專利名稱：具有心率降低特性的混合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是有關一種通過發(fā)酵制造得到的一種混合物，這種混合物是利用一種乳酸菌(lactic acid bacterium)發(fā)酵得到一種食物材料，它包含動物乳汁或植物蛋白質，以得到一種發(fā)酵的食物材料，它包含多肽(peptides)或其它能降低心率的活性成份，以制造出可降低哺乳動物心率的產(chǎn)品。
背景技術：
已有數(shù)篇報導明確的認為，靜止心律的降低與增進存活率之間有著非常強烈的相關連性。在一般人群中，幾篇研究報告顯示較高的靜止心率與死亡率的增加有很強的正相關性，報告中顯示男性死亡率的觀察中有2至3個峰值發(fā)生在靜止心率高達每分鐘88次的地方，相對于群體中其靜止心率是低于每分鐘65次的其它男性人口，心率不只與心血管系統(tǒng)所造成的死亡率有關，而且也與癌癥等其它原因所造成的死亡有關。Zaza等人曾于2001年假設在降低心率與一般壽命的預期之間存在相關性。
在現(xiàn)今發(fā)達國家中，最常見的心血管疾病為冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)或是冠狀心臟病(coronary heart disease，CHD)，它們是心臟遭受到攻擊的主要原因。CAD及CHD是指位在心臟表面的動脈硬化，“動脈硬化”是指動脈變窄與僵硬而阻礙到血液流動的一種狀態(tài)。
較低心率與較好的結果有關，特別是降低心律不齊的危險性；較高心率可能反映出較高的新陳代謝率和較低的迷走神經(jīng)活性，因而增加了缺血性的危險率。此外，較高的心率也可能使心室的功能惡化(Lombardi，F(xiàn) in Zaza et al.，2001)，因此并不奇怪有報道說，較高心率是導致CAD或CHD的非常相關的重要因素。CAD或CHD通常以藥物治療方式來治療，這些藥物治療是通過不同的機制來進行，例如1.β阻斷器，通過阻斷某種化學物質與心臟上之β接收器之間的連結，來降低心臟的負荷。
2.硝酸鹽，直接作用于血管上，使血管松弛并允許更多的富含氧血到達心臟。
3.鈣離子通道阻斷器，可增加流至心臟的血流量，并通過血管的壓縮與繃緊信號通知來阻斷鈣離子而降低心臟負荷。
4.抗血小板凝集(例如阿斯匹林)，可抑制血小板(存在于血液中的極小顆粒)凝集血液形成凝塊，使血液凝塊與聚集的情況降低。
在這種疾病的早期發(fā)展中，高心率的預防是用藥物來治療高心率的一種手段。大量可產(chǎn)生生物活性成分的食物認為是有益于生命健康或提升健康的。
已知乳酸菌(LAB)可以使牛奶發(fā)酵而產(chǎn)生抗高血壓(anti-hypertensive)的功效，因為牛奶中酪蛋白的多肽在乳酸菌的作用下進行蛋白質分解，這實施例的相關說明是在EP 821968(Calpis Food Industry)、EP 1016709(Calpis Food Industry)及WO 0132836(Valio Ltd.)等專利案中。
Yamamoto等人于1996年發(fā)表的文章中表明使用瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)來發(fā)酵的牛奶可以降低收縮壓與舒張壓，然而在其它文獻中觀察到的則無任何改變，包括脈搏速率。
WO0185984(Davisco International Foods，Inc.)也是有關具有抗高血壓功效(血液減少功效)的多肽，這種多肽來自于乳漿蛋白的酶消化。測量心率與血壓的變化，可以觀察到在平均動脈血壓中有一個明顯的減少，而且除了75毫克/公斤(mg/kg)的劑量可以導致心率降低之外，其余發(fā)生在30至150毫克/公斤間的劑量與心率反應并無任何有意義的差異存在。
Fuglsang，A.等人(2002)的文章描述，如同Yamamoto等人(1996)的結論文章，發(fā)酵牛奶多肽具有抗高血壓的特性。在3569頁第2段第1行中，測試樣品的反應表明與非發(fā)酵牛奶(安慰劑)相比，發(fā)酵牛奶對心率的影響非常微小。
上面所提到的Yamamoto等人(1996)的文章、Fuglsang，A.等人(2002)的文章和WO0185984文件中皆指出，雖然乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品具有降低血壓特性，但沒有理由相信它對于降低心率也具有同樣之功效。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種有利于降低心率的產(chǎn)品。
這解決方式是基于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過乳酸菌(LAB)發(fā)酵的食物材料，最好是牛奶，可以得到具有增加心率降低特性的活性成份。具體參見實施例1的表1。
因此，本發(fā)明的第一方面是有關發(fā)酵制程所制得的混合物，這種混合物是利用一種乳酸菌發(fā)酵食物材料，包括動物乳汁或植物蛋白質，以得到一種發(fā)酵的食物材料，它是包含多肽或其它具有心率降低特性的活性成份，以制造出可以降低哺乳動物之心率的產(chǎn)品。
第二方面，本發(fā)明提供一種發(fā)酵食物材料，它具有降低哺乳動物的心率的特性，并包含通過至少一種乳酸菌品種發(fā)酵所得的活性成份。特別是使用瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)品種CHCC5951(DSM 14998)發(fā)酵的食物材料是最佳實施例。
認為提取包含活的及死的菌種的食物是尤其有益于健康的，因此，本發(fā)明的第三方面是提供一種發(fā)酵食物材料，它具有降低哺乳動物的心率特性，并包含失活的或有活性的瑞士乳桿菌菌種DSM 14998或其突變種。
由劑量反應實驗(實施例4)可知，若混合物為高濃度的降低心率合成物，可能得到更大的效果，因此，本發(fā)明的第四方面是提供從發(fā)酵食物材料中分離出心率降低成份。
更進一方面，本發(fā)明是描述使用發(fā)酵食物材料或從中分離出心率降低活性成份而制作成藥劑，用于治療或緩和冠狀動脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高血壓、動脈硬化、中風、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術后再狹窄(restenosis following angioplasty)、心律不齊、心跳節(jié)律不齊、充血性心臟衰竭(Congestive Heart Failure，CHF)、主動脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙等。
定義在對本發(fā)明的細節(jié)進行討論之前，以下針對本發(fā)明主要方面各定義具體詳細說明。
″降低哺乳動物心率″定義為心率的降低與使用在此描述的混合物之前的心率間的相關性。在進行人體試驗前，最好在動物模式中驗證其降低心率的特性。在一個有用的動物模式中是使用胃管灌食法(gavage)將發(fā)酵產(chǎn)品提供給自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)，喂食后再使用遠距測量法24小時的監(jiān)測SHR于不同時間點的心率。安慰劑(Placebo)最好是與未發(fā)酵的食物材料有關，例如未發(fā)酵的牛奶。更進一步的說明請參見工作實施例1所示，但是也要對血壓正常的Wistar大鼠建立一模式，如實施例6所述可用來評估心率的降低。
″乳酸菌″是指一組革蘭氏陽性菌、過氧化氫酶陰性菌、無運動性者(non-motile)、微嗜氧菌或厭氧桿菌，它們能使糖發(fā)酵而制造出酸，包括主要產(chǎn)生的乳酸，、醋酸、甲酸和丙酸。
下面通過具體實施例配合附圖詳加說明。
發(fā)明詳述食物材料本發(fā)明的食物材料包含動物乳汁蛋白質或是植物蛋白質。
最好，食物材料包含有所列舉的動物乳汁蛋白質，例如全脂或脫脂動物乳汁或乳汁酪白質等乳汁蛋白質成份。
食物材料包含所列舉的植物蛋白質，最好是例如谷物、谷物蛋白質、小麥、小麥蛋白質、大豆、脫脂大豆或大豆蛋白質。
包含具有降低心率特性的多肽或其它活性成份的產(chǎn)品在此使用乳酸菌進行發(fā)酵，提供了大量有用且具有很好的心率降低特性的多肽或其它活性成份。因此，并不一定要從發(fā)酵食物材料中更進一步的純化或濃縮該多肽或其它活性成份；且發(fā)酵食物材料可以直接包裝并如食品般于市場上供應，最好是凍干狀態(tài)的功能食品或食品添加物等。
在實施例1中這將獲得驗證。簡言之，實施例1結果顯示，無須任何其它處理，發(fā)酵牛奶本身即具有良好的降低心率功效。另外，凍干的發(fā)酵牛奶可懸浮于中性牛奶中，進而可產(chǎn)生一適當?shù)氖称?，凍干的發(fā)酵牛奶可因而被視為一適當?shù)氖澄锾砑赢a(chǎn)品。
″功能食物″在這是指一食品，消費者通過某種途徑得知這食品具有降低心率特性有關的有用功能，當這種食物被使用時，它亦可為飼料；然而最好是食品。
因此，本發(fā)明在這使用的混合物的實施例是一食品，包含具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，這食品的制作方法包括下列步驟(1)根據(jù)這里指述的具有降低心率特性的活性成分的制備方法來準備一種發(fā)酵的食物材料；(2)將這發(fā)酵食物材料進行干燥；以及(3)以適當方式包裝這發(fā)酵食物材料，以得到一食品或食品添加物。
其中，步驟(2)最好使用冷凍干燥法。
″包裝″應該被理解為廣義的，其是指當一食物材料被發(fā)酵而得到一發(fā)酵食物材料，這發(fā)酵食物材料應該被包裝起來，以提供給消費者。它可以被包裝在一瓶子或一利樂包(tetra pack)內(nèi)，最好是在包裝上或相對應的銷售材料上能夠指明這產(chǎn)品具有心率降低特性。這適用于在這描述的產(chǎn)品可適用任何方面或實施例。
如實施例1所示，由于經(jīng)過加熱處理的發(fā)酵食物材料亦具有心率降低特性，所以在食品中的乳酸菌可以是失活的或有活的。
使用具有降低心率特性的產(chǎn)品如上所述，″降低(還原)哺乳動物心率″定義為心率的降低與使用在這描述的混合物前的心率間的相關性。這心率降低特性的驗證最好是使用胃管灌食法(gavage)將發(fā)酵產(chǎn)品提供給自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)喂食后再使用遠距測量法24小時的偵測SHR于不同時間點的心率和最好是連續(xù)性的。然而亦有其它動物模式可以用來評估這發(fā)酵產(chǎn)品對心率的功效，一個血壓正常的Wistar大鼠模式的實施例是描述如例6所示。安慰劑(Placebo)最好是相關的未發(fā)酵的食物材料，例如未發(fā)酵的牛奶，更進一步的詳細說明參見工作例1。
本產(chǎn)品是可用來治療冠狀動脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高血壓、動脈硬化、中風、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不齊、充血性心臟衰竭(CHF)、主動脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙等。對于這些癥狀而言，本產(chǎn)品是一相當好的藥劑，尤其是對心絞痛、高血壓和動脈硬化的效果尤佳。
此外，對于心率變動問題也產(chǎn)生興趣，在實施例1、4和5中證實發(fā)酵產(chǎn)品可有效降低心率，但也意外地發(fā)現(xiàn)其亦可降低實驗動物活性時期的心率變動。尤其在壓力情況下觀察心率變動頻率的一個重要發(fā)現(xiàn)，即因為在實驗模式中心率變化與死亡率相關，心率變動的阻尼(Damping)可能是一個重要的特征(Zaza et al 2001)。
由于冠狀動脈疾病一般是長期逐漸形成的，在其形成過程中具有許多機會來預防或控制它，預防治療可以早一點開始，如這才可減低動脈硬化生長的速度。因此，本產(chǎn)品的另一種最好使用方法是作為一種預防方式，在這種情形下，本產(chǎn)品更可為一種食品或食物添加物，使人們可以于日常食用或經(jīng)常性食用。
本產(chǎn)品最好具有超過安慰劑10％以上的心率降低功效，且這安慰劑是如上所述與為發(fā)酵食物材料有關。利用這定義，更好的產(chǎn)品是具有超過安慰劑15％以上的心率降低功效；甚至更好的產(chǎn)品是具有一為20％以上的安慰劑的心率降低功效，且最好的產(chǎn)品是具有一為25％以上的安慰劑的心率降低功效。
從發(fā)酵食物材料取得的心率降低多肽或其它活性成份的純化如上所述，在這描述的乳酸菌的使用，是提供發(fā)酵后直接得到大量具有很好心率降低特性的多肽或其它活性成份。
然而，在一些情況下，最好對自發(fā)酵食物材料取得的心率降低多肽或其它活性成份進行一后續(xù)純化步驟，例如，當多肽或其它活性成份被制作成藥劑，例如藥片，其是需要很高濃度的心率降低多肽或其它活性成份。所以，在本發(fā)明一種實施例中，本產(chǎn)品是為一藥劑。
再者，實施例1顯示心率降低功效與產(chǎn)品的濃度因素呈比例關系。
因此，本發(fā)明的一實施例是與在這描述的使用有關，即發(fā)酵食物材料需經(jīng)更進一步處理，以純化或濃縮該具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，其取得的制作方法包括下列步驟(1)準備一發(fā)酵食物材料，其是根據(jù)一制法來準備在這描述的具有心率降低特性的多肽或其它活性成份；(2)對步驟(1)的發(fā)酵食物材料進行更進一步的處理，其處理方式是以純化或向上濃縮這具有心率降低特性的活性成份；以及(3)以適當方式包裝這發(fā)酵食物材料，以得到一產(chǎn)品。
這種方式是為一種可獲得在本產(chǎn)品中相對高濃度的具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的解決方式。
假如這產(chǎn)品是一種食品，則這過程更包含一步驟(4)，將步驟(2)取得的濃縮多肽或其它活性成份添加至一食品中。
根據(jù)上述的步驟(2)，向上濃縮的最佳實施例是將包含具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的發(fā)酵食物材料進行離心，并可在分離后的上清液(supernatant)得到多肽或其它活性成份。假如食物材料是牛奶，則其產(chǎn)物為一乳漿(whey)，如實施例1所示，乳漿是為一具有優(yōu)異心率降低特性的產(chǎn)品。因此，本產(chǎn)品的較佳實施例為乳漿。
這離心分離法最好使用，例如，轉速在2,000rpm至20,000rpm并持續(xù)1至20分鐘，這離心分離法亦可在一離心機中進行的。
這取得的上清液更可進一步利用反相樹脂(reverse-phase resin)進行純化處理，使得到的樣品，其具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的含量逐漸增加。這利用反相樹脂的純化處理是以反相樹脂對多肽或其它活性成份進行吸收及溶離(elution)，及/或利用利用反相色譜分析法(chromatography)，使多肽或其它活性成份的純度增加。
有關這反相樹脂理論文獻的更多的技術說明是請參閱EP 821968。
