專利名稱：不加人血清白蛋白(hsa)的蛋白質(zhì)藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由低分子量非肽物質(zhì)組成的組合物，其穩(wěn)定配入藥物中的蛋白質(zhì)藥劑，并因此摒除了HSA的使用。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其除蛋白質(zhì)藥劑外還包含由低分子量非肽物質(zhì)組成的組合物。
基因工程技術(shù)的發(fā)展提供了多種其藥劑為蛋白質(zhì)的新型藥物。與其藥劑由低分子量物質(zhì)組成的常規(guī)藥物相比，高分子蛋白在低物質(zhì)量下表現(xiàn)出高效，并因此能分別以非常低的濃度和劑量應(yīng)用。
在各自這樣低的濃度和劑量下，藥物生產(chǎn)商面臨著問題。即蛋白質(zhì)具有粘著到固體表面上的性質(zhì)。由于這種吸附，大部分施用的蛋白質(zhì)藥劑丟失。當(dāng)然，施用的蛋白質(zhì)濃度越低，這種效果就越嚴(yán)重。沒有合適的配方，蛋白質(zhì)藥劑甚至可全部丟失。
這些藥物和蛋白質(zhì)藥劑各自的另一個(gè)問題在于蛋白質(zhì)的高度不穩(wěn)定性。例如，它們可分別地易被氧化(半胱氨酸殘基、蛋氨酸殘基)和去氨基(天冬酰胺)，或它們可分別裂解成片段和聚集成高級(jí)復(fù)合物。有效的制劑應(yīng)避免這種蛋白質(zhì)藥劑的丟失，并應(yīng)保證穩(wěn)定的產(chǎn)品。
由于蛋白質(zhì)結(jié)合到表面上是非特異性的，因此可通過加入極度過量的另外(非特異性)的蛋白質(zhì)來防止藥劑的丟失。由于這種另外的蛋白質(zhì)應(yīng)優(yōu)選完全沒有藥理學(xué)活性，并也應(yīng)不刺激抗體的產(chǎn)生，因此人血清白蛋白(HSA)目前用于這些目的，另外它可低價(jià)格得到，所以可大量施用它作為血漿替代物。因此目前市場(chǎng)上的幾種藥物(各種干擾素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、肉毒梭菌毒素和疫苗)都包含HSA作為穩(wěn)定劑。
HSA為從人血液中得到的產(chǎn)物，因此，盡管有強(qiáng)制性檢測(cè)，其可被污染(如病毒)，并且其可能為含HSA的藥物的接受者提供疾病傳播(尤其作為新病原體(可)時(shí)常出現(xiàn)，這不能通過試驗(yàn)及時(shí)登記)。因此，對(duì)藥物批準(zhǔn)負(fù)責(zé)任的管理機(jī)構(gòu)鼓勵(lì)在新批準(zhǔn)的藥物中代替HSA。出于這個(gè)原因，在藥物制劑中應(yīng)不使用HSA-只要它能被其它物質(zhì)代替。
人血清白蛋白(HSA)由于多種原因而特別適用于蛋白質(zhì)藥劑的制劑。它是一種蛋白質(zhì)，并因此可分別抑制和中和蛋白質(zhì)藥劑處的全部非特異性反應(yīng)。這尤其適用于界面(液-固、液-氣)處的反應(yīng)，其能導(dǎo)致藥劑的變性(Henson等(1970)，Colloid Interface Sci 32，162-165)。HSA的存在防止變性。此外，蛋白質(zhì)通過疏水相互作用對(duì)它們非特異性結(jié)合的表面有親合力(NordeW.(1995)Cells Mater 5，97-112)。表面上的結(jié)合位點(diǎn)可被過量HSA飽和，從而蛋白質(zhì)藥劑保留在溶液中，如果蛋白質(zhì)藥劑的劑量被降低，這尤其是必須的。
另外，HSA的存在防止了裝填和任選凍干過程中以及藥物存貯過程中的變性過程(例如，防氧化降解過程或防天冬酰胺的去氨化)。
以這種方式保護(hù)藥劑的蛋白質(zhì)本身自然應(yīng)不表現(xiàn)出任何藥理學(xué)活性，這是HSA滿足的先決條件。HSA為人蛋白，應(yīng)不作為抗原，即應(yīng)不刺激抗體產(chǎn)生。但是，由于HSA是從血液中分離并通過物理化學(xué)方法純化，因此不能嚴(yán)格排除在純化過程中，新的表位即新的抗原結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，HSA和蛋白質(zhì)藥劑的混合物的接受者對(duì)其形成抗體。這可能導(dǎo)致不需要的副反應(yīng)。由于可能的副反應(yīng)，因此不同蛋白質(zhì)和寡肽混合物各自的使用是不需要的。
