guó))人工合成的，其中所有磷酸二酯鍵都由硫代磷酸酯鍵代替。供給我們的合成的CpG ODN處于冷凍干燥狀態(tài)，它們經(jīng)過(guò)HPLC(高壓液相層析)和NAP純化過(guò)程以保持高純度。本發(fā)明中使用的CpG ODN核苷酸序列如表1所示。
實(shí)施例2CpG ODN對(duì)于小鼠脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖的作用研究實(shí)施例1中合成的預(yù)計(jì)具有抗癌免疫活性的CpG ODN，和已經(jīng)確認(rèn)具有抗癌免疫活性的CpG ODN，按照如下實(shí)驗(yàn)，研究當(dāng)它們分別應(yīng)用于小鼠脾細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞時(shí)是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。
把1.5ml的3％巰基乙酸鹽注射進(jìn)BALB/C小鼠的腹腔中。注射3天后，用添加了2％胎牛血清的磷酸緩沖液沖洗小鼠的腹腔，然后收集。進(jìn)一步用Hanks氏緩沖鹽溶液(HBSS)緩沖液沖洗兩次后，在添加了10％胎牛血清的Dulbecco氏改進(jìn)型Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
從BALB/C小鼠中分離脾臟，勻漿化成單細(xì)胞的個(gè)體，以2000rpm離心5分鐘，棄上清液。細(xì)胞沉淀與0.84％氯化銨混合從而使紅細(xì)胞溶胞，并用RPMI 1640洗滌兩次以獲得小鼠脾細(xì)胞。
如上制備的5×104個(gè)脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分別用0.6μg/ml的KSK-1，KSK-2，KSK-7，KSK-12和KSK-13中的一種，和0.1μg/ml LPS處理24，48和72小時(shí)，用添加了[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷的RPMI 1640培養(yǎng)6小時(shí)。在其增殖期間，活化的脾細(xì)胞可以從培養(yǎng)基中吸收[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷。清除培養(yǎng)基后，用不含[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷的相同的培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞，利用放射性探測(cè)器測(cè)量被脾細(xì)胞吸收的[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷的量。
圖1的(A)中，為了誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖而處理CpG ODN 72小時(shí)。其中KSK-13顯示出較其他CpG ODN，包括已知能誘導(dǎo)最高免疫活性的KSK-2更高的增殖力，并且與對(duì)照(未處理)或KSK-1、非CpG ODN相比較，KSK-13還顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的誘導(dǎo)增殖的效果。
另外，如圖1的(B)所示，本發(fā)明的CpG ODN誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的效果顯著大于其他CpG ODN對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的效果。為了誘導(dǎo)脾細(xì)胞的增殖，用CpG ODN處理脾細(xì)胞48小時(shí)。當(dāng)CpG ODN處理72小時(shí)的時(shí)候，脾細(xì)胞的增殖水平降低。KSK-13誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖的效果顯示為稍稍低于KSK-2誘導(dǎo)的平均值，KSK-13誘導(dǎo)在小鼠中已知是有效的，但是這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。
實(shí)施例3CpG ODN對(duì)于小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的作用基于如實(shí)施例2所示的KSK-13能誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞增殖的情況，本發(fā)明人研究了由KSK-13誘導(dǎo)的炎癥前期或Th1型細(xì)胞因子釋放的mRNA的表達(dá)。這些細(xì)胞因子可以有助于抗癌免疫防御。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法如下。
用實(shí)施例2中相同的方法制備小鼠腹膜巨噬細(xì)胞。用0.6μg/ml CpG ODN處理1×106個(gè)巨噬細(xì)胞12小時(shí)。用TRIzol試劑(生命技術(shù))從處理過(guò)的細(xì)胞中分離總RNA，用吸光度確定其濃度。用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)以1μg總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR以合成cDNA。然后根據(jù)表2的反應(yīng)條件，用合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增TNF-α，IL-6，IL-12和IFN-γ。
