專利名稱：穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)的制劑。更特別地，本發(fā)明涉及包含泊洛沙姆作為表面活性劑的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)的制劑。
背景技術(shù)：
隨著遺傳工程技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用生理活性蛋白如抗體、酶、激素及細胞因子作為藥物產(chǎn)品已經(jīng)成為可能。為了以穩(wěn)定的量高質(zhì)量提供它們，必需建立能夠保持結(jié)構(gòu)和活性的制備條件和儲存條件。
通常，蛋白質(zhì)儲存過程中遇到的問題是變質(zhì)現(xiàn)象，如形成不溶的聚集物，必須防止這種問題。
例如，抗體如免疫球蛋白、單克隆抗體和人源化抗體是不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它們在純化和制劑加工過程中的過濾、濃縮和加熱的應(yīng)激下以及在儲備溶液或制劑存儲過程中的熱、光和運輸?shù)膽?yīng)激下容易發(fā)生物理或化學(xué)變化例如群叢或群聚。
如果由遺傳工程技術(shù)得到抗體時，則大量培養(yǎng)并純化產(chǎn)生抗體的細胞以得到含抗體的溶液，然后冷凍保存該溶液，在制備制劑前解凍。然而，由于在反復(fù)的凍/融循環(huán)過程中形成抗體二聚體或不溶的顆?；虿蝗苄援愇锘蛘咴陂L期的存儲過程中抗體降解形成降解產(chǎn)物，該溶液中剩余的抗體含量降低。
為了抑制此類不溶性異物的形成并獲得穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)的制劑，使用表面活性劑是必不可少的，特別是，這樣的表面活性劑如聚山梨酯20和80已被廣泛使用。然而對于容易氧化的蛋白質(zhì)制劑來說，除了聚山梨酯80外還不得不包含抗氧化劑如L-蛋氨酸(JPA No.2000-247903，J.Pharm.Sci.903(2001))，因為聚山梨酯80趨向氧化蛋白質(zhì)(PDA J.Pharm.Sci.Technol.503(1996)；Formulation，Characterization，and Stability of Protein Drugs.Plenum Press，New Yolk，(1996))，由此降低了抗體制劑的生物活性。加入抗氧化劑需要復(fù)雜的操作如嚴格測定抗氧化劑的規(guī)格和含量。
因此，期望提供一種能夠不添加抗氧劑而抑制蛋白質(zhì)氧化并且能夠抑制蛋白質(zhì)制劑中不溶性異物形成的表面活性劑。凍干制劑能夠抑制蛋白質(zhì)的氧化(例如，JPA No.2000-247903)，但是對省去重構(gòu)步驟的便利溶液制劑存在巨大需求并且還將期望提供一種含有蛋白質(zhì)的制劑，該制劑即使以溶液制劑存在時也是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的一個目的是尋找一種表面活性劑(這種表面活性劑能夠不添加抗氧化劑而抑制蛋白質(zhì)氧化以保持蛋白質(zhì)生物活性，還能夠抑制蛋白質(zhì)制劑中不溶性異物的形成)并且提供一種含有所述表面活性劑的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)的制劑。

發(fā)明內(nèi)容
為了實現(xiàn)上述目的我們進行了細致的研究工作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過添加泊洛沙姆作為表面活性劑能夠在不存在抗氧化劑的情況下保持蛋白質(zhì)的生物活性而不引起蛋白質(zhì)的氧化，并且能夠抑制含蛋白質(zhì)的制劑中不溶性異物的形成，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供(1)一種含有泊洛沙姆作為表面活性劑的蛋白質(zhì)制劑；(2)上述(1)中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中泊洛沙姆是泊洛沙姆188；(3)上述(1)或(2)中定義的蛋白質(zhì)制劑，它是溶液制劑；(4)上述(1)至(3)任一項中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)是免疫球蛋白；(5)上述(4)中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中所述免疫球蛋白是人源化抗體；(6)上述(4)中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中所述免疫球蛋白是一種抗組織因子抗體；