原則上，明膠也可視為穩(wěn)定劑。它是一種由動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)，其激發(fā)免疫反應(yīng)，并還可為病原體的載體。
分別用于蛋白質(zhì)藥劑的HSA和其它合適的穩(wěn)定劑的用途還對(duì)包含蛋白質(zhì)藥劑的藥物特別重要，它們以非常低的劑量被給藥，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)尤其在低濃度下是極其不穩(wěn)定的，此外，立刻結(jié)合到可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn)上。因此，它們喪失了治療用途。作為以非常低劑量施加的蛋白質(zhì)藥劑的例子，可提到肉毒梭菌神經(jīng)毒素。這些高度活性的蛋白質(zhì)在最低劑量下有活性(它們和A型肉毒梭菌的神經(jīng)毒素分別為全部到目前為止開發(fā)的藥物之一，其能在最低劑量下被給藥(500pg/瓶)。除了使用保護(hù)藥劑外，這種非常低量的蛋白質(zhì)會(huì)丟失。
從基本上描述HSA作為這種保護(hù)藥劑的現(xiàn)有技術(shù)來看，需要提供HSA的替代物作為藥物中蛋白質(zhì)藥劑的穩(wěn)定劑。因此，本發(fā)明人解決了這個(gè)問題，開發(fā)了保護(hù)/穩(wěn)定藥物中蛋白質(zhì)藥劑的組合物，其至少與HSA一樣好。
本發(fā)明人通過開發(fā)由低分子量非肽物質(zhì)組成的組合物解決了提出的問題，該組合物穩(wěn)定配制在藥物中的蛋白質(zhì)藥劑，并且該組合物因此摒除了HSA的使用。這種組合物在下文中稱為用于穩(wěn)定的組合物。
根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及不含無關(guān)蛋白質(zhì)的組合物，該組合物可配制成具有蛋白質(zhì)藥劑的藥物。這種用于穩(wěn)定的組合物優(yōu)選基于低分子量物質(zhì)，它們按照European Pharmacopoe(Ph.Eur.)生產(chǎn)，并被批準(zhǔn)作為藥物佐劑。具體地，組合物允許上述HSA，并不僅保證蛋白質(zhì)藥劑和藥物沒有損失藥劑地分別穩(wěn)定存貯，而且消除了給藥被感染藥劑污染的各種藥物風(fēng)險(xiǎn)。令人驚奇地是，這種低分子量和“簡(jiǎn)單”的物質(zhì)，當(dāng)它們按照本發(fā)明用于穩(wěn)定組合物時(shí)，表現(xiàn)出所需的性能并能代替HSA。
根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物通過沒有副反應(yīng)的不同低分子量物質(zhì)的組合來代替HSA，這些物質(zhì)通過吸附到表面上以及通過溶解或凍干的蛋白質(zhì)藥劑的變性和化學(xué)降解過程防止蛋白質(zhì)藥劑的喪失。此外，穩(wěn)定組合物防止藥劑的降解，同時(shí)在高溫下存貯它經(jīng)過＞6個(gè)月的時(shí)期。
根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物列出了權(quán)利要求1中指出的成分，這些成分為a)表面活性物質(zhì)，具體是非離子洗滌劑(表面活性劑)，和b)至少兩種氨基酸的混合物，其中至少兩種氨基酸為Glu和Gln或Asp和Asn。
根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物包含一種或多種以下其它成分c)二糖，優(yōu)選蔗糖(甘蔗糖)、海藻糖或乳糖，d)乙二胺四乙酸(EDTA)，優(yōu)選以一種其鹽的形式，如Na4-EDTA。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選用于穩(wěn)定的組合物包含成分a)、b)和(c)，或成分a)、b)和d)，或成分a)、b)、c)和d)。所有這些優(yōu)選的組合物都可溶于水性介質(zhì)中或它們?yōu)樗芤骸?br> 有利的是用于穩(wěn)定的組合物中使用的全部物質(zhì)都被批準(zhǔn)為用于藥物制劑的佐劑，并因此經(jīng)過詳細(xì)毒性檢測(cè)，這意味著它們可混合到根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物中而不用進(jìn)一步檢測(cè)。令人驚奇的是，這些簡(jiǎn)單物質(zhì)的精確限定的組合表現(xiàn)出所需的性能，即能為蛋白質(zhì)藥劑提供穩(wěn)定的不含血清白蛋白的制劑。