或者，這發(fā)酵食物材料更可進行進一步處理，其方式是為在發(fā)酵食物材料上進行納米過濾(nanofiltration)，這做法可能為了從發(fā)酵食物材料中去除乳酸或單價離子。
有關這納米過濾理論文獻的更多的技術說明是請參閱WO 01/32905。
如實施例4所述，濃縮到21倍的乳漿產(chǎn)品在心率上有明顯的劑量依賴效應。在這實驗中固定或漸進的水平線并未達到，表示，包含更高濃度活性成份的混合物可預期到具有更高的降低心率功效。
發(fā)酵在本發(fā)明的制作過程中，這種食物材料是由處于操作狀態(tài)的乳酸菌進行發(fā)酵，可以根據(jù)食物材料的種類及/或與乳酸菌的結合不同而變化。如果食物材料并非是水性溶液，最好將食物材料先溶解于適當?shù)乃匀芤褐?，然后再與乳酸菌混合并發(fā)酵培養(yǎng)。
乳酸菌的培養(yǎng)可以通過將先培養(yǎng)乳酸菌的菌原(starter)加入食物材料培養(yǎng)基(medium)來完成，培養(yǎng)基可以先經(jīng)過高溫消毒(heat-sterilized)并冷卻到一預設的培養(yǎng)溫度。乳酸菌菌原的最佳培養(yǎng)濃度為105至107個乳酸菌/每毫升培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度通常為20至50℃，最好為30至45℃；培養(yǎng)時間通常為3至48小時，最好為6至24小時。培養(yǎng)過程最好是在pH值在3.5至7范圍中的培養(yǎng)基中進行，且為了有效地進行乳酸菌培養(yǎng)，其pH值最好是在5至6的間。再者，為進行固定pH值的培養(yǎng)，其pH值最好維持在4至7的范圍內(nèi)。當乳酸菌的濃度超過108個/毫升的后，培養(yǎng)即可終止而不受限制。
有關制作過程的較佳實施例為，食物材料的發(fā)酵是從每100毫升食物材料生產(chǎn)出0.5至25毫克具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，更好的是從每100毫升食物材料生產(chǎn)出1至5毫克具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
哺乳動物哺乳動物包含動物，例如馴養(yǎng)動物(如貓和狗)、豬、牛、羊及魚，這哺乳動物最佳的實施例為人。
乳酸菌如上面所述，有關″乳酸菌″的命名是指一組革蘭氏陽性菌、過氧化氫酶陰性菌、無運動的(non-motile)、微量嗜氧菌或厭氧細菌，能發(fā)酵糖而制造出酸，包括大量產(chǎn)生的乳酸、醋酸、甲酸和丙酸。
另外，還包括屬于乳酸桿菌屬(genus Lactobacillus)的乳酸菌種類，例如瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus delbruekii subsp.bulgaricus)等；屬于乳球菌屬(genus Lactococcus)的乳酸菌，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；屬于鏈球菌屬(genus Streptococcus)的乳酸菌，例如唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus)；屬于明串珠球菌屬(genusLeuconostoc)的乳酸菌，例如乳酸明串珠球菌(Leuconostoc lactis)；屬于雙歧桿菌屬(genus Bifidobacterium)的乳酸菌，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)或短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)；以及屬于片球菌屬(genus Pediococcus)的乳酸菌。
所用乳酸菌可以是含有其它微生物的混合物，例如酵母(yeasts)。
對于本領域技術人員，有許多公開可用的不同乳酸菌，請參照德國國家菌種培育中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，以及國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的因特網(wǎng)分類瀏覽器。
更好的是一種桿菌門(phylum Firmicutes)的乳酸菌，較好的是桿菌綱(classBacillus)，更好的是乳酸桿菌目(order Lactobacillales)，在這目中的乳酸菌為一種乳酸桿菌科(family Lactobacillaceae)，最好是為乳酸桿菌屬，更好地，它是為一種瑞士乳桿菌種。更進一步的詳細說明見伯格氏(Bergey)細菌分類手冊第二版第一冊(Bergey’sManual of Systematic Bacteriology，Second Edition，Volume 1The Archea and the DeeplyBranching and Phototrophic Bacteria)的分類法。
一特別好的瑞士乳桿菌種(Lactobacillus helveticus strain)CHCC 5951的樣品寄存在DSMZ內(nèi)，登記號為DSM 14998，寄存日為2002年5月15日。這種寄存是根據(jù)微生物有機體保存專利程序的國際認可布達佩斯協(xié)議(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Micro organisms for the Purposes of Patent Procedure)的規(guī)定。
所以，有關在這使用的乳酸菌的一個較佳實施例是登記號DSM 14998的瑞士乳桿菌。
另外，一種瑞士乳桿菌種CHCC 4080的樣品寄存在DSMZ，登記號為DSM 14997，寄存日為2002年5月15日。寄存是根據(jù)微生物有機體保存專利程序的國際認可布達佩斯協(xié)議的規(guī)定。
更好的菌種是登記號為FERM BP-4835的瑞士乳桿菌，登記號為FERM BP-6060的瑞士乳桿菌，登記號為DSM 13137的瑞士乳桿菌種，瑞士乳桿菌種CNRZ32以及瑞士乳桿菌CP790。
含有分子量200kDa細胞壁蛋白酶的乳酸菌(LAB)較好的乳酸菌是包含一種分子量約200kDa的特定細胞壁蛋白酶的，這種乳酸菌特別適合制備具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。較佳的乳酸菌詳細說明如下。
這種特定細胞壁蛋白酶在這稱為prtH200蛋白酶。如這部份說明的，prtH200蛋白酶是與在美國威斯康星州與猶他州立大學的論文(1999，J.of Bacteriology，1814592-4597)中所發(fā)表的瑞士乳桿菌種CNRZ32相當，在這論文中并未描述有使用CNRZ32種來制造具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
這乳酸菌的特征在于其包含編碼細胞壁蛋白酶(稱為prtH200)的基因序列，其中定義為prtH200的基因序列是為編碼表現(xiàn)細胞壁蛋白酶活性的酶的脫氧核糖核酸(DNA)序列，這DNA序列是選自包括下述的組(a)這DNA序列是出現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550的位置；(b)DNA序列包含一至少75堿基對(base pairs，bp)的片段(fragment)，其與(a)所定義的DNA序列的對應片段至少有50％的同源性；(c)DNA序列是編碼表現(xiàn)細胞壁蛋白酶活性的多肽(polypeptide)，多肽包含至少200氨基酸(amino acids，aa)的片段，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序列的對應片段至少有30％的同源性；(d)DNA序列是與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的雙股DNA探針在低嚴格性下進行雜交(hybridize)；以及(e)DNA序列，是(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列片段。
存在于乳酸菌中的基因序列編碼成prtH200蛋白酶已被使用適當設計的聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)引物(primer)的PCR擴增方法證實。當本領域技術人員具有適當設計的PCR引物，對他而言，使用其一般知識來選擇一特定適當?shù)腜CR擴增法去驗證這基因序列是否存在于乳酸菌中是相當容易的。
所以，本領域技術人員可以篩選(screen)一定數(shù)量的乳酸菌，驗明包含有prtH200基因序列的乳酸菌，并因此得到具有改良工業(yè)相關特性的特選乳酸菌。
一種特別好的瑞士乳桿菌種CHCC 5951的樣品是寄存在DSMZ，登記號為DSM14998，寄存日為2002年5月15日。這寄存是根據(jù)微生物有機體保存專利程序的國際認可布達佩斯協(xié)議的規(guī)定。
因此，有關在這部份使用的乳酸菌的一較佳實施例是為登記號DSM 14998的瑞士乳桿菌。
使用寄存的DSM 14998品種作為起始物質，使這技藝的讀者可以藉由傳統(tǒng)的突變技術或重新分離技術，以進一步得到突變體或衍生物，其是保持有適合制備具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的能力。
乳酸菌的蛋白質水解活性(Proteolytic activity of the lactic acid bacteria)于這段描述的prtH200、orfF3及orfF4基因序列是可視為指紋，具有高度適合證明在這描述的乳酸菌。不受限于理論，理論上有帶有這里描述的指紋基因序列而不展現(xiàn)有利的特性的菌種存在。
因此，一旦驗證在乳酸菌中具有于這段描述的指紋基因序列存在時，其是有利于測試乳酸菌的蛋白質水解活性，在本文中，一個較佳的乳酸菌是具有一較佳的蛋白質水解活性，詳細說明如下。
在本文中，當一乳酸菌具有合成一活性細胞壁蛋白酶的能力時，這乳酸菌被認為具有蛋白質水解活性；換言的，證明蛋白酶在細菌的細胞部份外有活性。再者，這蛋白酶應該具有使其降解(degrade)蛋白質(例如牛奶中的酪蛋白)的能力，以得到具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
細菌的蛋白質水解活性最好是利用一個程序檢測，包括下列步驟(1)以細菌發(fā)酵200毫升的食物材料一整夜；(2)提取(extract)產(chǎn)生的多肽或其它活性成份；以及(3)測量提取出的多肽或其它活性成份的心率降低特性，是通過測量需要抑制50％血管收縮素轉化酶(ACE)活性的多肽濃度的一種分析法。
這種ACE抑制活性檢測值在這也稱為DL50，DL50值越低，即表示包含在本產(chǎn)品中的多肽或其它活性成份的心率降低效果越佳。
在該程序的步驟(1)中，較好的食物材料為新鮮牛奶；再者，細菌最好以1％v/v灌注至食物材料中，并維持于適當?shù)臏囟冗^夜培養(yǎng)。這種適當溫度是適合細菌生長的溫度，本領域技術人員應知道如何去驗證其為一特定的細菌。對乳酸桿菌種而言，其適當溫度為37℃，對乳酸球菌種的適當溫度則為30℃。
在工作實施例3是提供一詳細的較佳協(xié)議，以說明發(fā)酵及提取步驟，并詳細說明這DL50的ACE活性檢測。
最好，這乳酸菌是具有蛋白質水解活性的能力，這種程序包括下列步驟(1)以細菌發(fā)酵200毫升的食物材料一整夜；(2)提取產(chǎn)生的多肽或其它活性成份；以及(3)測量提取出的多肽或其它活性成份的抗高血壓特性，是利用一種檢測法來測量需要抑制50％ACE活性的多肽濃度。
產(chǎn)生的多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)為0.25至5.0(毫克/毫升)之間。
最好，乳酸菌具有產(chǎn)生多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)0.25至4.0(毫克/毫升)間的能力；更佳者，乳酸菌具有產(chǎn)生多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)0.25至3.5(毫克/毫升)間的能力。
較低的DL50范圍是1.0毫克/毫升而不是0.25毫克/毫升。
根據(jù)慣用的定義，有關″基因″的定義為遺傳的基本物理與功能單位。基因是一種在特定染色體的特定位置上的整齊序列的核苷酸(例如DNA或RNA)，編碼特定功能的產(chǎn)品(例如蛋白質或RNA分子)。
″簡并引物的命名(nomenclature of degenerated primers)″是根據(jù)現(xiàn)有技術的標準命名法，Y＝C或T；R＝A或G；M＝A或C；K＝G或T；S＝G或C；W＝A或T；H＝A或C或T；B＝G或T或C；V＝G或C或A；D＝G或A或T；N＝G、A、C或T。
有關″片段″的名稱是與一DNA/氨基酸有關，這氨基酸是包含代表連續(xù)部份序列的片段。例如，在氨基酸序列的75至300位置是具有600個氨基酸。
有關″對應片段″的名稱是與比較二序列的片段的相同長度有關，最好，這二片段比較后的長度差異是少于50％；換言的，假如一片段為100bp，另一片段則最好少于150bp。更佳者，這二片段比較后的長度差異是小于25％，以及最佳者，這二片段比較后的長度差異小于5％。
prtH200細胞壁蛋白酶存在于乳酸菌中的細胞壁蛋白酶的活性已被證實，一合適的策略是通過在編碼待檢測的細胞壁蛋白酶的基因中的致死突變(lethal mutation)構建一種乳酸菌，然后這構建細菌的蛋白質水解活性(以適當檢測)可與相對應的野生型細菌(wild typebacterium)進行比較，實驗證明具有致死突變的乳酸菌與野生型細菌比較后，可檢測到蛋白質水解活性的減少，證明編碼待檢測的細胞壁蛋白酶基因是編碼活性乳酸細胞壁蛋白酶的基因。
熟悉這種技術的人士知道如何利用適當?shù)闹滤劳蛔儊順嫿ㄒ蝗樗峋渲圃旆绞秸垍⒖既鏟ederson等人(1999)及Yamamoto等人(1994)的論文。
在本發(fā)明的申請日，國家生物技術信息中心(NCBI)在其網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供一種標準BLAST計算機序列同源性的搜索程序。
SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2里表現(xiàn)的瑞士乳桿菌DSM 14998的prtH200的DNA及氨基酸序列是登記在GeneBank數(shù)據(jù)庫中，登記號為AF 133727，且其數(shù)據(jù)庫序列標記為gi|5758038|gb|AF133727.1|AF133727。
標準蛋白質-蛋白質BLAST[blastp]搜尋是使用表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200氨基酸序列作為參考序列，其中，搜尋結果如下所示(斜體字代表數(shù)據(jù)庫序列證明，這報告明白確認已發(fā)表的序列，且本領域技術人員知道如何藉這得到該些序列)gi|129346|sp|P15293|P2P_LACLCPII型蛋白酶前驅物(Lactocepin)(細胞壁-結合絲蛋白酶)有機體Lactococcus lactis subsp.cremoris.