(7)上述(6)中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中所述抗組織因子抗體是一種人源化抗組織因子抗體；(8)上述(1)至(9)任一項中定義的蛋白質(zhì)制劑，它不含有作為添加劑的抗氧劑；(9)一種通過添加泊洛沙姆作為表面活性劑而不添加抗氧劑保持蛋白質(zhì)制劑中的生物活性以及抑制不溶性異物形成的方法；(10)上述(1)至(3)任一項中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)是粒細胞集落刺激因子；以及(11)上述(1)至(3)任一項中定義的蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)是甲狀旁腺激素。
附圖簡要說明

圖1顯示含有不同表面活性劑的抗人組織因子抗體溶液制劑中生物活性隨時間的變化。
圖2表示含有泊洛沙姆188或聚山梨酯80的抗人組織因子抗體溶液制劑的陰離子交換色譜圖。
圖3顯示與添加泊洛沙姆的作用相比，在抗人組織因子抗體中添加L-蛋氨酸對由聚山梨酯80誘導(dǎo)的活性損失的作用。
圖4表示顯示聚山梨酯80、聚山梨酯20或泊洛沙姆188對粒細胞集落刺激因子氧化作用影響的色譜圖。
圖5表示顯示聚山梨酯80、聚山梨酯20或泊洛沙姆188對甲狀旁腺激素氧化作用影響的色譜圖。
發(fā)明的最優(yōu)選實施方案本發(fā)明使用的“含蛋白質(zhì)的制劑”是指一種含有蛋白質(zhì)，優(yōu)選作為活性成分的生理活性蛋白質(zhì)的制劑，它被制備用于給動物如人施用，包括凍干制劑和溶液制劑。
用于本發(fā)明制劑中的蛋白質(zhì)包括但不限定于抗體、酶、細胞因子和激素。特別地，它們包括但不限定于造血因子如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)和血小板生成素；細胞因子如干擾素、IL-1和IL-6；免疫球蛋白；單克隆抗體；人源化抗體；組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)；尿激酶；血清白蛋白；凝血因子VIII；瘦素；胰島素；干細胞生長因子(SCF)。在這些蛋白質(zhì)中，優(yōu)選造血因子如G-CSF和EPO、甲狀旁腺激素(PTH)和免疫球蛋白，特別是抗體。在抗體中，特別優(yōu)選抗組織因子抗體。
用于本發(fā)明制劑中的蛋白質(zhì)具有實質(zhì)上與哺乳動物特別是人的那些生理活性蛋白相同的生物活性，包括那些衍生自天然來源的蛋白質(zhì)，優(yōu)選由遺傳工程得到的那些。遺傳工程蛋白質(zhì)可以具有與那些天然蛋白質(zhì)相同的氨基酸序列，或者可以包含在所述氨基酸序列中的缺失、置換或添加一個或多個氨基酸但是保持所述生物活性。生理活性的蛋白質(zhì)還包括用PEG或類似物化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。
特別優(yōu)選具有糖鏈的蛋白質(zhì)。糖鏈可以來自任何來源，但是優(yōu)選加入哺乳動物細胞的糖鏈。哺乳動物細胞包括如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、BHK細胞、COS細胞、人衍生的細胞等等，其中最優(yōu)選CHO細胞。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是EPO時，則EPO可以通過任何方法制備，如它可以被提取自人的尿，用各種技術(shù)分離和純化，或者在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、BHK細胞、COS細胞、人衍生的細胞等中用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)(例如JPA No.SHO 61-12288)，然后用各種技術(shù)提取及分離和純化。也包括用PEG或類似物化學(xué)修飾的EPO(參見國際專利申請公開No.WO 90/12874)。也包括沒有糖鏈和用PEG或類似物化學(xué)修飾的EPO。也包括EPO類似物，這些類似物中EPO經(jīng)修飾，以在EPO的氨基酸序列中N連接的糖鏈結(jié)合部位或0連接的糖鏈結(jié)合部位增加一個或多個糖基化位點的數(shù)目(例如參見JPA No.HEI 8-151398和JPA No.HEI8-506023)。而且，糖鏈的數(shù)量可以通過增加唾液酸或類似物的含量而不改變糖鏈結(jié)合部位的數(shù)目來增加。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是G-CSF時，則可以使用任何高純度的人G-CSF。本發(fā)明中的G-CSF可用任何方法制備，如可以從人腫瘤細胞系的培養(yǎng)物中提取它們，用不同的技術(shù)分離和純化，或者在細菌細胞如E.Coli；酵母細胞；動物培養(yǎng)細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)、C127或COS細胞中用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)，然后用不同的技術(shù)提取及分離和純化。