根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含蛋白質(zhì)藥劑和上述用于穩(wěn)定的組合物的藥物組合物，用于穩(wěn)定的組合物包括成分a)和b)或?yàn)樯鲜鰞?yōu)選用于穩(wěn)定的組合物的一種。
優(yōu)選在包含成分a)和b)和任選還有c)和/或d)的水溶液(溶解的)中分別制備藥劑和蛋白質(zhì)藥劑。隨后可凍干該溶液。如果溶液實(shí)際上要被凍干，則先加入成分c)是尤其有利的。在凍干后，藥物組合物作為粉末存在，其可被重構(gòu)(reconstituted)(優(yōu)選用注射用水(WFI))。
因此，藥物組合物優(yōu)選以可溶于水介質(zhì)的凍干或真空干燥粉末的形式存在。在治療施用前，凍干的組合物和粉末各自優(yōu)選用注射用水(WFI)重構(gòu)。藥物組合物可仍然還以液體形式存在，優(yōu)選作為水溶液。
本發(fā)明的優(yōu)選藥物組合物幾乎包含上述成分a)和b)，作為蛋白質(zhì)的凝血因子如因子VIII(抗血友病球蛋白)，細(xì)胞因子如干擾素，尤其如α、β或γ干擾素，酶如尿激酶或鏈激酶，纖溶酶原激活劑或超純神經(jīng)毒素(對(duì)于“超純神經(jīng)毒素”的定義另參見下文)和神經(jīng)毒素絡(luò)合物，超純神經(jīng)毒素和神經(jīng)毒素絡(luò)合物分別來自肉毒梭菌，尤其來自A、B、C、D、E、F或G型肉毒梭菌。由于梭菌毒素能作為藥物以最低量配入，尤其是它們的超純形式，因此它們是優(yōu)選的蛋白質(zhì)。尤其優(yōu)選的是A和B型超純神經(jīng)毒素。
本發(fā)明的另外優(yōu)選藥物組合物除上述成分a)和b)和藥劑外還包含上面定義的成分c)、上面定義的成分d)或同時(shí)這兩種成分。
在根據(jù)本發(fā)明的兩種組合物中，至少有兩種氨基酸(i)天冬氨酸和天冬酰胺，或(ii)谷氨酸和谷氨酰胺。但是，優(yōu)選組合物包含這四種氨基酸中的至少三種(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸；天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺；天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)，或甚至全部四種(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺)。優(yōu)選單種氨基酸使用20～200mM、優(yōu)選20～100mM、尤其是50mM的濃度。這相當(dāng)于在0.5ml起始溶液中裝入數(shù)量分別為1.3mg～14.7和1.3～7.4mg，優(yōu)選約3.7mg的干燥后粉末形式的氨基酸。
在本發(fā)明兩種組合物的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，表面活性物質(zhì)(表面活性劑)為非離子洗滌劑，優(yōu)選聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(如泊洛沙姆184或泊洛沙姆188)。如果藥物組合物以液體形式存在，則聚山梨醇酯部分優(yōu)選為0.01～0.5wt％，優(yōu)選這部分為0.2wt％。這相當(dāng)于在例如0.5ml起始溶液凍干過程后數(shù)量為0.05～2.5mg、優(yōu)選1mg聚山梨醇酯。
在本發(fā)明兩種組合物的又一優(yōu)選實(shí)施方案中，二糖為蔗糖、海藻糖或乳糖。蔗糖是尤其優(yōu)選的。如果根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物作為溶液提供，則溶液包含優(yōu)選2～10wt％、更優(yōu)選5wt％的二糖，尤其是蔗糖。