在1％瓊脂糖凝膠中分析PCR產(chǎn)物從而在每種反應(yīng)條件下比較每種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。
另外，β-肌動(dòng)蛋白，一種組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)，用作對(duì)照以確認(rèn)在上述PCR反應(yīng)條件中是否獲得恒定水平的PCR產(chǎn)物，且結(jié)果顯示在每種反應(yīng)條件中獲得了相同水平的PCR產(chǎn)物，因此顯示凝膠上所見(jiàn)的PCR產(chǎn)物的濃度差異不是由于cDNA制備中的流程錯(cuò)誤所造成的。
如圖2a所示，與高度活化小鼠免疫細(xì)胞的KSK-2相似，KSK-13增加了TNF-α，IL-6和IL-12的mRNA體外表達(dá)水平。體內(nèi)差異更大，因此暗示KSK-13在體內(nèi)條件中發(fā)揮了抗癌免疫活性(圖2b)。
實(shí)施例4CpG ODN對(duì)于小鼠脾細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的作用實(shí)施例2中發(fā)現(xiàn)KSK-13能夠誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖。因此，本發(fā)明人研究了KSK-13誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌的量，如下所示KSK-13在這些細(xì)胞中涉及抗癌免疫用實(shí)施例2中相同的方法制備小鼠脾細(xì)胞。用0.6μg/ml CpG ODN處理1×106個(gè)脾細(xì)胞12小時(shí)。用TRIzol試劑(生命技術(shù))從處理過(guò)的細(xì)胞中分離總RNA，且以測(cè)量其吸光度來(lái)確定其濃度。用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)以1μg總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR以合成cDNA。然后根據(jù)表2的反應(yīng)條件，用合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增TNFα，IL-6，IL-12和IFN-γ。
在1％瓊脂糖凝膠中分析PCR產(chǎn)物從而比較在每種反應(yīng)條件下每種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。
另外，β-肌動(dòng)蛋白，一種組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)，用作對(duì)照以確認(rèn)在上述PCR反應(yīng)條件中是否獲得恒定水平的PCR產(chǎn)物，而結(jié)果顯示在每種反應(yīng)條件中獲得了相同水平的PCR產(chǎn)物，因此顯示凝膠上所見(jiàn)的PCR產(chǎn)物的濃度差異不是由于cDNA制備中的流程錯(cuò)誤所造成的。
如圖3a所示，與高度活化小鼠免疫細(xì)胞的KSK-2相似，KSK-13增加了TNF-α，IL-6和IL-12 mRNA在脾細(xì)胞中的體外表達(dá)水平。體內(nèi)差異更大，因此暗示KSK-13在體內(nèi)條件中發(fā)揮了抗癌免疫活性(圖3b)。
實(shí)施例5CpG ODN對(duì)于小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的信號(hào)傳遞分子表達(dá)的作用為研究能在體外活化小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的KSK-13是否也能在體內(nèi)活化它們，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
將CpG ODN和3％巰基乙酸鹽注射入BALB/C小鼠的腹腔。注射48小時(shí)后，用實(shí)施例2中相同的方法制備小鼠腹膜巨噬細(xì)胞。用FITC綴合的抗B7.2單克隆抗體或抗MHC II類(lèi)單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀分析。圖4中，對(duì)照指的是未經(jīng)處理的組；KSK-1，KSK-2，KSK-7，KSK-12和KSK-13分別以0.6μg/ml的濃度處理；而LPS以0.1μg/ml的濃度處理。
B7.2是輔助刺激分子，在巨噬細(xì)胞活化時(shí)其表達(dá)水平被提高。在非處理組中，腹膜巨噬細(xì)胞中B7.2分子的表達(dá)水平在標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)是2.9％，而本發(fā)明KSK-13的是14.2％。這是一個(gè)與典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，16.3％)或人CpGODN，KSK-12(即，17.3％)的表達(dá)水平相似的活化率，并且與非CpG ODN，KSK-1(即，5.1％)有顯著差異(圖4a)。