G-CSF優(yōu)選在E.Coli、酵母或CHO細胞中通過遺傳重組，最優(yōu)選在CHO細胞中通過遺傳重組生產(chǎn)。也包括用PEG或類似物化學(xué)修飾的G-CSF(參見國際專利申請公開No.WO 90/12874)。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是抗體時，則抗體沒有特殊限制，只要其結(jié)合到目標抗原上即可，適合時可以使用小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、綿羊抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體等等。抗體可以是多克隆的或單克隆的，但是優(yōu)選單克隆的，因為同質(zhì)性抗體能夠穩(wěn)定地生產(chǎn)。多克隆和單克隆抗體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。
產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤基本上可由下述已知的技術(shù)構(gòu)建。將目標抗原或表達目標抗原的細胞用作免疫抗原，按照標準免疫技術(shù)使宿主細胞免疫，通過標準的細胞融合技術(shù)將得到的免疫細胞融合入已知的親代細胞，然后用標準篩選法篩選融合細胞，選出單克隆抗體產(chǎn)生性細胞(雜交瘤)?？梢宰裾杖鏜ilstein等的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)733-46)進行雜交瘤的構(gòu)建。如果抗原免疫原性低，它可以結(jié)合到免疫原性的大分子如白蛋白上并用于免疫。
可以使用重組體抗體，這種重組體是應(yīng)用遺傳工程技術(shù)(參見如Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTICMONOCLONAL ANTIBODIES.MACMILLAN PUBLISHERS公司在英國出版，1990)用包含從雜交瘤克隆的抗體基因的適當(dāng)載體轉(zhuǎn)化宿主而生產(chǎn)。特別地，抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA序列是利用逆轉(zhuǎn)錄酶由雜交瘤的mRNA合成的。一旦得到編碼目的抗體V區(qū)的DNA序列，它們就可以結(jié)合到編碼目的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA序列上，并且被整合入表達載體?；蛘?，編碼抗體V區(qū)的DNA序列可以被整合入包含抗體C區(qū)的DNA序列的表達載體。它們可以用這樣一種方式被整合入表達載體，所述的方式就是它們可以在調(diào)節(jié)區(qū)如增強子和啟動子的控制下被表達。然后，宿主細胞可以用這個表達載體轉(zhuǎn)化從而表達抗體。
在本發(fā)明中，可以使用重組抗體，即經(jīng)人工修飾以減少在人中的抗原性或達到其它目的的抗體，如嵌合抗體和人源化抗體。這些經(jīng)修飾的抗體可以用已知的方法制備。嵌合抗體由從非人哺乳動物如小鼠中得到的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)和人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)組成，可以通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA序列與人抗體恒定區(qū)的DNA序列連接用包含連接序列的表達載體轉(zhuǎn)化宿主，讓其產(chǎn)生嵌合抗體而得到。
人源化抗體也被稱為重構(gòu)人抗體，是通過將來自非人哺乳動物如小鼠的抗體的互補決定區(qū)(CDRs)移植入人抗體的互補決定區(qū)而得到，制備人源化抗體的典型基因重組技術(shù)也是已知的。特別的，設(shè)計將小鼠抗體的CRDs連接到人抗體的構(gòu)架區(qū)(FRs)上的DNA序列是通過PCR從多個被制備成具有末端重疊區(qū)的寡核苷酸合成的。將得到的DNA序列連接到編碼人抗體恒定區(qū)的DNA序列上，然后整合到表達載體中，這種表達載體被轉(zhuǎn)化到宿主中讓它產(chǎn)生重構(gòu)抗體(參見歐洲專利申請公開No.EP239400，國際專利申請公開No.WO 96/02576)。連接CDRs的人抗體的FRs是以這樣的方式進行選擇的，即互補決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位。如果必要，重構(gòu)人源化抗體在可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)可以具有一些氨基酸變化，以便互補決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K.等，Cancer Res.(1993)53.851-856)。