如已描述的，還優(yōu)選使用成分d)，一種表現(xiàn)出附加穩(wěn)定效應(yīng)的絡(luò)合物形成物(螯合劑)。藥物組合物的起始溶液中乙二胺四乙酸的濃度優(yōu)選為0.1～1.0mM，尤其是5mM。
根據(jù)本發(fā)明的兩類組合物各自表現(xiàn)出優(yōu)選5.0～8.5的pH值，更優(yōu)選6.0～8.0的pH值，尤其是6.0～7.0和6.5。如果必要和需要的話，可分別用NaOH任選地調(diào)整pH值。
開始已經(jīng)提到的肉毒梭菌神經(jīng)毒素尤其是A和B型肉毒梭菌神經(jīng)毒素必須以非常低的劑量配制以用于藥物目的。因此，根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物的質(zhì)量可利用這種藥劑得到特別好地證實(shí)，其處理是極其復(fù)雜的。其它蛋白質(zhì)藥劑以相當(dāng)高的量配制；HSA因此可較容易地被根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物代替。
A型肉毒梭菌毒素(商標(biāo)名BotoxTM，Allergan；DysportTM，Ipsen)多年來已用于治療不同形式的張力失常(例如瞼痙攣、斜頸)、痙攣狀態(tài)，用于治療多汗癥，還有在美容領(lǐng)域用于除去臉部皺紋。這種藥劑為一種蛋白質(zhì)絡(luò)合物，其通過無氧生長(zhǎng)的細(xì)菌(肉毒梭菌)合成。這種蛋白質(zhì)絡(luò)合物中的活性藥劑為具有150kD分子量的蛋白質(zhì)，即肉毒梭菌神經(jīng)毒素(BoNT)。這種毒素和神經(jīng)毒素各自在運(yùn)動(dòng)終板處起作用，并抑制神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)到肌肉上，因此導(dǎo)致該肌肉的麻痹。這種作用機(jī)理允許在疾病中應(yīng)用神經(jīng)毒素，在該疾病中興奮傳導(dǎo)在病理學(xué)上被改變的，即發(fā)生乙酰膽堿釋放增強(qiáng)。
目前市場(chǎng)上的肉毒梭菌毒素和神經(jīng)毒素各自都基于肉毒梭菌的毒素絡(luò)合物，即神經(jīng)毒素。基本上，活性分子嵌在具有不同分子量的蛋白的總體中這些為不同的血凝素(15kD、19kD、35kD、52kD)以及無毒性非血凝素蛋白(NTNH，120kD)。沒有這些稱為保護(hù)蛋白的物質(zhì)，分離的神經(jīng)毒素非常不穩(wěn)定，并容易被蛋白酶降解。保護(hù)蛋白和絡(luò)合蛋白因此各自對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)際功能不是必要的，但在敏感性神經(jīng)毒素的穩(wěn)定中起作用。另一方面暗示，這些絡(luò)合蛋白可發(fā)揮免疫刺激作用，這將造成在5～10％的患者中產(chǎn)生抗體，不可避免地導(dǎo)致利用這類神經(jīng)毒素的治療結(jié)束(“二次無應(yīng)答者”)。另外不得不考慮，患者應(yīng)變(strained)異種蛋白(絡(luò)合蛋白)，這在藥理學(xué)上不是絕對(duì)需要的。因此應(yīng)用純的不含絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素作為藥劑是有意義的，但由于它的低劑量和不穩(wěn)定性而需要特別有效的制劑。
因此，使用不含絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素(不含絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素有時(shí)還稱為超純神經(jīng)毒素)作為藥物中藥劑的前提條件是開發(fā)一種藥物組合物，其能保證超純神經(jīng)毒素在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的生物功能穩(wěn)定性。本發(fā)明人通過提供根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物滿足了這個(gè)前提條件。