MHC II類(lèi)分子在巨噬細(xì)胞抗原遞呈中起著關(guān)鍵的作用，其表達(dá)水平在巨噬細(xì)胞活化時(shí)與B7.2分子一起增加。在非處理組中，腹膜巨噬細(xì)胞的MHC II類(lèi)分子表達(dá)水平在標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)是26.5％，而本發(fā)明KSK-13的是33.7％。這是一個(gè)與典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，35.8％)或人CpG ODN，KSK-12(即，30.2％)的表達(dá)水平相似的活化率，并且與非CpG ODN，KSK-1(即，25.0％)有顯著差異(圖4b)。
根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的KSK-13能夠在體內(nèi)活化小鼠腹膜巨噬細(xì)胞。MHC II類(lèi)和B7.2分子表達(dá)水平的增加顯示腹膜巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力被激活，其證明了KSK-13作為免疫增強(qiáng)劑的作用。
實(shí)施例6CpG ODN對(duì)于小鼠脾細(xì)胞的信號(hào)傳遞分子表達(dá)的作用為研究能在體外活化小鼠脾細(xì)胞的KSK-13是否也能在體內(nèi)活化它們，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
將CpG ODN和3％巰基乙酸鹽注射入BALB/C小鼠的腹腔。注射48小時(shí)后，用實(shí)施例2中相同的方法制備小鼠脾細(xì)胞。用FITC綴合的抗B7.2單克隆抗體或抗MHCII類(lèi)單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀分析。
在非處理組中，脾細(xì)胞中B7.2分子的表達(dá)水平在標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)是2.8％，而本發(fā)明KSK-13的是8.6％。這低于典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，12.13％)的表達(dá)水平，但是高于人CpG ODN，KSK-12(即，6.85％)的表達(dá)水平。另外，它與非CpG ODN，KSK-1(即，3.31％)的表達(dá)水平有顯著差異(圖5a)。
另外在非處理組中，脾細(xì)胞的MHC II類(lèi)分子表達(dá)水平在標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)是15.5％，而本發(fā)明KSK-13的是22.8％。這與典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，23.6％)的表達(dá)水平相似，高于人CpG ODN，KSK-12(即，18.6％)的表達(dá)水平，并且與非CpG ODN，KSK-1(即，17.5％)有顯著差異(圖5b)。
這些結(jié)果暗示，本發(fā)明的KSK-13能夠在體內(nèi)活化小鼠脾細(xì)胞。MHC II類(lèi)和B7.2分子表達(dá)水平的增加顯示脾細(xì)胞中的B細(xì)胞抗原遞呈能力被激活，因而顯示了KSK-13作為有效的免疫刺激劑的作用。
實(shí)施例7CpG ODN對(duì)于帶有乙型肝炎表面抗原的小鼠的免疫的作用為研究小鼠用乙型肝炎表面抗原免疫時(shí)，能活化小鼠脾細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞的KSK-13是否也能用作疫苗佐劑，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
構(gòu)建十三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)組分配7個(gè)BALB/C小鼠。每個(gè)小鼠在腹部皮下注射2.5μg乙型肝炎表面抗原和如表3所述的疫苗佐劑。根據(jù)上述相同的方法，以1周的間隔重復(fù)免疫兩次后，收集血液。將該血液用間接酶聯(lián)免疫吸附法確定抗乙型肝炎表面抗原抗體的效價(jià)，結(jié)果如表3所示。
表3
在單獨(dú)免疫乙型肝炎表面抗原的情況下效價(jià)為800，而當(dāng)KSK-1，KSK-12和KSK-13分別和重組HBs抗原聯(lián)合施用時(shí)，其增加16倍以上(12,800)。當(dāng)與臨床實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的明礬一起注射時(shí)，用作疫苗佐劑的KSK-13的效果高于KSK-12的4倍，并且高于KSK-2的64倍。另外，KSK-13的效果等于CFA(完全弗氏佐劑)的效果。這些結(jié)果暗示KSK-13能夠有效地用作肽抗原的疫苗佐劑。
實(shí)施例8CpG ODN對(duì)于小鼠脾細(xì)胞的抗癌活性的影響為研究能活化小鼠脾細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞的KSK-13是否也能激活脾細(xì)胞中天然殺傷細(xì)胞清除癌細(xì)胞的能力，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
將磷酸緩沖液(對(duì)照)，或10μg KSK-2，KSK-12或KSK-13注射入BALB/C小鼠的腹腔。注射18小時(shí)后，切下小鼠脾臟并由此制備脾細(xì)胞。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)脾細(xì)胞2小時(shí)以貼壁，游離細(xì)胞(非粘附細(xì)胞)轉(zhuǎn)移入新的培養(yǎng)皿中。用1.0μg/ml同種CpG ODN處理細(xì)胞2小時(shí)，然后以圖6所示的比例，將其與5×103個(gè)51Cr標(biāo)記的YAC-1細(xì)胞共培養(yǎng)。取培養(yǎng)溶液的上清液，并用伽馬射線計(jì)數(shù)器測(cè)量進(jìn)入溶液中的51Cr的量。