同源性一1600氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對應片段有50％的同源性。
gi|149582|gb|AAA25248.1|蛋白酶有機體Lactobacillus paracasei.
同源性一1632氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對應片段有49％的同源性。
gi|1381114|gb|AAC41529.1|(L48487)蛋白酶前驅物有機體Lactobacillus delbrueckii.
同源性一1682氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對應片段有32％的同源性。
gi|18568398|gb|AAL76069.1|(AF468027)細胞膜蛋白酶有機體Lactobacillus pentosus.
同源性一415氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對應片段有63％的同源性。
gi|9963932|gb|AAG09771.1|AF243528_1(AF243528)細胞膜蛋白酶有機體Streptococcus thermophilus.
同源性一781氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對應片段有30％的同源性。
gi|482386|pir||A44833PII型蛋白酶前驅物(EC 3.4.21.96)有機體Lactococcus lactis.
同源性一264氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對應片段有61％的同源性。
這些特定的序列全部代表一個DNA序列，它編碼表現(xiàn)細胞壁蛋白酶活性的一種多肽，包含至少200氨基酸(amino acids，aa)片段，與位于SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序列的對應片段至少有30％的同源性。
標準核苷酸-核苷酸BLAST[blastn]搜尋是使用表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH200氨基酸序列作為參考序列，其中，搜尋結果如下所示gi|149580|gb|M83946.1|LBAMPRO蛋白酶(prtP)基因有機體Lactobacillus paracasei.
同源性一102bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對應片段有84％的同源性。
gi|47197|emb|X14130.1|SLPRT763質體pLP763prt基因，細胞壁-結合絲蛋白酶有機體Streptococcus lactis同源性一81bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對應片段有86％的同源性。
gi|472834|gb|M24767.1|STRWGPROT.Wg2蛋白酶基因有機體S.Cremoris同源性一81bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對應片段有86％的同源性。
gi|149476|gb|J04962.1|LACPRASE.PIII型蛋白酶(prtP)及成熟蛋白質有機體Lactococcus lactis同源性一81bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對應片段有86％的同源性。
gi|18568397|gb|AF468027.1|.細胞膜蛋白酶(prtP)基因有機體Lactobacillus pentosus同源性一102bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對應片段有83％的同源性。
這些特定的序列全部代表一種包含至少75個堿基對(bp)片段的DNA序列，與位于SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的對應片段至少有50％的同源性。其它″指紋″基因序列(orfF3及orfF4)orfF3最好，除了prtH200基因序列的外，乳酸菌也帶有一個包括orfF3開放讀碼框(openreading frame)的基因，這基因可視為一個附加的指紋。
瑞士乳桿菌DSM 14998的orfF3的DNA及氨基酸序列是表現(xiàn)在SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4。
因此，在一較佳實施例中，在這段描述的乳酸菌包括這prtH200基因和基因序列(稱為orfF3)編碼成一開放讀碼框，其中這基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因組PCR擴增方法來進行識別鑒定，這PCR引物是選自下列所組成的群組[正義序列(sense sequence)稱為S；反義序列(antisense sequence)稱為A]orfF3(a)(S)5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3’(A)5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG3’；及(b)(S)5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW3’，(A)5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR3’。
上述合適的PCR引物可以基于這里提供的序列進行識別確認。
因此，在一較佳實施例中，在這段描述的乳酸菌包括這prtH200基因和基因序列編碼成一開放讀碼框(稱為orfF3)，其中這定義為orfF3的DNA序列是為一脫氧核糖核酸(DNA)序列編碼成一開放讀碼框，且這DNA序列是選自下列組(a)這DNA序列是出現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679的位置；(b)一DNA序列包含一至少75堿基對(bp)的片段(fragment)，其與(a)所定義的DNA序列的對應片段至少有40％的同源性。
(c)一DNA序列是編碼成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的多肽序列的對應片段至少有30％的同源性；(d)一DNA序列是與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的DNA序列的雙股DNA探針在低嚴格性下進行雜交(hybridize)；以及(e)一DNA序列，其是為(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列片段。
名稱″開放讀碼框(open reading frame)″表示一段DNA，它包含轉譯的起始信號、形成蛋白質的足夠長的正確順序的氨基酸三聯(lián)密碼子、轉譯的終止信號，并因此而驗證一蛋白質編碼基因的存在。
在本發(fā)明的申請日，一標準蛋白質-蛋白質BLAST[blastp]搜尋是使用表現(xiàn)在SEQID NO 4的1-893位置的演繹orfF3氨基酸序列作為參考序列，且其相對限制的最終結果是與已發(fā)表的同源序列有關。
然而，不限于理論，理論上，在這段描述的orfF3基因編碼成一細胞壁蛋白酶是為可信的，因此，在一較佳實施例中在這段描述的orfF3基因可編碼成一細胞壁蛋白酶。OrfF4最好，除了prtH200基因序列的外，這乳酸菌亦包括一含有開放讀碼框的基因，在這稱為orfF4。
瑞士乳桿菌DSM 14998的orfF4的DNA及氨基酸序列是表現(xiàn)在SEQ ID NO 5及SEQ ID NO 6。
因此，在一較佳實施例中，在這段描述的乳酸菌包括這prtH200基因和基因序列(稱為orfF4)編碼成一開放讀碼框，其中這基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因組PCR擴增方法來進行識別鑒定，這PCR引物是選自包括下列組成的組[正義序列(sense sequence)稱為S；反義序列(antisense sequence)稱為A]orfF4(a)(S)5’GGTGTTGCTCCTGAAGC3’(A)5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3’上述合適的PCR引物可以基于在這揭露的序列進行識別確認。
因此，在一較佳實施例中，在這段描述的乳酸菌是包括這prtH200基因和基因序列編碼成一開放讀碼框(稱為orfF4)，其中這定義為orfF4是DNA序列編碼成一開放讀碼框，且這DNA序列是選自下列所組成的群組
(a)這DNA序列是表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881的位置；(b)一DNA序列包含一至少75堿基對(bp)的片段，其與(a)所定義的DNA序列的對應片段至少有40％的同源性。
(c)一DNA序列是編碼成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 6的1-1627位置的多肽序列的對應片段至少有30％的同源性；(d)一DNA序列是與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881位置的DNA序列的雙鏈DNA探針在低嚴格性下進行雜交；以及(e)一DNA序列，其是為(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列片段。
在本發(fā)明的申請日，一標準蛋白質-蛋白質BLAST[blastp]搜尋是使用表現(xiàn)在SEQID NO 6的1-1627位置的orfF4氨基酸序列作為參考序列，且其相對限制的最終結果是與已發(fā)表的同源序列有關。
然而，無須受限于學理，理論上，在這段描述的orfF4基因編碼成一細胞壁蛋白酶是為可信的，因此，在一較佳實施例中在這段描述的orfF4基因是可編碼成一細胞壁蛋白酶。
最好，在這段描述的乳酸菌是包括于這敘述的prtH200基因、orfF3基因以及orfF4基因。
聚合酶鏈反應(PCR)擴增如上所述，在這描述的基因序列的存在最好利用使用PCR引物的PCR擴增來證實的，且這PCR引物的設計是根據(jù)在這所教導者。當本領域技術人員具有適當設計的PCR引物時，對他而言，使用其一般知識來選擇一特定適當?shù)腜CR擴增程序去驗證這些基因是否存在于乳酸菌中是相當容易的。
最好，這PCR擴增協(xié)議是根據(jù)實施例2所描述的內(nèi)容來訂定的。
一旦進行PCR擴增，不管產(chǎn)生的PCR擴增序列是否相當于在這段描述的基本片段，對本領域技術人員而言，是為其研究慣常的程序。由于本領域技術人員一班概略地知道一陽性PCR片段會有多大的長度，所以通?？苫赑CR片段的長度來進行驗明，且陽性PCR片段是與在這段描述的基因PCR片段有關。選擇性地，PCR片段可以做DNA測序，然后得到的DNA序列可與在這表明的序列相比較；再者，相對這PCR片段的基因致死變種的乳酸菌是可被構建，然后這構建細菌的蛋白質水解活性(參下面)可以與相對的野生細菌進行比較，且在這二細菌間的蛋白質水解活性的量測變化是可被實驗確認，而不管相當于擴增PCR片段的基因是否為如這段所描述的編碼一種乳酸細胞壁蛋白酶。
總的，不管一特定乳酸菌是否包含給予相對陽性PCR片段的基因能力，本領域技術人員是可使用在這教導所設計的PCR引物來進行驗明。
PCR是用來研究這基因是否存在于乳酸菌中最好的方式，然而，他亦可以以其它進行，例如，利用Southern點雜交分析法(Southern blot analysis)。
PCR引物如上述說明的，關于PrtH200基因的適當PCR引物為PrtH200(a)(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’，(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA3’；(b)(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA3’，(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA3’；及(c)(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA3’，(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK3’。
PrtH200(a)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 7；PrtH200(a)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 8；PrtH200(b)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 9；PrtH200(b)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 10；PrtH200(c)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 11；及PrtH200(c)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 12。
當使用(a)的引物時，擴增的PrtH200PCR片段較佳的長度應該介于400bp至800bp的間，更佳的長度則介于500bp至700bp的間。當使用(b)的引物時，這擴增的PrtH200PCR片段較佳的長度應該介于200bp至500bp的間，更佳的長度則介于250bp至375bp的間。當使用(c)的引物時，擴增的PrtH200PCR片段較佳的長度應該介于400bp至800bp的間，更佳的長度則介于500bp至700bp的間。
最佳的PrtH200相關的PCR引物是為編號(a)的引物以及編號(b)的引物。
如上述說明者，關于orfF3的適當PCR引物為orfF3(a)(S)5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3’(A)5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG3’；及(b)(S)5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW3’，(A)5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR3’。
orfF3(a)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 13；orfF3(a)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 14；orfF3(b)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 15；及orfF3(b)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 16。
當使用(a)的引物時，擴增的orfF3PCR片段較佳的長度應該介于1250bp至1900bp的間，更佳的長度則介于1500bp至1725bp的間。當使用(b)的引物時，擴增的orfF3PCR片段較佳的長度應該介于1250bp至1900bp的間，更佳的長度則介于1500bp至1725bp的間。
最佳的orfF3相關的PCR引物是為編號(a)的引物。
如上述說明者，關于orfF4的適當PCR引物為orfF4(a)(S)5’GGTGTTGCTCCTGAAGC3’，(A)5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3’。
orfF4(a)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 17；及orfF4(a)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 18。
當使用(a)的引物時，擴增的orfF4PCR片段較佳的長度應該介于700bp至1150bp的間，更佳的長度則介于875bp至1025bp的間。
DNA序列的同源/一致性參照上述內(nèi)容，DNA序列的同源/一致性是由兩序列間的同源性程度所決定的。
在本發(fā)明的申請日，國家生物技術信息中心(NCBI)在其網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供一種標準BLAST計算機序列同源性的搜索程序。
BLAST程序是敘述于[Altschul et al(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLASTa newgeneration of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.253389-3402]。
在本文中，較佳的計算機同源搜尋程序是為″標準核苷酸-核苷酸BLAST[blastn]″搜尋，且在本申請案的申請日，在NCBI網(wǎng)站已具有過濾性(filter)低復雜性；預期性(expect)10，及序列長度11等設定。
程序里引入?yún)⒖夹蛄校疫@程序是驗明已發(fā)表序列與參考序列的對應片段間的同源性百分比。
使用標準核苷酸-核苷酸BLAST計算機程序，在這描述的prtH200序列通常為含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20DNA序列的對應片段至少有60％的同源性；更佳者，含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20DNA序列的對應片段至少有70％的同源性；最佳者，含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20DNA序列的對應片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少100堿基對(bp)，最好的片段為至少200堿基對，更佳者的片段為至少400堿基對，最佳者的片段則為至少1500堿基對。
使用標準核苷酸-核苷酸BLAST計算機程序，在這描述的orfF3序列通常為含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA序列的對應片段至少有60％的同源性；更佳者，含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA序列的對應片段至少有70％的同源性；以及，最佳者，含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA序列的對應片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少100堿基對(bp)，最好的片段為至少200堿基對，更佳者的片段為至少400堿基對，最佳者的片段則為至少1500堿基對。
使用這標準核苷酸-核苷酸BLAST計算機程序，在這描述的orfF4序列通常為含有至少75堿基對(bp)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881位置的orfF4DNA序列的對應片段至少有60％的同源性；更佳者，含有至少75堿基對片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881位置的orfF4DNA序列的對應片段至少有70％的同源性；以及，最佳者，含有至少75堿基對片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ IDNO 5的1-4881位置的orfF4DNA序列的對應片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少100堿基對(bp)，最好的片段為至少200堿基對，更佳者的片段為至少400堿基對，最佳者的片段則為至少1500堿基對。
選擇性地，這同源/一致性是可適當?shù)乩萌魏我阎挠嬎銠C程序工具來決定，例如，在GCG程序軟件包中所提供的GAP。
使用GAP來進行DNA序列比對是具有下列設定GAP創(chuàng)造罰分(creation penalty)為5.0，且GAP延伸罰分(extension penalty)為0.3；當使用GAP時，關于BLAST程序所提供的同源性百分比亦可為較佳的同源性。
氨基酸序列的同源性相似于核苷酸同源分析，在本文中，一較佳的計算機同源搜尋程序是為″標準蛋白質-蛋白質BLAST[blastp]″搜尋，且在本申請案的申請日，在NCBI網(wǎng)站已具有統(tǒng)計是；過濾性低復雜性；預期性10；序列長度3；矩陣BLOSUM 62；間隔損失存在11延伸1等設定。
使用這標準蛋白質-蛋白質BLAST計算機程序，在這描述的prtH200序列是編碼成一多肽(polypeptide)，釋出細胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的對應片段至少有40％的同源性；最好，這一編碼成多肽，釋出細胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的對應片段至少有50％的同源性；更佳者，這一編碼成多肽，釋出細胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的對應片段至少有65％的同源性；最佳者，這一編碼成多肽，釋出細胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的對應片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少300氨基酸(aa)，最好的片段為至少400氨基酸，更佳者的片段為至少800氨基酸，最佳者的片段則為至少1200氨基酸。