目前市場(chǎng)上基于A型神經(jīng)毒素的兩種藥物都包含HSA作為基本的穩(wěn)定劑(BotoxTM100單位藥劑包含0.5mg HSA和另外包含0.9mg氯化納，而DysportTM500單位藥劑包含0.125mg HSA和另外包含2.5mg乳糖)。基于B型毒素絡(luò)合物的NeuroblocTM存在于2000單位溶液具有500μg/ml HSA、0.01M琥珀酸鈉和0.1M氯化鈉的情況。如上所述，HSA尤其用于防止毒素吸附到瓶壁(玻璃瓶、注射器、插管)上和防止變性的目的。沒有血清白蛋白(或沒有能代替這種效果的物質(zhì))，毒素不可避免地丟失。這主要是由于這些藥物中的神經(jīng)毒素量太低的事實(shí)(包裝單位(“瓶”)，BotoxTM包含5ng，DysportTM20ng毒素絡(luò)合物每)。倘若不存在其它蛋白質(zhì)，充分存在的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)被毒素占據(jù)。在高度過量(＞50000倍)存在時(shí)，如在提到的藥物中，結(jié)合位點(diǎn)被HSA占據(jù)，從而神經(jīng)毒素絡(luò)合物保留在溶液中。不含超純絡(luò)合物的神經(jīng)毒素吸附到容器固體表面上的可能性相當(dāng)大，因?yàn)閯┝繛?00單位的純神經(jīng)毒素的蛋白質(zhì)量只有500pg。
專利申請(qǐng)WO 01/58472描述了A型肉毒梭菌絡(luò)合物的制劑，其基本由羥乙基淀粉組成。給出了其中制劑能穩(wěn)定1年的例子。對(duì)于超純的這種不含絡(luò)合物蛋白的神經(jīng)毒素，沒有描述檢測(cè)。但是，它聲明“毒素蛋白在除去血凝素蛋白時(shí)具有顯著的不穩(wěn)定性”。此外，在超純?nèi)舛舅缶舅氐那闆r下，它提到“純?nèi)舛舅缶舅厥侨绱瞬环€(wěn)定，但它具有有限的制備藥物組合物的實(shí)際用途”。但是，它沒有提到基于羥乙基淀粉的所述制劑還對(duì)穩(wěn)定超純神經(jīng)毒素有效。
含HSA的超純神經(jīng)毒素的制劑描述在美國(guó)專利5512547和5756468中。在第一個(gè)專利中，描述了包含HSA以及海藻糖和麥芽三糖或有關(guān)蔗糖的制劑。第二個(gè)專利具體描述了一種制劑，其除了這些糖外還包含蛋氨酸或半胱氨酸。在公開中也論述了在超純神經(jīng)毒素的制劑中使用HSA的必要性(Goodenough等，(1992)Appl Environm Microbiol 58 3426-3428)。
例如可按如下生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用用于穩(wěn)定的組合物(水溶液形式)稀釋藥劑(肉毒梭菌神經(jīng)毒素)的溶液至濃度為1.0～1.2ng/ml(≈200單位/ml)，隨后無菌過濾。將0.5ml這種溶液裝在瓶中，凍干或真空干燥并存貯直到治療施用。因此一個(gè)瓶包含具有約100單位神經(jīng)毒素的凍干組合物或真空干燥粉末。為了給藥于患者，按照指示，用2～8ml WFI重構(gòu)凍干的組合物或粉末。根據(jù)本發(fā)明的所述用于穩(wěn)定的組合物保證蛋白質(zhì)藥劑(神經(jīng)毒素)在稀釋、無菌過濾、裝填和凍干后的完全復(fù)原(recovery)。凍干的組合物在37℃下能穩(wěn)定超過6個(gè)月。
實(shí)施例1檢測(cè)分別與磷酸鹽緩沖液以及磷酸鹽緩沖液和聚山梨醇酯的組合物相比，使用根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物是否能提供較高的復(fù)原率(recovery)。
所有使用的賦形劑均以藥物級(jí)得自生產(chǎn)商。A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素可得自List Biological Laboratories，Inc.Campell，California，USA，并各自按照DasGupta，B.R.(1984)Toxicon 3，415-424生產(chǎn)。
