專利名稱：預(yù)防和治療疾病的方法及免疫調(diào)節(jié)核酸組合物的制作方法
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背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療或預(yù)防疾病的方法和組合物，該方法包括給予免疫調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明還涉及鑒定用于預(yù)防或治療疾病、特別是自身免疫性疾病或炎性疾病的免疫調(diào)節(jié)序列的手段和方法。本發(fā)明還涉及通過單獨(dú)給予免疫調(diào)節(jié)序列、或者聯(lián)合編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的核酸來治療和預(yù)防疾病。本發(fā)明還涉及通過聯(lián)合給予自身免疫調(diào)節(jié)序列和自身分子，如自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白來治療或預(yù)防疾病。本發(fā)明還涉及通過聯(lián)合給予免疫調(diào)節(jié)序列和一種或多種其他免疫調(diào)節(jié)藥物來治療或預(yù)防疾病。
本發(fā)明還涉及治療受試者疾病的方法和組合物，該疾病與受試者體內(nèi)的參與非生理狀態(tài)的一種或多種自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)。本發(fā)明還涉及預(yù)防受試者疾病的方法和組合物，該疾病與受試者體內(nèi)的參與非生理狀態(tài)的一種或多種自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)。本發(fā)明還涉及聯(lián)合治療的方法，這種聯(lián)合治療包括免疫調(diào)節(jié)序列和參與非生理狀態(tài)的與疾病相關(guān)的自身蛋白、自身多肽或自身肽的編碼核酸。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，其中該免疫反應(yīng)是針對(duì)存在于動(dòng)物體內(nèi)的、與疾病相關(guān)的、參與非生理狀態(tài)的自身分子的。本發(fā)明特別提供了治療或預(yù)防自身免疫性疾病的方法和組合物，這些自身免疫性疾病與處于非生理狀態(tài)的動(dòng)物體內(nèi)的一種或多種自身分子有關(guān)，如多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫性色素層炎(AU)、原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)、重癥肌無力(MG)、Sjogren綜合征、尋常性天皰瘡(PV)、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和Grave病。本發(fā)明還特別涉及與處于非生理狀態(tài)的動(dòng)物體內(nèi)的一種或多種自身分子相關(guān)的其他疾病，如骨關(guān)節(jié)炎、脊索損傷、消化性潰瘍、痛風(fēng)、偏頭痛、高脂血癥和冠狀動(dòng)脈疾病。
2.發(fā)明背景自身免疫性疾病自身免疫性疾病是指由錯(cuò)誤攻擊肌體的健康細(xì)胞和/或組織的適應(yīng)性免疫引起的任何疾病。自身免疫性疾病在美國人群中的患病率為3％，其他工業(yè)化國家的人群患病率與此相似(Jacobson等，Clin Immunol Immunopathol，84，223-43，1997)。自身免疫性疾病的特征是T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞異常地攻擊自身分子，這些自身分子包括而不限于自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白及其衍生物，從而引起肌體內(nèi)器官、組織或細(xì)胞的損傷(如胰腺、腦、胸腺或胃腸道)，出現(xiàn)疾病的臨床表現(xiàn)(Marrack等，Nat Med，7，899-905，2001)。自身免疫性疾病包括影響特定組織的疾病，也包括影響多種組織的疾病。對(duì)于某些疾病，這可能部分取決于自身免疫應(yīng)答是涉及屬于特定組織的自身分子抗原還是廣泛分布在機(jī)體內(nèi)的自身分子抗原。組織特異性自身免疫反應(yīng)的特征是免疫反應(yīng)針對(duì)的是單一組織或某一類型的細(xì)胞。但是，某些針對(duì)廣泛存在的自身抗原的自身免疫性疾病也可能只影響特定的組織。例如，多肌炎中自身免疫反應(yīng)針對(duì)的是普遍存在的蛋白組氨酰-tRNA合成酶，但是其臨床表現(xiàn)主要是肌肉的自身免疫性損傷。
免疫系統(tǒng)通過一種非常復(fù)雜的機(jī)制產(chǎn)生反應(yīng)來保護(hù)哺乳動(dòng)物免受外源致病原的攻擊，同時(shí)又能避免出現(xiàn)針對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng)。除了決定是否產(chǎn)生反應(yīng)(抗原特異性)以外，免疫系統(tǒng)針對(duì)不同的致病原還可以選擇相應(yīng)的效應(yīng)子功能進(jìn)行處理(效應(yīng)子特異性)。介導(dǎo)和調(diào)節(jié)這些效應(yīng)子功能的一種關(guān)鍵細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞。另外，可以確定的是CD4+T分泌特異性的細(xì)胞因子是T細(xì)胞發(fā)揮功能的一個(gè)主要機(jī)制。因此，確定CD4+T分泌的細(xì)胞因子類型以及其分泌如何調(diào)控對(duì)于理解免疫反應(yīng)是如何被調(diào)節(jié)的來說是極端重要的。
最早關(guān)于鼠長期CD4+T細(xì)胞系分泌細(xì)胞因子的特征的研究發(fā)表于10多年以前(Mosmann等，J.Immunol.，1362348-2357，1986)。這些研究的結(jié)果表明CD4+T有兩類，T輔助細(xì)胞1(Th1)和T輔助細(xì)胞2(Th2)，分別產(chǎn)生不同細(xì)胞因子。Th1細(xì)胞選擇性地產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT)，而Th2細(xì)胞選擇性地產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、和IL-13(Cherwinski等，J.Exp.Med，1691229-1244，1987)。后來從Th2克隆中相繼分離出了IL-9和IL-10(Van Snick等，J.Exp.Med，169363-368，1989)(Fiorentino等，J.Exp.Med，1702081-2095，1989)。最后發(fā)現(xiàn)Th1和Th2細(xì)胞都能分泌IL-3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。
自身免疫性疾病包括下表中所列的影響肌體內(nèi)多種不同器官和組織的許多疾病(見Paul，W.E.(1999)Fundamental Immunology，第四版，Lippincott-Raven，NewYork.)。
目前所用的治療人自身免疫性疾病的藥物包括糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物以及最近發(fā)展起來的生物治療藥物?？傮w來說，對(duì)人系統(tǒng)性自身免疫性疾病的治療主要是經(jīng)驗(yàn)性的，其效果也不能令人滿意。在大多數(shù)情況下都是用廣譜的免疫抑制藥物如皮質(zhì)類固醇來治療各種嚴(yán)重的自身免疫性疾病和炎性疾病。除了皮質(zhì)類固醇以外，其他免疫抑制藥物也可用于治療系統(tǒng)性自身免疫性疾病。環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，可引起T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的重度缺失和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的缺陷。環(huán)孢菌素、他克莫司和霉酚酸嗎啉乙酯是具有特異性T淋巴細(xì)胞抑制活性的天然產(chǎn)物，已被用于治療SLE、RA，在某些情況下也可用于治療脈管炎和肌炎。這些藥物具有很大的腎毒性。氨甲蝶呤也可作為“二線藥物”治療RA，用于抑制疾病的進(jìn)展。也可用于治療多肌炎和其他結(jié)締組織病。其他曾經(jīng)試驗(yàn)過的措施包括利用單克隆抗體阻斷細(xì)胞因子的作用或耗竭淋巴細(xì)胞(Fox，D.A.Am.J.Med，9982-88，1995)。治療MS的藥物還包括干擾素γ和共聚物1，可使疾病的復(fù)發(fā)率降低20-30％，但是對(duì)疾病的進(jìn)展只有中等程度的影響。其他用于治療MS的免疫抑制藥物包括甲基強(qiáng)的松龍、其他類固醇、氨甲蝶呤、克拉屈濱和環(huán)磷酰胺。這些免疫抑制藥物在治療MS時(shí)效果很弱。目前治療PA所用的藥物對(duì)免疫功能的抑制或調(diào)節(jié)是非特異性的，如氨甲蝶呤、水楊酸偶氮磺胺吡啶、羥氯喹、來氟米特、強(qiáng)的松，以及最近開發(fā)出的TNFα拮抗劑依那西普和英夫利昔單抗(Moreland等，J Rheumatol，28，1431-52，2001)。依那西普和英夫利昔單抗可全面阻斷TNFα，使受試者對(duì)敗血癥引起的死亡、慢性分支桿菌感染的惡化以及脫髓鞘疾病的進(jìn)展更加敏感。
對(duì)于器官特異性自身免疫來說，已經(jīng)試驗(yàn)了許多不同的治療方法。全身注射可溶性的蛋白抗原來抑制隨后出現(xiàn)的對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)就是其中一種。這種方法包括給予實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦髓炎(EAE)動(dòng)物和多發(fā)性硬化癥病人髓鞘堿蛋白、其優(yōu)勢(shì)表位和髓鞘蛋白的混合物(Brocke等，Nature，379，343-6，1996)；(Critchfield等，Science，263，1139-43，1994)；Weiner等，Annu Rev Immunol，12，809-37，(1994)；給予膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人II型膠原或膠原蛋白的混合物(Gumanovskaya等，Immunology，97，466-73，1999)；(McKown等，Arthritis Rheum，42，1204-8，1999)，(Trentham等，Science，261，1727-30，1993)；給予自身免疫性糖尿病動(dòng)物和人胰島素(Pozzilli和Gisella Cavallo，Diabetes Metab Res Rev，16，306-7，2000)；以及給予自身免疫性色素層炎動(dòng)物和人S抗原(Nussenblatt等，Am J Ophthalmol，123，583-92，1997)。利用這種方法治療的一個(gè)問題是通過系統(tǒng)注射抗原會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞出現(xiàn)無反應(yīng)。另一種方法是試圖設(shè)計(jì)出合理的治療措施來系統(tǒng)注射肽抗原，其依據(jù)是T細(xì)胞受體與結(jié)合到主要相容性復(fù)合物(MHC)分子上的肽之間的特異性相互作用。一項(xiàng)利用肽方法在糖尿病動(dòng)物模型上進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果表明動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生出了該肽的抗體(Hurtenbach U.等，JExp.Med，1771499，1993)。另一種方法是TCR肽免疫，見(Vandenbark AA等，Nature，341541，1989)。還有一種方法是口服肽或蛋白抗原來誘導(dǎo)耐受，見(Weiner HL，Immmunol Today，18335，1997)。
通過單獨(dú)或聯(lián)合佐劑給予蛋白、多肽或肽可改變針對(duì)致病原或腫瘤的免疫反應(yīng)。例如，含重組乙肝病毒表面抗原，一種非自身抗原的乙肝病毒疫苗與作為佐劑的氫氧化鋁一起可制成制劑。這種疫苗可誘導(dǎo)出抗乙肝病毒表面抗原的免疫反應(yīng)，從而避免被感染。另外一種方法是給予減毒的、復(fù)制缺陷型和/或非致病性病毒或細(xì)菌，其中都含有非自身抗原，可以激發(fā)宿主產(chǎn)生抗致病原的保護(hù)性免疫反應(yīng)。例如，口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗就是由減毒活病毒-一種非自身抗原組成的疫苗，可感染細(xì)胞并在預(yù)防接種的個(gè)體體內(nèi)誘導(dǎo)出有效的抗脊髓灰質(zhì)炎病毒-一種外源的或非自身抗原的免疫反應(yīng)，而不會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)臨床癥狀。然而，含滅活的或“被殺死的”病毒的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗無法感染或復(fù)制，即使進(jìn)行皮下注射也不能誘導(dǎo)出抗脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)性免疫。
免疫反應(yīng)激發(fā)和放大的機(jī)制與“非自身分子”相關(guān)的炎性疾病微生物包括支原體、病毒、細(xì)菌、寄生蟲和分支桿菌感染可導(dǎo)致靶器官的炎癥，在某些情況下甚至?xí)鹑硇缘难装Y反應(yīng)。比較典型的例子有細(xì)菌膿毒性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、感染性色素層炎和感染性休克。作為先天性免疫系統(tǒng)的一部分，炎癥介質(zhì)如凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的組分、緩激肽和補(bǔ)體被活化，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致患病。感染性疾病所發(fā)生的免疫反應(yīng)是針對(duì)微生物上的非自身分子的，包括蛋白、脂質(zhì)、多糖和核酸。含某種被稱為″CpG″基序的細(xì)菌DNA在動(dòng)物模型中可激發(fā)炎癥反應(yīng)，這種基序在下文中有詳細(xì)定義。例如，細(xì)菌DNA或CpG基序都是非自身分子，它們感染滑膜關(guān)節(jié)可誘導(dǎo)出多種類似于膿毒性關(guān)節(jié)炎的炎癥信號(hào)和癥狀。
與“自身分子”相關(guān)的炎性疾病許多人類疾病都與急性或慢性炎癥有關(guān)，但是其感染源未知。在這些疾病中，免疫系統(tǒng)是活化的，導(dǎo)致受影響的組織出現(xiàn)炎癥，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞異常浸潤，但是又好像與感染無關(guān)。這類疾病包括骨關(guān)節(jié)炎、冠狀動(dòng)脈疾病、阿耳茨海默病、某些類型的皮膚炎、胃腸炎和肺炎。其中所發(fā)生的免疫反應(yīng)主要是先天性免疫反應(yīng)而不是適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
與“自身分子”相關(guān)的自身免疫性疾病許多自身免疫性疾病已被報(bào)道，其中包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、糖尿病、牛皮癬等。與上述和自身分子相關(guān)的炎性疾病一樣，其中的免疫系統(tǒng)也是活化的，導(dǎo)致受影響的組織出現(xiàn)炎癥，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞異常浸潤，但是又好像與感染無關(guān)。但是也有某些方面與自身分子相關(guān)的炎性疾病不同，自身免疫性疾病存在宿主自身分子特異性的自身抗體和/或T細(xì)胞。其中宿主T和B淋巴細(xì)胞如何選擇性地靶向到這些自身分子的機(jī)制還不清楚。某些研究者認(rèn)為自身免疫性疾病是由于微生物致病原的感染而激發(fā)或惡化的。用微生物CpG序列刺激可增加動(dòng)物模型對(duì)自身免疫性疾病如EAE(Segal等，J.Immunology，1585087，1997，)和SLE(Gilkeson等，J.immunology，1421482，1989)的敏感性；但是，很少有證據(jù)能夠支持CpG序列或微生物產(chǎn)物本身就可以在其他健康動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)出自身免疫性疾病的假說，雖然這些序列或產(chǎn)物可以誘導(dǎo)出炎性疾病。例如，幾個(gè)利用既知菌系統(tǒng)(即動(dòng)物在無微生物的環(huán)境中飼養(yǎng))進(jìn)行的重要試驗(yàn)都證明動(dòng)物即使不接觸天然微生物或微生物CpG也會(huì)發(fā)生自身免疫性疾病。這樣的例子有強(qiáng)直性脊柱炎無菌轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物模型的自身免疫性皮膚和生殖器疾病的發(fā)生(Taurog，JExp Med，1802359，1994)以及2個(gè)不同SLE模型的狼瘡的發(fā)生(Maldonadoi等，JImmunol，1626322，1999；Unni等，J RHeum，235，1975)。另外還報(bào)道了一種SLE可誘導(dǎo)模型，其中任何品系的小鼠單次注射烴油、異十八烷就可以誘導(dǎo)出SLE，其特征是產(chǎn)生特異性的自身抗體和免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎病。總之，這些試驗(yàn)說明自發(fā)的和可誘導(dǎo)的自身免疫性疾病不接觸微生物DNA和CpG就可以發(fā)生。
免疫刺激序列(ISS)先天性免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是抵抗微生物和致病原的第一道防線。一種最強(qiáng)的先天性免疫系統(tǒng)刺激因子是微生物DNA，其中包含免疫刺激序列(ISS)。細(xì)菌DNA的特異性免疫刺激序列活化先天性免疫需要一種由5’-嘌呤-嘌呤-胞嘧啶-鳥嘌呤-嘧啶-嘧啶-3’組成的非甲基化的核心六聚體基序來刺激小鼠，或者一種由5’-嘌呤-嘧啶-胞嘧啶-鳥嘌呤-嘧啶-嘧啶-3’組成的非甲基化的核心六聚體基序來刺激人(Krieg等，Annu Rev.Immunol，20709-760，2002)。在免疫刺激序列內(nèi)含有這種被稱為“CpG”序列的二核苷酸基序的細(xì)菌DNA和合成寡核苷酸(ODN)可刺激B細(xì)胞增殖和分泌IL-6、IL-10和免疫球蛋白(Krieg等，Nature，374546-549，1995；Yi等，J.Immunol，1575394-5402，1996)。ISS DNA還可以直接活化樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，使其分泌Th1樣細(xì)胞因子如TNF-α、IL6和IL12，上調(diào)MHC和共刺激分子的表達(dá)(Klinman等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，932879-2883，1996；Martin-Orozco等，Jnt.Immunol，111111-1118，1999；Sparwasser等，Eur.J.Immunol，282045-2054，1998)。在小鼠體內(nèi)，Toll樣受體-9(TLR9)被認(rèn)為是可識(shí)別CpG基序的關(guān)鍵受體。
對(duì)于脊椎動(dòng)物DNA來說，CpG二核苷酸出現(xiàn)的頻率被抑制到預(yù)測(cè)值的約1/4，CpG二核苷酸內(nèi)的C在約80％的時(shí)間內(nèi)是被甲基化的。而細(xì)菌DNA和合成的ODN一樣，CpG二核苷酸內(nèi)的C基本是非甲基化的。因此細(xì)菌DNA和脊椎動(dòng)物DNA在結(jié)構(gòu)上是有所不同的，其未甲基化CpG基序的含量增加超過20倍。很多試驗(yàn)已經(jīng)證明非甲基化的CpG基序可作為細(xì)菌DNA的一種分子模式活化免疫細(xì)胞(Krieg等，Annu.Rev.Immunol，20709-760，2002)。
CpG DNA被認(rèn)為是一種高效佐劑，能夠誘導(dǎo)抗自身抗原如雞蛋溶菌酶和卵清蛋白的強(qiáng)抗體反應(yīng)和Th1樣T細(xì)胞反應(yīng)(Chu等，J.Exp.Med，1861623-1631，1997；Lipford等，Eur.J.Immunol，2123AQ-23AA，1997)。目前，CpG DNA和CpG ODN已作為治療性疫苗被用于各種感染性疾病、腫瘤、變態(tài)反應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病動(dòng)物模型中(Krieg等，Annu.Rev.Immunol，20709-760，2002)。CpG可成功地用作疫苗主要是因?yàn)樗梢杂行У卣T導(dǎo)強(qiáng)的Th1樣反應(yīng)，在某些情況下還可以將Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h1反應(yīng)，如在變態(tài)反應(yīng)性哮喘模型中(Kline等，J.Immunol，1602555-2559，1998；Broide等，J.Immunol，1617054-7062，1998)。
通過CpG DNA活化先天性免疫反應(yīng)用于治療的目的已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。通過CpG DNA的誘導(dǎo)活化非抗原特異性的先天性免疫細(xì)胞足以保護(hù)小鼠免受細(xì)菌的感染，甚至可以治療細(xì)胞內(nèi)已有的致病原感染(Agrawal等，Trends Mol Med，8114-121，2002)。CpG DNA還可以誘導(dǎo)對(duì)腫瘤的先天性免疫耐受，抑制小鼠體內(nèi)已有的腫瘤(Dow等，J.Immunol，1631552-1561，1999；Carpenter等，Cancer Res.，595429-5432，1999；Smith et al，J.Natl Cancer Inst.，901146-1154，1998)。CpG DNA的Th1佐劑效應(yīng)甚至可以消除已經(jīng)存在的Th2免疫反應(yīng)；CpG DNA已被作為佐劑用于變態(tài)反應(yīng)疫苗中，在已經(jīng)存在Th2反應(yīng)的情況下可誘導(dǎo)出針對(duì)抗原的Th1反應(yīng)，使吸入變態(tài)反應(yīng)原后出現(xiàn)的反應(yīng)癥狀減輕(Van Uden等，J.Allergy Clin.Immunol，104902-910，1999)。
免疫抑制序列(IIS)免疫刺激序列寡聚脫氧核苷酸(ISS-ODN)的抑制劑已被用于抑制重組表達(dá)載體內(nèi)ISS-OND的免疫刺激活性，特別是在基因治療中，這些抑制劑可作為抗炎癥因子減輕針對(duì)細(xì)菌和病毒ISS-ODN的宿主免疫反應(yīng)，作為自身免疫調(diào)節(jié)因子與自身抗原和自身抗體一起抑制ISS-OND刺激的Th1產(chǎn)生IL-12，作為佐劑用于刺激抗細(xì)胞外抗原的Th2免疫反應(yīng)，通常可以將宿主的免疫反應(yīng)從Th1轉(zhuǎn)變成Th2。見美國專利No.6,255,292。