使用這標準蛋白質-蛋白質BLAST計算機程序，在這描述的orfF3序列是編碼成一多肽(polypeptide)，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的對應片段至少有40％的同源性；最好，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的對應片段至少有50％的同源性；更佳者，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的對應片段至少有65％的同源性；最佳者，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的對應片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少300氨基酸(aa)，最好的片段為至少400氨基酸，更佳者的片段為至少800氨基酸，最佳者的片段則為至少1200氨基酸。
使用這標準蛋白質-蛋白質BLAST計算機程序，在這描述的orfF4序列是編碼成一多肽，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對應片段至少有40％的同源性；最好，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對應片段至少有50％的同源性；更佳者，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對應片段至少有65％的同源性；最佳者，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對應片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少300氨基酸(aa)，最好的片段為至少400氨基酸，更佳者的片段為至少800氨基酸，最佳者的片段則為至少1200氨基酸。
選擇性地，這同源性是可適當?shù)乩萌魏我阎挠嬎銠C程序工具來決定，例如，在GCG程序軟件包中所提供的GAP。
使用GAP來進行DNA序列比對是具有下列設定GAP創(chuàng)造罰分為3.0，且GAP延伸罰分為0.1；當使用GAP時，關于BLAST程序所提供的同源性百分比亦可為較佳的同源性。
雜交反應(Hybridisation)這雜交反應根據(jù)前文所預期是包含一同功DNA序列(analogous DNA sequence)，其是雜交至一雙鏈DNA探針。在一核苷酸探針與一同源DNA或RNA序列的間決定雜交反應為低嚴格性、中嚴格性或高嚴格性的適當實驗條件是包含，將含有欲雜交DNA片段或RNA的濾膜(fliter)預浸(pre-soaking)在5× SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrooket al.1989)溶液中10分鐘，并將濾膜置于5×SSC、5×Denhard’s溶液(Sambrook et al.1989)、0.5％SDS及100mug/ml超聲波處理變性的鮭魚精DNA(Sambrook et al.1989)的溶液中進行預雜交(prehybridization)，隨后在含有10ng/ml隨機引物(Feinberg，A.Pand Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.1326-13)、P-dCTP-標記(特定活性＞1×10cpm/mug)探針的相同溶液中雜交12小時，且其溫度為45℃。然后這濾膜在2×SSC、0.5％SDS溶液下清洗二次30分鐘，其溫度為至少55℃(低嚴格性)，最好的溫度為至少60℃(中嚴格性)，仍為較佳的溫度為至少65℃(中/高嚴格性)，更佳者的溫度為至少70℃(高嚴格性)，以及最佳者的溫度為至少75℃(很高嚴格性)。
利用用X光片(X-ray film)檢測在上述條件下的寡核苷酸探針雜交的分子。


圖1為以濃度3(含有濃縮14.3倍的固體乳漿顆粒的乳漿混合物)或安慰劑治療的動物的心率測量示意圖，每一數(shù)據(jù)點代表8個動物的平均值，其中這些動物的活性周期是符合無光線的周期，如以黑色條表示的周期。
圖2為在動物接受含有固體乳漿成份的乳漿混合物后，于周期12-15小時的動物心率降低示意圖，這固體乳漿成份是分別經(jīng)濃縮2、6、14.3及21次，相對于在牛奶發(fā)酵后取得的乳漿中所含有的固體成份數(shù)量。這些動物是以胃管喂食法給予乳漿產(chǎn)品，即利用一胃管喂食。(O)表示安慰劑，動物心率的測定是如例1所述，且與未經(jīng)治療動物的心率相比較。
實施例實施例1心率降低特性的體內(nèi)(in vivo)試驗材料與方法菌種與培養(yǎng)(Strains and cultivation)將菌種涂布在耐甲氧西林葡萄球菌瓊脂(MRS agar)上，并在厭氧性、37℃的環(huán)境下培養(yǎng)48小時，選擇單一菌落(colony)，再接種至MRS培養(yǎng)液中，并于37℃下過夜培養(yǎng)。準備來自隔夜的貯存培養(yǎng)菌，將其貯存在-80℃的20％甘油中；再將這一菌種置于牛奶中預培養(yǎng)過夜，以1％(v/v)活化到新鮮牛奶中準備發(fā)酵。
樣品的制備乳漿樣品1將含有1％(v/v)單一菌落菌種的牛奶(蛋白質含量9.5％)發(fā)酵16小時，這發(fā)酵產(chǎn)品先經(jīng)過離心，將顆粒狀物去除，且乳漿是通過0.45毫米濾膜進行過濾，并冷凍干燥的。第二次發(fā)酵，在與第一次發(fā)酵的相同條件下進行發(fā)酵，經(jīng)離心后取得乳漿部份，其顆粒狀物是已去除，并將乳漿通過0.45毫米濾膜進行過濾并冷凍的。在喂食大鼠的前，這乳漿是用來溶解冷凍干燥乳漿粉末并濃縮21倍。
溶解在乳漿中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶樣品2將含有1％(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質含量9.5％)發(fā)酵16小時，且所有產(chǎn)品皆為冷凍干燥。第二次發(fā)酵，在與第一次發(fā)酵的相同條件下進行發(fā)酵，經(jīng)離心，以去除顆粒狀物，并將乳漿通過0.45厘米濾膜進行過濾并冷凍的。在喂食大鼠的前，這乳漿是用來溶解冷凍干燥乳漿粉末并濃縮5倍。
溶解在牛奶中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶樣品3將含有1％(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質含量9.5％)發(fā)酵16小時，且所有產(chǎn)品皆為冷凍干燥。在喂食大鼠的前，這牛奶(蛋白質含量9.5％)是用來溶解冷凍干燥乳漿粉末并因此濃縮5倍。
隔夜牛奶發(fā)酵產(chǎn)品樣品4將含有1％(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質含量9.5％)發(fā)酵16小時。
經(jīng)熱處理的隔夜牛奶發(fā)酵產(chǎn)品樣品5
將含有1％(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質含量9.5％)發(fā)酵16小時。自發(fā)性高血壓大鼠Spontaneous Hypertensive Rats)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是來自于IFFA CREDO(a Charles River company)，里昂，法國。
每一次治療是在9:15至9:30的間以胃管灌食法實施，且每一只動物接受總體積2.5毫升的劑量。
實驗設計分成三組別第1組(n＝16)接受治療1(牛奶；n＝16)第2組(n＝12)接受連續(xù)治療，每一次實施是間隔3天的間隔組別(1)安慰劑(牛奶)(2)樣品1(懸浮在乳漿中的冷凍干燥乳漿，并濃縮21倍)(3)樣品2(懸浮在乳漿中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶，并濃縮5倍)(4)樣品3(懸浮在中性pH值牛奶中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶，并濃縮5倍)(5)樣品4(只是發(fā)酵牛奶產(chǎn)品)(6)樣品5(在發(fā)酵后經(jīng)過加熱處理的發(fā)酵牛奶)(7)樣品6(未經(jīng)過發(fā)酵，但具有乳酸菌的牛奶)在所有SHR進行實驗的前，先使其適應動物環(huán)境9星期，這外，在進行第一次胃管灌食法的前，所有動物須先習慣胃管灌食法，并測量3天的心臟收縮壓。
研究參數(shù)(Investigated parameters)在經(jīng)胃管喂食24小時后，利用遙測技術(telemetry，Data Sciences Int.)測定清醒的SHR在不同時間點的心臟收縮壓及心率。
簡言的，在喂食前24小時及喂食后48小時的間，每15分鐘記錄其心臟收縮壓、心臟舒張壓及心率的平均值(超過一分鐘周期)。
藉由這些追蹤記錄，計算每一組別的心臟收縮壓、心臟舒張壓以及心率的24小時平均值。
再者，心臟收縮壓與心臟舒張壓的變動是由每個樣本與未經(jīng)治療的數(shù)值相比較，是計算喂食24小時，且在喂食后的時間3至6、12至15及21至24小時周期。
統(tǒng)計(Statistics)所有結果皆以平均值±平均標準誤差來表示，在未經(jīng)治療數(shù)值與每一本體經(jīng)胃管喂食后取得的值間的差異是使用配對student’的t-試驗(paired student’s t-test)來計算統(tǒng)計，且這計算是利用計算機程序SISTAT 8.0來進行。
結果在表1中是顯示測定心率的變動。
表1胃管喂食后的心率(心跳次數(shù)/分鐘，beats/min)

*p＜0.05vs.未經(jīng)治療未經(jīng)治療1及未經(jīng)治療2是分別作為研究編號1與研究編號2的控制組，未經(jīng)治療1是作為樣品1的安慰劑且未經(jīng)治療2則是作為其它樣品的安慰劑。由于本研究是分別以二種不同的體內(nèi)研究來進行，故在這是具有2種安慰劑。
上述的結果證明，濃縮21倍的(例1)濃縮的乳漿產(chǎn)品是具有最強的心率降低特性。
這些結果亦證明，無須濃縮發(fā)酵牛奶產(chǎn)品來取得一顯著的心率降低功效。樣品4和樣品5是為發(fā)酵整晚的發(fā)酵牛奶產(chǎn)品，且其是具有心率降低功效，然而，這心率降低功效是與產(chǎn)品的濃縮倍數(shù)成比例關系。
顯然地，包含多肽或其它活性成份的產(chǎn)品的乳漿部份是為心率降低功效的決定因素，并可在這產(chǎn)品中觀察到一劑量-心率降低功效。
樣品3是為懸浮在中性pH值牛奶中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶，可降低心率。證明在這描述的發(fā)酵產(chǎn)品是具有廣泛的應用，這是因為它可溶解在不同液體中，以得到所需的最終的適當使用。不同pH值并不影響產(chǎn)品的心率降低活性。
發(fā)酵后經(jīng)熱處理的樣品5也可降低心率，一般來說，所有在這樣品內(nèi)的細菌皆被殺死，因此，即證明在最終產(chǎn)品中并不需要活的細菌。
樣品6是沒有經(jīng)過發(fā)酵，但其含有活的細菌，其無法降低心率，故證明發(fā)酵步驟為必須的。
實施例2PCR擴增反應模板DNA(template DNA)是通過酚-氯仿(phenol-chloroform)抽提法取得的，如前面所述(Marmur(1961，Journal ofMolecular Biology，3,208-218)。最終制備的是在TE緩沖液+RNA酶中的基因組模板DNA。
這PCR反應的制備如下所述(1)1.0μl的模板DNA；1.0μl的正向引物(forward primer)(5pmol/μl)；1.0μl的反向引物(reverse primer)(5pmol/μl)；1.0μl、2.5mM的dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP的混合物)；5.0μl Mg緩沖液(20mM MgSO4)；0.5μl DNA聚合酶(Pwo，100U)；以及10.5μl水(H2O)。
(2)PCR擴增的熱程序是為30個循環(huán)，包括在94℃下1分鐘，在50℃下90秒(當引物Tm在55℃左右)、55℃下90秒(當引物Tm在62℃左右)、45℃下90秒(當引物Tm在50℃左右)以及在72℃下1分鐘。在30個循環(huán)完成后，這些樣品冷卻到4℃。
(3)這PCR產(chǎn)品是跑在60V的1.5％瓊脂糖膠(agarose gel)中，在紫外光下自瓊脂糖膠中分離，并根據(jù)制造商操作指南(Qiagen，Cat.No.28704)來使用器材QIAquick GelExtraction Kit進行純化。
實施例3蛋白質水解(ACE)活性分析保存菌種的制備(stock culture)乳酸桿菌(Lactobacillus)菌種接種在耐甲氧西林葡萄球菌瓊脂(MRS agar)上，并在厭氧性(anaerobically)、37℃的環(huán)境下培養(yǎng)48小時，選擇單一菌落(colony)，再接種至MRS培養(yǎng)液中，并于37℃下培養(yǎng)過夜。乳酸桿菌種是形成在M17瓊脂上，并在好氧性(aerobically)、30℃的環(huán)境下培養(yǎng)48小時，選擇單一菌落，再接種至M17培養(yǎng)液中，并于30℃下培養(yǎng)過夜。從上述過夜培養(yǎng)物里得到保存菌種，在20％甘油中貯存在-80℃。
發(fā)酵牛奶的制備與多肽或其它活性成份的提取在以實施例1(1％v/v)的隔夜貯存培養(yǎng)菌接種至200毫升新鮮牛奶中進行發(fā)酵，并根據(jù)使用的菌種不同判斷其溫度是整夜保持在37℃或30℃。
在該新鮮牛奶中，多肽或其它活性成份的提取是可藉由使用下列程序來得到-在室溫下進行10分鐘、3000g的離心。
-分離出上清液，并以NaOH調整酸堿值至pH 8.3(ACE活性試驗的最佳pH值)。
-在室溫下對取得的上清液進行10分鐘、3000g的離心。
-分離出上清液(乳漿)，其是包含多肽或其它活性成份。
-利用Lowry試驗(Lowry et al，1951.J.Biol.Chem.，193265-275)，測定在乳漿中的多肽濃度(每毫升乳漿中含有的多肽毫克數(shù))。
乳漿是直接以ACE分析并在-20℃下冷凍的，且這乳漿包含多肽或其它活性成份，即是實施例3的″多肽溶液″。
ACE活性分析發(fā)酵牛奶中的多肽是進行體外(in vitro)ACE活性試驗。多肽濃度為DL 50(mg/ml)，其是抑制50％的ACE活性，這值越低，發(fā)酵牛奶就具有越好的抗高血壓功效。提取出的多肽或其它活性成份是以下列的程序來進行檢測
這試驗分析主要是ACE降解一HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)基質，并加入染色劑(color reagent)進行染色。若存在有多肽或其它活性成份，這多肽或其它活性成份是抑制ACE，并有較少的HHL基質降解，亦即在加入染色劑的后，形成有較少的顏色。
溶液制備培養(yǎng)緩沖液(Incubation buffer)188mmole/l硼酸，pH值為8.3，及1.375mmole/l的氯化鉀。(將2.91克硼酸與25.63克氯化鉀溶解在200ml的蒸餾水中，以1mol/l的氫氧化鉀(potassium hydroxide)將pH值調整為8.3，并以250毫升蒸餾水稀釋的；貯存在室溫下)。
基質溶液(Substrate solution)5.8mmol/l的HHL。(將250毫克的HHL溶解在90毫升的培養(yǎng)緩沖液中，并以相同緩沖液補充到100毫升，這基質溶液是可使用至少2星期)。
終止溶液(stop solution)100mmol/l的HEPES，pH值為9，2.5mmol的EDTA。(將23.83克的HEPES與0.93克的EDTA溶解在800毫升的蒸餾水中，以1mol/l的氫氧化鈉將pH值調整為9，并以蒸餾水稀釋到1公升；貯存在室溫下)。
染色劑136mmol/l的三聚氯氰(cyanuric chloride)在1，4-二氧陸圜(1，4-dioxane)中。(將12.50毫克的三聚氯氰溶解在400毫升的1，4-二氧陸圜中，并補加1，4-二氧陸圜至500毫升，貯存在室溫下及暗棕色玻璃瓶內(nèi))。
分析(所有溶液先冷卻至室溫)-制造一經(jīng)由培養(yǎng)緩沖液連續(xù)稀釋的多肽溶液，這連續(xù)6次稀釋是將未稀釋的多肽溶液稀釋至空白(只有培養(yǎng)緩沖液)。
-對每次稀釋而言，放置10μl的多肽溶液、40μl的基質(HHL)溶液(2.5g/l)以及2.5μl的ACE(0.25單位/毫升)于一玻璃管中。
-陽性對照包括2.5μl的ACE、10μl的培養(yǎng)緩沖液以及40μl的基質(HHL)溶液。
-陰性對照包括12μl的培養(yǎng)緩沖液以及40μl的基質(HHL)溶液。
-在37℃下培養(yǎng)1小時。
-加入300μl的終止溶液停止反應，隨后以150μl的染色劑混合。
-沉積5分鐘，并在室溫下以3300g離心30分鐘，以去除變質的蛋白質和過量的三聚氯氰。
-轉移每一樣品的300μl上清液至微量滴定盤(microtiter plate)的孔洞中。
-在405nm下一水作對照進行讀取。
這SCE抑制百分比是以下列公式表示的ACE抑制活性＝(OD 405nm陽性對照-OD 405nm樣品)/(OD 405nm陽性對照-OD405nm陰性對照)每次稀釋是具有其所屬的ACE抑制百分比值，提供一曲線表示ACE抑制百分比與乳漿的多肽濃度的函數(shù)。DL 50(具50％抑制活性的多肽濃度)的獲得是藉由讀取位在該曲線與軸上對應的50％ACE抑制點的交叉點的多肽濃度而得到。
實施例4劑量反應實驗為了更進一步證實在實施例1的結果，一劑量反應實驗的進行是藉由調控含有不同的量來自發(fā)酵牛奶的乳漿中分離的發(fā)酵奶的冷凍干燥乳漿給自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)。
一般而言，使用的材料、方法與實驗設計是與實施例1所描述的內(nèi)容相同。
簡言的，將具有瑞士乳桿菌品種CHCC5951(DSM 14998)的牛奶接種1％(v/v)菌種發(fā)酵16小時，這發(fā)酵牛奶先經(jīng)過離心，將顆粒狀物去除，并將乳漿冷凍干燥。在與第一次發(fā)酵的相同條件下進行第二次發(fā)酵，經(jīng)離心，再將顆粒狀物去除，并將乳漿放置在4℃下。這乳漿是用來溶解冷凍干燥乳漿粉末，以產(chǎn)生包含固體乳漿成份的混合物，其是經(jīng)2、6及14.3次的濃縮，相對于在第二次發(fā)酵中獲得的乳漿固體成份數(shù)量。在喂食這混合物給大鼠之前很短時間進行溶解的最后一步。
如實施例1所示，未發(fā)酵牛奶是作為安慰劑。
以最低濃度的劑量開始，在三組分開試驗-周期的相同實驗動物上進行試驗，每一試驗-周期的間是以三天的間隔分開的，這期間的動物并不接受發(fā)酵乳漿產(chǎn)品，以排除前次劑量的影響。
上述的實驗結果顯示在表2的表格中。
表2胃管喂食后的心率(beats/min)

注未經(jīng)治療大鼠是指未接受牛奶及乳漿產(chǎn)品者，安慰劑是非發(fā)酵牛奶，濃度1、2及3分別為包含有固體乳漿成份的濃縮2、6及14.3次的乳漿混合物，且動物的活性周期是符合無光線周期，亦即時間周期9至21。
在第3圖中是顯示一濃度3(14.3倍濃縮)的完全周期。
另外，冷凍干燥乳漿粉末是產(chǎn)生包含固體乳漿成份的混合物，其是經(jīng)21次的濃縮，相對于在第二次發(fā)酵中獲得的乳漿固體成份數(shù)量。將濃縮2、6、14.3次以及21次的的乳漿產(chǎn)品喂食給動物的結果是如第2圖所示。
這結果顯示濃縮至21倍的乳漿產(chǎn)品對心率作用有一個明顯的劑量依賴效應。乳漿產(chǎn)品的劑量越高，具有越大的心率降低效應。固定或漸進的水平線并未達到，表示，包含更高濃度活性成份的混合物可預期到具有更高的降低心率功效。
實施例5降低在高活性期間的心率變動在這些動物的活性周期間，其心率是增加的。本研究的動物活性周期幾乎與無光線周期相符合，即第1圖所示的黑色條狀的周期。然而，由觀察第1圖結果可判斷，未經(jīng)治療動物相對于以14.3倍濃縮發(fā)酵乳漿產(chǎn)品治療的動物而言，具有較大的心率以及心率變動。
為了對心率變動進行定量，估計在時間周期12及15小時的間所觀察到的心率值變動。標準誤差(standard deviation)是用以估計已經(jīng)治療及未經(jīng)治療動物，且這估計是利用在實施例1中所描述的SISTAT 8.0程序來進行，并用來計算變動值((標準誤差)2＝變動值)。
用于已治療動物的標準誤差是估計為5.9，則其相對的變動值為(5.9)2＝34.8。
用于未經(jīng)治療動物的標準誤差是估計為10.4，則其相對的變動值為(10.4)2＝108.2。
假定主要數(shù)據(jù)是為正常分布的，34.8的變動值的統(tǒng)計意義與位于95％層級的108.2變動值有所不同。
因此，相對于以14.3倍濃縮發(fā)酵乳漿產(chǎn)品治療的動物的心率變動而言，是可推斷出在已治療動物中的活性周期的心率變動是相當?shù)卮蟆?br> 總之，心率變動是藉由以瑞士乳桿菌品種CHCC5951(DSM 14998)發(fā)酵的乳漿產(chǎn)品來使之穩(wěn)定，這一點可以成為這產(chǎn)品的重要特征，因為在一實驗性兔模型(Zaza etal 2001)中觀察到心率變化與死亡率的關連性，以及特別是在緊張?zhí)幘诚聦掖斡^察到心率的變動。
實施例6以瑞士乳桿菌品種CHCC5951發(fā)酵的乳漿產(chǎn)品與以不同菌種發(fā)酵的類似商業(yè)性產(chǎn)品間的比較這實施例的目的是用來比較以商業(yè)性乳酸菌發(fā)酵的乳漿產(chǎn)品，表明具有以瑞士乳桿菌品種CHCC5951(DSM 14998)發(fā)酵的產(chǎn)品的血壓還原特性。
這二種產(chǎn)品在血壓與心率功效的檢測，是將這二混合物提供給Wistar大鼠，并測量麻醉動物的心臟收縮壓、心臟舒張壓以及心率。
假如沒有特別提及，材料與方法是與實施例1所描述的內(nèi)容相同。