圖6a顯示了在用KSK-13處理脾細(xì)胞而增加脾細(xì)胞中天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性的時(shí)候，易感于天然殺傷細(xì)胞的YAC-1細(xì)胞的溶胞水平。分別以100∶1，50∶1，25∶1和12∶1的比例混合非粘附脾細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞，E)和YAC-1細(xì)胞(靶細(xì)胞，T)。在對(duì)照中，盡管效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增加到高于靶細(xì)胞的12倍至100倍的范圍，但是靶細(xì)胞的溶胞水平卻不顯著。相反，在KSK-13中，靶細(xì)胞的溶胞水平增加到效應(yīng)細(xì)胞增加數(shù)量的3.5％左右。其低于典型小鼠CpG ODN，KSK-2的溶胞水平，但是高于人CpG ODN，KSK-12的溶胞水平。
圖6b顯示了易感于天然殺傷細(xì)胞的K562細(xì)胞的溶胞水平。具體而言，用本發(fā)明的CpG ODN處理人外周血單核細(xì)胞能顯著增加人PBMC中天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如下制備人PBMC。將血液從健康志愿者身上收集到涂有肝素的試管中，以1,200g離心10分鐘。由此收獲分界層，并轉(zhuǎn)入新試管，然后用等體積的分離緩沖液(含0.5％胎牛血清和1mM EDTA的磷酸緩沖液)稀釋。向新試管注入等體積的Histopaque-1077(Sigma)，之后在其上緩緩加入稀釋劑。試管以1,200g離心30分鐘。將分界層上的外周單核細(xì)胞收集入新試管，并重懸浮于分離緩沖液。懸浮液以210g離心5分鐘，棄上清。重復(fù)該過(guò)程三次。
分別以50∶1，25∶1和12∶1的比例混合制備好的外周單核細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞，E)和K562細(xì)胞(靶細(xì)胞，T)并進(jìn)行培養(yǎng)。在對(duì)照和KSK-13中，當(dāng)它們以25∶1的比例混合培養(yǎng)的時(shí)候，用KSK-13處理過(guò)的外周血單核細(xì)胞中天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性已經(jīng)達(dá)到了65％，但是對(duì)照的僅有9％左右。50∶1和25∶1混合比例之間的細(xì)胞毒性幾乎沒(méi)有區(qū)別的原因是以25∶1的混合比例足以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。另外，圖6a和圖6b的結(jié)果暗示KSK-13在人體中可能比在小鼠中更有效。
實(shí)施例9抗癌活性1)抑制B16黑素瘤肺轉(zhuǎn)移的效果在添加了10％高溫滅活的FBS的RPMI 1640中培養(yǎng)所有的B16黑素瘤細(xì)胞。將2×105個(gè)B16黑素瘤細(xì)胞(0.2mL PBS)靜脈注射入小鼠(7-8周齡的特定無(wú)病雌性C57BL/6)尾部外側(cè)血管I.V.。為治療B16轉(zhuǎn)移的小鼠，向I.P.中施用各種CpG(10μg/小鼠)(治療日第一，第三，第五，第七和第九日)(圖7)。
2)通過(guò)抑制局部癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移而延長(zhǎng)存活率的效果將EL4細(xì)胞(T細(xì)胞淋巴瘤，2×104)靜脈注射入每組6個(gè)C57BL/6小鼠中以接種癌細(xì)胞。在注射后第1，3，5，7和9天，將KSK-13(10μg/小鼠)注射入BALB/C小鼠的腹腔，評(píng)估每個(gè)小鼠的存活率。KSK-13延長(zhǎng)了所有6個(gè)小鼠的存活率，特別的，其中2個(gè)存活過(guò)60天。
另外，用增加數(shù)目的小鼠僅使用KSK-13 CpG ODN的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)證明了KSK-13延長(zhǎng)存活率的效果。(圖8)3)CpG ODN活化的天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性通過(guò)陰性選擇從人外周血單核細(xì)胞中去除單核細(xì)胞，在以下實(shí)驗(yàn)中僅僅使用B、T和天然殺傷細(xì)胞。從小鼠脾細(xì)胞中分離除了巨噬細(xì)胞之外的非粘附細(xì)胞，并用作效應(yīng)細(xì)胞。K562細(xì)胞系作為專(zhuān)一作用于天然殺傷細(xì)胞的靶細(xì)胞，用于測(cè)量人NK(天然殺傷)細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而YAC-1細(xì)胞系用于測(cè)量鼠NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。利用以上效應(yīng)和靶細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性用51Cr釋放法進(jìn)行測(cè)量(圖9)。