Yamada等，J.Immunol，169；5590-5594，2002利用各種體外免疫活化細(xì)胞系統(tǒng)評(píng)價(jià)了IIS寡聚脫氧核苷酸在CpG誘導(dǎo)的免疫刺激中的作用，他們發(fā)現(xiàn)IIS寡聚脫氧核苷酸所產(chǎn)生的抑制作用超過了寡聚脫氧核苷酸所產(chǎn)生的刺激作用，對(duì)于CpG誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)來說是特異性的；大多數(shù)抑制性的寡核苷酸序列都含有聚鳥苷酸或富含G-C序列，但是未發(fā)現(xiàn)特異性的六聚體基序。Krieg等，PNAS，95；12631-12636，1998發(fā)現(xiàn)含有被稱為him的中和基序的合成寡核苷酸可阻斷免疫刺激性CpG基序誘導(dǎo)的免疫活化，這種中和基序存在同向重復(fù)簇的CpG二核苷酸、在5’端為C或在3’端為G。另外未發(fā)現(xiàn)六聚體免疫刺激序列。在文獻(xiàn)Zeuner等，Arthritis andRheumatism，462219-2224，2002中，上述Kreig等人描述的IIS被證明可在動(dòng)物模型中抑制CpG誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。在US 6,225,292中，Raz等人描述了一種特異性的六聚體基序，被定義為5’-嘌呤-嘌呤-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’，其中Y是除胞嘧啶核苷酸之外的任意核苷酸，Z是任意核苷酸，其中當(dāng)Y不是鳥嘌呤核苷或次黃嘌呤核苷、Z不是鳥嘌呤核苷或次黃嘌呤核苷時(shí)，可以阻斷CpG免疫刺激序列的免疫刺激活性。在上述所有例子中，IIS都被證實(shí)可以特異性地抑制免疫刺激性CpG序列引起的免疫活化。
核酸治療反義核酸治療反義寡核苷酸最初是作為特異性靶基因的互補(bǔ)序列來降低該基因的表達(dá)(Krieg，Annu.Rev.Immunol，20709-760，2002)。為了防止這些寡核苷酸的降解通常都要對(duì)寡核苷酸骨架進(jìn)行修飾，如硫代磷酸酯化。雖然在許多情況下反義寡核苷酸確實(shí)可以抑制組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的靶基因表達(dá)，但是在體內(nèi)試驗(yàn)中很少能成功地改變基因的表達(dá)。許多研究者意外地卻發(fā)現(xiàn)許多這樣的寡核苷酸可在體內(nèi)刺激免疫反應(yīng)。例如，抗人免疫缺陷病毒(HIV)rev基因的反義寡核苷酸具有免疫刺激效應(yīng)，因?yàn)樗梢源碳細(xì)胞的增殖和脾腫大(Branda等，Biocgen.Pharmacol.，452037-2043，1993)。雖然在早期的研究中并沒有馬上鑒定出免疫刺激基序，但是這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了后來對(duì)特異性免疫刺激基序的深入研究。
基因治療多核苷酸治療，其中包括編碼肽和/或多肽的裸DNA、用沉淀和轉(zhuǎn)染促進(jìn)試劑制成的DNA制劑以及病毒載體都已被用于“基因治療”?；蛑委熅褪峭ㄟ^轉(zhuǎn)移多核苷酸來提供蛋白或肽的表達(dá)以替代宿主內(nèi)缺失或缺陷的蛋白或肽，或者增強(qiáng)所需的生理功能。基因治療包括用于治療的目的使DNA整合到宿主基因組內(nèi)的方法。基因治療的例子包括轉(zhuǎn)移編碼凝血因子的DNA以治療血友病、轉(zhuǎn)移編碼腺嘌呤脫氨酶的DNA以治療重癥聯(lián)合免疫缺陷、轉(zhuǎn)移編碼低密度脂蛋白受體的DNA以治療家族性高膽固醇血癥、轉(zhuǎn)移編碼葡萄糖腦苷酯酶的DNA以治療Gaucher病、轉(zhuǎn)移編碼α1胰蛋白酶的DNA以治療α1胰蛋白酶缺乏癥、轉(zhuǎn)移α或β球蛋白基因以治療血紅蛋白病、以及轉(zhuǎn)移編碼氯離子載體的DNA以治療囊性纖維化(Verma和Somia，Nature，389，239-42，1997)。
DNA免疫治療感染在DNA免疫中，一個(gè)非復(fù)制型的轉(zhuǎn)錄子單位為蛋白或蛋白片段的合成提供了一個(gè)模板，這種蛋白或蛋白片段可在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)或提供特異性的免疫反應(yīng)。注射裸DNA可增強(qiáng)抗各種微生物和腫瘤的免疫(Robinson和Torres，SeminImmunol，9，271-83.，1997)。編碼病毒(乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、輪狀病毒和流感病毒)、細(xì)菌(結(jié)核分支桿菌)和寄生蟲特異性蛋白的DNA疫苗已被開發(fā)出來用于預(yù)防和治療這些致病原所引起的感染，其中所提到的蛋白都是非自身抗原(Le等，Vaccine，18，1893-901，2000)；(Robinson和Pertmer，Adv Virus Res，55，1-74，2000)。
DNA治療惡性腫瘤編碼主要組織相容性抗原I類分子、細(xì)胞因子(IL-2、IL-12和IFN-γ)和腫瘤抗原的DNA疫苗已被開發(fā)出來用于治療惡性腫瘤(Wlazlo和Ertl，Arch Immunol Ther Exp，491-11，2001)。例如，編碼B細(xì)胞免疫球蛋白獨(dú)特型(抗原結(jié)合區(qū))的病毒DNA被注射以后可根除B細(xì)胞淋巴瘤(Timmerman等，Blood，971370-1377，2001)。
DNA免疫治療自身免疫性疾病其他研究者也報(bào)道了利用編碼免疫分子的DNA來治療自身免疫性疾病的研究。這種DNA治療措施包括利用編碼T細(xì)胞受體抗原結(jié)合區(qū)的DNA來改變導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的水平(Waisman等，NatMed，2899-905，1996)(美國專利5,939,400)。將編碼自身抗原的DNA連接到顆粒上，然后用基因槍轉(zhuǎn)移到皮膚內(nèi)可治療多發(fā)性硬化癥和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(專利WO97/46253)(Ramshaw等，Immunol，和Cell Bio.，75409-413，1997)。編碼粘附分子、細(xì)胞因子(TNFα)、趨化因子(C-C趨化因子)和其他免疫分子(Fas配基)的DNA已被用于治療自身免疫性疾病的動(dòng)物模型(Youssef等，J Clin Invest，106361-371，2000)；(Wildbaum等，J Clin Invest，106671-679，2000)；(Wildbaum等，J Immunol，1655860-5866，2000)；(Wildbaum等，J Immunol，1616368-7634，1998)；(Youssof等，J Autoimmun，1321-9，1999).
本發(fā)明的目的之一是提供治療或預(yù)防疾病、特別是自身免疫性疾病或炎性疾病的方法和組合物，所述方法包括給予免疫調(diào)節(jié)核酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定治療疾病的免疫調(diào)節(jié)序列的方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供治療與存在于并參與動(dòng)物體內(nèi)非生理過程的自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)的疾病的方法和手段。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供用于治療或預(yù)防與存在于動(dòng)物體內(nèi)非生理過程的自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)的疾病的組合物。本發(fā)明還涉及疾病的治療或預(yù)防，其中包括聯(lián)合給予免疫調(diào)節(jié)核酸和自身分子。通過完整閱讀本說明書可以清楚地理解本發(fā)明的這些目的以及其他目的。
發(fā)明概述本發(fā)明的理論根據(jù)是單獨(dú)或聯(lián)合使用免疫調(diào)節(jié)序列可預(yù)防或治療與自身分子相關(guān)的自身免疫性疾病或炎性疾病。正是由于本發(fā)明的出現(xiàn)含有CpG二核苷酸的免疫調(diào)節(jié)序列或在特定免疫調(diào)節(jié)基序中含有的如本文所述的其他調(diào)節(jié)性二核苷酸才被用于預(yù)防或治療炎癥性或自身免疫性疾病，這種預(yù)防和治療方法不依賴于與其相似或并行的ISS刺激(如微生物DNA或含CpG的重組載體)。免疫調(diào)節(jié)基序的例子有5’-嘌呤-嘧啶-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’；和5’-嘌呤-嘌呤-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’本發(fā)明的目的可通過治療或預(yù)防疾病、特別是自身免疫性或炎性疾病的新型方法和組合物來實(shí)現(xiàn)，包括給予含有一個(gè)或多個(gè)免疫調(diào)節(jié)序列的免疫調(diào)節(jié)核酸。免疫調(diào)節(jié)核酸可單獨(dú)給藥，也可以和編碼自身蛋白、自身多肽、自身肽的多核苷酸一起給藥。免疫調(diào)節(jié)核酸也可以和其他自身分子一起用于治療與一種或多種處于非生理狀態(tài)的個(gè)體體內(nèi)的自身分子相關(guān)的自身免疫性或炎性疾病。本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防自身免疫性疾病或炎性疾病的藥物組合物，其中藥物組合物包含多核苷酸形式的免疫調(diào)節(jié)序列，如DNA多核苷酸。免疫調(diào)節(jié)序列還可以被插入到載體內(nèi)，通過修飾載體核苷酸序列的元件使其包含免疫調(diào)節(jié)基序，當(dāng)用于治療與非生理狀態(tài)個(gè)體體內(nèi)的自身分子相關(guān)的疾病，如自身免疫性或炎性疾病時(shí)，還可以包含抑制性二核苷酸基序。
本發(fā)明的其他目的可通過治療或預(yù)防與非生理狀態(tài)動(dòng)物體內(nèi)的一種或多種自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)的疾病的新型方法來實(shí)現(xiàn)，包括給予動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)序列的方法。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防與非生理狀態(tài)動(dòng)物體內(nèi)的一種或多種自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)的疾病的新型方法，其中包括給予動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)序列以及編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性色素層炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、重癥肌無力、Sjogren綜合征、尋常性天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性皮膚病和Grave病的方法，該方法包括給予動(dòng)物單獨(dú)的免疫調(diào)節(jié)序列，或者聯(lián)合含編碼自身免疫性疾病相關(guān)的自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的自身載體一起給藥。在本發(fā)明的另一方面，免疫調(diào)節(jié)序列可與含DNA的多核苷酸一起給藥，其中的DNA編碼處于非生理狀態(tài)或其相關(guān)疾病的個(gè)體體內(nèi)存在的自身蛋白、自身多肽或自身肽。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防炎性疾病如骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、假性痛風(fēng)、羥磷灰石沉積病、哮喘、滑囊炎、肌腱炎、結(jié)膜炎、尿道炎、陰莖頭炎、皮膚炎、冠狀動(dòng)脈疾病或偏頭疼的方法，該方法包括單獨(dú)或聯(lián)合給予動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)序列。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防器官或細(xì)胞移植相關(guān)的疾病的方法，這些疾病包括而不限于GVHD或移植排斥，該方法包括單獨(dú)或與自身載體一起給予動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)序列，其中的自身載體包括編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸，這些自身蛋白、自身多肽或自身肽與GVHD或移植排斥相關(guān)。給予免疫調(diào)節(jié)序列和含編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的自身載體可調(diào)節(jié)針對(duì)自身載體表達(dá)的自身蛋白、自身多肽或自身肽的免疫反應(yīng)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1IMS(抑制性IMS)抑制ISS(CpG-ODN)介導(dǎo)的全脾細(xì)胞增殖，并且是TLR-9依賴性的。(A)用刺激性CpG-ODN培養(yǎng)全脾細(xì)胞，在72小時(shí)內(nèi)按照?qǐng)D例所示不斷增加抑制性IMS的濃度。在培養(yǎng)的最后16小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值+/-SD。(B)從TLR-9 WT(交叉影線柱)和TLR-9 KO(黑柱)小鼠中分離全脾細(xì)胞，用刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或LPS培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)的最后16小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值+/-SD。(C)IMS抑制IκB-α在32位絲氨酸上的磷酸化。在存在5μg/ml所示的寡核苷酸的情況下培養(yǎng)空白的脾細(xì)胞72小時(shí)。用20μg蛋白提取物通過蛋白質(zhì)印跡分析確定IκB-α在32位絲氨酸上的磷酸化水平。在存在刺激性CpG(2道)或刺激性CpG和對(duì)照寡核苷酸(6道)的情況下IκB-α被活化，將IMS加入到刺激性CpG寡肽中時(shí)(5道)IκB-α被活化的水平降低。
圖2抑制性IMS降低細(xì)胞表面MHC II類分子和共刺激分子的表達(dá)水平。(A)在添加或不添加CpG-ODN(5μg/ml)或抑制性IMS(5μg/ml)的情況下培養(yǎng)空白脾細(xì)胞，72小時(shí)后收獲細(xì)胞。利用定量PCR從純化的RNA開始合成cDNA。每個(gè)樣品中MHC II類分子RNA的量表示為與β肌動(dòng)蛋白R(shí)NA量相比較后得到的相對(duì)單位。(B)在添加圖中所示量的每種寡核苷酸(μg/ml)的情況下培養(yǎng)空白脾細(xì)胞。通過FACS分析MHCII類分子表達(dá)陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，如圖所示，抑制性寡核苷酸以劑量依賴的方式抑制MHC II類分子表達(dá)。(C至F)抑制性IMS(抑制性寡核苷酸)對(duì)APC活化標(biāo)記分子表達(dá)水平的影響?？瞻灼⒓?xì)胞用所示濃度的刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或?qū)φ誒DN培養(yǎng)，72小時(shí)后收獲細(xì)胞。利用FACS分析CD40(C)、CD80(D)、CD86(E)和CD1d(F)的表達(dá)水平。抑制性IMS可以劑量依賴的方式抑制CD40、CD80和CD86的表達(dá)，而以劑量依賴的方式增加CD1d的表達(dá)。
圖3抑制性IMS抑制Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。空白脾細(xì)胞用所示濃度的刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或?qū)φ誒DN培養(yǎng)，72小時(shí)后收獲上清。用ELISA方法測(cè)定IL6(A)和IL12p40(B)的表達(dá)水平。如圖所示，抑制性IMS可以劑量依賴的方式抑制IL6和IL12p40的表達(dá)。一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值。
圖4用抑制性IMS預(yù)防治療來抑制PLP139-151介導(dǎo)的EAE。SJL/J小鼠皮下注射100μg PLP139-151肽進(jìn)行免疫，肽用PBS溶解，以CFA乳化。在肽免疫前14天和7天腹腔注射50μg懸浮于PBS中的IMS。每天記錄動(dòng)物的臨床分?jǐn)?shù)。1級(jí)，尾巴麻痹；2級(jí)，后肢輕度癱瘓；3級(jí)，后肢麻痹；4級(jí)，完全麻痹(四肢麻痹)；5級(jí)，死亡。
圖5用抑制性IMS預(yù)防治療來抑制PLP139-151介導(dǎo)的EAE。SJL/J小鼠皮下注射100μg含不完全弗氏佐劑和0.5mg熱滅活結(jié)核分支桿菌的PLP139-151肽進(jìn)行免疫。在肽免疫的同一天(第0天)腹腔注射如圖所示的50μg懸浮于PBS中的ODN。每天記錄動(dòng)物的臨床分?jǐn)?shù)。1級(jí)，尾巴麻痹；2級(jí)，后肢輕度癱瘓；3級(jí)，后肢麻痹；4級(jí)，完全麻痹(四肢麻痹)；5級(jí)，死亡。
圖6IMS對(duì)純化抗原特異性T細(xì)胞分化增殖的影響。(A)抑制性IMS抑制Th1細(xì)胞?？瞻兹⒓?xì)胞用PLP139-151肽和如圖所示的ODN共培養(yǎng)24小時(shí)，將載肽脾細(xì)胞照射以后加入PLP139-151特異性的Th1細(xì)胞系再培養(yǎng)72小時(shí)。IMS不能刺激Th1細(xì)胞的增殖，對(duì)CpG-ODN誘導(dǎo)的增殖只有輕微的抑制作用。(B)相反，抑制性IMS不能抑制PLP139-151特異性Th2細(xì)胞系的增殖。三組試驗(yàn)中都能觀察到CpG-ODN對(duì)這種Th2細(xì)胞系增殖的抑制效應(yīng)，在培養(yǎng)的最后16小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值+/-SD。
圖7對(duì)pBHT1載體的修飾可降低脾細(xì)胞的增殖活性。(A)全脾細(xì)胞用刺激性CpG寡核苷酸和免疫調(diào)節(jié)性GpG寡核苷酸培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)的最后4小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。刺激指數(shù)根據(jù)只用培養(yǎng)基孵育的脾細(xì)胞增殖水平之上的增殖程度來計(jì)算。(B)全脾細(xì)胞用圖中所示濃度的pVAX1空載體或pBHT1空載體培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)的最后4小時(shí)用1μCi[3H]胸腺嘧啶核苷脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。刺激指數(shù)根據(jù)只用培養(yǎng)基孵育的脾細(xì)胞增殖水平之上的增殖程度來計(jì)算。
圖8pBHT1載體降低APC的活化。空白脾細(xì)胞用10μg/ml CpG或GpG寡核苷酸(A)、或者100μg/ml pVAX1或pBHT1培養(yǎng)48小時(shí)。收獲細(xì)胞，染色后通過FACS分析CD16/32的表達(dá)。未標(biāo)記的圖代表只與培養(yǎng)基共孵育的細(xì)胞。
圖9pBHT1載體抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。空白脾細(xì)胞用10μg/ml刺激性CpG寡核苷酸、免疫調(diào)節(jié)性GpG寡核苷酸、100μg/ml pVAX1 DNA或100μg/ml pBHT1 DNA培養(yǎng)。在圖中所示的時(shí)間點(diǎn)后收獲上清，通過夾心ELISA測(cè)定IL6、IL10和IFNγ的表達(dá)水平。一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三個(gè)復(fù)孔的平均值。
圖10編碼自身抗原的pBHT1載體可減輕EAE的癥狀。將編碼鼠PLP(蛋白脂類蛋白)的DNA插入到pBHT1載體內(nèi)，肌肉注射給SJL小鼠。小鼠在第0天時(shí)先用溶于CFA(完全弗氏佐劑)的肽PLP139-151誘導(dǎo)EAE，然后在疾病起始后第7天(第20天)將小鼠隨機(jī)分成不同的治療組。50μg含鼠PLP的pBHT1載體或50μg pBHT1空載體對(duì)照以三種不同的給藥方案肌肉注射到小鼠體內(nèi)(A)每周一次，(B)兩周一次，以及(C)四周一次。每天記錄小鼠的EAE分?jǐn)?shù)，共分為5級(jí)，將治療組的平均得分作圖。所有治療組的平均疾病得分都有下降，最顯著的是兩周一次或四周一次給藥組。
圖11用抑制性IMS進(jìn)行多核苷酸治療抑制PLP139-151介導(dǎo)的EAE。在第0天時(shí)，7周齡的雌性SJL/J小鼠皮下注射100μg PLP139-151肽進(jìn)行免疫，肽用PBS溶解，以CFA乳化，其中含有IFA和0.5mg熱滅活的結(jié)核分支桿菌。從第7天開始每天記錄動(dòng)物的臨床得分。在第12天時(shí)，在小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射0.1ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后，在所選擇小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射編碼全長鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA(分別插入到pTARGET質(zhì)粒內(nèi)，每種25μg)和50μg編碼全長鼠IL-4的pTARGET質(zhì)粒，質(zhì)粒溶于TE內(nèi)，總體積為0.2ml。DNA注射每周進(jìn)行一次，共注射6周。在開始進(jìn)行DNA處理時(shí)，小鼠腹腔單獨(dú)注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA多核苷酸注射。IMS每?jī)芍茏⑸湟淮?，共注?周。
圖12EAE治療組細(xì)胞因子表達(dá)情況。誘導(dǎo)出EAE后57天處死小鼠，取出每只小鼠的腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)，并將一組的淋巴混合在一起。分離出細(xì)胞用含10μg/ml PLP139-151、10％FCS的濃縮RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)。3天后收集細(xì)胞上清，用標(biāo)準(zhǔn)的鼠(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)IL-10 ELISA試劑盒通過夾心ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。ELISA試劑盒購自BD Pharmingen。