簡言之，將含有瑞士乳桿菌品種CHCC5951(DSM 14998)的牛奶以1％(v/v)接種發(fā)酵16小時，且產(chǎn)生的產(chǎn)品是經(jīng)冷凍干燥而得到冷凍干燥牛奶粉末。第二次發(fā)酵，在與第一次發(fā)酵的相同條件下進行發(fā)酵及離心，且其顆粒狀物是已去除，并將乳漿通過0.45厘米濾膜進行過濾并冷凍的；在喂食大鼠之前很短時間，冷凍干燥牛奶粉末才溶解在乳漿中。溶解粉末的乳漿體積相當于得到這些粉末的乳將體積的1/5(如4.28克的粉末溶解在30毫升的乳漿中)。本例中所指的混合物是5倍濃度的。這混合物是在9:15時至9:30時的間提供給整夜血壓正常的Wistar大鼠上，并以每公斤7.5毫升的x5混合物的劑量進行胃管灌食法；再口服(oral administration)之后，測量麻醉動物的動脈血壓值與心率值，以計算14:30時至16:30時之間的混合物的功效。得到的結果如表3所示。
表3兩種不同發(fā)酵產(chǎn)品的血壓與心率功效

經(jīng)胃管喂食后5-7小時，在這三種群組的心臟收縮壓、舒張壓、平均動脈血壓及心率的值(平均±SEM)。
*表示在已治療與未經(jīng)治療大鼠間的p＜0.05層級的顯著差異。在以Tukey試驗倍數(shù)比較后，再使用ANOVA進行統(tǒng)計分析。
通過這些數(shù)據(jù)，可以推斷出商業(yè)性產(chǎn)品與CHCC5951發(fā)酵產(chǎn)品皆可降低血壓，并可達到相同的程度。然而，表3中的數(shù)據(jù)意外地顯示，只有CHCC5951發(fā)酵產(chǎn)品可有效降低心率。
以上所述的實施例僅是為說明本發(fā)明的技術思想及特點，其目的在使熟習這項技藝的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，不能以此限定本發(fā)明的專利范圍，即凡是依本發(fā)明所揭示的精神所作的均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
序列表<110>科.漢森有限公司(Chr.Hansen A/S)<120>具有心率降低特性的混合物(Composition with heart rate reducing properties)<130>P1040PC00<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<21l>5550<212>DNA<213>瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)<220>
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<308>GeneBank/A133727<309>1999-08-23<313>(1)..(5550)<400>1atg agg aga aac aaa tat gca ggc tta tta gtt tgt gcc act act cta48Met Arg Arg Asn Lys Tyr Ala Gly Leu Leu Val Cys Ala Thr Thr Leu1 5 10 15tcc gtc gta tct gtg ttc tct act gcc gaa caa caa gtt aag gct agt96Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser20 25 30gtt gac agc caa aca aaa act gtt gaa aaa agt act aaa gca gca gaa 144Val Asp Ser Gln Thr Lys Thr Val Glu Lys Ser Thr Lys Ala Ala Glu35 40 45tct act aca gca aat tta act aac aaa gca gtt gaa gcg caa tta gcc 192Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala50 55 60gca aaa ggt gtt aat ttt aaa cac tta act gtt aat caa aaa caa gat 240Ala Lys Gly Val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp65 70 75 80gta tat gtt gat gta att gtt cag tta tcg gct acc cca gct gct act 288Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr85 90 95
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290 295 300ttc tct aat tca gat agt tca gcc tct act gat tct act agc att atc 960Phe Ser Asn Ser Asp Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Ile305 310 315 320ggt gca atc gat gat tct gcc aag ctt ggg gct gac gtt cta aac atg 1008Gly Ala Ile Asp Asp Ser Ala Lys Leu Gly Ala Asp Val Leu Asn Met325 330 335tca tta ggt tca gtt tct ggt gaa caa act gaa gac gat cca gaa gtt 1056Ser Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Gln Thr Glu Asp Asp Pro Glu Val340 345 350gcc gct gtt gaa cgt gcc act aag aaa ggt act gca gct gta att tct 1104Ala Ala Val Glu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Thr Ala Ala Val Ile Ser355 360 365gcc ggt aac tcc ggc act tca aat tca gaa att gaa ggt gtt aat aaa 1152Ala Gly Asn Ser Gly Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Gly Val Asn Lys370 375 380gct tat tac ggg aat cct gat atg gaa act tta ggt aat cca ggc act 1200Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Asp Met Glu Thr Leu Gly Asn Pro Gly Thr385 390 395 400gca aga agt gca aca act gtt gcc tct gct gaa aac act aag gct act 1248Ala Arg Ser Ala Thr Thr Val Ala Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Thr405 410 415aca gat gga gta act att aca tct gct gat gga aaa act act atc gca 1296Thr Asp Gly Val Thr Ile Thr Ser Ala Asp Gly Lys Thr Thr Ile Ala420 425 430ggt cca gaa gct act cag ctt tca gaa ggt act gac cgt gct ttc ttt 1344Gly Pro Glu Ala Thr Gln Leu Ser Glu Gly Thr Asp Arg Ala Phe Phe435 440 445aat gat aaa aaa ttc tac gtc gta aaa gat aag aat ggc aat tta ggc 1392Asn Asp Lys Lys Phe Tyr Val Val Lys Asp Lys Asn Gly Asn Leu Gly450 455 460aca ggt tct gcc aag caa tat act tct gct gta aaa ggt aaa att gca 1440Thr Gly Ser Ala Lys Gln Tyr Thr Ser Ala Val Lys Gly Lys Ile Ala465 470 475 480att gtc aag cgt ggt gaa ctt act ttc act gat aaa caa aaa tat gcc 1488Ile Val Lys Arg Gly Glu Leu Thr Phe Thr Asp Lys Gln Lys Tyr Ala485 490 495caa gaa gct ggt gcc gct ggt tta atc att gtt aac aac aaa gcc ggc 1536
Gln Glu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Ile Ile Val Asn Asn Lys Ala Gly500 505 510gat ata act ggc atg tta ctt aac gct ggc ttc cct act gct ggt tta 1584Asp Ile Thr Gly Met Leu Leu Asn Ala Gly Phe Pro Thr Ala Gly Leu515 520 525tca gct aca tca gga gaa aaa tta gta aaa tat gtt gaa gcc cat cct 1632Ser Ala Thr Ser Gly Glu Lys Leu Val Lys Tyr Val Glu Ala His Pro530 535 540gat gaa gca ttg aag gta agt att gtt gtc caa gcc tta aat aat tct 1680Asp Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Val Gln Ala Leu Asn Asn Ser545 550 555 560gct cgt caa aca gac tta atg tct gat ttc acc tca tac ggt ccc act 1728Ala Arg Gln Thr Asp Leu Met Ser Asp Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Thr565 570 575tct agc ttg gca ttt aag cca gat atc tca gca cca ggt gga cat att 1776Ser Ser Leu Ala Phe Lys Pro Asp Ile Ser Ala Pro Gly Gly His Ile580 585 590tgg tca act caa aat aac aat ggc tat act aac atg tct ggt act tca 1824Trp Ser Thr Gln Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Asn Met Ser Gly Thr Ser595 600 605atg gct tct cca ttt att gct ggt acc caa gca ctt gtt agt caa aca 1872Met Ala Ser Pro Phe Ile Ala Gly Thr Gln Ala Leu Val Ser Gln Thr610 615 620atg aac gac aag aat ggt gct ttc tac gca act tat caa aag atg agc 1920Met Asn Asp Lys Asn Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Tyr Gln Lys Met Ser625 630 635 640gca gaa gaa aga acg cca ttt att aag act cta gaa atg aat act gca 1968Ala Glu Glu Arg Thr Pro Phe Ile Lys Thr Leu Glu Met Asn Thr Ala645 650 655agt att caa cct gat att agc cat gat aat gtc atc gtt tca cca cgt 2016Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser His Asp Asn Val Ile Val Ser Pro Arg660 665 670aga caa ggt gct gga ttt att aac gct aac gct act atc caa gct tta 2064Arg Gln Gly Ala Gly Phe Ile Asn Ala Asn Ala Thr Ile Gln Ala Leu675 680 685gct aaa aat cct tca act gta gtc agc agc aat ggc tat cct ggt gta 2112Ala Lys Asn Pro Ser Thr Val Val Ser Ser Asn Gly Tyr Pro Gly Val690 695 700
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Gly Glu Thr Asn Phe Gly Leu Val Leu Arg Asn Gly Gly Leu Pro110011051110gac aaa atc tca tct caa act aag ggc tac gat gcc aaa aat ggt 3384Asp Lys Ile Ser Ser Gln Thr Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Gly111511201125act tat gta ttc tct ggt act tac cca agc aaa ctc tat gga act 3429Thr Tyr Val Phe Ser Gly Thr Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Gly Thr113011351140tac act gat aaa gat ggt caa acc cat gac tta aat gta gaa agt 3474Tyr Thr Asp Lys Asp Gly Gln Thr His Asp Leu Asn Val Glu Ser114511501155gat ggc aac aag tta ttc gtt gca aag ctt cca ctt tct aaa gat 3519Asp Gly Asn Lys Leu Phe Val Ala Lys Leu Pro Leu Ser Lys Asp116011651170gac tat aag act act gtt acc ctt tac gct gat tct gac cat aag 3564Asp Tyr Lys Thr Thr Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Asp His Lys117511801185acc ttg ctt aag aaa caa gac att acc gta agc tta gtc cca gct 3609Thr Leu Leu Lys Lys Gln Asp Ile Thr Val Ser Leu Val Pro Ala119011951200aag gtc gaa agt ttg tct gta gat aag aat gat act tat gat gag 3654Lys Val Glu Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Thr Tyr Asp Glu120512101215act aaa gat tcg tcg gct gca tta gct caa act tct gaa aac act 3699Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Ala Gln Thr Ser Glu Asn Thr122012251230gta aaa ctt tct ggt aaa gta agt ggt gat act aag act tta gtg 3744Val Lys Leu Ser Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Lys Thr Leu Val123512401245gtt aaa caa aaa ggt cag aaa gac atc tca gtt aaa ctt aat gct 3789Val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu Asn Ala1250 1251260gat cac aca ttt agt act gaa ctg cca gta agc ttt ggt gaa aat 3834Asp His Thr Phe Ser Thr Glu Leu Pro Val Ser Phe Gly Glu Asn126512701275gac ttt act att gta gca acc gac tct aat ggt aat tca tct agt 3879Asp Phe Thr Ile Val Ala Thr Asp Ser Asn Gly Asn Ser Ser Ser128012851290
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Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala167016751680gta tcg aat att aat act tcc tct gat aac caa gtt gca gct cct 5094Val Ser Asn Ile Asn Thr Ser Ser Asp Asn Gln Val Ala Ala Pro168516901695gtg cat gct gaa aaa gac acc aag aat gat aac aag aat aca aca 5139Val His Ala Glu Lys Asp Thr Lys Asn Asp Asn Lys Asn Thr Thr170017051710gaa gaa ggt aag gac act aag gta atg ttc aag tca gtt ctt tac 5184Glu Glu Gly Lys Asp Thr Lys Val Met Phe Lys Ser Val Leu Tyr171517201725act aaa gac ctt aaa aag aca agg agc act gcc caa gcc tac agt 5229Thr Lys Asp Leu Lys Lys Thr Arg Ser Thr Ala Gln Ala Tyr Ser173017351740tca ctc aaa ctt gta acc gaa aaa gga aag ctt aag gtt tac aca 5274Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr174517501755ttc aaa ggt cac tac ttc tac aag gtt gtt gat cgg aat gca tat 5319Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr176017651770gtt cgt gta aga aat gtg act ggt act aag gca acg tta aag aga 5364Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg177517801785aat tca ttt gtc tac caa tca aat ggt aag aaa gca tca cgt aaa 5409Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys179017951800ctt ctc aag aaa ggt act acc att acc gtc tac ggc gat caa tac 5454Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr180518101815aaa gct ctt aag cat tac aag aag tat gct tac aga atc ggt gaa 5499Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu182018251830ggt aga tac ata aag agt gtc aat gtt aac aga gtt gat ctt gta 5544Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val183518401845aaa taa 5550Lys