用根據(jù)本發(fā)明的用于穩(wěn)定的組合物稀釋A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素的溶液(168μg/ml)至0.5μg/ml的濃度。對(duì)于天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，用于穩(wěn)定的組合物為50mM，包含0.05wt％的聚山梨醇酯20，表現(xiàn)出7.5的pH。
用各種溶液(見表1)進(jìn)行再次稀釋至1.2ng/ml(≈200LD50/ml)。在0.22μ過濾器上過濾后，將0.5ml這些再次稀釋的溶液裝在玻璃瓶(6R，Münnerstdt)中，并在37℃下存貯。用橡膠塞密封瓶。存貯15h后，利用常規(guī)特異性酶免疫分析(EIA)測(cè)定各種溶液中神經(jīng)毒素的濃度。
表1
選擇的配方在37℃下保溫后產(chǎn)生完全的復(fù)原。
實(shí)施例2檢測(cè)具有200單位A型神經(jīng)毒素/ml(1.2ng/ml)的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)是否穩(wěn)定。
按照實(shí)施例1使用表2列出的組合物由具有0.5μg/ml的A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素的儲(chǔ)備溶液產(chǎn)生濃度為1.2ng/ml的稀釋液。無菌過濾后，在瓶中裝入0.5ml這些組合物，然后用橡膠塞密封瓶。在4℃和37℃下存貯15h后，用ELISA測(cè)定A型神經(jīng)毒素的量。
在4℃下存貯8個(gè)月后，利用體外分析測(cè)定瓶中的生物活性。因此，利用小鼠膈(diaphragm)分析測(cè)定組合物的活性(Wohlfahrt K.等(1997)Naunyn-Schmiedebergs Arch.Pharmcol.355，225-340)。
表2
由氨基酸Asn、Asp、Gln和Glu(各50mM)和聚山梨醇酯80組成的溶液在4℃下能穩(wěn)定至少8個(gè)月。
實(shí)施例3檢測(cè)氨基酸的不同混合物表現(xiàn)出的穩(wěn)定效果。同樣將藥物組合物調(diào)整到1.2ng A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素/ml(200單位/ml)的濃度(按照實(shí)施例1并用表3列出的溶液分別進(jìn)行稀釋)，并在0.22μ過濾器上無菌過濾后在4℃下存貯。用酶免疫分析測(cè)定的神經(jīng)毒素結(jié)果顯示在表3中。
表3
全部四種氨基酸的混合物產(chǎn)生完全的藥劑復(fù)原。
實(shí)施例4檢測(cè)開發(fā)的制劑提供最高復(fù)原率時(shí)的pH值。在6.0～8.0的pH值下制備濃度為1.2mg/ml A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素的制劑，并在0.22μ過濾器上過濾后在37℃下存貯。用酶免疫分析測(cè)定的神經(jīng)毒素結(jié)果顯示在表4中。
表4
在6.0和6.5的pH值時(shí)獲得最好的復(fù)原率。
實(shí)施例5檢測(cè)獲得最高復(fù)原率時(shí)四種氨基酸天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺的濃度。由0.5μg/ml A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素的稀釋液開始，產(chǎn)生至1.2μg/ml的再稀釋液，并在0.22μ過濾器上過濾后裝在6R-瓶中，每瓶劑量為0.5ml。用橡膠塞密封后，在4℃下存貯它們15小時(shí)，隨后測(cè)定神經(jīng)毒素/瓶的量。
表5a
表5b
在液體制劑情況下，50mM的氨基酸濃度證明對(duì)藥劑的復(fù)原有效。
實(shí)施例6檢測(cè)凍干后得到最高復(fù)原率的氨基酸組成，其中在這種方法中不使用EDTA。凍干裝填溶液(0.5ml)，并在4℃下存貯過夜。用注射用水中0.5ml復(fù)原凍干的組合物。利用酶免疫分析測(cè)定神經(jīng)毒素濃度。
表6
當(dāng)在組合物中存在全部四種氨基酸并在50mM濃度下時(shí)，獲得凍干組合物中藥劑的最高復(fù)原率。