獲得人抗體的方法也是已知的。例如，對目標抗原具有結(jié)合活性的目標人抗體可以通過在體外用目標抗原或表達目標抗原的細胞免疫人淋巴細胞并將免疫的淋巴細胞和人骨髓瘤細胞如U266融合而獲得(參見JPB No.HEI 1-59878)。目標人抗體也可以通過用抗原免疫具有所有人抗體基因組成成分的轉(zhuǎn)基因動物而獲得(參見國際專利申請公開Nos.WO 93/12227，WO 92/03918，WO 94/02602，WO 94/25585，WO96/34096，WO 96/33735)。通過使用人抗體文庫淘選而獲得人抗體的方法也是已知的。例如，結(jié)合到抗原上的噬菌體可以通過用噬菌體展示法將作為單鏈抗體片段(scFv)的人抗體可變區(qū)表達于噬菌體表面上而進行選擇。編碼與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列是通過分析所選的噬菌體的基因而測定的。在與抗原結(jié)合的scFv片段的測定DNA序列的基礎(chǔ)上，通過制備適當(dāng)?shù)谋磉_載體可以獲得完整的人抗體。這些方法從WO 92/01047，WO 92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236.WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388中已經(jīng)是熟知的。
當(dāng)抗體是通過將初步分離的抗體轉(zhuǎn)化入合適的宿主而制得時，所述適當(dāng)?shù)乃拗骺梢耘c表達載體聯(lián)合使用。作為宿主使用的適當(dāng)?shù)恼婧思毎▌游锛毎⒅参锛毎驼婢毎?。已知的動物細胞包?1)哺乳動物細胞如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa和Vero細胞；(2)兩棲動物細胞如非洲蟾蜍屬卵母細胞；或者(3)昆蟲細胞如sf9、sf21和Tn5。已知的植物細胞包括煙草屬的細胞如Nicotiana tabacum，其可以用作愈傷組織培養(yǎng)。已知的真菌細胞包括酵母，例如酵母屬物種如saccharomyces serevisiae和絲狀真菌如曲霉屬物種如黑曲霉(Aspergillus miger)。原核細胞可用作使用菌細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。已知的細菌細胞包括大腸桿菌(E.Coli)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)。用目的抗體基因轉(zhuǎn)化這些細胞并在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞可以獲得抗體。
本發(fā)明的穩(wěn)定制劑中包含的抗體包括但不限定于，抗IL-6受體抗體、抗HM1.24抗原單克隆抗體、抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗PTHrP抗體)、抗組織因子抗體，等等。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的重構(gòu)人源化抗體包括人源化抗IL-6受體抗體(hPM-1)(參見國際專利申請公開No.WO 92-19759)、人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體(參見國際專利申請公開No.WO 98-14580)和人源化抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗PTHrP抗體)(參見國際專利申請公開No.WO 98-13388)。
我們制備了人/小鼠的嵌合抗體，該抗體由對抗人組織因子的小鼠單克隆抗體的可變區(qū)(V區(qū))和人抗體的恒定區(qū)(C區(qū))組成，以及由被轉(zhuǎn)移到人抗體中的抗人組織因子的小鼠單克隆抗體的輕鏈(L鏈)可變區(qū)和重鏈(H鏈)可變區(qū)中的互補決定區(qū)組成，并報道這些將可被期望成為DIC、動脈血栓形成和靜脈血栓形成的優(yōu)良治療劑(WO 99/51743，WO 01/24626)。特別優(yōu)選的是WO 99/51743中描述的包含人源化H鏈形式i和人源化L鏈形式b2的組合的人源化抗人組織因子抗體，它是由CHO細胞產(chǎn)生的重組抗體。許多抗人組織因子抗體已經(jīng)被報道(WO 99/51743，WO 88/07543，WO 96/40921，WO 98/40408，WO 01/70984)。它們可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備，因為它們的抗原組織因子是已知的(Ito T等，J.Biochem.114.691-696，(1993))。這些抗人組織因子抗體也是用于本發(fā)明的優(yōu)選抗體。