圖13利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進(jìn)行髓鞘自身抗體表位擴(kuò)散試驗(yàn)。用PLP139-151誘導(dǎo)出急性麻痹性EAE并在部分恢復(fù)后14天，SJL/J小鼠分別用PBS空白對(duì)照，IMS，編碼MBP、PLP、MOG、MAG(DPT)和IL-4的pTARGET；DPT和IL-4加上IMS；DPT和IL-4加上CpG.處理，每周一次。經(jīng)過6周處理以后，采集每個(gè)治療組小鼠的血清以及正常小鼠的血清(NMS)，進(jìn)行髓鞘蛋白芯片試驗(yàn)，SAM用于鑒定和制備分級(jí)集束分析來確定抗原的特征。
圖14單獨(dú)使用抑制性IMS和與多核苷酸治療聯(lián)合可抑制PLP139-151介導(dǎo)的EAE。在第0天時(shí)，7周齡的雌性SJL/J小鼠皮下注射100μg PLP139-151肽進(jìn)行免疫，肽用PBS溶解，以CFA乳化，其中含有IFA和0.5mg熱滅活的結(jié)核分支桿菌。從第7天開始每天記錄動(dòng)物的臨床得分。在第14天時(shí)，在小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射0.1ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后，在所選擇小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射編碼全長鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA(分別插入到pTARGET質(zhì)粒內(nèi)，每種25μg)和50μg編碼全長鼠IL-4的pTARGET質(zhì)粒，質(zhì)粒溶于TE內(nèi)，總體積為0.2ml。DNA注射每周進(jìn)行一次，共注射6周。在開始進(jìn)行DNA處理時(shí)，小鼠腹腔單獨(dú)注射200μl含50μgIMS的PBS(A)，或者同時(shí)進(jìn)行DNA多核苷酸注射(B)。IMS每?jī)芍茏⑸湟淮?，共注?周。
圖15DNA多核苷酸療法和IMS治療NOD糖尿病小鼠。取7周齡的NOD/Lt雌性小鼠，在禁止隨意出入的房間內(nèi)飼養(yǎng)。在10周齡時(shí)開始用One Touch Ultra BloodGlucose Monitoring System每周測(cè)定血糖水平(BGL)。當(dāng)BGL達(dá)到200-250 mg/dl時(shí)開始治療。在15周齡時(shí)將小鼠分組。小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射1)編碼全長鼠前胰島素原1和前胰島素原2的DNA多核苷酸，DNA分別被插入到pVAX1載體內(nèi)，注射劑量為50μg；或者2)編碼全長鼠前胰島素原1和前胰島素原2的DNA多核苷酸，DNA分別被插入到pVAX1載體內(nèi)，注射劑量為50μg，再加上編碼IL-4的pVAX1質(zhì)粒，質(zhì)粒用PBS溶解，總體積為0.2ml。注射每周進(jìn)行一次，連續(xù)4周。在開始進(jìn)行DNA治療的同時(shí)，小鼠腹腔單獨(dú)注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA多核苷酸治療。IMS治療每周一次，連續(xù)4周。開始治療后9周內(nèi)記錄在糖尿病進(jìn)展過程中的存活百分率(A)。29周齡時(shí)的糖尿病患病百分率定義為BGL持續(xù)超過250mg/dl的小鼠所占的百分率(B)。
圖16DNA多核苷酸療法和IMS治療NOD糖尿病小鼠。取7周齡的NOD/Lt雌性小鼠，在禁止隨意出入的房間內(nèi)飼養(yǎng)。在10周齡時(shí)開始用One Touch Ultra BloodGlucose Monitoring System每周測(cè)定血糖水平(BGL)。當(dāng)BGL達(dá)到200-250mg/dl時(shí)開始治療。在15周齡時(shí)將小鼠分組。小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射1)PBS，2)200μg pVAX1空質(zhì)粒，3)50μg IMS，4)pVAX1空質(zhì)粒加IMS(肌肉注射)，5)編碼全長鼠前胰島素原1和前胰島素原2的DNA多核苷酸，DNA分別被插入到pVAX1載體內(nèi)，注射劑量為50μg，6)DNA多核苷酸加IMS(肌肉注射)，7)DNA多核苷酸加50μg編碼IL-4的pVAX1質(zhì)粒，8)DNA多核苷酸加IL-4加IMS(肌肉注射)，9)DNA多核苷酸加IL-4，腹腔再注射0.2ml含50μg IMS的PBS。所有的注射都是每周一次，連續(xù)8周。糖尿病患病百分率定義為BGL持續(xù)超過250mg/dl的小鼠所占的百分率。開始治療后8周內(nèi)記錄在糖尿病進(jìn)展過程中的存活百分率。
圖17DNA療法和抑制性IMS抑制II型膠原誘導(dǎo)的CIA。將20只6周齡的DBA/1小鼠分組，在用完全弗氏佐劑乳化的CII誘導(dǎo)CIA前14天和7天用50μg如圖所示的DNA疫苗進(jìn)行IM預(yù)處理。誘導(dǎo)出CIA后用第三種劑量的DNA耐受疫苗處理小鼠1周。2周后小鼠用不完全弗氏佐劑乳化的CII誘發(fā)一次。利用Current Protocols inImmunology中描述的視覺評(píng)分系統(tǒng)記錄關(guān)節(jié)炎的分?jǐn)?shù)。(A)編碼II型膠原(CII)的DNA加上編碼IL-4的DNA，加或不加IMS，結(jié)果顯示與DNA疫苗載體(pTarget)加上IL-4再加或不加IMS的對(duì)照組相比關(guān)節(jié)炎的平均嚴(yán)重程度明顯下降。(B)疾病總體發(fā)病率各組基本一致。
圖18CIA治療組的增殖試驗(yàn)。CIA免疫爆發(fā)后27天處死小鼠，取腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)，并將一組的淋巴混合在一起。分離出細(xì)胞用含100μg/ml變性II型膠原、10％FCS的濃縮RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)的最后16小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值+/-SD。
圖19CIA治療組的細(xì)胞因子表達(dá)情況。CIA免疫爆發(fā)后27天處死小鼠，取腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)，并將一組的淋巴混合在一起。分離出細(xì)胞用含100μg/ml變性II型膠原、10％FCS的濃縮RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)。收集上清，用BD Pharmingen的標(biāo)準(zhǔn)鼠(A)IL-6、(B)IL-4、(C)IFN-γ和(D)TNF-α ELISA試劑盒通過夾心ELISA方法測(cè)定細(xì)胞因子的表達(dá)情況。
圖20DNA療法和抑制性IMS抑制II型膠原誘導(dǎo)的CIA。將20只6周齡的DBA/1小鼠分組，在用完全弗氏佐劑乳化的CII誘導(dǎo)CIA前14天和7天用50μg如圖所示的DNA疫苗和IP加IMS進(jìn)行IM預(yù)處理。誘導(dǎo)出CIA后用第三種劑量的DNA耐受疫苗和IMS處理小鼠1周。2周后小鼠用不完全弗氏佐劑乳化的CII誘發(fā)一次。利用Current Protocols in Immunology中描述的視覺評(píng)分系統(tǒng)記錄關(guān)節(jié)炎的分?jǐn)?shù)。(A)IMS處理鼠與未處理對(duì)照組的小鼠和編碼全長II型膠原(CII)的DNA加IMS處理組的小鼠相比其關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度明顯減輕。(B)IMS處理組的總發(fā)病率與其他兩組相比下降，其他兩組類似。
圖21抑制性IMS抑制ISS(CpG-ODN)介導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。利用羊抗鼠IgG和IgM、羊γ球蛋白的重鏈和輕鏈特異性抗體作為載體蛋白通過標(biāo)準(zhǔn)的B細(xì)胞淘洗技術(shù)從脾中分離初級(jí)B細(xì)胞，純度大于＞97％的B220+細(xì)胞通過FACScan分析來確定。B細(xì)胞用5μg如圖所示的寡核苷酸培養(yǎng)72小時(shí)。用100ng/ml的LPS共培養(yǎng)。在培養(yǎng)的最后16小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值+/-SD。
圖22抑制性IMS抑制B細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子?？瞻壮跫?jí)B細(xì)胞用如圖所示濃度的刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或?qū)φ誒DN培養(yǎng)。72小時(shí)后收獲上清。通過ELISA方法測(cè)定產(chǎn)生的IL6(A)；IFN-γ(B)；IL-10(C)和IL12p40(D)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值。
發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明前，需要說明的是本發(fā)明并不限于特定的制劑或方法參數(shù)，這些參數(shù)可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解的是本文所用的方法只是為了描述本發(fā)明的特定實(shí)施方式，而不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。
定義“核酸”和“多核苷酸”用在這里時(shí)意義是相同的，是指核苷酸(如脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其類似物)的聚合物。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”是指核酸的一個(gè)亞類，約含6到175個(gè)核苷酸或更長。典型的寡核苷酸的長度可達(dá)到約100個(gè)核苷酸。寡核苷酸既指寡核糖核苷酸，又指寡脫氧核糖核苷酸，本文稱為ODN。ODN包括寡核苷酸和其他含有機(jī)堿基的聚合物。
核苷酸是含有連接到磷酸基團(tuán)和可取代有機(jī)堿上的糖(優(yōu)選核糖或脫氧核糖)的分子，可取代有機(jī)堿可以是取代嘌呤(鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或次黃嘌呤(I))或取代嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。
免疫調(diào)節(jié)序列(IMS)。本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)序列”或“IMS”是指能調(diào)節(jié)自身免疫性疾病或炎性疾病的核酸分子的核苷酸序列或核酸分子的一段區(qū)域。例如，IMS可以是插入到載體內(nèi)的寡核苷酸或核苷酸序列。本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)核酸“是指含有一個(gè)和多個(gè)IMS的核酸分子。
術(shù)語“一致性”或“百分一致性”用于兩個(gè)和多個(gè)核酸或多肽序列時(shí)是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列在被排列到一起比較其最大一致性時(shí)是一樣的，或者有一定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是一樣的，例如用序列比較算法如PILEUP、BLAST或其他類似算法(見Higgins和Sharp，CABIOS，5151-153，1989；Altschul等，J.Mol Biol，215403-410，1990)進(jìn)行比較時(shí)。在比較序列時(shí)較好的排列方法是Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.，2482，1981所描述的局部同源性算法、Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970所描述的同源性排列算法、Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988所描述的相似性搜索法、以及根據(jù)這些算法編寫的計(jì)算機(jī)程序(Wisconsin Genetics Software Package內(nèi)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WT)，或者通過人眼的檢查來比較(見Ausubel等，同上)。
術(shù)語“基本一致的”用于兩個(gè)核酸或多肽時(shí)是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列在被排列到一起比較其最大一致性時(shí)至少有60％的核苷酸或氨基酸殘基是一致的，優(yōu)選至少有70％、更優(yōu)選至少有80％、最優(yōu)選至少有90％或95％的核苷酸或氨基酸殘基是一致的。如果在序列的一個(gè)區(qū)域內(nèi)存在序列的基本一致性，那么這個(gè)區(qū)域的長度優(yōu)選至少約50個(gè)殘基、更優(yōu)選的是至少約100個(gè)殘基、最優(yōu)選的是至少約150個(gè)殘基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，序列在給定核酸或多肽的全長序列上是基本一致的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，核酸或多肽(如自身蛋白、自身多肽或自身肽，或者編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的核酸)與本文所描述的特定核酸或多肽是基本一致的。
本文所用的術(shù)語“自身分子”包括自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白?！白陨淼鞍?、自身多肽、自身肽或其片段或衍生物”包括動(dòng)物基因組所編碼的蛋白、多肽或肽；動(dòng)物產(chǎn)生的蛋白、多肽或肽；在動(dòng)物生命過程的某個(gè)階段經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白、多肽或肽；或處于非生理狀態(tài)中的動(dòng)物體內(nèi)存在的蛋白、多肽或肽。術(shù)語“非生理狀態(tài)”用于描述本發(fā)明的自身蛋白、自身多肽或自身肽時(shí)是指這些自身蛋白、自身多肽或自身肽在動(dòng)物體內(nèi)偏離或脫離了其正常的功能或過程。當(dāng)指自身蛋白、自身多肽或自身肽“與疾病相關(guān)”或“參與疾病”時(shí)是指自身蛋白、自身多肽或自身肽可在形式上或結(jié)構(gòu)上加以修飾以使其不能再發(fā)揮其生理功能或參與生理過程；或者是指自身蛋白、自身多肽或自身肽通過誘導(dǎo)病理生理狀態(tài)、介導(dǎo)或促進(jìn)病理生理過程、和/或稱為病理生理過程的靶位來參與到疾病的病理生理過程中。例如，對(duì)于自身免疫性疾病來說，免疫系統(tǒng)異常攻擊自身分子，如自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白，引起表達(dá)和/或存在自身分子的細(xì)胞和組織損傷或功能障礙。另外，分子本身也可以非生理水平和/或以非生理功能表達(dá)。例如，在神經(jīng)變性疾病中，自身蛋白異常表達(dá)，聚集在腦的病變部位，從而引起神經(jīng)功能障礙。在其他情況下，自身分子可使病理狀態(tài)或過程惡化。例如在骨關(guān)節(jié)炎中，自身蛋白包括膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶異常地降解覆蓋在關(guān)節(jié)面上的關(guān)節(jié)軟骨。自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白的翻譯后修飾包括糖基化、添加脂質(zhì)基團(tuán)、被磷酸酶去磷酸化、添加二甲基精氨酸殘基、聚絲蛋白(fillagrin)和纖維蛋白被肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD)瓜氨酸化；αB-晶體蛋白磷酸化；MBP瓜氨酸化；級(jí)聯(lián)酶和粒酶蛋白水解SLE自身抗原。在免疫學(xué)上，自身蛋白、自身多肽或自身肽都被認(rèn)為是宿主的自身抗原，在正常的生理?xiàng)l件下，宿主免疫系統(tǒng)通過消除、滅活或失活能識(shí)別自身抗原的免疫細(xì)胞，經(jīng)過一個(gè)被稱為“免疫耐受”的過程來忽略自身抗原。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞為了調(diào)節(jié)免疫功能而生理性、特異性以及專一性表達(dá)的免疫蛋白、免疫多肽或免疫肽。免疫系統(tǒng)是一種防衛(wèi)機(jī)制，在動(dòng)物世界棲息的難以計(jì)數(shù)的致病性微生物入侵時(shí)提供快速的、高度特異性的保護(hù)反應(yīng)。免疫蛋白、免疫多肽或免疫肽包括T細(xì)胞受體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子如I型白細(xì)胞介素和II型細(xì)胞因子，其中包括干擾素和IL-10、TNF-α、淋巴毒素，趨化因子如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α和β、單核細(xì)胞趨化蛋白和RANTES，以及其他直接參與免疫功能的分子如Fas配基。某些免疫蛋白、免疫多肽或免疫肽也包括在本發(fā)明的自身蛋白、自身多肽或自身肽之中，其中包括MHC I類膜糖蛋白、MHC II類糖蛋白和骨橋接素。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括受試者完全缺乏或?qū)嵸|(zhì)缺乏的蛋白、多肽和肽，這些蛋白、多肽和肽的缺乏是由于先天性或獲得性缺陷所引起的代謝或功能障礙而導(dǎo)致的，并且可以通過給予所述的蛋白、多肽或肽，或者通過給予編碼所述的蛋白、多肽或肽的核酸(基因治療)來替代。這種障礙的例子包括杜興肌營養(yǎng)不良、貝克肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、苯丙酮酸尿癥、半乳糖血癥、楓糖尿病和高胱氨酸尿癥。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括具有能將其自身與其正常伙伴區(qū)別開來的特征的細(xì)胞所特異性和專一性表達(dá)的蛋白、多肽和肽，這些特征包括(1)克隆性，即具有異常突變的單個(gè)細(xì)胞可以增殖形成一個(gè)惡性細(xì)胞的克隆，(2)自主性，即其生長不能被適當(dāng)調(diào)節(jié)，以及(3)間變性或缺乏正常細(xì)胞協(xié)調(diào)分化的能力。具有上述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞被稱為腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞或惡性細(xì)胞。
“質(zhì)?！焙汀拜d體”的命名規(guī)則是小寫字母p加上字母和/或數(shù)字。起始質(zhì)?？梢再徺I或從無限制的公共資源中獲得，或者按照公開的方法從已有的質(zhì)粒開始構(gòu)建。另外，與已描述的質(zhì)粒等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域所熟知的，其構(gòu)建方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的?！拜d體”或“質(zhì)?！笔侵竿ㄟ^添加適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的任何基因元件。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明所用的載體或質(zhì)粒包括而不限于質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒等。
“裸核酸”用于本文中是指不被包裹(如包裹在病毒顆粒、細(xì)菌或脂質(zhì)體內(nèi))并且不與結(jié)合核酸的分子(如二乙氨乙基右旋糖酐)形成復(fù)合物，也不與其他的核酸相連接(如金屬顆?；蚨嗵侵С治?的核酸分子。
疾病或病癥的“治療”是指減緩、終止或反轉(zhuǎn)已發(fā)生疾病的進(jìn)展，其表現(xiàn)為通過給予本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)核酸使臨床癥狀或診斷癥狀減輕、終止或消除?！耙寻l(fā)生疾病”是指免疫系統(tǒng)被活化，導(dǎo)致受影響組織發(fā)生炎癥，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞異常浸潤。疾病或病癥的“治療”還指通過聯(lián)合給予免疫調(diào)節(jié)核酸和自身分子減緩、終止或反轉(zhuǎn)已發(fā)生疾病的進(jìn)展。本文所用的術(shù)語“自身分子”是指自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。疾病或病癥的“治療”還指通過聯(lián)合給予免疫調(diào)節(jié)核酸和免疫調(diào)節(jié)藥物減緩、終止或反轉(zhuǎn)已發(fā)生疾病的進(jìn)展。當(dāng)“聯(lián)合給予”用于包含免疫調(diào)節(jié)核酸和其他化合物如編碼自身蛋白、自身肽或自身多肽的DNA的治療方案時(shí)，是指兩種或多種化合物分開給藥，但是這些化合物被裝入一個(gè)容器內(nèi)一起給藥，通過連接物連接在一起，被一個(gè)或多個(gè)載體內(nèi)的DNA編碼，或者在不同的部位分別注射但是不同注射的間隔時(shí)間很短以至于本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為是聯(lián)合給藥。在本文中，改善疾病和治療疾病的意義是一樣的。
本發(fā)明中所用的術(shù)語疾病的“預(yù)防”是指免疫調(diào)節(jié)序列單獨(dú)或者和本文所描述的化合物一起給藥以防止疾病或病癥、疾病或病癥的某些或全部癥狀的發(fā)生或起始，或者降低疾病或病癥起始的可能性。本發(fā)明中所用的術(shù)語疾病的“預(yù)防”還指免疫調(diào)節(jié)序列和自身分子一起給藥以防止疾病或病癥、疾病或病癥的某些或全部癥狀的發(fā)生或起始，或者降低疾病或病癥起始的可能性。本發(fā)明中所用的術(shù)語疾病的“預(yù)防”還指免疫調(diào)節(jié)序列和免疫調(diào)節(jié)藥物一起給藥以防止疾病或病癥、疾病或病癥的某些或全部癥狀的發(fā)生或起始，或者降低疾病或病癥起始的可能性?！懊庖哒{(diào)節(jié)藥物”用于本文中是指當(dāng)給予受試者時(shí)能夠產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能的分子。這種免疫調(diào)節(jié)藥物包括細(xì)胞因子、趨化因子、類固醇激素、抗原或自身抗原的抗體。
“受試者”可指任何動(dòng)物，如人、非人靈長類動(dòng)物、馬、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
自身免疫性疾病本所描述的組合物和方法可用于治療或預(yù)防自身免疫性疾病。與自身分子包括處于非生理狀態(tài)的動(dòng)物體內(nèi)存在的自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白、或自身分子的衍生物相關(guān)的自身免疫性疾病的幾個(gè)例子列于下表中，并將在下文中描述。
表1