實(shí)施例7由A型肉毒梭菌神經(jīng)毒素在溶液(其包含各50mM的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，和0.5mM的EDTA，該溶液還包含0.2wt％的聚山梨醇酯80和5wt％的蔗糖，并表現(xiàn)出pH 6.5)中的預(yù)稀釋開始，產(chǎn)生在具有相同組成的溶液中1.26ng的A型神經(jīng)毒素/ml(200U/ml)的最終稀釋液，并在0.22μ膜過濾器上過濾。用移液管取0.5ml到6R玻璃瓶中，隨后凍干。將凍干的組合物溶解在WFI中。用酶免疫分析測(cè)定藥劑含量(A型神經(jīng)毒素)。檢測(cè)到96wt％的藥劑。為了驗(yàn)證復(fù)原藥劑的生物活性，溶解凍干的組合物，并在膈上試驗(yàn)。一瓶的凍干組合物包含110單位(相當(dāng)于110％復(fù)原率)。
實(shí)施例8類似于實(shí)施例7，產(chǎn)生凍干的組合物，隨后在37℃下存貯。三個(gè)月后，用免疫分析測(cè)定藥劑含量。檢測(cè)到94wt％的輸入藥劑。用生物分析(膈分析)驗(yàn)證活性/瓶得到102單位/瓶的含量。
實(shí)施例9由β干擾素在溶液(一種方法沒有EDTA，另一種有0.5mM EDTA)中的預(yù)稀釋開始，溶液包含各50mM的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，該溶液還包含0.2wt％的聚山梨醇酯80和5wt％的蔗糖，并表現(xiàn)出pH 7.0，產(chǎn)生在具有相應(yīng)組成的溶液中20μg/ml(4Mio國(guó)際單位/ml)的最終稀釋液，并在0.22μ膜過濾器上過濾。用移液管取1ml每種濾液到6R玻璃小瓶中，隨后凍干。將凍干的組合物溶解在WFI中。用酶免疫分析測(cè)定藥劑含量(β干擾素)。檢測(cè)到藥劑分別為18.8(沒有EDTA)和19.6μg(0.5mM EDTA)。為了驗(yàn)證復(fù)原藥劑的生物活性，溶解凍干的組合物，用常規(guī)生物分析測(cè)定活性(與參比標(biāo)準(zhǔn)相比，對(duì)VERO-細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)抑制)。復(fù)原輸入生物活性分別為94％和95％。
實(shí)施例10由凝血因子VIII在溶液(其包含各50mM的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，和0.5mM的EDTA，該溶液還包含0.2wt％的聚山梨醇酯和5wt％的蔗糖，并表現(xiàn)出pH 7.3)中的預(yù)稀釋開始，產(chǎn)生在具有相同組成的溶液中具有250國(guó)際單位/ml的最終稀釋液，并在0.22μ膜過濾器上過濾。在一種方法中，使用聚山梨醇酯20，在另一種使用聚山梨醇酯80。用移液管取1ml每種得到的濾液到6R玻璃小瓶中，隨后凍干。將凍干的組合物溶解在WFI中。用常規(guī)凝血試驗(yàn)測(cè)定藥劑含量(凝血因子VIII)。分別檢測(cè)到238(P20)和245(P80)國(guó)際單位/瓶。
實(shí)施例11由鏈激酶在溶液(其包含各50mM的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，和0.5mM的EDTA，該溶液還包含0.2wt％的聚山梨醇酯80和各自2.5、5和7.5wt％的蔗糖，并表現(xiàn)出pH 7.0)中的預(yù)稀釋開始，產(chǎn)生在具有相應(yīng)組成的溶液中具有250000國(guó)際單位/ml的最終稀釋液，并在0.22μ膜過濾器上過濾。用移液管取1ml各種濾液到6R玻璃小瓶中，隨后凍干。將凍干的組合物溶解在WFI中。用標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白溶解分析測(cè)定藥劑含量(鏈激酶)。分別檢測(cè)到236500、247000和242500國(guó)際單位/瓶。
權(quán)利要求