本發(fā)明制劑中包含的抗體可以屬于任意免疫球蛋白類，優(yōu)選IgG，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
本文中使用的“含抗體的溶液”可以是包含任何抗體的溶液，不論是生物衍生的還是重組的，優(yōu)選在其中培養(yǎng)包含抗體的哺乳動物細胞如CHO細胞的培養(yǎng)基，或者通過將這樣的培養(yǎng)基進行一定的處理如部分純化(本體溶液)而得到的溶液，或者如上所述制備的給動物如人施用的溶液制劑。
本文中使用的“不溶性異物”是指很容易檢測到的溶液制劑中不應(yīng)該含有的不溶性異物，并當(dāng)按照日本藥典中一般檢測、方法和裝置部分中關(guān)于注射劑的不溶性異物檢測一節(jié)中所定義的，將溶液制劑放在容器中在白熾燈下用肉眼在光線強度大約為1000勒克司的位置觀察時，所述溶液制劑是澄清的。
本文中使用的“抗體的生物活性”是指抗體結(jié)合與其抗原的能力，可以用抗原中和活性試驗測定。當(dāng)抗體是人源化抗人組織因子抗體時，保留抗體生物活性的制劑是指在25℃加速試驗6個月后，制劑保留抗體原種生物活性的60％或更多，優(yōu)選70％或更多；還更加優(yōu)選80％或更多，最優(yōu)選90％或更多。
在本發(fā)明中，抗體制劑的純度檢查可以用下述的凝膠過濾色譜法和陰離子交換色譜法來進行。
本發(fā)明的含蛋白質(zhì)的制劑中，通過添加泊洛沙姆作為表面活性劑，在不存在抗化氧劑的情況下，可以維持制劑的高生物活性，不引起蛋白質(zhì)的氧化并且能夠抑制不溶性異物的形成。
泊洛沙姆是非離子型表面活性劑，由一系列的環(huán)氧乙烷和1，2-環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物組成，其通式如下HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH泊洛沙姆包括USP(美國藥典)中描述的泊洛沙姆124、188、237、338和407，其中本發(fā)明特別優(yōu)選泊洛沙姆188。USP中描述的泊洛沙姆188是上述通式的化合物，其中a是80，b是27，平均分子量為7680-9510，BP(英國藥典)中描述的泊洛沙姆188是上述通式的化合物，其中a為大約75，b為大約30，平均分子量為8350。另外，EP(歐洲藥典)描述了泊洛沙姆182、184和331。Pluronics(可由BASF獲得的泊洛沙姆的商標)如Pluronics L35，L43，L44，L61，L62，L64，F(xiàn)68，L81，P84，P85，F(xiàn)87，F(xiàn)88，L92，F(xiàn)98，L101，P103，P104，P105，F(xiàn)108，L121，P123和F127也包括在本發(fā)明的泊洛沙姆的范圍內(nèi)。
在藥物制劑中泊洛沙姆以前被用作靜脈內(nèi)注射的脂肪乳劑的乳化劑或保持酏劑或糖漿劑澄清的增溶劑，但是沒有被用作含蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定劑。
添加的泊洛沙姆的量取決于使用的泊洛沙姆的類型和蛋白質(zhì)的類型和濃度，但泊洛沙姆188的量典型地是0.001-100mg/mL，優(yōu)選0.005-50mg/mL，更優(yōu)選0.01-10mg/mL。
本發(fā)明的含蛋白質(zhì)的制劑中，使用泊洛沙姆作為表面活性劑，消除了當(dāng)使用聚山梨酯時所需要的添加抗氧劑如L-蛋氨酸的需要。
本發(fā)明的含蛋白質(zhì)的制劑可以包含氨基酸作為穩(wěn)定劑。氨基酸包括但不限定于亮氨酸、色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸和它們的鹽。
為了抑制在凍/融循環(huán)過程中二聚體的形成，本發(fā)明的制劑還可以包含糖醇如甘露糖醇和山梨糖醇；以及非還原性低聚糖，如非還原性二糖例如蔗糖和海藻糖或非還原性三糖例如棉子糖。尤其優(yōu)選非還原性低聚糖。優(yōu)選的非還原性低聚糖是非還原性二糖，更優(yōu)選蔗糖和海藻糖。
優(yōu)選地，本發(fā)明的含抗體的溶液制劑實質(zhì)上不含有蛋白質(zhì)如人血清白蛋白或作為穩(wěn)定劑的純明膠。
本發(fā)明的抗體制劑的pH優(yōu)選4-8，更優(yōu)選5-7.5，然而，pH取決于所包含的抗體，并且不限于這些數(shù)值。
本發(fā)明的制劑還可以含有等滲劑，如聚乙二醇；以及糖，例如葡聚糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖。