多發(fā)性硬化癥多發(fā)性硬化癥(MS)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)脫髓鞘疾病，在美國有350,000人患病，全球患病人數(shù)有一百萬。開始出現(xiàn)癥狀的年齡一般在20到40之間，癥狀為急性或亞急性雙側(cè)視覺損傷、肌無力、感覺異常、共濟(jì)失調(diào)、眩暈、尿失禁、發(fā)音困難或智力障礙(發(fā)作頻率逐漸增加)。這些癥狀是由于局部脫髓鞘導(dǎo)致軸突傳導(dǎo)緩慢引起負(fù)傳導(dǎo)異常，同時(shí)異位脈沖產(chǎn)生引起正傳導(dǎo)異常(如Lhermitte癥狀)而造成的。MS的診斷需要根據(jù)病史如至少兩次間隔一段時(shí)間的神經(jīng)功能障礙的明顯發(fā)作，神經(jīng)功能障礙產(chǎn)生客觀的臨床癥狀和CNS白質(zhì)內(nèi)有不同區(qū)域受影響這些因素來確定。實(shí)驗(yàn)室研究也提供了一些其他的客觀證據(jù)支持對(duì)MS的診斷，其中包括CNS白質(zhì)損傷區(qū)域的磁共振成像(MRI)、腦脊髓液(CSF)內(nèi)的IgG寡克隆條帶以及異常喚起反應(yīng)。雖然大多數(shù)受試者會(huì)經(jīng)歷逐漸惡化的復(fù)發(fā)-緩解過程，但是不同個(gè)體之間MS的臨床過程差異很大，有的受試者在一生中可能只出現(xiàn)幾次溫和的發(fā)作，而有些受試者的癥狀可能不斷惡化并且會(huì)不時(shí)發(fā)作。能分泌IFNγ的髓鞘自身反應(yīng)性T細(xì)胞數(shù)量的增加被認(rèn)為與MS和EAE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性炎性滑膜炎，在全球整個(gè)人群中的患病率為0.8％。其特征是慢性炎性滑膜炎導(dǎo)致侵蝕性的關(guān)節(jié)損傷。RA是由T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的。
證明T細(xì)胞在RA中扮演關(guān)鍵角色的證據(jù)包括(1)滑膜內(nèi)浸潤有大量的CD4+T細(xì)胞，(2)利用藥物如環(huán)孢菌素抑制T細(xì)胞的功能可改善臨床癥狀，以及(3)RA與某些HLA-DR等位基因相關(guān)。與RA相關(guān)的HLA-DR等位基因β鏈的第三高變區(qū)67-74位置上有一個(gè)類似的氨基酸序列，參與肽的結(jié)合和向T細(xì)胞的呈遞。RA是由能識(shí)別自身分子如存在于宿主關(guān)節(jié)滑膜或其他部位的自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白、或未分類的自身生物分子的自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的。本發(fā)明的自身蛋白、自身多肽或自身肽還指RA內(nèi)作為靶位自身抗原，其中含有II型膠原；hnRNP；A2/RA33；Sa；中間絲相關(guān)蛋白；角蛋白；瓜氨酸；軟骨蛋白包括gp39；I、III、IV、V、IX、XI型膠原；HSP-65/60；IgM(類風(fēng)濕因子)；RNA聚合酶；hnRNP-Bl；hnRNP-D；心肌磷脂；醛縮酶A；瓜氨酸修飾的中間絲相關(guān)蛋白和纖維蛋白來源的表位。在大部分RA受試者的血清中都檢測(cè)到了能識(shí)別精氨酸殘基被修飾的中間絲相關(guān)蛋白(脫亞胺基形成瓜氨酸)的自身抗體。在某些受試者體內(nèi)含有直接抗同種免疫優(yōu)勢(shì)II型膠原(CII)肽257-270的自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)。
胰島素依賴型糖尿病人I型或胰島素依賴型糖尿病(IDMM)的特征是胰島β細(xì)胞因?yàn)樽陨砻庖叻磻?yīng)而被毀壞。B細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致無法調(diào)節(jié)血糖水平。當(dāng)血液中的葡萄糖濃度超過某個(gè)特定水平，通常是約250mg/dl時(shí)就會(huì)出現(xiàn)明顯的糖尿病癥狀。在這個(gè)期間胰島β細(xì)胞的功能不斷丟失。出現(xiàn)抗胰島素、谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗體就預(yù)示著疾病在惡化，這些蛋白都是本發(fā)明所包括的自身蛋白、自身多肽或自身肽的例子。
在出現(xiàn)癥狀前用于評(píng)價(jià)疾病的指標(biāo)有胰腺胰島素炎的出現(xiàn)、胰島細(xì)胞抗體的水平、胰島細(xì)胞表面抗體、胰島β細(xì)胞上MHC II類分子的異常表達(dá)、血糖濃度以及胰島素在血漿內(nèi)的濃度。胰腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞數(shù)量增多、胰島細(xì)胞抗體和血糖水平上升、以及胰島素濃度下降是糖尿病的象征。
非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠動(dòng)物模型具有多種與人IDDM相似的臨床、免疫性和組織病理學(xué)特征。NOD小鼠可自發(fā)地出現(xiàn)胰島的炎癥和β細(xì)胞的毀壞，導(dǎo)致高血糖和明顯的糖尿病癥狀。CD4+和CD8+T細(xì)胞都是糖尿病進(jìn)展所需要的，雖然其作用機(jī)制還不清楚。試驗(yàn)證明在誘導(dǎo)耐受的情況下給予胰島素和GAD可預(yù)防疾病，對(duì)其他自身抗原的表達(dá)下調(diào)產(chǎn)生反應(yīng)。
人IDDM的治療目前所采取的方法是通過監(jiān)測(cè)血糖水平來指導(dǎo)重組胰島素的注射或通過胰島素泵注射重組胰島素。飲食控制和運(yùn)動(dòng)也有助于控制血糖水平。
自身免疫性色素層炎自身免疫性色素層炎是眼的自身免疫性疾病，據(jù)估計(jì)受試者人數(shù)可達(dá)400,000，在美國每年新發(fā)病例就有43,000例。目前對(duì)自身免疫性色素層炎的治療是用類固醇激素、免疫抑制劑如氨甲蝶呤和環(huán)孢菌素、靜脈注射免疫球蛋白和TNFα拮抗劑。
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性色素層炎(EAU)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其靶位為眼內(nèi)的視網(wǎng)膜、色素層及其相關(guān)組織。EAU的許多臨床癥狀和免疫學(xué)特征與人的自身免疫性色素層炎相似，可通過外周注射完全弗氏佐劑(CFA)乳化的色素層炎生成肽(uveitogenic peptide)來誘發(fā)。
人自身免疫性色素層炎所發(fā)生的自身免疫反應(yīng)的自身蛋白靶位包括S抗原、感光細(xì)胞間維生素A類結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫紅質(zhì)和恢復(fù)蛋白。
原發(fā)性膽汁性肝硬變?cè)l(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)是一種器官特異性的自身免疫性疾病，主要影響40-60歲的女性。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)這類人群中的發(fā)病率約為1/1000。PBC的特征是小的肝內(nèi)膽管上的肝內(nèi)膽道上皮細(xì)胞(IBEC)進(jìn)行性的毀壞(Nishio等，Semin Liver Dis，22291，2002)，導(dǎo)致膽汁的分泌被阻塞和干擾，最終引起肝硬化。與具有上皮組織/分泌系統(tǒng)損傷特征的自身免疫性疾病相關(guān)的其他疾病已有報(bào)道，其中包括Sjogren綜合征、CREST綜合征、自身免疫性甲狀腺疾病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
雌性SJL/J小鼠腹腔注射(i.p.)哺乳動(dòng)物PDC、誘導(dǎo)非化膿性的毀壞性膽管炎(NSDC)和產(chǎn)生AMA可制備出實(shí)驗(yàn)性自身免疫性膽管炎(EAC)小鼠模型(Jones，JCHnPathol，53813-21，2000)。MRL/lpr小鼠SLE模型也可以發(fā)展成PBC樣的疾病，其特征是產(chǎn)生出抗α酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的自身抗體。
其他自身免疫性疾病及其相關(guān)的自身蛋白、自身多肽或自身肽導(dǎo)致重癥肌無力的自身抗原包括乙酰膽堿受體內(nèi)的表位。參與尋常性天皰瘡的自身靶抗原包括橋粒核心糖蛋白-3。Sjogren綜合征抗原包括SSA(Ro)；SSB(La)和fodrin。參與尋常性天皰瘡的主要自身抗原包括橋粒核心糖蛋白-3。參與肌炎的自身抗原包括tRNA合成酶(如蘇氨酰、組氨酰、丙氨酰、異亮氨酰和甘氨酰tRNA合成酶)；Ku；Scl；SS-A；Ul-sn-核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku；以及SRP。參與硬皮病的自身抗原包括Scl-70；著絲粒蛋白；Ul-sn-核糖核蛋白和纖維蛋白。參與惡性貧血的自身抗原包括內(nèi)因子和胃H/K ATP酶的β亞單位。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的抗原表位包括DNA；磷脂；核抗原；Ul核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；鈣網(wǎng)蛋白；Grp78；Scl-70；組蛋白；Sm蛋白；絲氨酸-精氨酸剪切因子核染色質(zhì)等。Grave病的表位包括Na+/I-同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體；促甲狀腺激素受體；Tg和TPO。
其他疾病與處于非生理狀態(tài)的動(dòng)物體內(nèi)的自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)的其他疾病的例子列在了表中，并且在下文有進(jìn)一步的描述。
炎性疾病骨關(guān)節(jié)炎和退行性關(guān)節(jié)病60歲以上的人群中有30％的人受骨關(guān)節(jié)炎(OA)的影響，是最常見的人類關(guān)節(jié)疾病。骨關(guān)節(jié)炎代表了關(guān)節(jié)滑膜的退化和功能障礙，包括關(guān)節(jié)軟骨的斷裂。
軟骨主要由蛋白多糖和膠原組成，蛋白多糖提供硬度和抵抗載荷的能力，膠原提供對(duì)突然施壓的張力和抵抗力。軟骨細(xì)胞通過產(chǎn)生和分泌潛在的膠原酶、潛在的基質(zhì)降解因子、潛在的白明膠酶、組織纖維蛋白溶酶原激活質(zhì)和其他相關(guān)的酶來更新和重塑正常的軟骨，這些酶單獨(dú)或聯(lián)合在一起都是本發(fā)明所述的自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。軟骨細(xì)胞還產(chǎn)生幾種抑制因子，包括金屬蛋白酶(TEVIP)和纖溶酶原激活劑抑制因子(PAI-1)來抑制天然金屬蛋白酶、組織纖維蛋白溶酶原激活質(zhì)和其他酶的降解活性。這些降解酶和抑制因子單獨(dú)或聯(lián)合在一起都是本發(fā)明的自身蛋白、自身多肽或自身肽。這些酶和抑制因子協(xié)同作用來重塑和維持正常的軟骨。在OA中，這一過程的調(diào)節(jié)異常會(huì)導(dǎo)致軟骨退化和降解。大多數(shù)OA受試者都有不同程度的炎癥，包括關(guān)節(jié)發(fā)熱和腫脹。早期OA出現(xiàn)膠原纖維排列和大小的異常改變。金屬蛋白酶、組織蛋白酶、纖維蛋白溶酶和其他自身分子單獨(dú)或聯(lián)合在一起都是本發(fā)明的自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白，引起軟骨基質(zhì)明顯的丟失。開始時(shí)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白多糖增多，軟骨增厚，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨異常增厚。然后由于降解酶如膠原酶、基質(zhì)降解因子、白明膠酶、組織纖維蛋白溶酶原激活質(zhì)和其他相關(guān)酶的作用關(guān)節(jié)軟骨變薄軟化，這些酶單獨(dú)或聯(lián)合在一起都是自身分子，如本發(fā)明的自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。炎癥分子如IL-1、組織蛋白酶和纖維蛋白溶酶可單獨(dú)或與本發(fā)明的自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白一起促進(jìn)軟骨的降解和斷裂。變軟變薄的軟骨對(duì)機(jī)械壓力造成的損傷更敏感。這些因素導(dǎo)致關(guān)節(jié)表面斷裂和垂直裂口的形成(纖維顫動(dòng))。疾病后期軟骨表面形成侵蝕并且深入到骨。軟骨細(xì)胞開始時(shí)通過增殖形成簇，在疾病后期軟骨內(nèi)的細(xì)胞顯著減少。骨重塑和骨肥大是OA的典型特征。
目前治療OA的方法包括休息，物理治療加強(qiáng)支持關(guān)節(jié)的肌肉，支架和其他裝置穩(wěn)定關(guān)節(jié)，非甾體類抗炎藥物，對(duì)乙酰氨基酚和其他止痛藥物。在晚期OA，對(duì)一些日?；顒?dòng)來說至關(guān)重要的骨與骨之間的關(guān)節(jié)可進(jìn)行關(guān)節(jié)置換。
脊索損傷據(jù)估計(jì)目前在美國每年大約有11,000例新發(fā)脊索損傷病例(Stover等，Arch Phys MedRehabil，80，1365-71，1999)。脊索損傷完全恢復(fù)的很少，通常會(huì)造成不可逆的破壞性神經(jīng)殘疾。目前治療急性脊索損傷的方法包括損傷部位的機(jī)械固定，如通過手術(shù)，以及系統(tǒng)給予類固醇藥物。這些方法很少能夠減輕脊索損傷后出現(xiàn)的永久性癱瘓。慢性脊索損傷的治療主要集中在維持受試者的生活質(zhì)量，如止痛、緩解痙攣狀態(tài)和恢復(fù)膀胱功能。目前還無法解決神經(jīng)功能恢復(fù)的問題。在損傷后的急性期，炎癥反應(yīng)很明顯，脊髓損傷造成的腫脹是發(fā)病的主要原因。這種炎癥可通過服用大劑量的皮質(zhì)激素來控制。
移植物抗宿主病人類組織和器官移植的最大限制之一就是組織移植物被受體的免疫系統(tǒng)排斥。試驗(yàn)證實(shí)供體與受體之間MHC I類和II類分子(HLA-A、HLA-B和HLA-DR)等位基因之間匹配的程度越高，移植物存活的可能性就越大。移植物抗宿主病(GVHD)在接受含同種異體造血干細(xì)胞的移植物的受試者中可引起較高的發(fā)病率和死亡率，這部分是由于皮膚和其他靶器官的炎癥反應(yīng)。造血干細(xì)胞存在于骨髓移植物、干細(xì)胞移植物和其他移植物中。在接受HLA匹配的同胞的移植物的受試者中大約有50％會(huì)發(fā)生中度到重度的GVHD，而接受HLA不相匹配的移植物的受試者中GVHD的發(fā)病率更高。發(fā)生中度到重度GVHD的受試者中大約有1/3會(huì)死亡。供體移植物中的T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞攻擊表達(dá)其氨基酸序列發(fā)生變化的多肽的受體細(xì)胞，特別是人6號(hào)染色體上的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)基因復(fù)合體編碼的蛋白發(fā)生變化的細(xì)胞。對(duì)同種異體造血干細(xì)胞移植發(fā)生GVHD影響最大的蛋白是高度多態(tài)性(同種蛋白在不同人之間其氨基酸序列變化很大)的I類蛋白(HLA-A、-B和-C)和II類蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum，Nature 411385-389，2001)。即使供體和受體的MHC I類等位基因在血清學(xué)上相“匹配”，但是通過DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)也有30％的病例在等位基因水平是不相匹配的，這就是造成相匹配的供體-受體對(duì)也發(fā)生I類分子介導(dǎo)的GVHD的原因(Appelbaum，Nature，411，385-389，2001)。GVHD通常造成皮膚、小腸、肝臟、肺和胰腺的損傷?？捎闷べ|(zhì)激素、環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤和OKT3治療GVHD。
組織移植排斥組織移植物，包括肺、心、肝、腎、胰腺以及其他器官和組織的免疫排斥是由移植物受體抗被移植器官的免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的。同種異體移植器官含有的蛋白質(zhì)其氨基酸序列與移植受體的同種蛋白質(zhì)的氨基酸序列有所不同。由于供體器官的蛋白質(zhì)與受體的蛋白質(zhì)氨基酸序列有所不同，因此會(huì)在受體體內(nèi)激發(fā)抗被移植器官的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)包括先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)，并且伴隨靶器官的炎癥反應(yīng)。被移植器官被排斥是組織移植的主要并發(fā)癥和限制因素，可導(dǎo)致被移植器官在受體體內(nèi)壞死。由于排斥反應(yīng)而引起的慢性炎癥通常會(huì)導(dǎo)致被移植器官的功能障礙。目前治療移植排斥的方法是利用各種免疫抑制劑預(yù)防和抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生。這些藥物包括皮質(zhì)激素、環(huán)孢菌素A、Cellcept、FK-506和OKT3。
免疫調(diào)節(jié)核酶及其相關(guān)組合物在一個(gè)方面，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)核酸含有下列核心六聚體5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’其中X和Y是天然產(chǎn)生的或合成的任意核苷酸，但是X和Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。
IMS的核心六聚體在本文中是指含二核苷酸基序的免疫調(diào)節(jié)序列，其5’和/或3’可以是任意組合物或任意數(shù)量的核苷酸或核苷。免疫調(diào)節(jié)核酸所包含的免疫調(diào)節(jié)基序優(yōu)選6到100個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸，最優(yōu)選的是16-50個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸。免疫調(diào)節(jié)序列還可以作為含100到100,000個(gè)堿基對(duì)的大片段DNA的一部分。IMS可被插入到DNA質(zhì)粒、病毒載體和基因組DNA中，或者是其中的一部分。免疫調(diào)節(jié)核酸的長度范圍為6到10,000個(gè)堿基對(duì)或者更長。六聚體核心兩側(cè)的序列可以加以構(gòu)建以使其與已知的免疫調(diào)節(jié)序列兩側(cè)的序列相匹配。例如，具有序列TGACTGTG-嘌呤-嘧啶-X-Y-嘧啶-嘧啶-AGAGATGA的IMS含有側(cè)翼序列TGACTGTG和AGAGATGA。其他優(yōu)選的側(cè)翼序列摻有一系列嘧啶核苷酸(C、T和U)，或者是單個(gè)嘧啶核苷酸重復(fù)2次或多次，或者是2個(gè)或多個(gè)不同嘧啶核苷酸混合物。抑制性調(diào)節(jié)序列可用不同側(cè)翼序列來檢測(cè)。抑制性核酸側(cè)翼序列的其他例子見如下的參考文獻(xiàn)美國專利Nos.6,225,292和6,339,068；Zeuner等，Arthritis and Rheumatism，462219-24，2002。
本發(fā)明的特定IMS含有如下六聚體序列1.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含有GG二核苷酸核心GTGGTT、ATGGTT、GCGGTT、ACGGTT、GTGGCT、ATGGCT、GCGGCT、ACGGCT、GTGGTC、ATGGTC、GCGGTC、ACGGTC等；2.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含有GC二核苷酸核心GTGCTT、ATGCTT、GCGCTT、ACGCTT、GTGCCT、ATGCCT、GCGCCT、ACGCCT、GTGCTC、ATGCTC、GCGCTC、ACGCTC等；3.鳥嘌呤核苷酸和肌苷替代腺嘌呤核苷酸和/或鳥嘧啶核苷酸替代胞嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸，這些替代可按照上述的指導(dǎo)原則來進(jìn)行。
上面所描述的免疫抑制序列或IIS能夠抑制含核心二核苷酸CpG的免疫刺激序列(ISS)的活性，美國專利6,225,292。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)在無ISS的情況下這種IIS可單獨(dú)或與DNA多核苷酸一起預(yù)防和治療自身免疫性疾病。這種IIS含有帶序列AAGGTT的核心六聚體區(qū)。那種序列在本文中是指免疫調(diào)節(jié)序列或IMS。具有與本發(fā)明的IMS相似的基序的其他相關(guān)IIS有1.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GG二核苷酸核心GGGGTT、AGGGTT、GAGGTT、AAGGTT、GGGGCT、AGGGCT、GAGGCT、AAGGCT、GGGGTC、AGGGTC、GAGGTC、AAGGTC等；2.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GC二核苷酸核心GGGCTT、AGGCTT、GAGCTT、AAGCTT、GGGCCT、AGGCCT、GAGCCT、AAGCCT、GGGCTC、AGGCTC、GAGCTC、AAGCTC等；3.鳥嘌呤核苷酸和肌苷替代腺嘌呤核苷酸和/或鳥嘧啶核苷酸替代胞嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸，這些替代可按照上述的指導(dǎo)原則來進(jìn)行。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，IMS的核心六聚體區(qū)的5’端或3’端，或者是兩端有聚鳥苷酸區(qū)。“聚鳥苷酸區(qū)”或“聚鳥苷酸基序”用于本文中是指至少由兩個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基組成的核酸區(qū)，通常是2到30或2到20個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基。在某些實(shí)施方式中，聚鳥苷酸區(qū)含有2到10個(gè)、4到10個(gè)、或4到8個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基，在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，側(cè)翼聚鳥苷酸區(qū)與核心六聚體相連接。在其他的實(shí)施方式中，聚鳥苷酸區(qū)通過一個(gè)非聚鳥苷酸區(qū)(非聚鳥苷酸連接子)與核心六聚體相連；一般來說，非聚鳥苷酸連接子的長度不超過6個(gè)核苷酸，更常見的是不超過4個(gè)，最常見的是不超過2個(gè)核苷酸。
免疫調(diào)節(jié)核酸可從已有的核酸資源中獲得，如基因組DNA、病毒DNA和cDNA。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸是通過寡核苷酸合成技術(shù)合成的寡核苷酸。IMS可以是單鏈或雙鏈DNA、RNA和/或寡核苷酸的一部分。