1.用于穩(wěn)定藥物中蛋白質(zhì)藥劑的組合物，該組合物包含以下成分a)表面活性物質(zhì)，優(yōu)選非離子洗滌劑(表面活性劑)，和b)至少兩種氨基酸的混合物，其中至少兩種氨基酸為Glu和Gln或Asp和Asn。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，還包括至少一種以下成分c)二糖，優(yōu)選蔗糖(甘蔗糖)、海藻糖或乳糖，d)乙二胺四乙酸(EDTA)，優(yōu)選一種其鹽的形式，如Na4-EDTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，包括成分a)、b)和(c)，成分a)、b)和d)，或成分a)、b)、c)和d)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中組合物可溶于水性介質(zhì)中或作為水溶液存在。
5.藥物組合物，包括蛋白質(zhì)藥劑和根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的用于穩(wěn)定的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其中藥物組合物以可溶于水性介質(zhì)的凍干或真空干燥粉末形式存在。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的藥物組合物，其中蛋白質(zhì)藥劑為凝血因子如因子VIII(抗血友病球蛋白)，細(xì)胞因子如干擾素，尤其是α、β或γ干擾素，酶如尿激酶或鏈激酶，纖溶酶原激活物或分別來自肉毒梭菌，尤其來自A或B型肉毒梭菌超純神經(jīng)毒素和神經(jīng)毒素絡(luò)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的用于穩(wěn)定的組合物或根據(jù)權(quán)利要求5至7中任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中至少兩種氨基酸為(i)天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸；(ii)天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(iii)天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺；(iv)天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺；或(v)天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中單種氨基酸的濃度在每種情況下都為20～200mM，更優(yōu)選20～100mM，尤其是50mM。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的組合物，其中表面活性物質(zhì)為非離子洗滌劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任意一項(xiàng)的組合物，其中非離子洗滌劑為聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，或泊洛沙姆如泊洛沙姆184或188。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任意一項(xiàng)的組合物，其中二糖為蔗糖、海藻糖或乳糖。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任意一項(xiàng)的組合物，其中組合物在溶液中的pH值各自為5.0～8.5，尤其是6.0～8.0，優(yōu)選6.0～7.0和6.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于穩(wěn)定藥物中的蛋白質(zhì)活性成分的組合物(1)，所述組合物包含以下兩種成分a)表面活性物質(zhì)，優(yōu)選非離子洗滌劑(表面活性劑))；和b)至少兩種氨基酸的混合物，所述至少兩種氨基酸為Glu和Gln或Asp和Asn。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1826132SQ200480021141
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日
發(fā)明者于爾根·弗雷弗特 申請(qǐng)人:比奧泰康醫(yī)療有限責(zé)任公司