如果需要，本發(fā)明的含抗體的溶液制劑還可以包括稀釋劑、增溶劑、賦形劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩和劑、緩沖劑、含硫還原劑、抗氧化劑等等。例如，含硫的還原劑包括N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巰基乙酸(thioglycolic acid)和其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽和含巰基的化合物如具有1至7個碳原子的硫代鏈烷酸?？寡趸瘎┌ó惪箟难帷⒍』u基甲苯、丁基羥基茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸或其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或螯合劑如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉和偏磷酸鈉。也可以包含其它常用的添加劑，如無機鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀和碳酸氫鈉；以及有機鹽，例如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀和醋酸鈉。
可以如下制備本發(fā)明的制劑將這些組分溶解于溶液制劑領(lǐng)域已知的含水緩沖溶液中，如磷酸鹽緩沖液(優(yōu)選磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉體系)和/或檸檬酸鹽緩沖液(優(yōu)選檸檬酸鈉緩沖液)，制成溶液制劑。緩沖液的濃度典型地是1-500mM，優(yōu)選5-100mM，更優(yōu)選10-50mM。
本發(fā)明含有抗體的溶液制劑通常是通過胃腸道外途徑給藥，如注射(例如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)或者經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、鼻腔或肺給藥，也可以口服給藥。
本發(fā)明的含蛋白質(zhì)的制劑可以是凍干制劑或者是溶液制劑，優(yōu)選溶液制劑。溶液制劑通常在密封并滅菌的具有確定容積的塑料或玻璃容器，如小瓶、安瓿或注射器或者大容積如瓶中被供應(yīng)。從方便的角度，優(yōu)選預(yù)填充的注射器。
本發(fā)明制劑中所含抗體的量一般為0.1-200mg/ml，優(yōu)選1-120mg/ml，取決于所治療的疾病的種類、疾病嚴重程度和患者的年齡以及其它因素。
如下面實施例所示，本發(fā)明的溶液制劑通過添加泊洛沙姆作為表面活性劑，不添加抗氧化劑能夠以高水平保持抗體制劑的生物活性，并抑制不溶性異物的形成。
下述的實施例進一步闡述了本發(fā)明，但是不限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本說明書而做出各種變化和修改，這些變化和修改也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例樣品1.抗體樣品WO 99/51743中描述的人源化抗人組織因子抗體，其包含人源化H鏈形式i和人源化L鏈形式b2的組合，被用作抗人組織因子抗體。用在下述實施例中的抗人組織因子抗體是由CHO細胞產(chǎn)生并屬于IgG4類的重組抗體。
2.粒細胞集落刺激因子(G-CSF)使用的粒細胞集落刺激因子是在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中使用基因重組方法通過遺傳工程技術(shù)而制得以及提取并分離/純化的。
3.甲狀旁腺激素(PTH)具有1-84個殘基的甲狀旁腺激素是由WO9014415中描述的方法制備的。
試驗方法(1)TF中和活性試驗組織因子(TF)是在細胞表面上表達的凝血因子VII受體并被定位為凝血反應(yīng)的實質(zhì)觸發(fā)物。組織因子通過與凝血因子VII形成復(fù)合物而激活凝血因子IX和X。因此，人源化的抗人組織因子抗體的生物活性可以通過下面描述的使用凝血因子VIIa溶液和凝血因子X溶液的的方法測定。
1.制備下列溶液。
1)A.B.(測試緩沖液)TBS(pH 7.6)包含5mmol/L CaCl2，0.1％BSA。
2)因子VIIa&Thromborel S的混合溶液因子VIIa和Thromborel S分別用A.B.稀釋至0.1PEU/mL和0.42mg/mL。
3)因子X溶液因子X用A.B.稀釋至0.25PEU/mL。
4)混合的Testzyme顯色底物S-2222溶液1.5mg/mL顯色底物S-2222溶液與水及1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚溴化物水溶液以1∶1∶2的比例混合。
2.將因子VIIa和Thromborel S的混合溶液以60μL/孔分配于板中并允許在室溫下放置60分鐘。
3.將抗人組織因子抗體儲備溶液(標準溶液)和用因子X溶液稀釋的樣品溶液以40μL/孔分配于板中并允許在室溫下放置30分鐘。