免疫調(diào)節(jié)核酸優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)IMS區(qū)的核酸，其中的IMS含有未甲基化的GpG寡核苷酸。在其他的實(shí)施方式中，IMS區(qū)的一個(gè)或多個(gè)腺嘌呤或胞嘧啶殘基是甲基化的，對(duì)于真核細(xì)胞來說，胞嘧啶殘基和腺嘌呤殘基通常都是被甲基化的。
免疫調(diào)節(jié)核酸可以是經(jīng)過穩(wěn)定化處理和/或未經(jīng)過穩(wěn)定化處理的寡核苷酸。經(jīng)過穩(wěn)定化處理的寡核苷酸意味著寡核苷酸對(duì)體內(nèi)的外切核酸酶、內(nèi)切核酸酶和其他降解途徑的降解是耐受的。優(yōu)選的經(jīng)穩(wěn)定化處理的寡核苷酸含有被修飾的磷酸骨架，最優(yōu)選的寡核苷酸含有硫代磷酸酯化的磷酸骨架，其中至少有一個(gè)磷酸氧被硫取代。骨架上的磷酸基團(tuán)被修飾，包括甲基磷酸化，硫代磷酸酯化、氨基磷酸酯化和二硫代磷酸酯化內(nèi)核苷酸連接可為BVIS提供抗微生物特性。免疫調(diào)節(jié)核酸優(yōu)選經(jīng)過穩(wěn)定化處理的寡核苷酸，最好通過硫代磷酸酯化對(duì)寡核苷酸進(jìn)行穩(wěn)定化處理。
其他穩(wěn)定化處理寡核苷酸的方法包括烷基磷酸三酯化和磷酸二酯化，其中帶正電荷的氧是烷基化的；芳基磷酸化和烷基磷酸化，這是非離子型的DNA類似物，其中帶正電荷的磷酸氧被芳基或烷基取代；或/和在一個(gè)或兩個(gè)末端帶有六乙二醇或四乙二醇或其他二醇的寡核苷酸。其他steric結(jié)構(gòu)可用于將糖基連接到IMS區(qū)的核苷堿基上。
兩側(cè)為修飾二核苷酸的IMS區(qū)的核苷酸堿基可以是已知的天然堿基，也可以是合成的非天然堿基?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)將寡核苷酸插入到IMS-ON的內(nèi)部和/或兩端作為連接點(diǎn)，即作為連接或粘附其他分子如化合物，其中包括自身分子的方式，或作為添加其他免疫調(diào)節(jié)因子的連接點(diǎn)。EVIS-ON的堿基、糖基、磷酸基和末端還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法加以修飾以構(gòu)建出具有除調(diào)節(jié)活性之外的其他特性的EVIS-ON。例如，可將糖基連接到任何steric構(gòu)型的EVIS-ON的核苷酸堿基上。
修飾寡核苷酸的磷酸基團(tuán)的方法是本領(lǐng)域所熟知的，因此不需要進(jìn)行詳細(xì)的解釋。其中一種適用的技術(shù)是對(duì)靶寡核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行中間磷酸三酯化，然后在碘水溶液或其他試劑如無水胺中氧化成天然的磷酸二酯。所得到的寡核苷酸氨基磷酸酯用硫處理生成硫代磷酸酯?？捎门c此相似的技術(shù)(硫處理步驟出外)將甲基磷酸酯制備成甲基氨基磷酸酯。要了解磷酸基團(tuán)修飾技術(shù)的細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參考美國專利Nos.4,425,732；4,458,066；5,218,103和5,453,496，以及Tetrahedron，Lett，214149 25(1995)，75575(1986)，251437(1984)和Journal Am.ChemSoc，936657(1987)，這些文獻(xiàn)披露的內(nèi)容都已納入本文用于說明本領(lǐng)域有關(guān)免疫調(diào)節(jié)核酸的組合物和制備方法的技術(shù)水平。
一種特別有用的磷酸基團(tuán)修飾方法是將EVIS-ON寡核苷酸轉(zhuǎn)化成硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯形式的寡核苷酸比其未修飾的形式更耐受體內(nèi)的降解，因此本發(fā)明的EVIS-ON更適合宿主。
EVIS-ON可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和核酸合成設(shè)備來合成。這方面的參考文獻(xiàn)有Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，第2章和第4章(WileyInterscience，1989)；Maniatis等，Molecular CloningALaboratory Manual(ColdSpring Harbor Lab.，New York，1982)；美國專利No.4,458,066和No.4,650,675。這些文獻(xiàn)都已被納入本文中用于說明本領(lǐng)域制備合成的寡核苷酸的水平。
另外，EVIS-ON還可以通過突變游離的微生物ISS-ODN來獲得，其中的突變是用競(jìng)爭(zhēng)性的二核苷酸來替代天然的CpG基序和側(cè)翼核苷酸。通過核酸雜交技術(shù)進(jìn)行篩選有可能從任何生物中分離出任何多核苷酸序列，只要有合適的探針或抗體。如果需要研究一種蛋白，則可以通過化學(xué)合成方法合成編碼該蛋白的部分核酸序列相應(yīng)的寡核苷酸探針。但是這需要事先知道該蛋白氨基酸序列的一段短的寡肽組成。編碼蛋白質(zhì)的DNA序列也可以根據(jù)遺傳密碼規(guī)則推測(cè)出來，但是需要考慮密碼子的簡(jiǎn)并性。
例如，可以篩選懷疑含有攜帶ISS的多核苷酸的cDNA文庫，篩選過程如下將cDNA來源的各種mRNA注射到卵母細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)足夠的時(shí)間使cDNA基因產(chǎn)物得以表達(dá)，然后檢測(cè)目的cDNA表達(dá)產(chǎn)物是否存在，例如用目的多核苷酸編碼的肽的抗體，或者用探針檢測(cè)目的多核苷酸編碼的肽的重復(fù)基序和組織表達(dá)模式特征。另外，還可以間接篩選cDNA文庫來分析目的肽的表達(dá)，其中的肽至少含有一個(gè)表位，篩選所用的是該表位的特異性抗體。這種抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，用于檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物來判斷目的cDNA是否存在。
一旦獲得了含ISS的多核苷酸就可以利用常規(guī)技術(shù)通過酶消化方法將其剪切到所需要的長度。然后突變ISS-ODN寡核苷酸產(chǎn)物內(nèi)的CpG基序，取代成“抑制性”的二核苷酸，這種抑制性的二核苷酸是用本發(fā)明的方法鑒定的。在已知序列的DNA的特定位點(diǎn)上進(jìn)行替代突變的方法是本領(lǐng)域熟知的，如通過PCR進(jìn)行M13引物突變。由于IMS是非編碼序列，因此在進(jìn)行替代突變時(shí)不需要考慮如何維持開放閱讀框架的問題。但是，當(dāng)用于體內(nèi)時(shí)，ISS-ODN寡核酸中間體或IMS突變產(chǎn)物應(yīng)該是相當(dāng)純的(即無天然污染物和LPS，利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員的選擇可以做到這一點(diǎn))。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)序列可以包含獨(dú)立的DVIS，DVIS也可以順式或反式的方式和其他核酸區(qū)一起插入到重組自身載體(質(zhì)粒，粘粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)內(nèi)，這些重組表達(dá)載體可以編碼任何自身蛋白、自身多肽或自身肽。在某些實(shí)施方式中，EVIS不需要插入到載體內(nèi)就可以直接注射。而在另外一些實(shí)施方式中，EVIS被插入到載體如表達(dá)載體內(nèi)，這可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)來完成(見Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，同上)。
例如，構(gòu)建重組表達(dá)載體可以利用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)。為了確定所構(gòu)建的載體內(nèi)的序列是正確的，可以將連接混合物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過適當(dāng)?shù)目股啬退幮詠砗Y選成功的轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中提取載體，利用限制性內(nèi)切酶消化和/或測(cè)序來分析所提取的載體，如Messing等，Nucleic Acids Res.，9309，1981描述的方法，Maxam等，Methods in Enzymology，65499，1980描述的方法，或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他適宜方法。利用常規(guī)的凝膠電泳技術(shù)根據(jù)裂解片段的大小來分開裂解的片段。見Maniatis等，Molecular Cloning，133-134頁，1982的描述。
宿主細(xì)胞可用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，然后用常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中的培養(yǎng)基可加以適當(dāng)調(diào)整以誘導(dǎo)啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等都是宿主細(xì)胞以前篩選表達(dá)時(shí)所用的，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
如果用重組載體作為本發(fā)明的EVIS-ON的載體，質(zhì)粒和粘粒是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儧]有致病性。但是，質(zhì)粒和粘粒在體內(nèi)的降解速度比病毒快，因此不適于傳遞適當(dāng)劑量的EVIS-ON來預(yù)防或治療炎性疾病或自身免疫性疾病。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種核酸載體，其中結(jié)構(gòu)式5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’中的一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸被非CpG二核苷酸替代，這樣載體的IIS相關(guān)的免疫刺激活性下降。這種載體可用于使用免疫調(diào)節(jié)核酸的方法和/或使用編碼一個(gè)或多個(gè)自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身載體的方法。例如，CpG二核苷酸中的胞嘧啶可用鳥嘌呤替代，得到一個(gè)含結(jié)構(gòu)式5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’中的GpG基序的IMS區(qū)。胞嘧啶還可用其他任何非胞嘧啶核苷酸來替代。替代可用位點(diǎn)特異性突變技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。一般來說，被替代的CpG基序是那些定位在載體重要調(diào)控區(qū)(如啟動(dòng)子區(qū))外的CpG。另外，如果將位于表達(dá)載體的編碼區(qū)內(nèi)的CpG進(jìn)行非胞嘧啶替代，則一般是為了產(chǎn)生靜默突變，或者生成編碼氨基酸保守替代相應(yīng)的密碼子。
例如，在某些實(shí)施方式中，提供了經(jīng)改造的pVAX1載體，其中通式5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸通過用非胞嘧啶核苷酸替代CpG二核苷酸中的胞嘧啶而被突變。PVAX1載體是本領(lǐng)域熟知的，可從Invitrogen(Carlsbad，CA)購買到。在一個(gè)典型的實(shí)施方式中，經(jīng)改造的pVAX1載體在CpG基序內(nèi)有如下的胞嘧啶到非胞嘧啶的替代在784、1161、1218和1966位核苷酸上胞嘧啶取代成鳥嘌呤；在1264、1337、1829、1874、1940和1997位核苷酸上胞嘧啶取代成腺嘌呤；以及在1963和1987位核苷酸上胞嘧啶取代成胸腺嘧啶；另外在1831、1876、1942和1999位核苷酸上也有胞嘧啶到鳥嘌呤的替代。(上述核苷酸位數(shù)是根據(jù)Invitrogen提供的pVAX1載體的計(jì)數(shù)系統(tǒng)來確定的)(見下面的實(shí)施例3)。
EVIS的功能特性有幾個(gè)機(jī)制可解釋EVIS的免疫調(diào)節(jié)特性，其中包括不依賴于ISS(CpG)介導(dǎo)的免疫刺激的機(jī)制。
“免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)或改變免疫反應(yīng)”用于本文中是指已有的或潛在的抗自身分子免疫反應(yīng)的任何變化，其中的自身分子包括而不限于作為給予免疫調(diào)節(jié)序列后的結(jié)果而產(chǎn)生的核酸、脂質(zhì)、磷脂、多糖、自身蛋白、自身多肽、自身肽、蛋白復(fù)合體、核糖核蛋白復(fù)合體或其衍生物。這種調(diào)節(jié)包括參與或能參與免疫反應(yīng)的任何免疫細(xì)胞存在與否、其活性或能力的改變。免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK T細(xì)胞、專職抗原呈遞細(xì)胞、非專職抗原呈遞細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及能參與或影響免疫反應(yīng)的其他任何細(xì)胞。調(diào)節(jié)還包括能對(duì)已發(fā)生的免疫反應(yīng)、正在發(fā)生的免疫反應(yīng)、潛在的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響的任何改變，或者誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)、影響或回應(yīng)免疫反應(yīng)的能力。調(diào)節(jié)還包括作為免疫反應(yīng)一部分的免疫細(xì)胞內(nèi)的基因、蛋白和/或其他分子表達(dá)和/或功能的改變。
免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)包括而不限于清除、缺失或隔離免疫細(xì)胞；誘導(dǎo)或產(chǎn)生能調(diào)節(jié)其他細(xì)胞如自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞、APC或炎癥細(xì)胞的功能活性的免疫細(xì)胞；誘導(dǎo)免疫細(xì)胞進(jìn)入未反應(yīng)狀態(tài)，術(shù)語稱為無反應(yīng)性；提高、降低或改變免疫細(xì)胞的功能或活性，或者提高、降低或改變其發(fā)揮活性或功能的能力，其中包括而不限于改變這些細(xì)胞所表達(dá)蛋白的表達(dá)模式。其中包括改變某類分子的產(chǎn)生和/或分泌，如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、共刺激分子或其他細(xì)胞表面受體；或者上述調(diào)節(jié)事件的任意組合。
免疫反應(yīng)的特征是輔助T細(xì)胞和免疫反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-2和IFN-γ，并且與產(chǎn)生某些同型抗體的(一般來說在鼠體內(nèi)為IgG1，在人體內(nèi)為IgG2和IgG4)B細(xì)胞有關(guān)。Th1型免疫反應(yīng)主要發(fā)生在自身免疫性疾病中，并且與自身免疫介導(dǎo)的組織損傷有關(guān)。而Th2型免疫反應(yīng)的特征是輔助T細(xì)胞和免疫反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-4和IL-10，并且與產(chǎn)生某些同型抗體的(一般來說在鼠體內(nèi)為IgG1，在人體內(nèi)為IgG2和IgG4)B細(xì)胞有關(guān)。Th2型免疫反應(yīng)在嚙齒類動(dòng)物和人的自身免疫中可產(chǎn)生抗自身免疫介導(dǎo)的組織損傷的保護(hù)作用。
免疫調(diào)節(jié)核酸可通過清除、隔離或反轉(zhuǎn)介導(dǎo)或能夠介導(dǎo)非期望免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞；誘導(dǎo)、產(chǎn)生或轉(zhuǎn)變成介導(dǎo)或能夠介導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞；改變免疫細(xì)胞的生理或功能特性(如抑制Th1型反應(yīng)和/或誘導(dǎo)Th2型反應(yīng))；或者上述效應(yīng)的結(jié)合來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的檢測(cè)方法包括而不限于檢測(cè)是否存在免疫細(xì)胞群(利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、組織學(xué)、電鏡、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；檢測(cè)免疫細(xì)胞的功能活性，包括受到刺激信號(hào)的刺激后能夠增殖或分裂，或者耐受刺激信號(hào)的刺激(如用抗CD3抗體、抗T細(xì)胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、PMA、載肽或蛋白抗原的抗原呈遞細(xì)胞刺激后根據(jù)3H胸腺嘧啶核苷摻入的情況進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn)和肽掃描分析；B細(xì)胞增殖試驗(yàn))；測(cè)定殺傷或溶解其他細(xì)胞的能力(如細(xì)胞毒T細(xì)胞試驗(yàn))；測(cè)定細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞表面分子、抗體和其他產(chǎn)物(流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡分析、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、免疫沉淀試驗(yàn))；測(cè)定免疫細(xì)胞活化后的生物化學(xué)標(biāo)記物或免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路分子(蛋白質(zhì)印跡雜交試驗(yàn)和免疫沉淀試驗(yàn)分析酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化、多肽的裂解和蛋白復(fù)合體的形成與解離、蛋白芯片分析、利用DNA芯片或消減雜交技術(shù)分析DNA的轉(zhuǎn)錄模式)；測(cè)定細(xì)胞由于調(diào)亡、壞死或其他機(jī)制造成的死亡(膜聯(lián)蛋白V染色、TUNEL分析、凝膠電泳測(cè)定DNA梯型、組織學(xué)檢測(cè)、熒光發(fā)生級(jí)聯(lián)分析、級(jí)聯(lián)反應(yīng)底物的蛋白質(zhì)印跡分析)；檢測(cè)免疫細(xì)胞表達(dá)的基因、蛋白質(zhì)和其他分子(RNA印跡雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片、二維電泳、蛋白質(zhì)印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù))；以及觀察臨床結(jié)果如自身免疫性疾病、神經(jīng)變性性疾病和其他疾病癥狀的改善(臨床評(píng)分、是否需要其他治療措施、功能狀態(tài)、影像學(xué)檢查)。
另外一些研究者進(jìn)行了一些試驗(yàn)來評(píng)價(jià)IIS的作用機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明中和性或抑制性IIS(GpG)基序可阻斷ISS(CpG)的免疫刺激作用(Krieg等，PNAS，9512631，1998；美國專利6,225,292和6,339,068)。這些試驗(yàn)中的IIS被用于接觸、抑制、競(jìng)爭(zhēng)或克服ISS的效應(yīng)(來源于細(xì)菌、病毒、寄生蟲和外源DNA，如DNA疫苗或基因治療所用的DNA)。ISS和IIS可進(jìn)入同一細(xì)胞內(nèi)，說明在同一細(xì)胞內(nèi)IIS通過相同機(jī)制與ISS直接競(jìng)爭(zhēng)來抑制ISS(Yamada等，J.Immunolgyy，2002，1695590)。
給藥方法免疫調(diào)節(jié)分子可制備成含藥學(xué)上可接受的載體的組合物?？膳c本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)核酸一起使用的優(yōu)選藥學(xué)上可接受的載體包括水性溶液或非水性溶液、懸液和乳化液。非水性溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、蔬菜油如橄欖油、以及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、乙醇水溶液、乳化液或懸液，其中包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外途徑給藥的載體包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉溶液、乳酸鹽林格溶液或脂肪油。靜脈注射用載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電介質(zhì)補(bǔ)充劑(如以林格葡萄糖為基礎(chǔ)制成的補(bǔ)充劑)等。還可以添加防腐劑和其他添加劑，如抗生素、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。免疫調(diào)節(jié)核酸還可以用本領(lǐng)域熟知的方法凍干以便于隨后按照本發(fā)明的方法重新恢復(fù)和使用。免疫調(diào)節(jié)序列還可以混合到藥物組合物中，組合物中含有多拷貝的單一IMS、不同DVIS的混合物、等摩爾濃度的不同DVIS的混合物、不同摩爾濃度的EVIS混合物、或單一的和/或不同的EVIS，其中EVIS插入到重組表達(dá)載體內(nèi)，如質(zhì)粒、線性多核苷酸、病毒和病毒載體、細(xì)菌和其他活的、滅活的或合成的含寡核苷酸的組合物。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)序列可制備成藥用鹽的形式。免疫調(diào)節(jié)核苷酸可用無毒的無機(jī)或有機(jī)堿制備。有機(jī)堿鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鋅鹽、鈣鹽、鋁鹽、鎂鹽等。有機(jī)無毒堿包括伯、仲、叔胺的鹽。這種免疫調(diào)節(jié)核酸可制成凍干的形式以便于在使用前重新恢復(fù)，如用無菌水或鹽溶液溶解。另外，免疫調(diào)節(jié)序列可用水性載體或油性載體制備成溶液、懸液或乳化液以便于轉(zhuǎn)移。免疫調(diào)節(jié)序列可凍干，然后在使用前用無菌水溶解。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，現(xiàn)在有很多方法可用于將核酸轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸以裸核酸的形式給藥。例如，在某些實(shí)施方式中，使用前裸核酸與病毒顆粒(如腺病毒顆粒，見Curiel等，Am.J.Respir.CellMol.Biol，6247-52，1992，同上)混合成含病毒顆粒的制劑，其中的病毒顆粒并不包裹核酸但是可以促進(jìn)核酸的轉(zhuǎn)移。另外，在其他的實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸用分子包裹或者與分子結(jié)合形成復(fù)合物，如陽離子物質(zhì)(如DEAE右旋糖酐或陽離子脂質(zhì))。例如，脂質(zhì)體就是一種制備和轉(zhuǎn)移寡核苷酸和/或自身多核苷酸的有效載體。在其他特殊實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸被插入到病毒載體、病毒顆?；蚣?xì)菌內(nèi)以便于藥理轉(zhuǎn)運(yùn)。病毒載體可以是具有完整感染性的，也可以是減毒的(經(jīng)突變后誘導(dǎo)疾病的能力下降)或復(fù)制缺陷型的。在其他的實(shí)施方式中，核酸與固相支持物相連接，如金顆粒、多糖支持物，或者可注射、吸入或顆粒打靶(彈道轉(zhuǎn)移)轉(zhuǎn)移的其他顆?；蛭⑶?。