<210>2<211>1849<212>PRT<213>Lactobacillus helveticus<400>2Met Arg Arg Asn Lys Tyr Ala Gly Leu Leu Val Cys Ala Thr Thr Leu1 5 10 15Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser20 25 30Val Asp Ser Gln Thr Lye Thr Val Glu Lye Ser Thr Lys Ala Ala Glu35 40 45Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala50 55 60Ala Lys Gly Val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp65 70 75 80Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr85 90 95Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala100 105 110Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys115 120 125Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn130 135 140Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn145 150 155 160Ile Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Tyr Tyr Ala Asn165 170 175Asp Ser Ser Ala Asp Asn Met Ala Asn Val Ser Thr Val Trp Asn Asn180 185 190Tyr Lys Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Ile Ile Asp Thr Gly195 200 205Ile Asp Pro Asn His Lys Asp Leu Arg Leu Ser Asp Asp Ser Lys Val210 215 220Lys Leu Thr Lys Asp Lys Val Asn Ala Phe Thr Lys Glu Ser Gly Tyr225 230 235 240Gly Arg Tyr Phe Thr Asp Lys Val Pro Tyr Gly His Asn Tyr Ser Asp245 250 255Asn Asn Asp Asn Ile Thr Asp Asp Asn Pro Ser Glu Gln His Gly Met
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565 570 575Ser Ser Leu Ala Phe Lys Pro Asp Ile Ser Ala Pro Gly Gly His Ile580 585 590Trp Ser Thr Gln Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Asn Met Ser Gly Thr Ser595 600 605Met Ala Ser Pro Phe Ile Ala Gly Thr Gln Ala Leu Val Ser Gln Thr610 615 620Met Asn Asp Lys Asn Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Tyr Gln Lys Met Ser625 630 635 640Ala Glu Glu Arg Thr Pro Phe Ile Lys Thr Leu Glu Met Asn Thr Ala645 650 655Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser His Asp Asn Val Ile Val Ser Pro Arg660 665 670Arg Gln Gly Ala Gly Phe Ile Asn Ala Asn Ala Thr Ile Gln Ala Leu675 680 685Ala Lys Asn Pro Ser Thr Val Val Ser Ser Asn Gly Tyr Pro Gly Val690 695 700Glu Leu Lys Ser Phe Lys Asp Arg Thr Leu Asn Phe Gln Val Lys Phe705 710 715 720Thr Asn Arg Thr Asn Lys Ala Leu Thr Tyr Lys Leu Ala Asn Asn Gly725 730 735Lys Asn Ser Asp Val Tyr Thr Ser Ala Thr Asp Ser Ser Ala Val Leu740 745 750Tyr Asp Lys Lys Ile Asp Gly Ala Ser Val Lys Ala Ser Gly Asp Ile755 760 765Phe Val Pro Ala Asn Ser Thr Lys Glu Leu Thr Leu Thr Leu Thr Leu770 775 780Pro Ser Asp Phe Lys Glu Asn Gln Tyr Val Glu Gly Phe Leu Thr Phe785 790 795 800Asn Ser Ser Asp Ser Ser Gln Leu Arg Leu Pro Tyr Met Gly Phe Phe805 810 815Gly Asp Trp Ala Ser Ser Asp Leu Pro Ile Phe Ala Ser Leu Asn Asp820 825 830Pro Asn Val Phe Gln Pro Asp Asn Asn Met Phe Gly Thr Leu Val Thr835 840 845Val Gly Asn Ser Ser Asp Asn Thr Asn Pro Gly Leu Ser Gln Asp Ala850 855 860Ser Gly Asn Leu Ser Phe Asp Ser Ser Lys Phe Ala Ile Ser Asn Ala
865 870 875 880Lys Asn Ala Gln Phe Lys Trp Phe Lys Pro Thr Tyr Tyr Leu Tyr Arg885 890 895Asn Ala Asn Asn Val Lys Ile Gln Ile Leu Asp Lys Asn Gly Lys Val900 905 910Ile Asn Thr Leu Ala Ser Leu Ser Asn Ala Thr Lys Thr Tyr Tyr Asn915 920 925Ser Gln Ala Gln Ser Tyr Thr Tyr Phe Asp Asp Ala Pro Ser Trp Asp930 935 940Gly Thr Tyr Phe Asp Gln Gln Ala Asn Lys Thr Val Asn Ala Pro Asp945 950 955 960Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Ile Ser Ala Thr Ile Asp Gly Thr Asn Thr965 970 975Glu Gln His Tyr Asp Ile Pro Val Lys Val Asp Ser Val Ala Pro Val980 985 990Val Lys Asn Leu Lys Leu Glu Ser Ser Lys Val Glu Asp Ala Lys Gly995 10001005Gln Glu Gln Thr Arg Tyr Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Lys Asp Glu101010151020Leu Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asn Val Ser Val Asn Gly Val102510301035Ser Ala Gln Leu Glu Tyr Asp Pro Thr Ala Lys Ala Asp Lys Asp104010451050Gly Phe Gln Lys Val Glu Ile Asp Leu Ser Pro Ala Gln Ala Lys105510601065Ala Leu Gln Ala Gly Thr Asn Thr Phe Ser Val Ala Leu Phe Asp107010751080Asn Ala Ala Asn Ala Gly Thr Ala Ser Gly Glu Gly Asn Lys Pro108510901095Gly Glu Thr Asn Phe Gly Leu Val Leu Arg Asn Gly Gly Leu Pro110011051110Asp Lys Ile Ser Ser Gln Thr Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Gly111511201125Thr Tyr Val Phe Ser Gly Thr Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Gly Thr113011351140Tyr Thr Asp Lys Asp Gly Gln Thr His Asp Leu Asn Val Glu Ser1145 11501155Asp Gly Asn Lys Leu Phe Val Ala Lys Leu Pro Leu Ser Lys Asp
116011651170Asp Tyr Lys Thr Thr Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Asp His Lys117511801185Thr Leu Leu Lys Lys Gln Asp Ile Thr Val Ser Leu Val Pro Ala119011951200Lys Val Glu Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Thr Tyr Asp Glu120512101215Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Ala Gln Thr Ser Glu Asn Thr122012251230Val Lys Leu Ser Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Lys Thr Leu Val123512401245Val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu Asn Ala125012551260Asp His Thr Phe Ser Thr Glu Leu Pro Val Ser Phe Gly Glu Asn126512701275Asp Phe Thr Ile Val Ala Thr Asp Ser Asn Gly Asn Ser Ser Ser128012851290Val Glu Gln Lys Val Lys Ser Ser Asp Arg Gly Lys Thr Thr Val129513001305Ser Ser Ser Asp Val Thr Phe Asp Asn Gly Ile Lys Trp Gly Thr131013151320Arg Asn Val Asn Gly Ile Arg Asn Val Asn Ala Lys Thr Lys Asn132513301335Tyr Asn Pro Lys Thr Gly Glu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Val Lys134013451350Arg Pro Thr Thr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Lys Asn Val Lys Ile135513601365Asn Ser Asp Gln Thr Phe Lys Val Val Leu Asn Ile Gly Thr His137013751380Gly Ala Lys Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Asp Ser Thr Val Arg138513901395Glu Thr Thr Gln Glu Arg Leu Ser Phe Tyr Val Asp Ala Glu Ala140014051410Pro Thr Leu Asn Leu Asp Ser Glu Asn Thr Val Tyr Thr Asn Lys141514201425Asp Lys Phe Thr Ile Ser Gly Thr Ile Ser Asp Asp Tyr Lys Phe143014351440Tyr Asp Leu Ser Ile Asn Gly Asn Asp Val Glu Thr Ser Trp Ser
144514501455Ala Val Asp Tyr His Ser Lys Glu Gly Ile Lys Lys Asn Phe Lys146014651470His Glu Val Asp Leu Lys Lys Gly Lys Asn Thr Phe Asn Val Lys147514801485Val Thr Asp Ile Gln Gly Asn Ser Ser Ser Gln Ala Leu Val Val149014951500Tyr Tyr Glu Pro Ala Lys Thr Leu Ala Glu Pro Ser Val Asp Lys150515101515Leu Leu Thr Lys Thr Ala Asn Leu Gln Leu Leu Lys Ala Thr Thr152015251530Asp Glu Ser Glu Ala Lys Val Val Tyr Ser Leu Asp Asn Gly Lys153515401545Thr Phe Asn Asp Val Pro Ala Asp Gly Phe Lys Val Thr Glu Asn155015551560Gly Thr Val Gln Phe Lys Ala Val Asp Lys Tyr Gly Asn Glu Ser156515701575Lys Val Lys Ser Val Glu Ile Lys Gly Leu Asn Lys Glu Asn Gln158015851590Pro Ser Glu Asp Lys Glu Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asn Leu Gln159516001605Ala Lys Val Asp Ala Gly Glu Lys Lys Asp Leu Asp Lys Tyr Thr161016151620Ala Asp Ser Lys Lys Asp Phe Asn Asp Ala Leu Lys Lys Ala Lys162516301635Asp Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Lys Leu Ala Asp Leu Gln Asp164016451650Ala Ala Lys Ala Leu Asp Lys Ala Glu Gln Ala Leu Thr Glu Lys165516601665Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala167016751680Val Ser Asn Ile Asn Thr Ser Ser Asp Asn Gln Val Ala Ala Pro168516901695Val His Ala Glu Lys Asp Thr Lys Asn Asp Asn Lys Asn Thr Thr170017051710Glu Glu Gly Lys Asp Thr Lys Val Met Phe Lys Ser Val Leu Tyr171517201725Thr Lys Asp Leu Lys Lys Thr Arg Ser Thr Ala Gln Ala Tyr Ser
173017351740Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr174517501755Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr176017651770Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg177517801785Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys179017951800Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr180518101815Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu182018251830Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val183518401845Lys<210>3<211>2679<212>DNA<213>Lactobacillus helveticus<220>
<221>CDS<222>(1)..(2679)<223>
<400>3atg ata aga cta ctg gga aga tgg ttg tgc tcc aga tgg tca ata cac 48Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His1 5 10 15tta ccg ctt tgt tgc ccc ttg tac aac aat ggt gaa aac aaa gtt caa 96Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln20 25 30act aat gac act cca gtt atc att gat act act gct cct gtt ttg aac 144Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn35 40 45aat gtg aaa tat gat aca tct tct ttc aca ttg tca ggt gat tac gct 192Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala50 55 60gat gca ggt gca ggc ttt act gac tac tca tat gca act gta act gtt 240
Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val65 70 75 80aac gat cat gtc ttt ggc ttt aag tta aac gaa ggc gat aag tca aac 288Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn85 90 95ttt gat aat gct aat aaa acc aag gga cac ttt gtc ttt gtt ttg act 336Phe Asp Asn Ala Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Val Phe Val Leu Thr100 105 110ccg gaa gaa caa gct gct tta act agc gct gct aac aag gtt acc gtt 384Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val115 120 125gcc ttt agt gat gtc gca gat aac act gca acg caa aca ttt aat gtt 432Ala Phe Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ala Thr Gln Thr Phe Asn Val130 135 140gca cct gta gca ggt cat aaa aag att gca gtt tgg aat gca att aat 480Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn145 150 155 160ggg tta cca ttc aat gaa aat tcc gat gat tat aat gtt ggt cgc aaa 528Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys165 170 175gta ttt atg ctt cgt ggt ggt gct gaa cat gat ttc tat gtc aat ggt 576Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly180 185 190aag tgg gtt cag gtt gat caa ggt caa ttt gta ttg cca gtt agt gtt 624Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val195 200 205gat gaa cag aat ttt gtt ttc agt tca gat caa gcg ggt aaa aat att 672Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile210 215 220tta ggt aag ttc act act ttt act cct aaa gct caa ttc gca tgg caa 720Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln225 230 235 240cat gtt gat ggt gaa gaa aga tca ttt ggt gtc agt gtt tac tca gta 768His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val245 250 255gaa ggc aag gat cca caa gat att gtt gtt caa gca tca gta ccc aag 816Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys260 265 270