4.通過添加10μL/孔0.5mol/L的EDTA溶液結(jié)束反應(yīng)，然后將混合的Testzyme顯色底物S-2222溶液以50μL/孔分配于板中并允許在室溫下放置30分鐘。
5.測定在405nm-655nm處的吸光度。
6.每個測試樣品的生物活性基于標準曲線分析被計算為標準溶液的百分數(shù)。
縮略語TBS三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水BSA牛血清白蛋白EDTA乙二胺四乙酸(2)離子交換柱色譜法(IEC)分析條件如下柱DEAE-NPR(4.6mm I.D.x3.5cm)流動相A50mmol/L Tris緩沖液，pH 8.0
B50mmol/L Tris緩沖液+500mmol/L NaCl，pH 8.0梯度0-5min溶液B0％5-40min溶液B 0→50％流速1.0mL/min檢測在280nm處的UV吸收樣品載荷相當(dāng)于100μg(3)分析不溶性異物按照日本藥典中一般檢測、方法和裝置部分中關(guān)于注射劑的不溶性異物檢測一節(jié)中所定義的，在白熾燈下在光線強度大約為1000勒克司的位置以肉眼觀察裝在容器中的溶液制劑。
實施例1添加表面活性劑對生物活性的影響測試了含有不同表面活性劑的抗人組織因子抗體溶液制劑的生物活性隨時間的變化。測試了在5℃下保存14天和在40℃下保存14天后，含2.3mg/mL抗人組織因子抗體的醋酸鹽緩沖液和0.5mg/mL的聚山梨酯20或80(均是A公司制造)或泊洛沙姆188(B公司制造)作為表面活性劑的樣品(pH6.0)的生物活性(TF-中和活性)。為了比較，也以相同方式測試了不含表面活性劑的組。結(jié)果如圖1所示。
和含有聚山梨酯80制劑形成對比，該制劑顯示抗人組織因子抗體的生物活性明顯損失，含有泊洛沙姆188的制劑保持與不含表面活性劑的制劑的類似活性。在包含本領(lǐng)域中被稱為可注射表面活性劑的聚山梨酯20的制劑中也觀察到了活性損失。
實施例2表面活性劑對生物活性和純度的影響測試了添加表面活性劑對抗人組織因子抗體溶液制劑的生物活性和純度的影響。在25℃加速試驗6個月后，通過TF-中和活性試驗測試了含10mg/mL抗人組織因子抗體的醋酸鹽緩沖液和0.5mg/mL的聚山梨酯80(C公司制造)或泊洛沙姆188(D公司制造)作為表面活性劑的樣品(pH5.5)的生物活性，通過離子交換色譜法(IEC)測定其純度。為了比較，也以相同的方式測試了不經(jīng)加速試驗的抗人組織因子抗體儲備溶液(本體)。結(jié)果如圖2所示。
含有泊洛沙姆188作為表面活性劑的制劑的生物活性是抗人組織因子抗體儲備溶液生物活性的92％，而含有聚山梨酯80的制劑的生物活性為52％。
在離子交換色譜法中，含有聚山梨酯80的抗人組織因子抗體溶液制劑中的主峰降低，在主峰的前面立即出現(xiàn)一個新的峰(在圖2中用箭頭指示)。在主峰前立即出現(xiàn)的峰部分是含有一些氧化的氨基酸殘基的衍生物造成的。然而，含有泊洛沙姆188的制劑保持與抗人組織因子抗體儲備溶液的相似色譜圖。
這些結(jié)果顯示，泊洛沙姆188在生物活性和純度方面都優(yōu)于聚山梨酯80。
實施例3與添加泊洛沙姆的影響比較，添加L-蛋氨酸對由聚山梨酯80誘導(dǎo)的抗人組織因子抗體活性損失的影響測試了添加L-蛋氨酸對由聚山梨酯80誘導(dǎo)的抗人組織因子抗體活性損失的影響，并與含有泊洛沙姆的制劑作比較。制備了含有10mg/mL抗人組織因子抗體醋酸鹽緩沖液以及1)0.5mg/mL聚山梨酯80，2)0.5mg/mL聚山梨酯80和5mg/mL的L-蛋氨酸，或者3)0.5mg/mL泊洛沙姆188的樣品(pH 5.5)。
在25℃加速試驗6個月后，通過TF-中和活性試驗測定每個樣品的生物活性，并與抗人組織因子抗體儲備溶液(本體)的生物活性比較。
結(jié)果如圖3所示。由聚山梨酯80誘導(dǎo)的活性損失被添加L-蛋氨酸抑制。含有泊洛沙姆188樣品顯示了與含有聚山梨酯80和L-蛋氨酸的樣品的類似的或者更高的生物活性。
實施例4表面活性劑對不溶性異物的影響測試了添加表面活性劑對抗人組織因子抗體溶液制劑中不溶性異物形成的影響。在制備后立即和在5℃儲存24個月后，測試了含有10mg/mL抗人組織因子抗體醋酸鹽緩沖液和0.5mg/mL聚山梨酯80(C公司制造)或泊洛沙姆188(D公司制造)作為表面活性劑的樣品(pH6.0)的不溶性異物。為了比較，也以相同的方式測試了不含表面活性劑的組。結(jié)果顯示在表1中。顯示的是在5個樣品瓶中觀察到有不溶性異物的瓶的數(shù)目。在不含表面活性劑的樣品中制備后立即觀察到了不溶性異物。然而，在含有泊洛沙姆188和聚山梨酯80的樣品中沒有觀察到不溶性異物的形成。
表1

(4)泊洛沙姆對蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用的實驗將不同的表面活性劑加入上述的粒細胞集落刺激因子溶液制劑和甲狀旁腺激素溶液制劑中，評價它們對粒細胞集落刺激因子和甲狀旁腺激素氧化作用的影響。