轉(zhuǎn)移核酸制劑的方法是本領(lǐng)域熟知的。見美國專利Nos.5,399,346、5,580,859、5,589,466。現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出了多種病毒系統(tǒng)用于將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(美國專利No.5,219,740)；(Miller等，Biotechnipues，7980-990，1989)；(Miller，AD.，Human Gene Therapy，15-14，1990)；(Scarpa等，Virology，180849-852，1991)；(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908033-8037，1993)和(Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.，3102-109，1993)。文獻(xiàn)中還描述了多種腺病毒載體，見(Haj-Ahmad等，J.Virol，57267-27’4，1986)；(Bett等，J.Virol，675911-5921，1993)；(Mittereder等，Human Gene Therapy，5717-729，1994)；(Seth等，J.Virol，68933-940，1994)；(Ban等，Gene Therapy，151-58，1994)；(Berkner，K.L.，BioTechniques，6616-629，1988)和(Rich等，Human Gene Therapy，4461-476，1993)。腺相關(guān)病毒(AAV)載體系統(tǒng)也被開發(fā)出來用于轉(zhuǎn)移核酸。AAV載體利用本領(lǐng)域所熟知的方法很容易構(gòu)建。見美國專利Nos.5,173,414和5,139,941；國際專利WO 92/01070(
公開日為1992年1月23日)和WO 93/03769(
公開日為1993年4月4日)；(Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.83988-3996，1988)；(Vincent等，Vaccines，90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)1990)；(Carter，B.J.，Current Opinion inBiotechnology，3533-539，1992)；(Muzyczka，N.，Current Topicsin MicrobiotAnd Immunol.，15897-129，1992)；(Kotin，R.M.，Human Gene Therapy，5793-801，1994)；Shelling等，Gene Therapy，1165-169，1994)和(Zhouetf等，J.Exp.Med.，1791867-1875，1994)。
本發(fā)明的IMS不用載體也可以轉(zhuǎn)移。例如，在轉(zhuǎn)移前可將分子包裹在脂質(zhì)體內(nèi)。脂質(zhì)包裹通常是用能穩(wěn)定結(jié)合或納入并保留核酸的脂質(zhì)體。使用脂質(zhì)體作為載體轉(zhuǎn)移核酸的方法見如下文獻(xiàn)的描述(Hug等，Biochim.Biophys.Acta，10971-17，1991)；(Straubinger等，Methods of Enzymology，Vol.101，pp.512-527，1983)。例如，可用于本發(fā)明的脂質(zhì)體包括而不限于DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、膽固醇和CUDMEDA(N-(5-cholestrum-3-ol 3 urethanyl)-N’，N’-二甲基乙二胺)。例如，DNA可混合在含下列陽離子脂質(zhì)體的溶液中使用LipofectinTM(LTI/BRL)、TransfastTM(Promega Corp)、Tfx50TM(Promega Corp)、Tfx 10TM(Promega Corp)或Tfx20TM(Promega Corp)。
根據(jù)本發(fā)明的說明給予“治療有效量”的免疫調(diào)節(jié)核酸足以治療或預(yù)防疾病，比如疾病癥狀和/或病因的減輕或消失。例如，治療有效量落在一個(gè)很寬的范圍內(nèi)，可以通過臨床試驗(yàn)加以確定，對(duì)于特定病人來說，要根據(jù)普通臨床醫(yī)生所熟知的因素如疾病的嚴(yán)重程度、受試者的體重、年齡和其他因素來確定治療有效量。免疫調(diào)節(jié)核酸的治療有效量范圍約在0.001mg到1g之間。免疫調(diào)節(jié)核酸的優(yōu)選治療劑量約為5mg到1000mg之間。更優(yōu)選的范圍約為50到200mg。免疫調(diào)節(jié)核酸治療可以每天一次、隔天一次、每周兩次、每周一次、兩周一次或每月一次連續(xù)進(jìn)行。如果免疫調(diào)節(jié)核酸治療和編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸治療一起進(jìn)行，那么治療方案可以先執(zhí)行不同的時(shí)間，如6-12個(gè)月，然后再以維持劑量3-12個(gè)月治療一次。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度、受試者的年齡、使用的編碼自身蛋白、自身多肽、自身肽的寡核苷酸和/或多核苷酸以及普通醫(yī)師所考慮的其他因素，還可以采用其他治療方案。
在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸通過肌肉注射轉(zhuǎn)移。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸通過鼻內(nèi)吸入、口服、皮下注射、真皮內(nèi)注射、靜脈注射、皮膚加壓、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、粘膜給藥或者粘附到金顆粒上給藥，或者透過真皮給藥(見WO 97/46253)。另外，核酸還可以通過局部涂抹轉(zhuǎn)移到皮膚細(xì)胞內(nèi)，混合或不混合脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)(美國專利No.6,087,341)。另外一種給藥方法是將核酸制成可吸入的制劑。在聯(lián)合治療的情況下，免疫調(diào)節(jié)核酸和編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸可在同一部位或不同部位、同時(shí)或不同時(shí)給藥。
在給予免疫調(diào)節(jié)核酸前，給藥部位可用bupivicane、心臟毒素或其他藥物預(yù)處理以提高隨后進(jìn)行的多核苷酸的轉(zhuǎn)移效率。這種預(yù)處理一般在轉(zhuǎn)移多核苷酸前12到96小時(shí)進(jìn)行，優(yōu)選在轉(zhuǎn)移免疫調(diào)節(jié)核酸前24到48小時(shí)進(jìn)行。另外，在進(jìn)行IMS治療前也可以不進(jìn)行預(yù)處理。
免疫調(diào)節(jié)核酸和/或含有編碼自身蛋白、自身多肽、自身肽的多核苷酸的自身載體可以和其他物質(zhì)，如藥物、佐劑、細(xì)胞因子、自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白、DNA藥物一起給藥，或者和編碼細(xì)胞因子的載體一起給藥。
在其他的實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)核酸可以和其他的療法一起使用。這種療法包括和自身分子一起使用的免疫調(diào)節(jié)核酸，自身分子包括而不限于編碼自身分子的DNA，例如在多核苷酸治療的情況下(見公開號(hào)為20030148983的美國專利申請(qǐng))，或者和自身脂質(zhì)、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及經(jīng)過翻譯后修飾的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白，或用于治療自身免疫性疾病的其他治療性化合物一起使用的免疫調(diào)節(jié)核酸。
通過參考下面對(duì)說明性實(shí)施方式的描述可以對(duì)本發(fā)明有進(jìn)一步的了解。
實(shí)施例1確定前期研究的結(jié)果IMS可抑制ISS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化和預(yù)防實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦髓炎的發(fā)生利用一系列的試驗(yàn)來確證以前的研究結(jié)果，即IMS可抑制含ISS(CpG)的序列的刺激作用。這些試驗(yàn)如下所述已知刺激性CpG-ODN可活化脾來源的免疫細(xì)胞，其中包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞(見Krieg等，Nature，374546-549，1995；Yi等，J.Immunol，1575394-5402，1996；Klinman等，Proc Nat.Acad.Sci.USA，932879-2883，1996；Martin-Orozco等，Int.Immunol.，111111-1118，1999；Sparwasser等，Eur.J.Immunol，28-2045-2054，1998)。通過測(cè)定空白脾細(xì)胞的總體增殖情況來評(píng)價(jià)IMS的效應(yīng)。我們構(gòu)建了含單一5’-AACGTT-3’(CpG-ODN)或IMS 5’-AAGGTT-3’序列和硫代硫酸酯骨架以保護(hù)DNA免受核酸酶降解的22-mer寡核苷酸序列。為了確定添加IMS是否可以抵消刺激性CpG-ODN的效應(yīng)，分離的空白全脾細(xì)胞單獨(dú)用5μg/ml刺激性CpG-ODN培養(yǎng)，并用5μg/ml刺激性CpG-ODN和濃度逐漸增加的IMS培養(yǎng)。48小時(shí)后，加入1μg/ml IMS的全脾細(xì)胞增殖能力下降2倍，而加入5μg/ml和10μg/ml IMS的全脾細(xì)胞增殖能力下降3倍(圖1A)。
TLR-9已被證明可識(shí)別細(xì)菌DNA CpG基序(Hemmi等，Nature，408740-745，2000)。為了確定這種簡(jiǎn)單的C-G顛換是否可以改變其識(shí)別作用，從TLR-9野生型(WT)和TRL-9敲除型(KO)小鼠中分離出空白全脾細(xì)胞，用CpG-ODN、IMS和二者聯(lián)合培養(yǎng)。作為獨(dú)立的對(duì)照，加入脂多糖(LPS)以證明TLR-9 KO脾細(xì)胞依然能夠?qū)Ψ翘禺愋缘慕z裂原刺激作出反應(yīng)而發(fā)生增殖。加入刺激性CpG-ODN可誘導(dǎo)出很強(qiáng)的增殖反應(yīng)，但是加入IMS后這種增殖反應(yīng)被明顯抑制(圖1B)。與單獨(dú)的LPS刺激相比，用LPS和刺激性CpG-ODN聯(lián)合刺激可增強(qiáng)脾細(xì)胞的增殖能力。但是，即使加入LPS，IMS的調(diào)節(jié)效應(yīng)依然是顯著的。
由于TLR-9 KO脾細(xì)胞缺失TLR-9受體，因此與TLR-9野生型脾細(xì)胞相比，CpG-ODN對(duì)其的增殖刺激效應(yīng)消失。同樣，TLR-9 KO脾細(xì)胞對(duì)IMS的刺激也沒有反應(yīng)。如果將LPS加入到TLR-9 KO脾細(xì)胞培養(yǎng)基中，與TLR-9野生型脾細(xì)胞相比，IMS單獨(dú)或與刺激性CpG-ODN聯(lián)合都不能影響脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)。這說明IMS可能是通過TLR-9信號(hào)傳導(dǎo)途徑來抑制刺激性CpG-ODN的效應(yīng)。
TLR-9識(shí)別刺激性CpG-ODN后誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活，最后導(dǎo)致NF-κB活化(Krieg，Ann.Rev.Immunol.，20709-760，2002)。為了說明IMS對(duì)刺激性CpG-ODN的作用機(jī)制，研究了NF-κB對(duì)IκB-α在32位絲氨酸位點(diǎn)上發(fā)生磷酸化的影響。用如圖所示的寡核苷酸活化脾細(xì)胞，其提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以確定通過刺激性CpG-ODN的作用可使IκB-α在32位絲氨酸上發(fā)生磷酸化(圖1C，2道)。相應(yīng)的，IMS不能誘導(dǎo)IκB-α在32位絲氨酸上發(fā)生磷酸化(圖1C，3道)。令人感興趣的是，刺激性CpG-ODN和IMS聯(lián)合可導(dǎo)致IκB-α在32位絲氨酸上磷酸化水平的顯著下降(圖1C，5道)。這些結(jié)果說明IMS發(fā)揮作用的作用機(jī)制是與刺激性CpG-ODN競(jìng)爭(zhēng)TLR-9信號(hào)傳導(dǎo)途徑成分的識(shí)別與結(jié)合。
以前的研究表明CpG-ODN可增加MHC II類分子的表達(dá)水平(Martin-Orozco等，Int.Immunol，111111-1118，1999)。為了定量測(cè)定mhC II類分子mRNA的相對(duì)濃度，用定量PCR(QPCR)擴(kuò)增全脾細(xì)胞培養(yǎng)物純化出的RNA。信號(hào)強(qiáng)度根據(jù)β肌動(dòng)蛋白mRNA的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。與CpG-ODN孵育的脾細(xì)胞其MHC II類分子mRNA表達(dá)水平升高，而與IMS孵育的脾細(xì)胞沒有出現(xiàn)這種變化(圖2A)。通過熒光活化細(xì)胞掃描(FACScan)分析發(fā)現(xiàn)IMS可下調(diào)細(xì)胞表面MHC II類分子的表達(dá)。IMS可以劑量依賴的方式抑制刺激性CpG-ODN對(duì)細(xì)胞表面MHC II類分子表達(dá)的活化(圖2B)。
為了確定IMS是否可以抑制抗原呈遞細(xì)胞(APC)的活化，還檢測(cè)了APC的各種表面活化標(biāo)記分子?？瞻灼⒓?xì)胞與如圖所示濃度的抑制性、刺激性或無關(guān)對(duì)照寡核苷酸共孵育72小時(shí)，F(xiàn)ACScan分析表明IMS可以劑量依賴的方式抑制刺激性CpG-ODN誘導(dǎo)的細(xì)胞表面CD40(圖2C)、CD80(圖2D)和CD86(圖2E)的表達(dá)。與此相反的是，IMS可以劑量依賴的方式增加糖脂呈遞分子CD1d的表達(dá)(圖2F)。
為了全面了解免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響，從動(dòng)物體內(nèi)取出空白脾細(xì)胞，與如圖所示濃度的IMS、刺激性CpG-ODN或無關(guān)對(duì)照寡核苷酸共孵育72小時(shí)，結(jié)果表明單獨(dú)的IMS不能誘導(dǎo)IL-6(圖3A)和IL12p40(圖3B)的產(chǎn)生，但是與刺激性CpG-ODN聯(lián)合時(shí)卻可以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是一種Th1介導(dǎo)的多發(fā)性硬化癥動(dòng)物疾病模型。誘導(dǎo)EAE動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥可導(dǎo)致白質(zhì)炎癥性浸潤和脫髓鞘化而造成上行性麻痹。誘導(dǎo)EAE需要用髓鞘抗原或髓鞘肽加完全弗氏佐劑免疫動(dòng)物，弗氏佐劑中含有熱滅活的分支桿菌。
然后我們又研究了體內(nèi)注射IMS來預(yù)防EAE的方法。用含在CFA中的PLP139-151肽皮下注射免疫SJL/J小鼠，誘導(dǎo)EAE。同時(shí)腹腔注射單次劑量的如圖所示的寡核苷酸，其中寡核苷酸懸浮于磷酸鹽緩沖液中。結(jié)果表明與PBS和刺激性CpG-ODN相比，小鼠單次注射抑制性IMS就可以使疾病的嚴(yán)重程度全面減輕(圖4)。
實(shí)施例2在無ISS(CpG)的情況下，IMS可調(diào)節(jié)保護(hù)性Th2細(xì)胞、抑制自身免疫性Th1細(xì)胞、以及防止實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生。
因?yàn)樵囼?yàn)已經(jīng)證明IMS可抑制空白的非定向髓鞘特異性T細(xì)胞，因此我們進(jìn)一步研究了在存在或不存在CpG-ODN的情況下IMS對(duì)定向的Th1或Th2細(xì)胞是否有不同效應(yīng)。刺激性CpG-ODN促進(jìn)PLP139-151特異性Th1細(xì)胞系的增殖，而IMS抑制它的增殖(圖5A)。IMS和刺激性CpG-ODN聯(lián)合與單獨(dú)的CpG-ODN相比其促進(jìn)PLP139-151特異性Th1細(xì)胞系增殖的活性下降。
利用PLP139-151特異性Th2細(xì)胞系進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)。刺激性CpG-ODN可抑制PLP139-151特異性Th2細(xì)胞系的增殖(圖5B)。令人驚奇的是，IMS可促進(jìn)Th2細(xì)胞系的增殖。因此，CpG-ODN可作為PLP139-151特異性Th2細(xì)胞系的抑制因子，而單獨(dú)的IMS，即在沒有ISS的情況下，可調(diào)節(jié)PLP139-151特異性的Th2細(xì)胞?？傊@些未預(yù)料到的結(jié)果表明了本發(fā)明的IMS可抑制自身免疫性Th1細(xì)胞，增強(qiáng)Th2細(xì)胞的保護(hù)功能，并且不依賴于ISS-ODN(CpG)。
在用含在CFA中的PLP139-151誘導(dǎo)EAE前14天和7天給予SJL小鼠IMS。這種處理可在無任何ISS的情況下將IMS導(dǎo)入到免疫系統(tǒng)中達(dá)2周。與未處理組相比，用IMS處理小鼠可延遲發(fā)病時(shí)間，全面降低疾病的嚴(yán)重程度(圖6)。
實(shí)施例3利用GpG修飾的質(zhì)粒載體進(jìn)行多核苷酸治療基于IMS寡核苷酸的試驗(yàn)結(jié)果證明GpG序列有助于減輕疾病的嚴(yán)重程度、使自身反應(yīng)性T細(xì)胞群向Th2亞型轉(zhuǎn)變，因此我們構(gòu)建了一個(gè)在載體骨架內(nèi)插入有GpG序列的經(jīng)改造的載體。我們以pVAX1載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)為基礎(chǔ)開始構(gòu)建，這是一個(gè)在我們的EAE試驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒載體，符合用于人體的所有要求。然后我們檢測(cè)了CpG基序與已知的具有免疫刺激作用的人CpG基序，即Pu-Py-C-G-Py-Py一致的載體。我們發(fā)現(xiàn)pVAX1的一條鏈上有16個(gè)這樣的CpG基序。我們利用位點(diǎn)特異性突變技術(shù)修飾了這些位點(diǎn)中的12個(gè)，見表1。其余CpG位點(diǎn)由于位于載體的重要調(diào)控區(qū)內(nèi)，因此未作修飾。在可能的位點(diǎn)上將CpG基序中的C突變成G以匹配IMS寡核苷酸中GpG寡核苷酸序列的相應(yīng)基序。12個(gè)被修飾位點(diǎn)中有4個(gè)是這樣的修飾。其他的8個(gè)位點(diǎn)不是修飾成GpG，而是通過同樣的方式將CpG中的C轉(zhuǎn)變成A或T。以這種方式可將潛在的具有Th1免疫刺激性的CpG基序去掉。構(gòu)建出的載體被命名為pBHT1。
表2pBHT1載體內(nèi)序列發(fā)生突變的位點(diǎn)以及核苷酸改變的類型
*編號(hào)系統(tǒng)是基于Invitrogen的pVAX1序列的原始編號(hào)系統(tǒng)通過體外試驗(yàn)來分析pBHT1載體與未修飾的pVAX1載體相比其免疫刺激活性是否明顯降低。試驗(yàn)用的是SJL/J小鼠來源的新鮮全脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞。使用全脾細(xì)胞是因?yàn)橐阎碳ば訡pG寡核苷酸能夠活化脾來源的免疫細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。體外分析試驗(yàn)包括增殖試驗(yàn)、FACS分析和ELISA分析細(xì)胞因子的產(chǎn)生。以CpG寡核苷酸作為免疫活化的對(duì)照，以GpG IMS寡核苷酸作為免疫抑制的對(duì)照。
在對(duì)照試驗(yàn)中，分離出的脾細(xì)胞與10μg/ml的CpG寡核苷酸或GpG IMS寡核苷酸共孵育24小時(shí)測(cè)定增殖效應(yīng)。另外，脾細(xì)胞與三種不同濃度的圖7所示的pVAX1空載體或pBHT1空載體共孵育24小時(shí)。如刺激指數(shù)所顯示，與pBHT1載體相比，各濃度的pVAX1載體都有很高的增殖刺激效應(yīng)。雖然刺激的幅度較小(可能因?yàn)榻o定濃度的寡核苷酸中刺激序列的克分子量比質(zhì)粒中的高)，但是所得到的趨勢(shì)是刺激作用與兩種寡核苷酸所觀察到結(jié)果是相關(guān)的。即，GpG IMS的刺激作用很弱，pBHT1載體的刺激作用也很弱。
為了確定GpG IMS寡核苷酸是否能夠抑制抗原呈遞細(xì)胞(APC)的活化，檢測(cè)了APC活化標(biāo)記分子CD16/32在細(xì)胞表面表達(dá)的情況?？瞻灼⒓?xì)胞與10μg/ml的CpG寡核苷酸或GpG IMS寡核苷酸共孵育48小時(shí)。收獲細(xì)胞，通過FACScan分析CD16/32分子的表達(dá)。CpG寡核苷酸可誘導(dǎo)CD16/32的表達(dá)升高，而免疫調(diào)節(jié)性GpG IMS寡核苷酸可將細(xì)胞表面CD16/32分子的表達(dá)水平抑制到對(duì)照的一半(圖8A)。然后我們?cè)俅_定經(jīng)修飾的pBHT1載體是否能以同樣的方式影響CD16/32的表達(dá)。同樣我們觀察到pBHT1載體可抑制CD16/32分子的表達(dá)，說明APC的活化被抑制(圖8B)。
已知CpG寡核苷酸可通過促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌的方式來活化免疫細(xì)胞。我們進(jìn)行了如上所述的試驗(yàn)，其中脾細(xì)胞與CpG寡核苷酸或GpG IMS寡核苷酸共孵育如圖所示的時(shí)間后，通過夾心ELISA法測(cè)定各種細(xì)胞因子的分泌情況。另外，脾細(xì)胞與pVAX1空載體或pBHT1空載體共孵育以確定經(jīng)修飾的pBHT1載體對(duì)細(xì)胞因子的分泌是否有同樣的影響。如圖9所示，CpG寡核苷酸可誘導(dǎo)空白脾細(xì)胞分泌IL6、IL10和IFN-γ。但是GpG IMS寡核苷酸卻不能誘導(dǎo)這些細(xì)胞因子的分泌。pVAX1可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，而pBHT1載體沒有這種效應(yīng)。pBHT1在抑制IL6、IL10和IFN-γ的分泌中有一種相似的趨勢(shì)。雖然pBHT1與GpG IMS相比對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生有一種較弱的促進(jìn)作用，GpGIMS組中幾乎檢測(cè)不到細(xì)胞因子的分泌，但是其誘導(dǎo)的程度大大低于pVAX1，這可能是因?yàn)槠渲械腃pG序列不能被修飾，依然保留在載體骨架內(nèi)。事實(shí)上，我們也不想要一個(gè)完全沒有免疫誘導(dǎo)效應(yīng)的載體，因?yàn)檫@樣的載體無法用于制備DNA疫苗以有效的方式刺激免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。