ggt gac aat gtt aaa gct ttt gcg aag gac tac ttc act cat gaa gtt 864Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val275 280 285tat acc ggt gag gtt cat gac ggt gta gct act ttc cac att cat acc 912Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr290 295 300agt gtc aat aaa gac gct gca act ggc att aat tta aga gcc ctt ctt 960Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu305 310 315 320caa ggt tgg gtt gaa att gat gga cca aca ttt aat gct aaa caa gta 1008Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val325 330 335acg gat cca tcg cca att aat gat gct aac tac ttg ggt gtg tac tac 1056Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr340 345 350aat cca aat gct gaa gag aga aag aat tat gat aat cgc gat gat ctt 1104Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu355 360 365ggc gta gac ttt gaa gat gaa gca gct gac aca aac aca ttt ggc cca 1152Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro370 375 380ggg aat tat tca agt gcg aaa gat gac gct aaa att cat ttc gac tac 1200Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr385 390 395 400ttg aat aat aat ggt att tct act ttg ggt aat aaa gca gta gaa aag 1248Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys405 410 415ggt tat tac aat cca gca act cat aaa ttt act ttg act ggt cgg gtt 1296Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val420 425 430aat cca gaa gtt att agc tta aca ttc tta gct gat agt ccg tat gaa 1344Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu435 440 445gtc gat cca gaa aat caa gct gat att cat gat aat ggt aaa ttc tct 1392Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser450 455 460gta aca ttc aca att gat aat cca gca aca cgt caa tta tca tat ttc 1440Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe
465 470 475 480ttt aag acg aat gat ggc aaa aca aca aga ggc tct ttg act tta att 1488Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile485 490 495ctt gac act gtt gat cca act ctt act gta gat caa tta ggc gac aag 1536Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys500 505 510gat gag gct gaa att act act aat aag cca acc ttt aag tta tcc ggt 1584Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly515 520 525gag gcc aac gat aac att gat ggt tac aat gta ttt atc aat ggt gat 1632Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp530 535 540aat gtt ttt ggg caa ttt ggt aat tcg ggt tat gat ttt ctg cca gga 1680Asn Val Phe Gly Gln Phe Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Phe Leu Pro Gly545 550 555 560atc tac aat gat tta aat caa aat act cca aat ttg tac gga tct tac 1728Ile Tyr Asn Asp Leu Asn Gln Asn Thr Pro Asn Leu Tyr Gly Ser Tyr565 570 575aag ttt gat caa gaa gag caa ttg gat gat cag aat ggg caa cca aca 1776Lys Phe Asp Gln Glu Glu Gln Leu Asp Asp Gln Asn Gly Gln Pro Thr580 585 590acc cat gtc ttt act att gca gta gag gac caa gct ggt aac aga gtt 1824Thr His Val Phe Thr Ile Ala Val Glu Asp Gln Ala Gly Asn Arg Val595 600 605gaa aag aag gtt act gtt cat tac gat cca aat tat ctt aca gaa ccg 1872Glu Lys Lys Val Thr Val His Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Glu Pro610 615 620ggt aat aca gga aaa aaa gat gat caa gca gat gta aaa ccg gca gaa 1920Gly Asn Thr Gly Lys Lys Asp Asp Gln Ala Asp Val Lys Pro Ala Glu625 630 635 640ggt caa aag caa gat aaa aat gac aac caa act gtt aac aat tca aaa 1968Gly Gln Lys Gln Asp Lys Asn Asp Asn Gln Thr Val Asn Asn Ser Lys645 650 655gaa gat cca gag agt ggt caa act act gaa aat gct caa tct aca gaa 2016Glu Asp Pro Glu Ser Gly Gln Thr Thr Glu Asn Ala Gln Ser Thr Glu660 665 670agt caa gag caa aat aag act gat gta act aaa cca gca gca aag cca 2064
Ser Gln Glu Gln Asn Lys Thr Asp Val Thr Lys Pro Ala Ala Lys Pro675 680 685agt aac gat gat caa aaa gaa aat cac aga gct ggt gaa tcg acc att 2112Ser Asn Asp Asp Gln Lys Glu Asn His Arg Ala Gly Glu Ser Thr Ile690 695 700gag tta aat caa gag aaa caa cta ggt caa agt aat gtc caa gcc caa 2160Glu Leu Asn Gln Glu Lys Gln Leu Gly Gln Ser Asn Val Gln Ala Gln705 710 715 720gat act aaa cca gat aaa aca gta gtt caa ggt aat gtt caa aat act 2208Asp Thr Lys Pro Asp Lys Thr Val Val Gln Gly Asn Val Gln Asn Thr725 730 735gca ccg aca aca ggt cat ttg act aat tct tca gta aat gtg caa caa 2256Ala Pro Thr Thr Gly His Leu Thr Asn Ser Ser Val Asn Val Gln Gln740 745 750ttt aag act aag aaa gaa aca cta caa tta aag aag ttt aag tta tta 2304Phe Lys Thr Lys Lys Glu Thr Leu Gln Leu Lys Lys Phe Lys Leu Leu755 760 765aag aat aca tat ggc tac act tta aat ggt aaa att gct aaa aaa cac 2352Lys Asn Thr Tyr Gly Tyr Thr Leu Asn Gly Lys Ile Ala Lys Lys His770 775 780ggt aaa aag tta ctc ttt aag aaa gga aaa acc gtc ctt gtt tgg aac 2400Gly Lys Lys Leu Leu Phe Lys Lys Gly Lys Thr Val Leu Val Trp Asn785 790 795 800aac agt aga gtt gtg act atc aag gga caa aag tac tac cgt gct act 2448Asn Ser Arg Val Val Thr Ile Lys Gly Gln Lys Tyr Tyr Arg Ala Thr805 810 815aag aat gta ttt gtt aaa gtt tca act atc aag cag gtt aaa gac ttg 2496Lys Asn Val Phe Val Lys Val Ser Thr Ile Lys Gln Val Lys Asp Leu820 825 830aaa tta gtt tta acg aag aac tcc tac gtt tac aat aaa ttg ggc aaa 2544Lys Leu Val Leu Thr Lys Asn Ser Tyr Val Tyr Asn Lys Leu Gly Lys835 840 845cgc gtt aag tat aag agt caa agt ttg ctt aag gaa ggt aaa cat ctt 2592Arg Val Lys Tyr Lys Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Gly Lys His Leu850 855 860tct acc cac aat aat gga aaa gtt gtg act att aaa aat ata cat ttt 2640Ser Thr His Asn Asn Gly Lys Val Val Thr Ile Lys Asn Ile His Phe865 870 875 880
ttt aat ata tct ctt ttc tta aaa tat ttc caa caa cgt2679Phe Asn Ile Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Phe Gln Gln Arg885 890<210>4<211>893<212>PRT<213>Lactobacillus helveticus<400>4Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His1 5 10 15Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln20 25 30Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn35 40 45Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala50 55 60Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val65 70 75 80Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn85 90 95Phe Asp Asn Ala Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Val Phe Val Leu Thr100 105 110Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val115 120 125Ala Phe Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ala Thr Gln Thr Phe Asn Val130 135 140Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn145 150 155 160Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys165 170 175Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly180 185 190Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val195 200 205Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile210 215 220
Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln225 230 235 240His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val245 250 255Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys260 265 270Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val275 280 285Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr290 295 300Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu305 310 315 320Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val325 330 335Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr340 345 350Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu355 360 365Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro370 375 380Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr385 390 395 400Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys405 410 415Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val420 425 430Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu435 440 445Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser450 455 460Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe465 470 475 480Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile485 490 495Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys500 505 510Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly515 520 525
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agt gta gat cca aac cag gaa caa caa cct gct aat caa gct gat cat 384Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His115 120 125gtt aaa gga aat gtg cag tct gca tgg gat caa gga tat agg gga caa 432Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln130 135 140gga aca gtt gtt gca gtc atc gat tcc ggt gca gat cca act cat aaa 480Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys145 150 155 160gat ttt aaa acc atg cca gaa gat cct aag ctg tcc gag gat gat atg 528Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met165 170 175caa gct aag atc gcc aag caa ggc tat ggt aaa tat gtg aat gaa aag 576Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys180 185 190ttc cca tat gtt tat aat tat gcc gat cgt gat aat gac tat att act 624Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr195 200 205tcg gat gac acc aat gct aat gat tct cca cac ggt caa cac gtt tca 672Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser210 215 220gga atc att gca gct gat ggt aag cca gat gga aat aaa gaa tat gtc 720Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val225 230 235 240gtt ggt gtt gct cct gaa gct caa ttg atg cag ctg aga gtt ttt gga 768Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly245 250 255caa ttt tca gat gaa aaa act gat gat gtg gca aaa gca atc tac gat 816Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp260 265 270gct acc aat tta ggt gcg gat gtc atc caa atg tca tta gga caa ggt 864Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly275 280 285gtt gcc gat caa caa ttg acc aat att gag caa aaa gct gtt caa tat 912Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr290 295 300gca att gat cac ggt gta ttt gta tca att tca gca tct aat aac ggt 960Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly
305 310 315 320aat tca gct tca gtt gat aat cca agt aaa gtt aaa gat caa gga tat 1008Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr325 330 335caa tct ggt agc caa gct ggt aac tat gaa cct ctt aat tta agt act 1056Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Asn Tyr Glu Pro Leu Asn Leu Ser Thr340 345 350gta gca aac cct ggt gtg tca aag aac gca tta act gtt gct gca gaa 1104Val Ala Asn Pro Gly Val Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Glu355 360 365aca tca gat act ggt gat tta agc gat atg gcc tac ttc tca tca tgg 1152Thr Ser Asp Thr Gly Asp Leu Ser Asp Met Ala Tyr Phe Ser Ser Trp370 375 380ggc cca gct caa gac tat act tta aag cca gat tta tca gca cct gga 1200Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro Asp Leu Ser Ala Pro Gly385 390 395 400tat caa gta gtt tct acc gtt aat cat gat cag tac caa aca atg agt 1248Tyr Gln Val Val Ser Thr Val Asn His Asp Gln Tyr Gln Thr Met Ser405 410 415ggt act tca atg gct ggt cca ttt gcc gca gct agt gct gcc tta gta 1296Gly Thr Ser Met Ala Gly Pro Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala Leu Val420 425 430att caa cga ttg aag caa act aat cct gaa ttg aag ggt gca caa tta 1344Ile Gln Arg Leu Lys Gln Thr Asn Pro Glu Leu Lys Gly Ala Gln Leu435 440 445gta gct gct gct aaa gca atg ctg atg aat acg gcc aaa cca caa aca 1392Val Ala Ala Ala Lys Ala Met Leu Met Asn Thr Ala Lys Pro Gln Thr450 455 460caa tta ggc tat aca aca cct gtt tca cca aga cgt caa ggt gca ggt 1440Gln Leu Gly Tyr Thr Thr Pro Val Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly465 470 475 480caa att gat gtt ggt gct gct acg gct act cca gtt tat gta act act 1488Gln Ile Asp Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Pro Val Tyr Val Thr Thr485 490 495gat gac ggc act agt tca gta tca ctt cat caa gtt ggt gaa agt act 1536Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr500 505 510aaa ttt acg tta acc ttc cat aat tta act gac caa agc cga act tat 1584
Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr515 520 525act ttc gat gat tat ggt gga ggt tac act gaa caa aga gat aca acc 1632Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr530 535 540acc ggc gtt ttt cat gat gtt caa tta gct ggt gct aga gta aat ggt 1680Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly545 550 555 560gaa cat agt ttt act tta gct cct aaa gaa gaa cgt caa gtt agc tat 1728Glu His Ser Phe Thr Leu Ala Pro Lys Glu Glu Arg Gln Val Ser Tyr565 570 575tca tta gac ttg acc ggc tta aag aag aac caa tta gtt gaa gga ttt 1776Ser Leu Asp Leu Thr Gly Leu Lys Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe580 585 590tta cgc ttt act aat gcc aat aat gca tct acg gtt tct gtt cct tac 1824Leu Arg Phe Thr Asn Ala Asn Asn Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Tyr595 600 605tta gct tat tat ggg gac tta act agt gaa aac gtc ttt gat caa aat 1872Leu Ala Tyr Tyr Gly Asp Leu Thr Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn610 615 620gca aat gag gag cat cta gat atc cag ggt aat cgt tta gtt aat gaa 1920Ala Asn Glu Glu His Leu Asp Ile Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu625 630 635 640caa aac tat cct cgt ggt att gca gat caa gaa tca ttg aag gaa ctt 1968Gln Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala Asp Gln Glu Ser Leu Lys Glu Leu645 650 655gta aat gtt gat gga aac tat aat tgg caa gaa gta gcc aaa tta tat 2016Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr660 665 670gaa agt ggt aaa gtt gcc ttt tca cca aat gat aat caa aag agc gat 2064Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser Pro Asn Asp Asn Gln Lys Ser Asp675 680 685tta ctg aag cca tat gtt tac ttg aag caa aat gtt aaa gat ctt aag 2112Leu Leu Lys Pro Tyr Val Tyr Leu Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys690 695 700gta gaa atc ctc gat gca caa ggt aac gtg gtt aga gtg gtt tct gac 2160Val Glu Ile Leu Asp Ala Gln Gly Asn Val Val Arg Val Val Ser Asp705 710 715 720
gtt caa ggc gta gat aaa tct tac gat gaa aat ggt gta act aaa gat 2208Val Gln Gly Val Asp Lys Ser Tyr Asp Glu Asn Gly Val Thr Lys Asp725 730 735act agt tta tca gtt tea atg aga gat aat cct gac gct ctt gaa tgg 2256Thr Ser Leu Ser Val Ser Met Arg Asp Asn Pro Asp Ala Leu Glu Trp740 745 750gat ggt aaa gtt tat aac agc aaa aca ggc aaa atg gaa act gcc aaa 2304Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ser Lys Thr Gly Lys Met Glu Thr Ala Lys755 760 765gat ggc aat tac act tac cgt tta gtt gct act ctt tgg aac aaa gga 2352Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Leu Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly770 775 780cca cat caa gtt caa aca gct gat ttc cca gta gta gtt gat aca gtt 2400Pro His Gln Val Gln Thr Ala Asp Phe Pro Val Val Val Asp Thr Val785 790 795 800gct cca aca ttg tca aat gtg aaa tat gat gct gcc tca cat act ttg 2448Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu805 810 815tca ggt gaa tac caa gat gct ggt gca gga ttt acg aat tat tca tat 2496Ser Gly Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asn Tyr Ser Tyr820 825 830gca acg gta aca gtt aat gat aag gtc ttt ggc tat aag ttg agt gat 2544Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp835 840 845ggt gga tca ggc ttc gat aat gca gaa aag act aag gga cat ttt agc 2592Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser850 855 860ttt gtg tta ggt caa gat gca ctt tct gca tta aca gct gct gca aac 2640Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn865 870 875 880aag gtg acc gta gcc ttg agt gat gtc gct gat aat act tca ttg gct 2688Lys Val Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ser Leu Ala885 890 895act gtt aat gtt gcc ggt gac cat gat agt gag act ggt gta agt gtt 2736Thr Val Asn Val Ala Gly Asp His Asp Ser Glu Thr Gly Val Ser Val900 905 910tgg aat gct gtc aat ggt tta gcc ttt gat caa aaa tca cca aac tat 2784Trp Asn Ala Val Asn Gly Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Pro Asn Tyr
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Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu111511201125gct aaa gat gaa gct gca aag tta gat tca ttt tgc cca ggt gca 3429Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala113011351140tac cca gga cac gca cca tca gct ctg aca acc aga acg gat cct 3474Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu Thr Thr Arg Thr Asp Pro114511501155aat cca gat att cat ttt gat tat atg aat gac aac gat act act 3519Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn Asp Asn Asp Thr Thr116011651170cgt ttt ggt cag aat gcc gtt act cat gga tac tat gat cct tca 3564Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr Tyr Asp Pro Ser117511801185act cag aag ttt acg gtt acc ggt aaa gtt gat gac aat gta gta 3609Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp Asn Val Val11901195 1200tct cta act gtg tta ggc gat aac tca aat gaa aat gct cct gaa 3654Ser Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Asn Ala Pro Glu120512101215aac caa gtt aag tta ggc aac gac ggt aag ttt agc ttt acg gta 3699Asn Gln Val Lys Leu Gly Asn Asp Gly Lys Phe Ser Phe Thr Val122012251230aca gct aac aga aca ggg caa cgt cca att gca tat att tac aaa 3744Thr Ala Asn Arg Thr Gly Gln Arg Pro Ile Ala Tyr Ile Tyr Lys123512401245gct aaa gat gga caa aga gtt cgt ggt acc ttg aat ctt att ctt 3789Ala Lys Asp Gly Gln Arg Val Arg Gly Thr Leu Asn Leu Ile Leu125012551260gat act gtt gct cct agc ttg gaa gta aat cag gtt aat ggg gat 3834Asp Thr Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Asn Gln Val Asn Gly Asp126512701275gaa tta gag ctt tgg act aat aat cca aaa ttc act ctg tcc gga 3879Glu Leu Glu Leu Trp Thr Asn Asn Pro Lys Phe Thr Leu Ser Gly128012851290aag gta aat gat aat ctt gat gga tat agg tta ttc gtt aat ggt 3924Lys Val Asn Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Phe Val Asn Gly129513001305
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權利要求
1.一種混合物用于生產(chǎn)降低哺乳動物心率的一種產(chǎn)品，所述混合物通過包括利用乳酸菌發(fā)酵包括動物乳汁或植物蛋白質的食物材料以得到發(fā)酵食物材料的過程而制得，所述發(fā)酵食物材料包含具有心率降低特性的活性成份。
2.如權利要求1所述的應用，其中所述發(fā)酵食物材料包含多肽或其它具有心率降低特性的活性成份。
3.如權利要求1或2所述的應用，其中所述產(chǎn)品是一種食品及飼料。
4.如前述權利要求中任何之一所述的應用，其中所述心率降低是用來治療或緩和冠狀動脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，諸如心絞痛、高血壓、動脈硬化、中風、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不整、充血性心臟衰竭(CHF)、主動脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙。
5.如前述權利要求中任何之一所述的應用，其中所述治療產(chǎn)生心率變動的降低。
6.如前述權利要求中任何之一所述的應用，其中所述發(fā)酵食物材料經(jīng)進一步處理，以純化或濃縮所述具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，其包括下列步驟(1)制備一發(fā)酵食物材料，其是根據(jù)一制法來制備所述具有心率降低特性的活性成份；(2)對步驟(1)所述發(fā)酵食物材料進行進一步處理，以純化或濃縮所述具有心率降低特性的活性成份；以及(3)以適當方式包裝所述發(fā)酵食物材料，以得到所述產(chǎn)品。
7.如權利要求6所述的應用，其中步驟(2)所述的濃縮是以離心機進行，并得到含有所述活性成份的上清液。
8.如權利要求6或7所述的應用，其中所述食物材料為乳汁，所述產(chǎn)品是為乳漿。
9.如前述權利要求中任何之一所述的應用，其中所述的乳酸菌選自乳酸桿菌屬(genusLactobacillus)、乳球菌屬(genus Lactococcus)、鏈球菌屬(genus Streptococcus)、明串珠球菌屬(genus Leuconostoc)、雙歧桿菌屬(genus Bifidobacterium)以及片球菌屬(genusPediococcus)所組成的群組。
10.如權利要求9所述的應用，其中所述乳酸桿菌屬的乳酸菌一種瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)。
11.如前述權利要求中任何之一所述的應用，其中所述的乳酸菌包含一基因序列編碼成一細胞壁蛋白酶(稱為prtH200)，其中所述基因序列定義為prtH200是編碼表現(xiàn)出細胞壁蛋白酶活性的一種酶的一段DNA序列，該DNA序列是選自下列所組成的群組(a)表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550的位置的DNA序列；(b)一DNA序列，其包含一至少75堿基對(bp)的片段，其與(a)所定義的DNA序列的對應片段至少有50％的同源性；(c)一DNA序列，其編碼一多肽，釋出細胞壁蛋白酶活性，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序列的對應片段至少有30％的同源性；(d)一DNA序列，其與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的雙股DNA探針在低嚴格性下進行雜交；以及(e)一DNA序列，其為(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列的片段。
12.如前述權利要求中任何之一所述的應用，其中所述的乳酸菌為一具有登記號為DSM 14998的瑞士乳桿菌種或其突變體。
13.一種發(fā)酵食物材料，其具有降低哺乳動物心率的特性，并包含用至少一種乳酸菌種發(fā)酵食物材料而產(chǎn)生的活性物質。
14.如權利要求13所述的發(fā)酵食物材料，其中所述乳酸菌是為選自乳酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、明串珠球菌屬、雙歧桿菌屬以及片球菌屬所組成的群組中的一種或多種乳酸菌。
15.如權利要求13或14所述的發(fā)酵食物材料，其中所述乳酸桿菌中的至少一種是一種瑞士乳桿菌。
16.如權利要求13或15所述的發(fā)酵食物材料，其中所述乳酸菌中的至少一種是登記號為DSM 14998的一種瑞士乳桿菌種或其突變體。
17.一種發(fā)酵食物材料，其具有降低哺乳動物心率的特性，并包含死的或活的瑞士乳桿菌種DSM 14998或其突變體。
18.自前述權利要求中任何之一所述的發(fā)酵食物材料分離出的降低心率的活性成份。
19.如前述權利要求13-17中任何之一所述的發(fā)酵食物材料用于生產(chǎn)治療或緩和冠狀動脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高血壓、動脈硬化、中風、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不整、充血性心臟衰竭(CHF)、主動脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙的藥物。
20.如權利要求18所述的發(fā)酵食物材料中分離出的降低心率的活性成份，用于生產(chǎn)治療或緩和冠狀動脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高血壓、動脈硬化、中風、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不整、充血性心臟衰竭(CHF)、主動脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙的藥物。
全文摘要
本發(fā)明是關于一種具有心率降低特性的混合物，它是通過發(fā)酵過程得到的。發(fā)酵過程包括利用乳酸菌發(fā)酵包含動物乳汁或植物蛋白質的食物材料，以得到發(fā)酵的食物材料，這種發(fā)酵食物材料包含具有降低心率特性的活性成分，以制造出可降低哺乳動物的心率及/或心率變動的產(chǎn)品。
文檔編號A61K38/01GK1802093SQ200480009291
公開日2006年7月12日 申請日期2004年4月5日 優(yōu)先權日2003年4月7日
發(fā)明者班奈迪特·佛林巴爾德 申請人:科·漢森有限公司