實施例5表面活性劑對粒細胞集落刺激因子氧化作用的影響測試了表面活性劑對粒細胞集落刺激因子溶液制劑的影響。在25℃加速試驗5周后，用反相色譜法(RPC)測定含有0.25mg/mL集落刺激因子磷酸鹽緩沖液和0.05％聚山梨酯80(A公司制造)、聚山梨酯20(A公司制造)或泊洛沙姆188(B公司制造)作為表面活性劑的樣品(pH6.5)的粒細胞集落刺激因子的氧化衍生物的含量。
分析條件如下。
柱DAISOPAK SP-300-5-C4-P(4.6mm I.D.x25cm)流動相A乙腈∶水∶三氟醋酸＝400∶600∶1
B腈∶水∶三氟醋酸＝800∶200∶1梯度0-25min 溶液B 20→90％25-40min 溶液B 90→90％40-41min 溶液B 90→20％41-60min 溶液B 20％流速0.3mL/min載荷10μL柱溫35℃檢測波長在215nm處的UV吸收結(jié)果如圖4所示。
反相色譜法顯示，在包含不同表面活性劑的粒細胞集落刺激因子溶液制劑的主峰前立即出現(xiàn)氧化的衍生物(在圖4中用箭頭表示)。這些峰部分是由于包含一些氧化的氨基酸殘基的粒細胞集落刺激因子的衍生物而形成的。
在包含聚山梨酯20的樣品中氧化衍生物的含量最高，其次是聚山梨酯80，再次是泊洛沙姆188。
實施例6表面活性劑對甲狀旁腺激素的氧化作用的影響測定表面活性劑對甲狀旁腺激素溶液制劑的影響。在40℃加速試驗2周后，用反相色譜法(RPC)測定含有0.25mg/mL甲狀旁腺激素檸檬酸鹽緩沖液和0.05％聚山梨酯80(A公司制造)、聚山梨酯20(A公司制造)或泊洛沙姆188(B公司制造)作為表面活性劑的樣品(pH5.0)的甲狀旁腺激素的氧化衍生物的含量。
分析條件如下。
柱YMC-Pack ODS A-312(4.6mm I.D.x15cm)流動相A腈∶水∶三氟醋酸＝0∶1000∶1B乙腈∶水∶三氟醋酸＝600∶40O∶1
梯度0-40min 溶液B 40→60％40-42min溶液B 60→60％42-42.5min 溶液B 60→40％42.5-60min 溶液B 40％流速1.0mL/min載荷10μL柱溫25℃檢測波長在215nm處的UV吸收結(jié)果如圖5所示。
反相色譜法顯示，在包含不同表面活性劑的甲狀旁腺激素溶液制劑的主峰前立即出現(xiàn)氧化的衍生物(在圖5中用箭頭表示)。這些峰部分是由于包含一些氧化的氨基酸殘基的甲狀旁腺激素的衍生物而形成的。
在包含聚山梨酯20樣品中的氧化衍生物的含量最高，其次是聚山梨酯80，再次是泊洛沙姆188。
這些結(jié)果顯示，泊洛沙姆188在對蛋白質(zhì)溶液制劑的抗氧化作用方面優(yōu)于聚山梨酯。
工業(yè)實用性本發(fā)明穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑在顯示，即使長期儲存后既沒有生物活性損失，也沒有形成不溶性異物。它們是穩(wěn)定的制劑，其中蛋白質(zhì)的氧化衍生物的產(chǎn)生被有效地抑制。
權(quán)利要求
1.一種含有泊洛沙姆作為表面活性劑的蛋白質(zhì)制劑。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)制劑，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)制劑，它是溶液制劑。
4.權(quán)利要求1至3任一項的蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)是免疫球蛋白。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)制劑，其中所述免疫球蛋白是人源化抗體。
6.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)制劑，其中所述免疫球蛋白是抗組織因子抗體。
7.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)制劑，其中所述抗組織因子抗體是人源化抗組織因子抗體。
8.權(quán)利要求1至9任一項的蛋白質(zhì)制劑，它不含作為添加劑的抗氧化劑。
9.一種通過添加泊洛沙姆作為表面活性劑，不添加抗氧化劑而保持蛋白質(zhì)制劑中的生物活性以及抑制不溶性異物形成的方法。
10.權(quán)利要求1至3任一項的蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)是粒細胞集落刺激因子。
11.權(quán)利要求1至3任一項的蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)是甲狀旁腺激素。
全文摘要
含有泊洛沙姆作為表面活性劑的蛋白質(zhì)制劑；以及通過添加泊洛沙姆作為表面活性劑，不添加抗氧化劑而保持蛋白質(zhì)制劑的生物活性以及抑制不溶性異物形成的方法。
文檔編號A61K38/29GK1744912SQ200480003079
公開日2006年3月8日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月28日
發(fā)明者齋藤彰彥, 宮內(nèi)英一 申請人:中外制藥株式會社