利用EAE模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)對(duì)多核苷酸DNA治療的耐受情況，其中DNA用的是pBHT1載體內(nèi)的自身抗原。將編碼自身抗原一小鼠PLP(蛋白脂類蛋白)的DNA插入到pBHT1載體內(nèi)，通過肌肉注射到SJL小鼠體內(nèi)(見圖10)。本文所用的模型是治療模型而不是預(yù)防模型，其中小鼠先用含在CFA(完全弗氏佐劑)中的PLP139-151肽誘導(dǎo)出EAE，然后在疾病發(fā)作(第20天)后數(shù)天內(nèi)隨機(jī)分成幾個(gè)治療組。將50μg編碼鼠PLP的pBHT1載體或50μg pBHT1空載體對(duì)照以三種不同的給藥方案肌肉注射給小鼠。如圖10所示，所有治療組小鼠的EAE平均疾病得分都有下降，其中最明顯的是兩周一次組和四周一次組。以前有研究用非pBHT1載體進(jìn)行自身抗原多核苷酸治療，結(jié)果顯示這類EAE治療模型的復(fù)發(fā)率降低。但是，這些前期研究并沒有證實(shí)治療模型中EAE嚴(yán)重程度的這個(gè)指標(biāo)(即平均臨床得分)降低，而本發(fā)明利用pBHT1載體進(jìn)行自身抗原多核苷酸治療證明了這一點(diǎn)。
我們的結(jié)論是目前pBHT1載體是一種較好的用于治療Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病如MS的載體。因此，人源自身抗原基因也可以被克隆到pBHT1載體內(nèi)用于人類疾病的多核苷酸治療。
實(shí)施例4利用IMS和編碼多種自身蛋白的DNA聯(lián)合治療多發(fā)性硬化癥動(dòng)物模型DNA多核苷酸治療包括利用編碼髓鞘的4種主要成分MBP、MAG、MOG和PLP的全長cDNA在疾病開始發(fā)作后治療EAE動(dòng)物模型中的復(fù)發(fā)疾病。另外，在髓鞘DNA多核苷酸治療時(shí)加上編碼IL-4的DNA可以通過降低復(fù)發(fā)率使治療的效果進(jìn)一步提高。但是，盡管復(fù)發(fā)率降低，疾病的整體嚴(yán)重程度與對(duì)照組相比依然沒有變化。
雌性SJL/J小鼠皮下注射100μg用PBS溶解、CFA乳化的PLP139-151肽進(jìn)行免疫，其中CFA由IFA和0.5mg熱滅活的結(jié)核分支桿菌組成。免疫后12天，即疾病開始發(fā)作時(shí)，在小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射0.1ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后，在所選擇小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射DNA混合物，該混合物含有編碼全長鼠PLP、MAG、MOG和MBP的質(zhì)粒(分別插入到pTARGET質(zhì)粒(Promega Corp.Wisconsin)內(nèi)，每種25μg)和50μg編碼全長鼠IL-4的pTARGET質(zhì)粒，質(zhì)粒溶于TE內(nèi)，總體積為0.2ml。DNA注射每周進(jìn)行一次，共注射6周。在開始進(jìn)行DNA免疫時(shí)，小鼠腹腔單獨(dú)注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA多核苷酸注射。IMS每?jī)芍茏⑸湟淮危沧⑸?周。
與未處理的小鼠相比，DNA多核苷酸加編碼IL-4的質(zhì)粒處理的小鼠、單獨(dú)IMS處理的小鼠在整個(gè)疾病過程中其平均疾病得分總體都有下降(圖11)。當(dāng)小鼠用DNA混合物加IL-4聯(lián)合IMS治療時(shí)，總體平均疾病得分下降的更加明顯(圖11)。
EAE疾病被誘導(dǎo)發(fā)生后57天處死小鼠，誘導(dǎo)出EAE后57天處死小鼠，取出每只小鼠的腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)，并將一組的淋巴混合在一起。分離出細(xì)胞用含10μg/ml PLP139-151、10％FCS的濃縮RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)。3天后收集細(xì)胞上清，通過夾心ELISA檢測(cè)IFN-γ、IL-4和IL-10的表達(dá)情況。未處理組小鼠、單獨(dú)IMS處理組小鼠以及DNA多核苷酸+IL-4處理組小鼠分泌的細(xì)胞因子是偏Th1型的，表現(xiàn)為IFN-γ的表達(dá)水平升高(圖12)。DNA多核苷酸+IL-4聯(lián)合IMS處理組小鼠分泌的細(xì)胞因子是偏Th2型的，表現(xiàn)為IL-4和IL-10的表達(dá)水平升高。
分離體內(nèi)試驗(yàn)的動(dòng)物的腦和脊髓進(jìn)行組織學(xué)分析。小鼠灌注10％的緩沖福爾馬林，然后取出腦和脊髓再用10％的緩沖福爾馬林固定。石蠟包埋的樣品用蘇木精-伊紅和羅克沙爾固藍(lán)染料染色，Bielschowsky浸透。如表2所示，與對(duì)照組相比，IMS治療組小鼠腦脊膜和實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎癥病灶總數(shù)和發(fā)生脫髓鞘的病灶數(shù)明顯減少。DNA多核苷酸+IL-4治療組的炎癥病灶總數(shù)和脫髓鞘病灶數(shù)都減少。DNA多核苷酸+IL-4+IMS治療組的炎癥病灶總數(shù)和脫髓鞘病灶數(shù)進(jìn)一步下降。
表3
小鼠經(jīng)如圖11所示的處理后57天采集血清樣本，利用一種新型蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析該樣本，這種技術(shù)能夠大規(guī)模地鑒定疾病樣本與對(duì)照樣本之間髓鞘自身抗體反應(yīng)特異性的模式。進(jìn)行芯片試驗(yàn)時(shí)利用SAM鑒定和制備分級(jí)集束分析以確定抗原的特征。在圖13中，DNA多核苷酸+IL-4+CpG處理組與對(duì)照組、單獨(dú)IMS處理組和DNA多核苷酸+IL-4處理組相比髓鞘自身抗體的表位擴(kuò)散顯著升高。DNA多核苷酸+IL-4+IMS處理還可以進(jìn)一步升高髓鞘自身抗體的表位擴(kuò)散。
重復(fù)這個(gè)體內(nèi)試驗(yàn)可得到相似的結(jié)果。在圖14A中，在急性EAE高峰期小鼠兩周一次注射50μg/ml IMS或CpG。經(jīng)過57天后，IMS處理組小鼠與PBS處理組小鼠和CpG處理組小鼠相比總體平均疾病得分顯著下降。在圖14B中，在急性EAE高峰期小鼠每周注射一次DNA多核苷酸+IL-4、DNA多核苷酸+IL-4+CpG或DNA多核苷酸+IL-4+IMS。經(jīng)過57天后，DNA多核苷酸+IL-4+CpG處理組小鼠的總體平均疾病得分與PBS處理組小鼠相似。DNA多核苷酸+IL-4處理組小鼠與PBS處理組小鼠相比總體平均疾病得分顯著下降。DNA多核苷酸+IL-4+IMS處理組小鼠的總體平均疾病得分進(jìn)一步下降。
實(shí)施例5
利用IMS和編碼自身蛋白胰島素的DNA聯(lián)合治療胰島素依賴型糖尿病非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠可自發(fā)地產(chǎn)生自身免疫性糖尿病，具有多種與人胰島素依賴型糖尿病(IDDM)相似的臨床、免疫學(xué)和組織病理學(xué)特征。該疾病的特征是Langerhans胰島的炎癥和β細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致高血糖癥和明顯的糖尿病癥狀。CD4+和CD8+T細(xì)胞是糖尿病形成所必需的。已經(jīng)鑒定了對(duì)幾種自身抗原如胰島素、IA-2和谷氨酸脫羧酶的反應(yīng)性。
IMS和自身蛋白胰島素編碼DNA聯(lián)合治療開始發(fā)揮作用的時(shí)間是在侵入性胰島炎發(fā)生過程中，但是是在IDDM完全發(fā)作之前。取7周齡的NOD/Lt雌性小鼠，在禁止隨意出入的房間內(nèi)飼養(yǎng)。在10周齡時(shí)開始用One Touch Ultra Blood GlucoseMonitoring System每周測(cè)定血糖水平(BGL)。當(dāng)BGL達(dá)到200-250mg/dl時(shí)開始治療。在15周齡時(shí)將小鼠分組。小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射50μg pVAX1載體或DNA混合物，其中的DNA混合物含有三種pVAX1載體，每種50μg，分別編碼全長鼠前胰島素原1、前胰島素原2和IL-4，載體用PBS溶解，總體積為0.2ml。注射每周進(jìn)行一次，連續(xù)4周。在開始進(jìn)行DNA治療的同時(shí)，小鼠腹腔單獨(dú)注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA多核苷酸治療。IMS治療每周一次，連續(xù)4周。
糖尿病患病百分率定義為BGL持續(xù)超過250mg/dl的小鼠所占的百分率。經(jīng)過四次注射后，記錄每組的小鼠存活率(圖15A)。到第9周時(shí)，對(duì)照組的存活率為10％，單獨(dú)IMS治療組的存活率為20％，單純質(zhì)粒組的存活率為54％，DNA多核苷酸+IL-4組的存活率為45％，而DNA多核苷酸+IL4+IMS組的存活率為73％。當(dāng)比較不同治療組小鼠的存活時(shí)間時(shí)發(fā)現(xiàn)，到第29周時(shí)，單獨(dú)IMS治療組小鼠的糖尿病發(fā)病率為80.0％(圖15B)，pVAX1(Invitrogen，CA)空質(zhì)粒治療組小鼠的糖尿病發(fā)病率為45.4％(p＝0.635)。自身抗原編碼DNA+細(xì)胞因子IL-4+免疫調(diào)節(jié)序列治療組小鼠的發(fā)病率只有27.3％(p＝0.0075)，而未治療組小鼠的發(fā)病率到29周時(shí)為90％(圖15B)。在這個(gè)試驗(yàn)中，DNA質(zhì)粒通過肌肉注射，而IMS通過腹腔注射，清楚地表明DNA質(zhì)粒(ISS)和IMS的靶細(xì)胞群是不同的。另外，本試驗(yàn)的NOD小鼠不用ISS處理?？傊?，這些令人驚奇的意外結(jié)果證明IMS可有效治療自然發(fā)生的自身免疫性疾病。
這個(gè)試驗(yàn)添加治療組后重復(fù)了一次，治療過程調(diào)整為每周一次，連續(xù)8周。治療組分別是1)PBS，2)200μg pVAX1空質(zhì)粒，3)50μg IMS肌肉注射，4)pVAX1空質(zhì)粒加IMS(肌肉注射)，5)DNA多核苷酸混合物，6)DNA多核苷酸加IMS(肌肉注射)，7)DNA多核苷酸加IL-4，8)DNA多核苷酸加IL-4加IMS(肌肉注射)，9)DNA多核苷酸加IL-4，腹腔再注射IMS。如圖16所示，各組的存活百分率分別為1)PBS(0％)，2)pVAX1空質(zhì)粒(36％)，3)IMS肌肉注射(14％)，4)pVAX1空質(zhì)粒加IMS(47％)，5)DNA多核苷酸混合物(36％)，6)DNA多核苷酸加IMS(25％)，7)DNA多核苷酸加IL-4(31％)，8)DNA多核苷酸加IL-4加IMS(38％)，9)DNA多核苷酸加IL-4，腹腔再注射IMS(54％)。
實(shí)施例6IMS和編碼全長自身蛋白II型膠原和IL4的DNA聯(lián)合治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎膠原誘導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎(CIA)是一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)模型。通過給遺傳易感性的小鼠品系注射完全弗氏佐劑(CFA)乳化的全長II型膠原(CII)可誘導(dǎo)出RA。CII是動(dòng)關(guān)節(jié)軟骨的主要組成蛋白，也是RA內(nèi)的主要炎癥靶位(Myers等，Life Sciences，611861-1878，1997)。所誘導(dǎo)出的重度多關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎的特征是滑膜炎及軟骨和骨的慢性侵蝕，在組織學(xué)上與RA相似(Courtenay等，Nature，283(5748)666-668，1980)。與RA一樣，嚙齒類動(dòng)物對(duì)CIA的敏感性與特異性主要組織相容性復(fù)合物II類分子的表達(dá)有關(guān)(Wooley等，J.Exp.Med.，154688-700，198l；Griffiths，Int.Rev.Immunol，41-15，1988)。
本試驗(yàn)檢測(cè)了IMS聯(lián)合全長自身蛋白II型膠原(CII)和IL-4編碼DNA的治療效應(yīng)。20只6周齡的雄性DBA/1小鼠分組后雙側(cè)四頭肌注射0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射如圖所示的DNA疫苗，每種50μg，在開始注射DNA進(jìn)行免疫的同時(shí)腹腔注射200μl含50μg IMS的PBS。治療組分別為1)單純PBS，2)pTarget質(zhì)粒+編碼IL-4的pTarget，3)pTarget質(zhì)粒+編碼IL-4的pTarget+IMS，4)編碼全長CII的pTarget+編碼IL-4的pTarget；5)編碼全長CII的pTarget+編碼IL-4的pTarget+IMS。在用完全弗氏佐劑乳化的CII誘導(dǎo)CIA前14天和7天開始治療。誘導(dǎo)出CIA后用第三種劑量的劑量的劑量的DNA耐受疫苗和IMS處理小鼠1周。2周后小鼠用不完全弗氏佐劑乳化的CII誘發(fā)一次。利用Current Protocols in Immunology中描述的視覺評(píng)分系統(tǒng)記錄關(guān)節(jié)炎的分?jǐn)?shù)。
編碼全長II型膠原(CII)的DNA加編碼IL-4的DNA，加或不加IMS的處理組小鼠與DNA疫苗載體(pTarget)加IL-4，加或不加IMS的對(duì)照組小鼠相比其關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度明顯減輕(圖17A)。各組的總發(fā)病率基本一致(圖17B)。變性的全長CII能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖說明各組都存在CII反應(yīng)性T細(xì)胞(圖18)。細(xì)胞因子分析結(jié)果表明用DNA質(zhì)粒加或不加IMS治療可顯著抑制IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，但是卻可以增加IL-4的分泌(圖19)。
第二組體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)了IMS單獨(dú)或聯(lián)合全長自身蛋白II型膠原(CII)編碼DNA的效應(yīng)。20只6周齡的雄性DBA/1小鼠分組后雙側(cè)四頭肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射如圖所示的DNA疫苗，每種50μg，在開始注射DNA進(jìn)行免疫的同時(shí)腹腔注射200μl含50μg IMS的PBS。治療組分別為1)單純PBS，2)單純IMS，和3)編碼全長CII的pTarget+IMS。在用完全弗氏佐劑乳化的CII誘導(dǎo)CIA前14天和7天開始治療。誘導(dǎo)出CIA后用第三種劑量的劑量的DNA耐受疫苗和/或IMS處理小鼠1周。利用Current Protocols inImmunology中描述的視覺評(píng)分系統(tǒng)記錄關(guān)節(jié)炎的分?jǐn)?shù)。與對(duì)照組和全長CII+IMS處理組相比，單純IMS處理組小鼠的關(guān)節(jié)炎平均嚴(yán)重程度(圖20A)和發(fā)病率顯著下降(圖20B)。
實(shí)施例7IMS阻斷CpG對(duì)初級(jí)B細(xì)胞的刺激效應(yīng)在存在特異性抗原的情況下，CpG DNA可作為共刺激因子誘導(dǎo)初級(jí)B細(xì)胞成熟，表現(xiàn)為促進(jìn)免疫球蛋白的產(chǎn)生和B細(xì)胞的增殖(Krieg等，Nature，374546，1995；Yi等，J.Immunol.，1575394，1996)。利用羊抗鼠IgG和IgM、羊γ球蛋白的重鏈和輕鏈特異性抗體作為載體蛋白通過標(biāo)準(zhǔn)的B細(xì)胞淘洗技術(shù)從SJL/J小鼠脾中分離初級(jí)B細(xì)胞，純度大于＞97％的B220+細(xì)胞通過FACScan分析來確定。初級(jí)B細(xì)胞用5μg如圖所示的寡核苷酸培養(yǎng)72小時(shí)。用100ng/ml的LPS共培養(yǎng)。在培養(yǎng)的最后16小時(shí)用1μCi[3H]TdR脈沖，然后測(cè)定摻入的放射活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)復(fù)孔的平均值+/-SD。如圖21所示，富集的B細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明CpG可導(dǎo)致B細(xì)胞的劇烈增殖，而IMS卻可以抑制CpG-ODN對(duì)成熟B細(xì)胞的這種效應(yīng)。B細(xì)胞與LPS和CpG-ODN共培養(yǎng)對(duì)B細(xì)胞的增殖有疊加效應(yīng)，這種效應(yīng)可被IMS而不是對(duì)照寡核苷酸抑制。細(xì)胞因子分析結(jié)果表明CpG-ODN可促進(jìn)IL-6(圖22A)、IFN-γ(圖22B)、IL-10(圖22C)和IL-12(p40)(圖22D)的產(chǎn)生，而這種效應(yīng)可被IMS有效抑制。
實(shí)施例8單獨(dú)利用IMS以及聯(lián)合編碼細(xì)胞內(nèi)大分子自身蛋白的DNA來治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡有幾種自發(fā)的或誘導(dǎo)的狼瘡樣疾病鼠模型具有多種與人狼瘡相似的特征，其中包括自發(fā)的新西蘭雜合子模型(NZB/NZW F1雜合子)、自發(fā)的MRL-1pr/1pr模型和異十八烷誘導(dǎo)的Balb/c模型。抗細(xì)胞內(nèi)大分子如核小體、DNA和小核糖核蛋白的自身抗體的產(chǎn)生在組織損傷和腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。
用Balb/c雌性小鼠檢驗(yàn)單獨(dú)IMS和IMS聯(lián)合自身蛋白小核糖核蛋白U1A或U1C編碼DNA的治療效果。將10只6周齡的雌性Balb/c小鼠分組，雙側(cè)四頭肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射如圖所示的DNA疫苗1)pTarget質(zhì)粒(100μg/次)；2)編碼U1A的pTarget+pTarget空質(zhì)粒(每種50μg/次)；3)編碼U1C的pTarget+pTarget空質(zhì)粒(每種50μg/次)；以及4)U1A和U1C的混合物(每種50μg/次)。在開始進(jìn)行DNA免疫的同時(shí)，小鼠單獨(dú)腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA免疫。注射每周一次，連續(xù)2周。腹腔單次注射0.5ml的異十八烷就可以誘導(dǎo)出SLE。誘導(dǎo)出SLE后給小鼠注射第三種劑量的DNA耐受疫苗和/或寡核苷酸一周。每月重復(fù)一次相同的治療方案，共持續(xù)9個(gè)月。通過每月檢測(cè)尿蛋白的水平來評(píng)價(jià)SLE的進(jìn)展情況。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過蘇木精和伊紅染色、過碘酸-席夫堿染色、三色(trichrome)染色和網(wǎng)硬蛋白銀染進(jìn)行組織學(xué)檢查以評(píng)價(jià)腎組織損傷情況。腎損傷通過檢查腎小球系膜細(xì)胞增多的嚴(yán)重程度、腎小球系膜基質(zhì)增生情況、小葉增生情況以及IgG和C3染色的范圍來評(píng)分。
用MRL-MpJFAS Ipr雌性小鼠檢驗(yàn)單獨(dú)IMS和IMS聯(lián)合編碼自身蛋白小核糖核蛋白U1A、U1C和U170、核小體組蛋白H2B和H3的DNA的治療效果。將10只6周齡的雌性MRL-MpJFAS Ipr小鼠分組，雙側(cè)四頭肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射如圖所示的DNA疫苗(pBHT1，編碼U1A的pBHT1，編碼U1C的pBHT1，編碼H2B的pBHT1和編碼H3的pBHT1)，每種50μg/次，連續(xù)三周。載體pBHT1見實(shí)施例3的描述。在開始進(jìn)行DNA免疫的同時(shí)，小鼠單獨(dú)腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA免疫。給小鼠每月注射DNA耐受疫苗和/或寡核苷酸，連續(xù)兩個(gè)月以上。通過每月檢測(cè)尿蛋白的水平來評(píng)價(jià)SLE的進(jìn)展情況。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過蘇木精和伊紅染色、過碘酸-席夫堿染色、三色染色和網(wǎng)硬蛋白銀染進(jìn)行組織學(xué)檢查以評(píng)價(jià)腎組織損傷情況。腎損傷通過檢查腎小球系膜細(xì)胞增多的嚴(yán)重程度、腎小球系膜基質(zhì)增生情況、小葉增生情況以及IgG和C3染色的范圍來評(píng)分。
用(NZB×NZW)Fl雜合子雌性小鼠檢驗(yàn)單獨(dú)IMS和IMS聯(lián)合編碼自身蛋白核小體組蛋白H2B和H3的DNA的治療效果。將10只5個(gè)月齡的雌性(NZB×NZW)Fl雜合子小鼠分組，雙側(cè)四頭肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射如圖所示的DNA疫苗(pBHT1，編碼H2B的pBHT1、編碼H3的pBHT1以及H2B和H3的混合物)，每種50μg/次，連續(xù)三周。在開始進(jìn)行DNA免疫的同時(shí)，小鼠單獨(dú)腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA免疫。通過每月檢測(cè)尿蛋白的水平來評(píng)價(jià)SLE的進(jìn)展情況。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過蘇木精和伊紅染色、過碘酸-席夫堿染色、三色染色和網(wǎng)硬蛋白銀染進(jìn)行組織學(xué)檢查以評(píng)價(jià)腎組織損傷情況。腎損傷通過檢查腎小球系膜細(xì)胞增多的嚴(yán)重程度、腎小球系膜基質(zhì)增生情況、小葉增生情況以及IgG和C3染色的范圍來評(píng)分。
實(shí)施例9單獨(dú)利用IMS以及聯(lián)合編碼自身蛋白丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和IL-4的DNA來治療原發(fā)性膽汁性肝硬變?cè)l(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)是一種自身免疫性慢性膽汁郁積性肝疾病，是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性膽管炎(EAC)是一種能導(dǎo)致PBC樣損傷的動(dòng)物疾病模型，其中SJL小鼠的肝內(nèi)小膽管上皮細(xì)胞通過自身抗原-丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)致敏而產(chǎn)生損傷。