實(shí)施例10毒性測(cè)試用0.5mg KSK-13肌肉注射6個(gè)ICR小鼠的臀肌或三角肌。以2周的間隔用KSK-13注射兩個(gè)小鼠兩次。初步注射一個(gè)月后，其中之一有KSK-13以2周的間隔進(jìn)一步再注射三次。
注射之后，觀察小鼠6個(gè)月，觀察其臨床征候，進(jìn)行諸如體重和體溫的體檢，驗(yàn)血和驗(yàn)?zāi)?。結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都存活下來(lái)了，且沒(méi)有顯著的異常臨床征兆、體重改變或其他毒性效應(yīng)。
制備實(shí)施例1疫苗的制備將1mg乙型肝炎表面抗原，10mg本發(fā)明dT標(biāo)記的寡聚脫氧核苷酸，1mg氫氧化鋁，0.01w/v％硫柳汞，用作緩沖劑的適當(dāng)劑量的磷酸二氫鉀和磷酸氫鈉以及適當(dāng)劑量的氯化鈉混合于蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合物的pH值，從而制成疫苗。
經(jīng)過(guò)描述說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)例，在不背離本發(fā)明精神的情況下其中顯然可進(jìn)行各種改變和修改，而不僅僅局限于附加的權(quán)利要求中。
序列表<110>Yonsei University<120>具有改善的免疫調(diào)節(jié)功能的經(jīng)修飾的CpG寡聚脫氧核苷酸<160>5<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的無(wú)免疫刺激作用的非CpG寡核苷酸<400>1tccaggactt ctctcaggtt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>對(duì)小鼠尤其有效的合成的具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸<400>2tccatgacgt tcctgacgtt 20<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>在KSK-12的3’末端有6個(gè)鳥(niǎo)嘌呤且具有硫代磷酸酯骨架的合成的CpG寡核苷酸<400>3tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttgggggg30<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)小鼠尤其有效的合成的具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸
<400>4tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸<400>5tcgtcgtttt cgtcgtcgtt tt2權(quán)利要求
1.一種顯示出免疫活性并具有CpG基序的硫代磷酸酯或磷酸二酯或結(jié)構(gòu)修飾的寡聚脫氧核苷酸(ODN)，其特征在于在ODN的3′-末端偶聯(lián)連續(xù)的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷(dT)序列。
2.權(quán)利要求1的寡聚(脫氧)核苷酸，其中連續(xù)的dT序列具有4至15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
3.權(quán)利要求1的寡聚(脫氧)核苷酸，其中ODN改善脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞的免疫活性。
4.權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)的寡聚(脫氧)核苷酸，其中ODN具有SEQ ID No5的核苷酸序列。
5.一種疫苗佐劑，包含權(quán)利要求1的寡聚(脫氧)核苷酸作為有效成份。
6.權(quán)利要求5的疫苗佐劑，其進(jìn)一步包含其他抗原。
7.權(quán)利要求5或6的疫苗佐劑，其用于預(yù)防或治療乙型肝炎。
8.一種抗癌劑，包含權(quán)利要求1的寡聚(脫氧)核苷酸作為有效成份。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種修飾的CpG寡聚脫氧核苷酸(ODN)，其由連續(xù)的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷(dT)序列偶聯(lián)到具有免疫調(diào)節(jié)功能的CpG ODN的3′－末端而制備出來(lái)，用以增強(qiáng)脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和外周單核細(xì)胞的免疫活性，因此，能有效地用作預(yù)防和治療乙型肝炎的疫苗佐劑，或用作抗癌劑。由于在其3′－末端具有連續(xù)dT序列的硫代磷酸酯CpG ODN顯示出誘導(dǎo)Th－1免疫應(yīng)答的高度活性并且不產(chǎn)生體內(nèi)毒性，從而保證了它的安全性，能夠有效地用作疫苗佐劑。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1637013SQ20041009591
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者金壽起, 樸升圭, 樸守貞, 曹鉉哲 申請(qǐng)人:延世大學(xué)校