用SJL/J雌性小鼠檢驗(yàn)單獨(dú)IMS和IMS聯(lián)合編碼自身蛋白-PDC的二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2)和E3結(jié)合蛋白成分的DNA的治療效果。將15只8周齡的雌性SJL/J小鼠分組，雙側(cè)四頭肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％鹽酸布比卡因。兩天后在小鼠的雙側(cè)四頭肌內(nèi)注射如圖所示的DNA疫苗(pTarget質(zhì)粒，編碼PDC-E2的pTarget以及PDC-E2和IL-4的混合物)，每種50μg/次，連續(xù)三周。在開始進(jìn)行DNA免疫的同時(shí)，小鼠單獨(dú)腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同時(shí)進(jìn)行DNA免疫。PDC-E2肽GDLLAEIETDKATI(500μg，溶于10μl PBS中)用CFA(含10mg/ml的結(jié)核分支桿菌株H37RA)乳化，小鼠單次腹腔注射200μl誘導(dǎo)EAC。致敏后30周評(píng)價(jià)EAC的情況。肝組織切片，用H&E染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，觀察炎癥壞死情況和膽管損傷情況。
實(shí)施例10篩選預(yù)計(jì)可調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的其他IMS寡核苷酸據(jù)估計(jì)其他IMS寡核苷酸也可能具有相似的或更高的活性來改變自身免疫性疾病的進(jìn)程。根據(jù)較早前所描述的IMS寡核苷酸(即5’-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3’)的活性數(shù)據(jù)可以推測(cè)出其他的IMS寡核苷酸序列。根據(jù)如下通式來預(yù)測(cè)其他IMS寡核苷酸是否具有相似的或更高的活性5’-TGACTGTGTGRRαβYYAGAGATGA-3’，其中R代表嘌呤(A或G)，Y代表嘧啶(C或T)，α和β是GpG或非GpG二核苷酸。據(jù)估計(jì)這些寡核苷酸在嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)中具有最大的活性，這與以前所報(bào)道的在嚙齒類系統(tǒng)中的活性最高的結(jié)果是一致的。這些IMS寡核苷酸全部都列在表4中。在這個(gè)表中“I”代表肌苷。
同樣，根據(jù)如下通式也可以預(yù)測(cè)其他IMS寡核苷酸是否具有相似的或更高的活性5’-TGACTGTGTGRYαβYYAGAGATGA-3’，其中R代表嘌呤(A或G)，Y代表嘧啶(C或T)，α和β是GpG或非GpG二核苷酸。據(jù)估計(jì)這些寡核苷酸在嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)中具有最大的活性，這與以前所報(bào)道的在嚙齒類系統(tǒng)中的活性最高的結(jié)果是一致的。這些IMS寡核苷酸全部都列在表5中。在這個(gè)表中“I”代表肌苷。
所有的寡核苷酸合成時(shí)都在每個(gè)核苷酸上進(jìn)行硫代磷酸化以提高寡核苷酸的穩(wěn)定性。通過體外試驗(yàn)分別篩選這些寡核苷酸以檢測(cè)其對(duì)免疫細(xì)胞活化的影響。這些篩選方法包括細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞因子分泌試驗(yàn)、以及通過FACS來分析細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)情況。表現(xiàn)出免疫抑制活性的候選IMS寡核苷酸再進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)來分析其免疫調(diào)節(jié)功能。這些體內(nèi)試驗(yàn)包括給動(dòng)物以及自身免疫性疾病模型(如EAE、NOD、SLE和CIA)注射IMS寡核苷酸，然后分析免疫細(xì)胞的上述活化參數(shù)。
在表4和表5中描述了核心六聚體(即RRαβYY和RYαβYY)5’端和3”端的側(cè)翼序列。這個(gè)核心六聚體兩側(cè)的其他側(cè)翼序列可以通過用任意長度的任意核苷酸序列來替代上述側(cè)翼序列而獲得。比如5’-NNNNNNNNNNNRyαβYYNNNNNNNNNN-3’和5’-NNNNNNNNNNRRαβYYNNNNNNNNNN-3’，其中N代表任意核苷酸。
特殊的例子包括而不限于如下寡核苷酸5’-GGGGGGGGGGGAAGGTTGGGGGGGGGG-3’，5’-GGGGGGGGGGGATGGTTGGGGGGGGGG-3’，5’-GGGGGGGGGGGACGGTTGGGGGGGGGG-3’，5’-GGGGGGGGGGGAAGCTTGGGGGGGGGG-3’，5’-GGGGGGGGGGGATGCTTGGGGGGGGGG-3’，5’-GGGGGGGGGGGACGCTTGGGGGGGGGG-3’，5’-CCCCCCCCCCCAAGGTTCCCCCCCCCC-3’，5’-CCCCCCCCCCCATGGTTCCCCCCCCCC-3’，5’-CCCCCCCCCCCACGGTTCCCCCCCCCC-3’，5’-CCCCCCCCCCCAAGCTTCCCCCCCCCC-3’，5’-CCCCCCCCCCCATGCTTCCCCCCCCCC-3’，5’-CCCCCCCCCCCACGCTTCCCCCCCCCC-3’.
表45′ RRαβYY 3′TGACTGTGAAGCTTAGAGATGATGACTGTGAAGCTCAGAGATGATGACTGTGAAGCCTAGAGATGATGACTGTGAAGCCCAGAGATGATGACTGTGAGGCTTAGAGATGA
5′ RRαβYY 3′TGACTGTGAGGCTCAGAGATGATGACTGTGAGGCCTAGAGATGATGACTGTGAGGCCCAGAGATGATGACTGTGGAGCTTAGAGATGATGACTGTGGAGCTCAGAGATGATGACTGTGGAGCCTAGAGATGATGACTGTGGAGCCCAGAGATGATGACTGTGGGGCTTAGAGATGATGACTGTGGGGCTCAGAGATGATGACTGTGGGGCCTAGAGATGATGACTGTGGGGCCCAGAGATGATGACTGTGAAGGTTAGAGATGATGACTGTGAAGGTCAGAGATGATGACTGTGAAGGCTAGAGATGATGACTGTGAAGGCCAGAGATGATGACTGTGAGGGTTAGAGATGATGACTGTGAGGGTCAGAGATGATGACTGTGAGGGCTAGAGATGATGACTGTGAGGGCCAGAGATGATGACTGTGGAGGTTAGAGATGATGACTGTGGAGGTCAGAGATGATGACTGTGGAGGCTAGAGATGATGACTGTGGAGGCCAGAGATGATGACTGTGGGGGTTAGAGATGATGACTGTGGGGGTCAGAGATGATGACTGTGGGGGCTAGAGATGATGACTGTGGGGGCCAGAGATGATGACTGTGAAAGTTAGAGATGATGACTGTGAAAGTCAGAGATGATGACTGTGAAAGCTAGAGATGATGACTGTGAAAGCCAGAGATGATGACTGTGAGAGTTAGAGATGA
5′ RRαβYY 3′TGACTGTGAGAGTCAGAGATGATGACTGTGAGAGCTAGAGATGATGACTGTGAGAGCCAGAGATGATGACTGTGGAAGTTAGAGATGATGACTGTGGAAGTCAGAGATGATGACTGTGGAAGCTAGAGATGATGACTGTGGAAGCCAGAGATGATGACTGTGGGAGTTAGAGATGATGACTGTGGGAGTCAGAGATGATGACTGTGGGAGCTAGAGATGATGACTGTGGGAGCCAGAGATGATGACTGTGAAIGTTAGAGATGATGACTGTGAAIGTCAGAGATGATGACTGTGAAIGCTAGAGATGATGACTGTGAAIGCCAGAGATGATGACTGTGAGIGTTAGAGATGATGACTGTGAGIGTCAGAGATGATGACTGTGAGIGCTAGAGATGATGACTGTGAGIGCCAGAGATGATGACTGTGGAIGTTAGAGATGATGACTGTGGAIGTCAGAGATGATGACrGTGGAIGCTAGAGATGATGACTGTGGAIGCCAGAGATGATGACTGTGGGIGTTAGAGATGATGACTGTGGGIGTCAGAGATGATGACTGTGGGIGCTAGAGATGATGACTGTGGGIGCCAGAGATGATGACTGTGAAICTTAGAGATGATGACTGTGAAICTCAGAGATGATGACTGTGAAICCTAGAGATGATGACTGTGAAICCCAGAGATGATGACTGTGAGICTTAGAGATGA
5′ RRαβYY 3′TGACTGTGAGICTCAGAGATGATGACTGTGAGICCTAGAGATGATGACTGTGAGICCCAGAGATGATGACTGTGGAICTTAGAGATGATGACTGTGGAICTCAGAGATGATGACTGTGGAICCTAGAGATGATGACTGTGGAICCCAGAGATGATGACTGTGGGICTTAGAGATGATGACTGTGGGICTCAGAGATGATGACTGTGGGICCTAGAGATGATGACTGTGGGICCCAGAGATGATGACTGTGAATGTTAGAGATGATGACTGTGAATGTCAGAGATGATGACTGTGAATGCTAGAGATGATGACTGTGAATGCCAGAGATGATGACTGTGAGTGTTAGAGATGATGACTGTGAGTGTCAGAGATGATGACTGTGAGTGCTAGAGATGATGACTGTGAGTGCCAGAGATGATGACTGTGGATGTTAGAGATGATGACTGTGGATGTCAGAGATGATGACTGTGGATGCTAGAGATGATGACTGTGGATGCCAGAGATGATGACTGTGGGTGTTAGAGATGATGACTGTGGGTGTCAGAGATGATGACTGTGGGTGCTAGAGATGATGACTGTGGGTGCCAGAGATGATGACTGTGAATATTAGAGATGATGACTGTGAATATCAGAGATGATGACTGTGAATACTAGAGATGATGACTGTGAATACCAGAGATGATGACTGTGAGTATTAGAGATGA
5′ RRα β YY 3′TGACTGTGAGTATCAGAGATGATGACTGTGAGTACTAGAGATGATGACTGTGAGTACCAGAGATGATGACTGTGGATATTAGAGATGATGACTGTGGATATCAGAGATGATGACTGTGGATACTAGAGATGATGACTGTGGATACCAGAGATGATGACTGTGGGTATTAGAGATGATGACTGTGGGTATCAGAGATGATGACTGTGGGTACTAGAGATGATGACTGTGGGTACCAGAGATGATGACTGTGAACGTTAGAGATGATGACTGTGAACCTTAGAGATGA表55′ RYαβYY 3′TGACTGTGATGCTTAGAGATGATGACTGTGATGCTCAGAGATGATGACTGTGATGCCTAGAGATGATGACTGTGATGCCCAGAGATGATGACTGTGACGCTTAGAGATGATGACTGTGACGCTCAGAGATGATGACTGTGACGCCTAGAGATGATGACTGTGACGCCCAGAGATGATGACTGTGGTGCTTAGAGATGATGACTGTGGTGCTCAGAGATGATGACTGTGGTGCCTAGAGATGATGACTGTGGTGCCCAGAGATGATGACTGTGGCGCTTAGAGATGATGACTGTGGCGCTCAGAGATGATGACTGTGGCGCCTAGAGATGATGACTGTGGCGCCCAGAGATGATGACTGTGATGGTTAGAGATGATGACTGTGATGGTCAGAGATGATGACTGTGATGGCTAGAGATGATGACTGTGATGGCCAGAGATGATGACTGTGACGGTTAGAGATGATGACTGTGACGGTCAGAGATGATGACTGTGACGGCTAGAGATGATGACTGTGACGGCCAGAGATGATGACTGTGGTGGTTAGAGATGA
5′ RYαβ YY 3′TGACTGTGGTGGTCAGAGATGATGACTGTGGTGGCTAGAGATGATGACTGTGGTGGCCAGAGATGATGACTGTGGCGGTTAGAGATGATGACTGTGGCGGTCAGAGATGATGACTGTGGCGGCTAGAGATGATGACTGTGGCGGCCAGAGATGATGACTGTGATAGTTAGAGATGATGACTGTGATAGTCAGAGATGATGACTGTGATAGCTAGAGATGATGACTGTGATAGCCAGAGATGATGACTGTGACAGTTAGAGATGATGACTGTGACAGTCAGAGATGATGACTGTGACAGCTAGAGATGATGACTGTGACAGCCAGAGATGATGACTGTGGTAGTTAGAGATGATGACTGTGGTAGTCAGAGATGATGACTGTGGTAGCTAGAGATGATGACTGTGGTAGCCAGAGATGATGACTGTGGCAGTTAGAGATGATGACTGTGGCAGTCAGAGATGATGACTGTGGCAGCTAGAGATGATGACTGTGGCAGCCAGAGATGATGACTGTGATIGTTAGAGATGATGACTGTGATIGTCAGAGATGATGACTGTGATIGCTAGAGATGATGACTGTGATIGCCAGAGATGATGACTGTGACIGTTAGAGATGATGACTGTGACIGTCAGAGATGATGACTGTGACIGCTAGAGATGATGACTGTGACIGCCAGAGATGATGACTGTGGTIGTTAGAGATGATGACTGTGGTIGTCAGAGATGATGACTGTGGTIGCTAGAGATGATGACTGTGGTIGCCAGAGATGATGACTGTGGCIGTTAGAGATGATGACTGTGGCIGTCAGAGATGATGACTGTGGCIGCTAGAGATGATGACTGTGGCIGCCAGAGATGATGACTGTGATICTTAGAGATGATGACTGTGATICTCAGAGATGATGACTGTGATICCTAGAGATGATGACTGTGATICCCAGAGATGATGACTGTGACICTTAGAGATGATGACTGTGACICTCAGAGATGATGACTGTGACICCTAGAGATGATGACTGTGACICCCAGAGATGATGACTGTGGTICTTAGAGATGATGACTGTGGTICTCAGAGATGA
5′ RYαβ YY 3′TGACTGTGGTICCTAGAGATGATGACTGTGGTICCCAGAGATGATGACTGTGGCICTTAGAGATGATGACTGTGGCICTCAGAGATGATGACTGTGGCICCTAGAGATGATGACTGTGGCICCCAGAGATGATGACTGTGATTGTTAGAGATGATGACTGTGATTGTCAGAGATGATGACTGTGATTGCTAGAGATGATGACTGTGATTGCCAGAGATGATGACTGTGACTGTTAGAGATGATGACTGTGACTGTCAGAGATGATGACTGTGACTGCTAGAGATGATGACTGTGACTGCCAGAGATGATGACTGTGGTTGTTAGAGATGATGACTGTGGTTGTCAGAGATGATGACTGTGGTTGCTAGAGATGATGACTGTGGTTGCCAGAGATGATGACTGTGGCTGTTAGAGATGATGACTGTGGCTGTCAGAGATGATGACTGTGGCTGCTAGAGATGATGACTGTGGCTGCCAGAGATGATGACTGTGATTATTAGAGATGATGACTGTGATTATCAGAGATGATGACTGTGATTACTAGAGATGATGACTGTGATTACCAGAGATGATGACTGTGACTATTAGAGATGATGACTGTGACTATCAGAGATGATGACTGTGACTACTAGAGATGATGACTGTGACTACCAGAGATGATGACTGTGGTTATTAGAGATGATGACTGTGGTTATCAGAGATGATGACTGTGGTTACTAGAGATGATGACTGTGGTTACCAGAGATGATGACTGTGGCTATTAGAGATGATGACTGTGGCTATCAGAGATGATGACTGTGGCTACTAGAGATGATGACTGTGGCTACCAGAGATGATGACTGTGATCGTTAGAGATGATGACTGTGACCGTTAGAGATGA上述實(shí)施例是用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的特殊實(shí)施方式。提供實(shí)施例的目的只是為了說明本發(fā)明，而不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明的其他變化，并且這些變化也包括在權(quán)利要求中。本文所引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和其他文獻(xiàn)都已納入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用于治療與以非生理狀態(tài)存在于受試者體內(nèi)的一種或多種自身分子相關(guān)的疾病的藥物組合物，該組合物包含(a)含通式為5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’的六聚體區(qū)域的免疫調(diào)節(jié)核酸，其中，X和Y是任何天然產(chǎn)生的或合成的核苷酸，但是X-Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤；和(b)藥學(xué)上可接受的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含一個(gè)連接到六聚體區(qū)域5’端或3’端的聚鳥苷酸區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含一個(gè)連接到六聚體區(qū)域5’端的第一聚鳥苷酸區(qū)域和一個(gè)連接到六聚體區(qū)域3’端的第二聚鳥苷酸區(qū)域。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸在無菌管中。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸的長度不超過約45個(gè)核苷酸。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸區(qū)域。
7.一種包含如下成分的核酸組合物一種核酸載體，該載體的CpG基序中至少發(fā)生了一個(gè)胞嘧啶到非胞嘧啶的取代，其中CpG基序的通式為5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’，其中所述胞嘧啶到非胞嘧啶的取代在CpG二核苷酸內(nèi)。
8.如權(quán)利要求7所述的核酸組合物，其中，所述CpG基序的通式為5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述胞嘧啶到非胞嘧啶的取代是胞嘧啶取代成鳥嘌呤。
10.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述核酸載體含有多個(gè)胞嘧啶到非胞嘧啶的取代。
11.一種在受試者體內(nèi)治療與以非生理狀態(tài)存在于受試者體內(nèi)的一種或多種自身分子相關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予受試者含有通式為5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的六聚體區(qū)域的免疫調(diào)節(jié)核酸，其中，X和Y是任何天然產(chǎn)生的或合成的核苷酸，但是X-Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含一個(gè)連接到六聚體區(qū)域5’端或3’端的聚鳥苷酸區(qū)域。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含一個(gè)連接到六聚體區(qū)域5’端的第一聚鳥苷酸區(qū)域和一個(gè)連接到六聚體區(qū)域3’端的第二聚鳥苷酸區(qū)域。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫性疾病。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述疾病是多發(fā)性硬化癥。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述疾病是胰島素依賴型的糖尿病。
18.一種在受試者體內(nèi)治療與以非生理狀態(tài)存在于受試者體內(nèi)的一種或多種自身分子相關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予受試者含有通式為5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的六聚體區(qū)域的免疫調(diào)節(jié)核酸，其中，X和Y是任何天然產(chǎn)生的或合成的核苷酸，但是X-Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含一個(gè)連接到六聚體區(qū)域5’端或3’端的聚鳥苷酸區(qū)域。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述免疫調(diào)節(jié)核酸還包含一個(gè)連接到六聚體區(qū)域5’端的第一聚鳥苷酸區(qū)域和一個(gè)連接到六聚體區(qū)域3’端的第二聚鳥苷酸區(qū)域。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫性疾病。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述疾病是多發(fā)性硬化癥。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述疾病是胰島素依賴型的糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防疾病的方法和組合物，該方法包括給予含有一個(gè)或多個(gè)免疫調(diào)節(jié)序列(IMS)的免疫調(diào)節(jié)核酸。本發(fā)明還涉及鑒定用于預(yù)防或治療疾病、特別是自身免疫性疾病或炎性疾病的免疫調(diào)節(jié)序列的手段和方法。本發(fā)明還涉及通過單獨(dú)或者聯(lián)合編碼自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸給予免疫調(diào)節(jié)核酸來治療或預(yù)防疾病。本發(fā)明還涉及在受試者體內(nèi)治療與存在于受試者體內(nèi)并處于非生理狀態(tài)的一種或多種自身蛋白、自身多肽或自身肽相關(guān)的疾病的方法和組合物。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1777447SQ200380107730
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月21日
發(fā)明者H·加倫, P·P·霍, L·斯坦曼 申請(qǐng)人:貝希爾治療學(xué)股份有限公司, 利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì)